KR19990022476A - 재조합 단백질을 발현시키기 위한 그람 양성균의 용도 - Google Patents

재조합 단백질을 발현시키기 위한 그람 양성균의 용도 Download PDF

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알디스 다진스
스티븐 화이트헤드
데니스 흐루비
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피셰티,빈센트,에이.
윌리암 에이치. 그리자
더 락커펠러 유니버시티
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Abstract

본 발명은 그람 양성균에서의 유전자의 클로닝 및 발현을 위한 신규의 계에 관한 것이다. 발현계는 많은 그람 양성균이 시스-작용 N-말단 시그널 서열 및 C-말단 부착 영역을 통해 단백질을 그들의 세포 표면으로 선별한다는 발견에 근거하였다. 구체적으로는, 공지된 표면 분자인 스트렙토코커스 M6 단백질의 세포 선별 시그널을 사용하여 SPEX (스트렙토코커스 단백질 발현)로 명명된 그람 양성 발현계를 구성하였다. 발현은 관심있는 유전자를 적절한 SPEX 카셋트 내로 클로닝시킨 다음 이것을 사람의 편공생 스트렙토코커스 고르도니와 같은 세균 숙주 내로 안정적으로 도입시킴으로써 달성된다. 사용된 SPEX 벡터에 따라, 재조합 단백질은 특이적 내단백질분해성 절단에 의해 방출되기 전에 세포벽에 부착되거나 또는 세균 성장 동안에 배지 내로 분비될 수 있다. 세포외 프로테아제가 결핍된 숙주 세균의 사용은 단백질분해성 분해로부터 분비된 단백질을 보호해야 한다. 이 계에서 몇 개의 발현 벡터는 생성된 생성물의 단일 단계 정제를 가능하게 하는 특이적으로 표지를 단 재조합 단백질도 또한 생산한다.

Description

재조합 단백질을 발현시키기 위한 그람 양성균의 용도
많은 원핵 및 진핵 단백질을 과잉생산할 수 있는 능력은 재조합 DNA 기술의 사용을 통해 가능하게 되어 왔다. 대장균 (Escherichia coli) 내로의 잡종 DNA 분자의 도입은 각종 유전자 생성물을 발현시키는 선택 방법이 되어 왔다. 대장균 기재 단백질 생산계의 사용 이면의 주요 추진력은 숙주 짧은 세대 기간 및 잘 발전된 유전학이다. 최근 수년 동안의 많은 효율적인 대장균 기재 유전자 발현계의 개발에도 불구하고, 가장 중요한 관심은 생성물의 다운스트림 처리에 관련된 것에 계속되고 있다. 대장균에서 생산된 재조합 단백질은 바깥 세포벽 (OM)을 용이하게 가로지를 수 없고; 그 결과, 폴리펩티드는 세포질 또는 주변세포질 (PS) 공간으로부터 정제되어야 한다. 이들 세포 격벽으로부터의 단백질 정제는 다소 어려울 수 있다. 흔히 만나게 되는 문제점들로는 낮은 생성물 수율, 잠재적으로 독성인 세포 물질 (즉, 내독소)로의 감염 및 봉입체로 불리는 비활성 응집체 중의 다량의 부분적으로 접혀진 폴리펩티드 사슬의 형성을 들 수 있다. 이들 고유한 정제 곤란의 결과로, 최근에 많은 관심이 많은 그람 양성균의 단백질을 그들의 세포벽 경계 넘어로 수송시키는 본성적 능력에 맞추어졌다. 그람 양성균의 유전학이 대장균에서와 같이 잘 밝혀져 있지 않다는 사실에도 불구하고, 이들 미생물은 재조합 단백질 생산용 숙주로서의 보다 바람직한 후보로서 인식되어 가고 있다.
그람 양성 세포질 막 (CM)을 가로질러 수송된 단백질은 일반적으로 2가지의 운명을 갖는다: 이들은 세포외 환경으로 방출(분비)되거나 또는 여전히 세포벽/막에 부착되어 있다. 다수의 최근에 개발된 그람 양성 기재 발현계는 예외없이 모두 전자의 단백질 수송 경로 (즉, 분비)에 의존해왔다. 그람 양성 발현계에서의 단백질 분비를 이끌기 위한 기본적인 전략은 표적 단백질을 현재 이용가능한 그람 양성 분비계의 기능적 N-말단 시그널 서열과 융합시키는 것을 포함한다. 지금까지, 가장 대중적인 숙주는 바실러스 (Bacillus)속에 속하고 있다. 이 군의 미생물은 각종의 경제적으로 중요한 단백질 생산용 산업에 의해 사용되어 왔다 [프리스트 (Priest), Bacteriol. Rev., 41:711 (1977); 글렌 (Clenn), Ann. Rev. Microbiol., 30:41 (1976)]. 아마도, 가장 광대하게 연구된 그람 양성 숙주-벡터 발현계는 비. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자에 기초한다 [울마넨 (Ulmanen) 등, J. Bacteriol., 162:176 (1985); 팔바 (Palva) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:5582 (1982); 팔바 등, Gene., 22:229 (1983); 런드스톰 (Lundstorm), Virus. Res., 2:69 (1985)]. 그러나, 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 비. 코아귤란스 (B. coagulans), 비. 리헤니포르미스 (B. licheniformis) [미합중국 특허 제4,824,782호, 제5,171,673호, 제4,711,843호; WO 특허 제8,605,812호; 창 (Chang, S.), Methods in Enzymology, 153:507-516 (1987)], 락토코커스 (Lactococcus) 및 락토바실러스 (Lactobacillus) 종 [미합중국 특허 제5,242,821호], 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종 [아브람센 (Abrahmsen) 등, EMBO J. 4:3901-3906 (1986)], 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종 [미합중국 특허 제4,745,056호; 일본국 특허 제2,002,379호; 유럽 특허 제352,707호] 및 코리네박테리움 (Corynebacterium) 종 [미합중국 특허 제4,965,197호; WO 특허 제9,303,158호]과 같은 다른 그람 양성 숙주에 기초한 발현계도 또한 대중적 사용을 위해 개발되었다.
그람 양성 분비계는 전통적인 대정균 기재 발현계보다 몇가지 이점을 제공한다. 한가지 분명한 이점은 세포벽을 지나 수송된 단백질은 일반적으로 그들의 본래의 형태를 보유한다는 점이다. 그 결과, 활성 단백질의 기능성에 기초한 설정된 정제 프로토콜을 완전히 이용할 수 있다. 또한, 그람 양성 발현계는 일반적으로 세포 물질을 오염시키는 잠재적인 독성이 없는 보다 높은 수율의 단백질을 일반적으로 생성시킨다.
그러나, 세포외 단백질의 정제에는 몇가지 실제적인 제한이 있다. 첫번째 관심은 단백질 불안정성이다. 많은 그람 양성 숙주에 의해 분비되는 재조합 단백질은 숙주가 코딩하는 세포외 프로테아제에 의해 단백질분해성 분해에 지극히 민감하다. 이 프로테아제의 존재는 단백질 수율에 크게 영향을 미칠 수 있다. 다행하게도, 감소된 세포외 프로테아제 활성을 갖도록 숙주 균주를 유전학적으로 변형시켜 분비된 단백질의 생육성을 유지하는데 있어서 상당한 개선이 달성되었다 [가와무라 (Kawamura) 등, J. Bacteriol., 160:442 (1984); 미합중국 특허 제5,084, 383호].
그람 양성 분비계를 사용할때 고려해야 하는 다른 중요한 점은 광대한 다운스트림 처리에 대한 요구이다. 대량의 큰 부피 발효로부터 재조합 단백질의 정제는 장치 및 인력 면에서 모두 극히 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 일임이 널리 받아들여져 있다. 그람 양성 분비계의 사용이 간단히 실용적이지 않은 경우, 보다 덜 비싼 그람 음성 기재 발현계에 호소하는 것이 일반적이다. 대체 발현 숙주로서 대장균을 사용하는 것에 대한 결정이 잠재적인 위함에도 불구하고, 재조합 폴리펩티드가 여전히 세균 세포와 관련되어 있고 (즉, 세포내 또는 주변세포질), 따라서 정제하기 보다 용이하다는 사실을 근거로 간단히 이루어질 수 있다. 그러므로, 이 분야에서 필요한 것은 그람 양성 (즉, 단백질 분비) 및 그람 음성 (즉, 단백질 구분화) 계의 두드러진 특징들을 포함시키는 세균 발현계임이 명백하다. 현재 이용할 수 있는 세균 발현계에 대한 신규의 그러나 간단한 대체법은 재조합 단백질을 직접적으로 세포벽 표면에 특이적으로 부착시키거나 부착시킬 수 있는 그람 양성 계의 개발이다. 이러한 면에서, 부착 방법은 정제 방법의 중요한 부분이 될 수 있다. 예를 들면, 세포 표면에 부착된 재조합 단백질을 품고있는 세포를 세척하고, 수거하여 적은 부피 중에 재현탁시킨 다음, 소정의 단백질의 방출을 행하는 특정 약제로 처리할 수 있다. 세균 세포의 제거에 따라, 얻어진 상징액은 단백질 생성물이 매우 풍부할 수 있다.
그람 양성균의 세포벽은 상이한 생물학적 특성들을 갖는 펩티도글리칸, 탄수화물 및 단백질로부터 조립된 복잡한 새포내기관이다. 표면 단백질은 이들을 단백질 수송의 정상적인 결함 경로로부터 벗어날 수 있게 하는 것으로 추정할 수 있는 특이적 선별 시그널을 필요로 한다는 점에서 자연적으로 분비되는 생성물과는 상이하다. 스트렙토코커스의 M 단백질 및 에스. 오레우스 (S. oreus)의 단백질 A 및 피브로넥틴 결합 단백질을 포함하여 많은 생물학적으로 중요한 그람 양성 단백질이 세포 표면에 부착되어 있다는 사실에도 불구하고, 그람 양성균의 세포벽은 비교적 잘 알려져 있지 않은 세포 격벽으로 남아있다.
세균 분비계에 대한 기준으로서 사용되는 정상적인 N-말단 수송 시그널이 광범위하게 특성화되어 있는 반면 [아브람센 (Abrahmsen) 등, EMBO J. 4:3901-3906 (1985); 하이네 (Heijne) 및 아브람센, FEBS Letters. 244:439-446 (1989); 퍽슬레이 (Pugsley), Microbio. Reviews, 57:50-108 (1993)], 세포 단백질의 그람 양성 세포벽에의 부착을 지휘하는 시스-작용 선별 시그널은 단지 최근에 밝혀졌다. 최근까지 50개 이상의 그람 양성 표면 단백질의 서열 배열 (비. 서브틸리스 및 에스. 뉴모니애 (S. pneumoniae)의 것은 제외)이 아미노 및 카르복시 말단 분비/부착 시그널 모두가 존재함을 밝혀냈다. 예상된 바와 같이, 관찰된 모든 단백질은 이들을 세포 수송 기관으로 보내는 것으로 추정할 수 있는 N-말단 시그널 서열을 함유한다. 이들 단백질의 C-말단은 하전된 꼬리가 바로 뒤에 이어지는 소수성 잠재 막 경간(徑間) 영역 (potential membrane spanning region)을 우세적으로 함유한다 [피쉐티 (Fischetti) 등, Mol. Microbiol., 4:1603-1605; 도 1: 진하게 음영진 영역 = LP(X)TG(X) 공통 서열; 연하게 음영진 영역 = 카르복시 말단의 소수성 잠재 막 경간 영역; 굵게 되어 있는 나머지 부분 = 하전된 단백질 꼬리; 단백질 A = 스타필로코커스 오레우스 (Staphylococcus oreus) 단백질 A; M6 = 스트렙토코커스 파이오게네스 (Streptococcus pyogens) M6 단백질; WapA = 에스. 뮤탄스 (S. mutans) 벽 관련 단백질 A; M49 = 에스. 파이오게네스 M49 단백질; IgA-BP = 스트렙토코커스 IgA 결합 단백질; 단백질 G = 스트렙토코커스 단백질 G; Fn-BP = 스타필로코커스 피브로넥틴 결합 단백질; T6 = 스트렙토코커스 T6 단백질; Pac = 에스. 뮤탄스 표면 단백질; Wg2 = 에스. 크레모리스 (S. cremoris) 표면 프로테아제]. 선행되는 소수성 영역은 베타 시트 유사 형태로 펩티도글리칸 세포벽에 걸쳐있는 것으로 예측된 프롤린/글리신 풍부 영역이다. 이 영역 내에서, 관찰된 모든 표면 단백질은 공통서열 LP(X)TG(X) (여기서, X는 일반적으로 Thr 또는 Ser이고, 때때로 Gly, Lys 또는 Asn임) (도 1) 거의 100% 보존된 헥사펩티드를 갖는다. C-말단 서열 요소 (즉, LP(X)TG(X) 모티프, 소수성 막 경간 영역 및 하전된 꼬리)의 보존은 폴리펩티드의 선별 및 세균 세포벽에의 부착 과정이 많은 그람 양성 종에 의해 공유됨을 제시한다 [피쉐티 등, Mol. Microbiol., 4:1603-1605(1990); 피쉐티 등, Curr. Opinion Biotechnol., 4:603-610(1993)].
서열 배열 분석에 의해 동정된 카르복시 말단 선별 요소의 기능적 중요성은 모델 계로서 잘 특성화된 에스. 오레우스의 표면 단백질인 단백질 A [목스(Moks) 등, Eur. J. Biochem., 156:637-643(1986)]를 사용하여 확인되었다. 단일 폴리펩티드 사슬인 단백질 A는 2개의 중요한 기능 영역을 함유한다. N-말단 영역은 36개의 아미노산 시그널 펩티드 서열에 이어지는 면역글로불린 결합 활성을 갖는 몇 개의 반복되는 서열 모듈 (E, D, A, B 및 C)을 함유한다. C-말단 영역은 단백질 A의 세포 벽에의 부착을 책임지고 있는 것으로 말해지는 보존 선별 영역을 함유한다 [거스 (Guss) 등, Eur. J. Biochem., 138:413-420 (1984); 거스 등, Eur. J. Biochem., 143:685 (1984); 피쉐티 등, Mol. Microbiol., 4:1603-160S (1990)]. 결실 분석을 사용하여, 슈네빈드 (Schneewind) 등 [Cell, 70:267-281 (1992)]은 에스. 오레우스에서의 단백질 A의 적절한 선별은 모든 3개의 보존 서열 요소 (즉, -LPETGE-모티프, C-말단 소수성 영역, 및 하전된 꼬리)를 필요로 함을 확인하였다. 그들의 결과에 근거하여, 슈네빈드 등 [Cell, 70:267-281 (1992)]은 단백질 A 및 아마도 많은 다른 그람 양성 단백질의 세포 표면에의 부착에서 사건들의 하기하는 순서를 제시하였다. 먼저, 단백질 A의 N-말단 시그널 서열은 폴리펩티드를 일반적인 분비 경로 (GSP)로 이끈다 [검토하기 위해서는, 퍽슬리, Microbio. Reviews, 57:50-108 (1993); 살몬드 (Salmond) 및 (Reeves), TIBS 18:7-12 (1993) 참조]. 막 전좌 과정 동안, C-말단 하전된 꼬리의 주 기능은 단백질의 배지로의 분비를 막는 것이다. 단백질 A의 막을 통한 전좌는 아마도 C-말단 선별 시그널의 인식을 야기시킨다. 인식 후에, LPETGE(LPXTGX) 모티프는 트레오닌 (T)와 글리신 (G) 잔기 사이를 특이적으로 절단한 다음 생성된 N-말단 단백질 단편을 에스. 오레우스 세포벽에 공유적으로 연결된다 [슈네빈드, Mol. Microbiol., 14:115-121 (1994)].
그람 양성 표면 단백질의 부착 모티프는 매우 다양한 분자와 수 개의 상이한 그람 양성 종 사이에 보존되기 때문에, 물어야 하는 논리적 문제는 공지된 표면 단백질을 이종성 그람 양성 숙주의 세포벽에 부착시킬 수 있는지 여부이다. 포찌 (Pozzi) 등 [Res. Microbiol., 143:449-457 (1992)]은 원섬유 스트렙토코커스 M 단백질을 사용하여 처음으로 이종성 그람 양성 숙주에서의 단백질 부착 문제에 손을 댔다. 구조적으로는, M 단백질은 기능성 말단 영역이 측면에 있는 연장된 중앙의 알파-나선형으로 감겨진 코일 막대로 이루어진다 (도 2) [필립스 (Phillips) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78:4689-4693 (1981); 피쉐티, Clin. Microbiol. Reviews, 2:285-314 (1989)] [도 2, (A) M6 단백질의 구조도; (B) M6 단백질 분자의 직선도. 지도는 N-말단 시그널 펩티드 (S), 몇 개의 반복되는 영역 (A, B, C, 및 D), LPSTGE 모티프 (LPXTGX)를 함유하는 프롤린/글리신 풍부 영역, C-말단의 소수성 잠재 막 경간 영역 (검정색 막대) 및 하전된 꼬리 (KRKEEN)를 나타낸다. M6 단백질의 수송 및 세포벽 선별/부착에 중요한 아미노 및 카르복시 말단 잔기는 음영져있다. 부착 영역은 일정 비율로 그려지지 않았다]. N-말단은 적절한 처리에 필요한 42개의 잔기 시그널 서열을 함유하지만 [피쉐티, Clin. Microbiol. Reviews, 2:285-314 (1989); 홀링쉐드 (Hollingshead) 등, J. Biol. Chem., 261:1677-1686 (1986)], C-말단은 서열 비교로 알 수 있는 바와 같이, 세포 선별 및 부착에 필요한 보존 잔기를 함유한다 [피쉐티 등, Mol. Microbiol., 4:1603-1605 (1990); 판콜리 및 피쉐티, J. Bacteriol., 170: 2618-2624 (1988); 도 1]. 사람의 구강 편공생 에스. 고르도니 (S. gordonii)의 염색체 내에서의 프로모터가 없는 emm-6.1 유전자의 통합 후에, M6 단백질이 이종성 숙주의 세포벽에 정확하게 위치됨이 입증되었다 [포찌 등, Res. Microbiol., 143:449-457 (1992)].
다음의 논리 단계는 그람 양성 숙주의 표면 상에 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 M6 선별 시그널의 이용 가능성을 관찰하는 것이다. M6 단백질은 몇 개의 이종성 항원, 예를 들면 사람의 유두종 바이러스 타입 16 E7 단백질로부터 유도된 서열, HIV-1 gp120의 면역우성 에피토프 및 흰 얼국 말벌 독액의 알레르기 유발항원을 에스. 고르도니의 표면으로 전달하도록 성공적으로 개질되었다 [포찌 등, Infect. Immun., 60:1902-1907 (1992); 포찌 등, Vaccine, 12:1071-1077 (1994); 메다글리니 (Medaglini) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), in press (1995)]. 재조합 융합 단백질을 그들의 세포 표면 상에 발현시키는 그람 양성 경구 편공생 세균을 사용하여 구강인두를 전이증식시키면서 외부 항원에 대한 점막 및 전신 면역 반응을 이끌어냈다 [피쉐티 등, Curr. Opinion Biotechnol., 4:603-610(1993); 메다글리니 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), in press (1995)].
M6 실험에 대한 최근의 결과는 2가지 중요한 이유로 중요하다. 첫째로, 이들은 단백질 선멸 및 부착 메카니즘이, 보편적이지 않을 경우, 그람 양성 균에서 극히 잘 보존된 과정이라는 가정을 확인하는데 사용된다. 보다 중요하게는, 이들 실험은 재조합 단백질을 그람 양성 세균 숙주의 표면에 부착시키는 신규의 발현계를 구성하기 위하여 세포벽 단백질 선별 시그널을 이용할 수 있다는 개념의 입증에 대한 증거이다. 그러므로, 선행 기술의 발현계에 수반되는 상기한 결합에 비추어볼 때, 독특한 그람 양성 단백질 발현계의 구성 및 이용에 대한 요구가 여전히 존재함이 명백해진다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 주 목적은 재조합 단백질의 제조 및 정제에 사용될 수 있는 그람 양성균 발현계를 개발하는 것이다.
특정 예로서, 스트렙토코커스 M6 단백질을 기재로 한 SPEX 계 (스트렙토코커스 단백질 발현)의 구성 및 이용법을 제공하는 것 역시 본 발명의 목적이다. 이 계는 유전자 조작 및 단백질 생화학 분야에 친숙한 자가 재조합 단백질을 발현시키고, 사람의 구강 편공생 에스. 고르도니와 같은 그람 양성 숙주로부터 재조합 단백질을 정제시킬 수 있게 한다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 세포외 프로테아제 생산이 결핍되고, C-말단 선별 시그널을 통해 표면 단백질을 부착시킬 수 있는, 그람 양성인 이종성 세균 숙주를 선택하고, 그람 양성 세포벽 단백질의 아미노 및 카르복시 말단 선별 서열을 코딩하는 DNA 단편, 소정의 단백질 생성물을 코딩하는 DNA 단편, 및 선택된 숙주 내에서 기능하는 전사 및 번역 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 숙주 내로 도입시키고, 발현된 단백질이 숙주의 세포 표면에 부착되도록 소정의 단백질 생성물, N-말단 시그널 서열 및 C-말단 선별 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현시키고, 프로테아제를 사용하여 숙주의 세포 표면으로부터 부착된 단백질을 절단시키고, 상징액으로부터 절단된 단백질을 정제시키는 것을 포함하는, 그람 양성균에서 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 그람 양성 숙주에서 단백질을 발현시켜 소정의 단백질 생성물을 세포외 공간으로 분비시키고, 분비된 단백질을 상징액으로부터 정제시키는 별법을 제공한다.
간략하게는, 본 발명은 표적으로 하는 세포벽에의 부착을 위해 표면 단백질의 세포 선별 시그널을 이용하는 그람 양성 숙주/벡터계의 구성 및 이용에 대한 일반적인 방법을 특징으로 한다. 이 계의 유용성을 입증하기 위하여, 본 발명은 또한 에스. 파이오게네스 M6 단백질을 기재로 하는, SPEX로 명명된 수 개의 특수 벡터의 구성을 설명한다. 이들 벡터는 사람의 구강 편공생 에스. 고르도니와 같은 그람 양성균에서의 단백질 및 펩티드의 발현에 사용하기 위한 것이다. 각종의 재조합 단백질 생성물은 적절한 SPEX 클로닝 벡터를 선택함으로써 발현될 수 있다. 폴리히스티딘 꼬리표 (tag) 및 단백질 A IgG 결합 영역, 인자 Xa 또는 TEV 프로테아제 절단 부위, 및 세포벽 부착 영역 LP(X)TG(X)의 조합물의 존재와 같은 몇가지 단백질 입체배치가 가능하다. 각각의 클로닝 벡터는 초기 클로닝을 대장균에서 수행되도록 한 후, 그람 양성 숙주, 예를 들면 천연적으로 수용성 에스. 고르도니 V288 [찰리스 (Challis)] 내로 형질전환되는 셔틀 플라스미드로서 작용한다. 사용된 SPEX 벡터에 따라, 재조합 단백질은 특정 프로테아제를 이용한 절단 후에 부착된 상태로부터 또는 별법으로는 배지로부터 정제될 수 있다.
이하에서 명백해질 본 발명의 상기한 및 다른 목적, 이점 및 특징들과 함께, 본 발명의 성질은 하기하는 본 발명의 바람직한 실시태양의 상세한 설명 및 첨부된 특허 청구의 범위를 참조하여 보다 분명하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 신규의 그람 양성 발현 벡터계의 구성 및 용도에 관한 것이다. 그람 양성 표면 폴리펩티드의 아미노 및 카르복시 선별 서열을 함유하는 단백질 융합물은 이종성 숙주의 표면에 부착될 수 있다. 별법으로는, 재조합 단백질은 성장 배지 내로 분비될 수 있다. 이 계는 진단 및 백신 항원 및 치료 단백질, 예를 들면 호르몬 및 성장 인자의 상업적 규모의 제조를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는, 임의의 목적을 위한 재조합 단백질 또는 펩티드의 과잉생산 및 정제에 사용될 수 있다.
도 1은 그람 양성 표면 단백질의 선택 군으로부터 C-말단 잔기의 배열을 도시한다.
도 2는 에스. 파이오게네스 M6 단백질의 기능성 영역을 도시한다.
도 3은 에스 파이오게네스 emm6 유전자 및 인접한 DNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 4는 SPEX 벡터의 구성의 개략도이다. 각 플라스미드의 pBLUESCRIPT (Apr) 주쇄는 나타나있지 않다.
도 5는 재조합 단백질의 부착된 표면 제조 및 정제에 유용한 가능한 SPEX 카셋트를 예시한다.
도 6은 재조합 단백질의 분비 및 정제에 사용된 가능한 SPEX 카셋트를 예시한다.
도 7은 M6 융합 단백질의 통합된 발현에 가능한 일부 에스. 고르도니 균주를 도시한다.
도 8은 에스. 고르도니 염색체 내로의 M6 융합물의 통합을 도시한다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 신규의 그람 양성 발현계의 구성 및 이용에 대한 일반적인 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 기재되는 발현계에 의해 생산된 단백질은 직접적으로 세포 표면으로부터 또는 분비 후에 상징액으로 정제될 수 있다. 예를 들면, 에스 파이오게네스의 공지된 M6 단백질 기재 발현계도 또한 설명된다. SPEX (스트렙토코커스 단백질 발현)로 명명된 이 발현계는 이 군의 유기체에 대한 모델 숙주로서 사람의 구강 편공생 스트렙토코커스 고르도니를 사용한다.
A. 일반적인 방법
그람 양성 발현계를 구성할 때 고려해야 하는 제1의 중요한 인자는 숙주로서 사용한 세균을 결정하는 것이다. 본 발명에 효과적이기 위해서는, 세균 숙주는 C-말단 선별 시그널을 통해 표면 단백질을 부착시킬 수 있는 그람 양성균이어야 한다. 상기 그람 양성균으로는 에어로코커스 (Aerococcus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 코르프로코커스 (Corprococcus), 데이노박테르 (Deinobacter), 데이노코커스 (Deinococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 게멜라 (Gemella), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 마리노코커스 (Marinococcus), 멜리소코커스 (Melissococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 펩토코커스 (Peptococcus), 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus), 플라노코커스 (Planococcus), 루미노코커스 (Ruminococcus), 사카로코커스 (Saccharococcus), 살리노코커스 (Salinococcus), 카르시나 (Carcina), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 스토마토코커스 (Stomatococcus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 트리코코커스 (Trichococcus) 및 바고코커스 (Vagococcus) 속을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명으로부터 최대한의 이점을 얻기 위하여, 세균 숙주는 세포외 프로테아제 생산이 결핍되어 있어야 한다.
본 발명에서 발현 숙주로서 사용되는 보다 바람직한 종은 스트렙토코커스 고르도니 (Streptococcus gordonii)이다. 가장 바람직한 균주는 V288 [찰리스 (Challis)]의 프로테아제 결핍 변종이다.
제2 주요 고려사항은 발현 벡터의 구성에 대한 기본으로 사용되는 그람 양성 세포벽 단백질의 선택이다. 그람 양성균의 거의 모든 표면 분자들은 세포벽 부착을 위해 이들을 특이적으로 표적으로 하는 아미노 및 카르복시 말단 선별 시그널을 갖는다 [피쉐티 등, Mol. Microbiol., 4:1603-1605 (1990)]. 본 발명의 실행에 사용된 발현계는 적절한 선별 시그널을 함유하는 임의의 그람 양성 표면 단백질과 함께 구성될 수 있다. 상기 선별 시그널은 당업계의 통상의 숙련인에 의해 용이하게 동정될 수 있다. 표면 단백질원으로는 에어로코커스, 비피도박테리움, 코르프로코커스, 데이노박테르, 데이노코커스, 엔테로코커스, 게멜라, 락토바실러스, 락토코커스, 류코노스톡, 마리노코커스, 멜리소코커스, 마이크로코커스, 페디오코커스, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 플라노코커스, 루미노코커스, 사카로코커스, 살리노코커스, 카르시나, 스타필로코커스, 스토마토코커스, 스트렙토코커스, 트리코코커스 및 바고코커스와 같은 그람 양성 속을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에 사용하기 보다 바람직한 단백질은 스트렙토코커스 파이오게네스 (Streptococcus pyogenes)의 타입-6 M 단백질이다. 에스. 파이오게네스로부터의 타입 6-M 단백질에 대한 구조 유전자가 클로닝되어 [스콧트 및 피쉐티, Science, 221:758-760 (1983)] 완전한 뉴클레오티그 서열이 결정되었다 [홀링쉐드 등, J. Biol. Chem. 261:1677-1686 (1986)]. 이 서열은 도 3에 나타나 있다. 예측된 M6 아미노산 잔기가 DNA 서열 아래에 나타나 있다. 추정되는 리보좀 결합 부위 (RBS)는 네모로 둘러쳐져 있고, 시그널 펩티드 (-42 내지 -1)는 밑줄그어져 있다. 성숙 폴리펩티드는 +1 내지 441 잔기를 나타낸다. 프롤린/글리신 풍부 세포벽 영역은 음영되어 있지 않은 직사각형으로 나타내어 있다. LPXTGX(LPSTGE) 모티프는 굵은 문자로 나타나 있다. 인접하는 연하게 음영진 직사각형은 소수성 막 경간 영역을 나타내고, 진하게 음영진 직사각형은 C-말단 하전된 꼬리를 나타낸다. 관련 제한 부위는 DNA 서열 위에 나타나 있다. 전사 종료암호는 화살표로 표시되어 있는 역 반복 구조로 나타나 있다.
다음의 고려사항은 선택된 숙주에서 세포벽 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리하고 특성화하는 것이다. 적절한 단백질 코딩 서열을 단리하기 위한 게놈 라이브러리(즉, 플라스미드, 코스미드, 파아지 또는 YAC)의 구성 및 스크리닝에 사용된 방법 및 그의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 기술은 유전공학 분야의 통상의 숙련인에게 공지되어 있다 [예를 들면, 샘브룩, 프리취 및 매니아티스 (Sambrook, Fritsch Maniatis), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판 (1989); 매니아티스, 프리취 및 샘브룩, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982); 및 그리핀 및 그리핀 (Griffin Griffin), PCR Technology: Current Innovations (1994) 참조].
표면 단백질의 아미노 및 카르복시 말단 선별 시그널을 코딩하는 DNA 단편은 당업계의 통상의 숙련인에게 친숙한 재조합 DNA 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 이들 단편은 대장균 클로닝 벡터, 예를 들면 pUC18/19 또는 임의의 다른 적절한 플라스미드 요소 상에서 조립될 수 있다. N-말단 시그널은 성숙 단백질의 N-말단으로부터 다수의 아미노산 잔기 및 완전한 리더 서열을 포함해야 한다. 이들 서열의 포함은 세포의 수송 기관 및 실제적인 전좌 과정 동안의 정확한 처리를 위한 정확한 표적화를 확실하게 할 수 있다. C-말단 선별 (즉, 부착) 시그널은 LPXTGX 모티프 (여기서, X는 임의의 아미노산 잔기), 소수성 막 경간 영역 및 하전된 꼬리를 포함해야 한다. 상기 선별 서열의 비교는 도 1에 나타나 있다. 배열의 왼쪽의 진하게 음영진 서열은 LP(X)TG(X) 공통서열을 나타내고, 단백질은 이 서열로부터 배열된다. 배열의 오른쪽의 연하게 음영진 영역은 카르복시 말단의 소수성 잠재 막 경간 영역을 나타낸다. 굵게 나타낸 잔기는 하전된 단백질 꼬리를 나타낸다.
이종성 융합 단백질의 구성을 용이하게 하기 위하여, 몇 개의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 함유하는 작은 DNA 단편은 아미노 및 카르복시 말단 선별 시그널을 코딩하는 DNA 서열들 사이에 위치할 수 있다. 이 다중 클로닝 부위 (MCS)는 이종성 단백질 코딩 서열의 삽입을 용이하게 하고, 발현시 그람 양성 세포벽 표면에 부착된 프레임내 단백질 융합물을 생성시키게 된다. 별법으로는, 발현 벡터는 C-말단 부착 시그널이 결핍된 발현 벡터도 구성될 수 있다. 이 경우, 단백질 융합물은 부착에 대해 표적되지 않고, 대신 새포외 공간으로 분비되게 된다.
본 발명에 기재된 벡터는 당업계에 친숙한 자가 세포 표면에 부착되어 있거나 또는 세포외 공간으로 분비되는 재조합 단백질을 생산할 수 있게 한다. 표적 단백질의 최종 행선지에 관계없이, 모든 벡터는 M6 리보좀 결합 부위(RBS), 번역 개시 코돈 (ATG) 및 42개의 아미노산 리더 서열 (-42 내지 -1)을 함유한다 (도 3, 4 및 5). 또한, 모든 벡터는 M6 단백질의 성숙 N-말단의 일부분을 함유한다. 이전의 연구는 성숙 M 단백질 N-말단의 122개 만큼 많은 아미노산도 또한 성공적인 전좌에 필요함을 증명하였다. 그러나, 보다 최근에는, 성숙 단백질의 5개 만큼 적은 N-말단 아미노산 잔기가 M6 융합 단백질의 적절한 처리 및 세포 표면으로의 전좌에 필요할 수 있음을 보여주었다 [피쉐티 등, Curr. Opinion Biotechnol. 4:603-610(1993)]. 본 발명의 실행에 사용되는 M6 아미노 말단 잔기의 바람직한 수는 58이고, 잔기 -42 내지 +16을 포함한다 (도 3).
본 발명에 사용되는 바람직한 C-말단 선별 시그널은 또한 타입-6 에스. 파이오게네스의 M 단백질로부터 유도된다. 표적 단백질 부착용으로 디자인된 벡터는 M6 C-말단 잔기 302 내지 441, 종료 코돈 (TAA) 및 다운스트림 서열을 함유하고, 이것은 추정되는 전사 종료암호를 포함한다 (도 3). 단백질 분비용으로 디자인된 벡터는 M6 C-말단 선별 시그널을 함유하지 않는다.
본 발명의 발현 벡터계는 임의의 소정의 단백질을 과잉생산하고 정제하는데 적합하다. 적어도, 본 발명의 발현 벡터계는 재조합 단백질 또는 펩티드의 과잉생산 및 정제에 유용하다. 이들 단백질 또는 펩티드는 임의의 목적에 사용될 수 있는데, 예를 들면, 이들은 진단 및 백신 항원 및 치료 단백질, 예를 들면 호르몬 및 성장 인자 등을 생성시키는데 사용될 수 있다.
그람 양성 세포벽으로부터 부착된 융합 단백질의 방출을 용이하게 하기 위하여, 각종 단백질분해 효소에 대한 절단 부위는 발현 벡터 내로 공작될 수 있다. 이들 독특한 서열은 임의적으로는 이들이 N-말단 시그널 펩티드의 바로 다운스트림 또는 C-말단 선별 시그널 영역의 바로 업스트림에 존재하도록 벡터 내로 혼입될 수 있다. 2개의 위치 모두에 절단 부위를 공작시킬 수도 있다. 적합할 수 있는 프로테아제로는 담배 에치 바이러스 (TEV)의 프로테이나제, 트롬빈, 엔테로키나제 및 인자 Xa를 들 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.
세포벽으로부터 멀리 융합 단백질을 물리적으로 이동시키는 다양한 크기를 갖는 단백질 스페이서 또는 링커 영역도 또한 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 이들 스페이서의 부재하에서 프로테아제 절단의 효율은 세포벽 표면의 입체 장해 때문에 감소될 수 있는 가능성이 있다. 이들 링커 서열은 프로테아제 인식 서열 및 C-말단 선별 시그널 영역 사이에 혼입될 수 있다.
임의의 독특한 프로테아제 절단 부위는 본 발명의 벡터내로 혼입될 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제 절단 부위는 4개의 아미노산 잔기보다 클 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 가장 바람직한 프로테아제는 TEV NIa 프로테이나제이다. TEV NIa 프로테이나제는 7개의 아미노산 서열 E-X-V/I/L-Y-X-Q*S/G [X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다; 도터리 (Doughtery) 등, EMBO J., 7:1281-1287 (1988)]에 걸쳐있는 특이적 공통 절단 부위를 절단시킨다. 본 발명에 바람직한 절단 부위는 E-N-L-Y-F-Q*G이다 [팍스 (Parks) 등, Anal. Biochem., 216:413-417 (1994)]. TEV 절단 부위는 융합 구성물을 따라 어디서든 공작될 수 있지만, 바람직한 위치는 LPXTGX 모티프를 품고 있는 프롤린/글리신 풍부 영역에 바로 옆이다 [도 5 참조: RBS = M6 리보좀 결합 부위; ATG = 개시 코돈; MCS = 다중 클로닝 부위 (MCS); 검정색 막대 = 막 경간 영역; 색칠된 삼각형 = TEV (담배 에치 바이러스) NIa 프로테아제에 대한 공작된 절단 부위; 비어있는 삼각형 = 인자 Xa(IEGR/)에 대한 절단 부위; 작은 수직 화살표 16 = 추정되는 세포 시그널 펩티드 절단 부위; SPEX1b 및 SPEX1c 참조]. TEV 인식 서열과 글리신/프롤린 풍부 부착 영역 사이에 단백질 스페이서 영역의 첨가는 TEV N1a 프로테이나제 효율을 개선시킬 수 있다. 본 발명에 바람직한 스페이서는 M6 단백질로부터 유도되고 아미노산 잔기 222 내지 301을 함유한다 (도 5; SPEX1d).
프로테아제 처리에 이어, 방출된 단백질은 당업계에 공지되어 있는 각종 방식으로 정제될 수 있다. 적합한 정제 방법으로는 투석, 한외여과, 띠 원심분리법, 분자 배제 크로마토그래피, 등전 침전, 용매 분류, 전기영동 분리, 열 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 친화 꼬리표를 사용하는 단단계 정제가 바람직하다. 이들 친화 꼬리표는 프로테아제 절단 부위와 마찬가지로 융합 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단 영역에서 임의적으로 공작될 수 있다. 유용한 친화 꼬리표로는 폴리히스티딘 트랙(HHHHHH), 단백질 A의 IgG 결합 영역 및 글루타티온 S-전이효소 (GST)를 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 그람 양성 숙주로부터 방출된 재조합 단백질은 금속 킬레이트화 (예를 들면, Ni-아가로스), 단백질 A-세파로스, 및 글루타티온-세파로스 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 1단계 과정으로 용이하게 정제될 수 있다. N-말단 시그널 및 친화 꼬리표 서열은 세포 표면으로부터 단백질을 제거하는데 사용된 인식 서열과는 상이한 프로테아제 절단 부위를 포함시킴으로써 용이하게 제거될 수 있다.
본 발명에 바람직한 친화 꼬리표는 6 내지 10개의 히스티딘 잔기의 연속되는 스트레치이다 (HHHHHH). 6개의 아미노산 잔기의 폴리히스티딘 꼬리표는 열등하게 면역원성이고 단백질 기능 및 구조에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 폴리히스티딘 친화 tag는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에서 공작될 수 있다. 본 발명을 위하여, 바람직한 부위는 N-말단 M6 서열의 바로 다운스트림이다 (도 5).
N-말단 M6 및 친화 꼬리표 서열은 제2 프로테아제 절단 부위에서의 공작에 의해 정제된 단백질로부터 제거될 수 있다. 본 발명에 바람직한 효소는 인자 Xa이다. 바람직한 위치는 친화 꼬리표의 바로 다운스트림이다 (도 5).
융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 효율적으로 발현시키기 위하여, 바람직하게는 조절 서열이 적절한 전사 및 번역을 확실하게 하도록 포함되어야 한다. 이들 벡터는 그람 양성 숙주에서 기능하는 전사 (즉, 프로모터) 및 번역 (즉, 리보좀 결합 부위) 조절 서열을 함유해야 한다.
많은 프로모터들이 임의적으로 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 당업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있는 이들 조절 서열에는 그람 음성 및 그람 양성균 모두로부터의 이종성 프로모터가 포함된다. 이들 조절 서열은 유전자의 발현이 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 켜지거나 또는 꺼지게 할 수 있다. 별법으로는, 구성적으로 발현된 프로모터도 또한 사용될 수 있다.
유전자 투여는 몇 개의 세균 발현계에서 단백질 생산에 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀진 변수이다. 일반적으로, 다중 복사 플라스미드 상에 존재하는 유전자는 보다 높은 수준의 단백질을 생성시킨다. 본 발명에서 재조합 단백질의 발현에 사용된 플라스미드는 선택된 그람 양성 숙주에서 안정하게 복제될 수 있어야 한다. 높거나 또는 낮은 복제수로 복제되는 이들 플라스미드는 당업계의 통상의 숙련인에게 친숙하다.
본 발명에서, 재조합 유전자의 플라스미드 관련 발현에 사용된 염색체외 요소는 임의적으로는 선택을 위하여 적절한 유전자 마커를 함유할 수 있다. 적절한 유전자 마커로는 각종의 항생제 및 중금속 내성 유전자 및 영양 결정인자를 들 수 있다. 그러나, 선택적 이점을 제공하는 다른 유전자도 또한 사용될 수 있다. 이상적으로는 선택 마커는 대장균 및 그람 양성 숙주에서 모두 발현될 수 있어야 한다. 이것은 대장균에서 초기 클로닝을 수행한 다음 이어서 재조합 플라스미드를 그람 양성 숙주로 전달시킬 수 있도록 한다. 게다가, 이종성 DNA 단편의 삽입을 용이하게 하기 위하여, 플라스미드는 유용한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 프레임내 폴리링커 또는 MCS도 또한 함유해야 한다.
재조합 플라스미드를 형질전환가능하지 않은 숙주 내로 도입시키는 기술은 당업계의 통상의 숙련인에게 친숙하다. 이들 방법으로는 전기천공 [도우어 (Dower), Genetic Engineering-Principles and Methods Vol. 12, 275-296 페이지 (1990)], 화학적 형질전환, 접합, 형질도입 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 재조합 DNA는 형질전환에 의해 천연적으로 수용성인 그람 양성 종 내로 용이하게 도입될 수 있다.
다중 복사 플라스미드 상에서의 특정 유전자 존재는 때때로 독성을 야기시키고, 일부 경우에는 세포 사망을 야기시킬 수 있다. 이들 유전자 생성물의 독성 효과는 발현시키고자 하는 결정인자의 복제수를 간단하게 감소시킴으로써 수배로 감소될 수 있다. 이것은 숙주 염색체 내로 직접적으로 융합 생성물을 코딩하는 유전자를 안정적으로 통합시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다. 단일 복제 원핵 발현 모듈을 생성시키는데 흔히 사용된 유전자 방법은 동종의 부위 특이적 및 비합법 (자리바꿈) 재조합을 포함한다.
본 발명에 바람직한 유전자 발현 방법은 재조합 SPEX 구성물의 에스. 고르도니 염색체 내로의 통합을 포함한다. 발현 숙주로서 유용한 에스. 고르도니 균주는 GP230 [포찌 등, Res. Microbiol. 143:449-457 (1992)], GP232 [포찌 등, Infect. Immun, 60:1902-1907 (1992)], 및 GP251 [포찌 등, Vaccine, 12:1071-1077(1994); 도 7: emm-6은 에스 파이오게네스 타입 6 M 단백질에 대한 구조 유전자이다. ermC 및 cat 유전자는 각각 에리토마이신 및 클로람페니콜 내성을 코딩한다. 삽입된 (네모로 둘러쳐져 있는) 서열이 측면에 있는 얇은 선은 에스. 고르도니 염색체를 나타낸다. 통합된 서열은 강한 염색체 에스. 고르도니 프로모터 (P)의 다운스트림에 위치한다]. 이들 균주는 동종 재조합을 통해 강한 에스. 고르도니 프로모터의 다운스트림에 통합된 유전자 카셋트를 함유한다. 본 발명에서, 이들 카셋트는 당업계의 통상의 숙련인이 GP230, GP232 및 GP251 상에 존재하는 서열을 생체내에서 구성된 재조합 SPEX 플라스미드로 대체시킬 수 있도록 하는 동종성의 측면 영역을 제공한다.
하기하는 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 보다 완전하게 예시하기 위하여 제공된다. 그러나, 이들은 본 발명의 넓은 영역을 제한하는 것으로 간주되어서는 결코 안된다.
실시예 1: SPEX 플라스미드의 구성
A. 부착된 벡터
프로모터가 없는 emm-6 유전자 및 에리트로마이신 내성을 코딩하는 유전자[ermC; 호리노우찌 (Horinouchi) 및 바이스블룸 (Weisblum), J. Bacteriol. 150:804-814 (1982)]를 함유하는 3.4 kb ClaI 단편을 pVMB3[포찌 등, Res. Microbiol. 143:449-457 (1992)]로부터 플라스미드 pBLUESCRIPT 내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pVMB20 [포찌 등, Infect. Immun. 60:1902-1907 (1992)]을 구성하였다. emm-6 유전자의 545 bp 내부 영역을 KpnI 및 HindIII 소화로 제거하고 합성 다중 클로닝 부위 (MCS)를 품고있는 작은 DNA 단편으로 대체시켰다. 생성된 pSMB55 (도 4)로 명명된 플라스미드는 M6 단백질의 처음의 122 N-말단 및 마지막 140 C-말단 아미노산을 코딩하는 서열을 함유한다. 이종성 단백질 서열을 코딩하는 DNA 단편을 pSPEX1a 또는 pSPEX2a의 MCS 내로 삽입시켜 M6 N-말단 및(또는) C-말단 서열이 있는 프레임내 융합물을 형성시켰다. pSMB55의 ermC 결정인자 내로부터의 SacI-HpaI 단편을 제거하여 카나마이신 내성을 코딩하는 aphIII 유전자를 품고 있는 단편으로 대체시켰다 [트리우-쿠옷 (Trieu-Cuot) 및 쿠발린 (Courvalin), Gene. 23:331-341 (1983)]. 생성된 플라스미드를 pSMB113으로 명명하였다 (도 4).
플라스미드 pSMB104는 처음의 16 N-말단 및 마지막 220 C-말단 아미노산을 함유하는 단백질인 M6Δ104를 코딩하는 emm-6Δ104유전자를 갖는다 [포찌, 공개되지 않은 자료]. pSMB104의 ClaI-KpnI 단편을 사용하여 기존의 pSMB113의 ClaI-KpnI 단편을 대체하였다. pSPEX1a로 명명된 (도 4) 생성된 플라스미드 벡터는 M6 단백질의 N-말단 58 및 C-말단 140 아미노산을 함유하는 단백질 융합물을 구성하는데 사용될 수 있다. 이들 단백질 융합물은 적절한 그람 양성 숙주 내에 발현되었을 때 세균 세포 표면에 부착될 수 있게 된다 (도 5).
B. 분비 벡터
pSPEX1a의 HinDIII-SacI 단편의 결실은 M6 단백질의 C-말단 선별 시그널을 효과적으로 제거한다. 생성된 pSPEX2a로 명명된 플라스미드는 단백질 전좌 및 처리에 필수적인 M6 N-말단 58 아미노산 잔기를 보유한다 (도 4). 그 결과, pSPEX2a와 함께 생성된 단백질 융합물은 성장 배지 내로 분비되게 될 것이다. TEV 프로테이나제 절단 부위 및 폴리히스티딘 꼬리표는 각각 비필수 단백질 서열의 제거를 용이하게 하기 위하여 및 정제를 위하여 혼입될 수 있다 [도 6: RBS = M6 리보좀 결합 부위; ATG = 개시 코돈; Term = 종료 코돈; 삼각형 = TEV (담배 에치 바이러스) NIa 프로테이나제에 대한 공작된 절단 부위; 음영진 잔기 = M6의 적절한 처리 및 분비에 중요; 작은 수직 화살표 = 추정되는 세포 시그널 펩티다제 절단 부위].
실시예 2: 에스. 고르도니에서의 재조합 유전자의 발현
본 발명에서는, M6 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자는 다중복사 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 본 발명에 바람직한 발현 숙주는 에스. 고르도니이기 때문에, 각종의 스트렙토코커스 종에서 기능하는 복제 원본 (oriV)을 함유하는 플라스미드가 사용될 수 있다 [호로드니세누 (Horodniceanu) 등, Antimicrob. Agents Chemother., 10:795-801 (1976); 클레웰 (Clewell) 등, J. Bacteriol. 117:283-289 (1974); 벤케 (Benke) 및 페레티 (Ferretti), Plasmid, 4:130-138 (1980); 마크리나 (Macrina) 등, Infect. Immun. 28:692-699 (1980); 마크리나 등, Gene 19:345-353 (1982)]. 별법으로는, 재조합 유전자는 에스. 고르도니 염색체 내로 안정하게 삽입될 수 있었던 단일 복사물 형태로 발현될 수 있다.
재조합 플라스미드는 형질전환 동안에 자연적으로 직선화되고 [포찌 등, Res. Microbiol. 141:659-670 (1990); 포찌 등, Infect. Immun. 60:1902-1907 (1992)], 측면의 동종성 세그먼트의 인식은 aphIII 유전자와 함께 M6 유전자 융합의 통합을 용이하게 한다 (도 8: 에스. 고르도니 수용체 균주 GP251 내에 존재하는 cat 유전자는 클로람페니콜 내성을 준다). 재조합 에스. 고르도니를 포찌 등 [FEMS Microbiol. Lett., 48:189-194 (1987)]에 의해 이미 설명된 다층 플레이팅 기술을 사용하여 카나마이신 내성 (aphIII에 의해 수여됨)에 대해 선택하였다. 이어서 카나마이신 내성 형질전환체를 에리트로마이신 (ermC에 의해 수여됨) 또는 클로람페니콜 (cat에 의해 수여됨) 내성 (수용체에 따라)의 손실에 대해 기록하였다. 항생제들은 하기하는 농도로 사용되었다: 에리트로마이신 5 μg/ml, 클로람페니콜 5 μg/ml 및 카나마이신 500 μg/ml. Kmr(Cmr또는 Emr) 형질전환체의 정제된 게놈 DNA의 서던 블롯 [서던 (Southern), J. Mol. Biol., 98:503 (1975); 서던, Methods Enzymol., 69:152 (1980)] 또는 PCR 분석이 세균 염색체에서의 발현 카셋트의 복제수 및 구조를 확정하는데 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 생산은 존 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정될 수 있다 [토우빈 (Towbin) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:4350 (1979); 토우빈 및 고르돈 (Gordon), J. Immunol., 72:313 (1984)]. M6 융합 단백질의 표면 발현은 이전에 기재한 방법 [포찌 등, Vaccine, 12:1071-1077 (1994)]에 따른 면역형광으로 시험할 수 있다. 재조합 단백질은 전체 M6 분자에 대한 다중클론 항혈청, 특이적 M6 에피토프에 대한 단일클론 항체 [존스 (Jones) 등, J. Exp. Med., 164:1226-1238 (1986); 존스 및 피쉐티, J. Exp. Med., 167:1114-1123 (1988)] 또는 융합물의 일부로서 발현된 이종성 단백질에 대한 항혈청을 사용하여 검출될 수 있다.
실시예 3: 에스. 고르도니로부터 재조합 단백질의 정제
재조합 에스. 고르도니를 카나마이신을 함유하는 토드 헤위트 (Todd Hewitt)-효모 추출물 육즙배지 (THYEB), 뇌 심장 침출액 (BHI) 또는 트립티케이스 콩 육즙배지 (TSB)와 같은 적절한 액체 배지 중에서 37 ℃에서 24시간 동안 또는 고정적인 상 성장이 달성될 때까지 성장시켰다. 세균 배양물을 원심분리시키고, 재조합 단백질 (세포벽 부착되거나 또는 분비되는)의 위치에 따라 세포 펠릿 또는 사용한 성장 배지를 추가의 분석을 위해 보전하였다.
표면 발현된 단백질을 품는 에스. 고르도니 세포를 수거하고, 세척하고 프로테이나제 억제제 존재하에, 최소한의 부피의 PBS (150 mM NaCl, 16 mM Na2HPO4, 4mM NaH2PO4pH 7.3) 중에 재현탁시켰다.
공작된 프로테아제 절단 부위가 있는 재조합 단백질을 TEV NIa 프로테이나제의 첨가에 의해 세포 표면으로부터 제거된다. 25 내지 30 ℃에서 적합한 기간의 시간 동안 배양시킨 후, 세포를 원심분리시켜 제거하고, 재조합 단백질이 풍부한 상징액을 수거하였다. 앞뒤로 나란히 있는 히스티딘 잔기를 함유하는 융합 단백질은 상징액을 니켈-킬레이트화 수지 [프로본드 (ProBond), 인비트로겐 코포레이션 (Invitrogen Corp.)] 또는 니켈 니트릴로트리아세트산 [Ni-NTA] 아가로스 [키아겐 인크. (Qiagen Inc.)] 상에 통과시켜 추가로 정제할 수 있다. 세척 후에, 재조합 단백질을 이어서 컬럼으로부터 온화한 조건 (즉, pH 6.0) 하에서 이미다졸 구배를 사용하여 용출시켰다. 정제된 단백질의 양은 브래드포드 [브래드포드 (Bradford), Anal. Biochem., 72:248-254 (1976)]의 방법으로 측정할 수 있다.
SPEX2 시리즈의 벡터 (도 6)의 사용은 성장 동안에 주변의 배지로 분비되는 융합 단백질을 생성시킨다. 세균 세포의 제거 후에, 사용한 성장 배지를 보존하여 소정의 생성물의 정제를 위한 출발 물질로서 사용하였다. 재조합 단백질은 상기한 바와 같이 금속 킬레이트화 크로마토그래피를 사용하여 정제시킬 수 있고, 비필수 N-말단 잔기는 TEV NIa 프로테이나제 처리로 제거할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에서는 각종의 특정 물질, 방법 및 실시예를 참고로 하여 설명 및 예시하였지만, 본 발명이 이러한 목적으로 선택된 물질 및 방법들의 특정 조합물로 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 상기한 세부사항들의 수많은 변형들이 가능하고, 당업계의 통상의 숙련인이라면 알 수 있을 것이다.

Claims (53)

  1. 그람 양성이고, C-말단 선별 시그널을 통해 표면 단백질을 부착시킬 수 있는 이종성 세균 숙주를 선택하는 단계;
    그람 양성 세포벽 표면 단백질의 아미노 및 카르복시 말단 선별 서열 및 소정의 단백질을 코딩하는 DNA 단편, 및 선택된 숙주 내에서 기능하는 전사 및 번역 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 숙주 내로 도입시키는 단계,
    소정의 단백질, N-말단 시그널 서열 및 C-말단 선별 서열을 포함하고 이 때 발현된 융합 단백질이 숙주의 세포 표면에 부착되는, 융합 단백질을 발현시키는 단계,
    프로테아제를 사용하여 숙주의 세포 표면으로부터 부착된 단백질을 절단시키는 단계, 및
    절단된 단백질을 회수 및 정제시키는 단계
    를 포함하는, 그람 양성균에서 소정의 단백질을 발현시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 숙주가 에어로코커스, 비피도박테리움, 코르프로코커스, 데이노박테르, 데이노코커스, 엔테로코커스, 게멜라, 락토바실러스, 락토코커스, 류코노스톡, 마리노코커스, 멜리소코커스, 마이크로코커스, 페디오코커스, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 플라노코커스, 루미노코커스, 사카로코커스, 살리노코커스, 카르시나, 스타필로코커스, 스토마토코커스, 스트렙토코커스, 트리코코커스 또는 바고코커스 속으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 숙주가 스트렙토코커스 속으로부터 선택된 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 숙주가 스트렙토코커스 고르도니인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 숙주가 스트렙토코커스 고르도니 V288[챨리스(Challis)], GP230, GP232 또는 GP251인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 숙주가 세포외 프로테아제 생산이 결핍된 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 그람 양성 세포벽 표면 단백질이 에어로코커스, 비피도박테리움, 코르프로코커스, 데이노박테르, 데이노코커스, 엔테로코커스, 게멜라, 락토바실러스, 락토코커스, 류코노스톡, 마리노코커스, 멜리소코커스, 마이크로코커스, 페디오코커스, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 플라노코커스, 루미노코커스, 사카로코커스, 살리노코커스, 카르시나, 스타필로코커스, 스토마토코커스, 스트렙토코커스, 트리코코커스 또는 바고코커스 속으로부터 유도된 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 그람 양성 세포벽 표면 단백질이 스트렙토코커스 파이오게네스의 타입-6 M 단백질인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 그람 양성 세포벽 표면 단백질이
    완전한 리더 서열 및 성숙 단백질의 N-말단으로부터의 다수의 아미노산 잔기를 포함하는 N-말단 시그널 서열,
    프롤린/글리신 풍부 영역 내에 있는, LPXTGX 모티프 (여기서, X는 임의의 아미노산 잔기임)를 포함하는 C-말단 선별 시그널,
    소수성 막 경간 영역 및
    하전된 꼬리
    를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 그람 양성 세포벽 표면 단백질이 추가로 아미노 및 카르복시 말단 선별 시그널을 코딩하는 DNA 서열들 사이에 위치하는 1개 이상의 제한 엔도뉴클레아제 (다중 클로닝 부위, MCS)에 대한 인식 서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 단백질분해 효소에 대한 1개 이상의 절단 부위를 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제가 담배 에치 바이러스 (TEV)의 프로테이나제, 트롬빈, 엔테로키나제 또는 인자 Xa인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 세포 표면으로부터 멀리 융합 단백질을 물리적으로 위치시키는 다양한 크기를 갖는 단백질 스페이서 또는 링커 서열을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 링커 서열이 프로테아제 인식 서열 및 C-말단 선별 시그널 영역 사이에 포함되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 절단된 단백질을 친화 꼬리표의 사용을 통해 단일 단계로 정제시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 친화 꼬리표가 6 내지 10개의 히스티딘 잔기를 함유하는 폴리히스티딘 트랙, 단백질 A의 IgG 결합 영역 또는 글루타티온 S-전이효소인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 절단된 단백질이 금속 킬레이트화, 단백질 A-세파로스, 글루타티온-세파로스 컬럼 크로마토그래피 또는 이들의 조합물을 사용하여 정제되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 유전자 마커를 발현시키는 숙주에게 선택적 이점을 제공하기에 충분한 염색체외 유전자 마커를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 유전자 마커가 항생제 유전자, 중금속 내성 유전자 및 영양 결정인자인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 유전자 마커가 대장균에서 및 그람 양성 숙주에서 모두 발현될 수 있는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 폴리링커 또는 다중 클로닝 부위를 포함하는 방법.
  22. 제7항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 M6 리보좀 결합 부위, 번역 개시 코돈(ATG), 42개의 아미노산 리더 서열 (-42 내지 -1) 및 5개 이상의 아미노산 길이인 성숙 N-말단의 일부분을 코딩하는 서열들을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 N-말단을 코딩하는 부분이 -42 내지 +16 잔기를 포함하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 C-말단 선별 시그널이 타입-6 에스. 파이오게네스의 M 단백질로부터 유도된 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 M6 C-말단 잔기 302 내지 441, 종료 코돈 (TAA), 및 전사 종료암호를 포함하는 다운스트림 서열을 포함하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 pSPEX1a인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 pSPEX1a 벡터가 추가로 4개의 아미노산 잔기보다 큰 절단 부위를 갖는 프로테아제를 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 프로테아제가 7개의 아미노산 서열 E-X-V/I/L-Y-X-Q*S/G (여기서, X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음)에 걸치는 특이적 공통서열 절단 부위를 절단하는 TEV NIa 프로테이나제인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 절단 부위가 E-N-L-Y-F-Q*G인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 절단 부위가 LPXTGX 모티프를 품는 프롤린/글리신 풍부 영역에 인접하게 위치하는 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 단백질 스페이서가 TEV 프로테이나제 인식 서열과 프롤린/글리신 풍부 부착 영역 사이에 첨가되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 스페이서가 M6 단백질로부터 유도되고 아미노산 잔기 222 내지 301로 이루어진 방법.
  33. 이종성 그람 양성균 숙주를 선택하는 단계;
    그람 양성 세포벽 표면 단백질의 아미노 및 카르복시 말단 선별 서열 및 소정의 단백질을 코딩하는 DNA 단편, 및 선택된 숙주 내에서 기능하는 전사 및 번역 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 숙주 내로 도입시키는 단계,
    소정의 단백질, 및 N-말단 시그널 서열을 포함하고 이 때 발현된 단백질이 세포로부터 분비되는, 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및
    단백질 생성물을 분비 후의 상징액으로부터 정제시키는 단계
    를 포함하는, 그람 양성균에서 소정의 단백질을 발현시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 숙주가 에어로코커스, 비피도박테리움, 코르프로코커스, 데이노박테르, 데이노코커스, 엔테로코커스, 게멜라, 락토바실러스, 락토코커스, 류코노스톡, 마리노코커스, 멜리소코커스, 마이크로코커스, 페디오코커스, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 플라노코커스, 루미노코커스, 사카로코커스, 살리노코커스, 카르시나, 스타필로코커스, 스토마토코커스, 스트렙토코커스, 트리코코커스 또는 바고코커스 속으로부터 선택되는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 숙주가 스트렙토코커스 속으로부터 선택된 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 숙주가 스트렙토코커스 고르도니인 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 숙주가 스트렙토코커스 고르도니 V288 [찰리스 (Challis)], GP230, GP232 또는 GP251인 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 숙주가 세포외 프로테아제 생산이 결핍된 방법.
  39. 제33항에 있어서, 상기 그람 양성 세포벽 표면 단백질이 에어로코커스, 비피도박테리움, 코르프로코커스, 데이노박테르, 데이노코커스, 엔테로코커스, 게멜라, 락토바실러스, 락토코커스, 류코노스톡, 마리노코커스, 멜리소코커스, 마이크로코커스, 페디오코커스, 펩토코커스, 펩토스트렙토코커스, 플라노코커스, 루미노코커스, 사카로코커스, 살리노코커스, 카르시나, 스타필로코커스, 스토마토코커스, 스트렙토코커스, 트리코코커스 또는 바고코커스 속으로부터 유도된 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 그람 양성 세포벽 표면 단백질이 스트렙토코커스 파이오게네스의 타입-6 M 단백질인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 그람 양성 세포벽 표면 단백질이
    완전한 리더 서열 및 성숙 단백질의 N-말단으로부터의 다수의 아미노산 잔기를 포함하는 N-말단 시그널 서열,
    프롤린/글리신 풍부 영역 내에 있는, LPXTGX 모티프 (여기서, X는 임의의 아미노산 잔기임)를 포함하는 C-말단 선별 시그널,
    소수성 막 경간 영역 및
    하전된 꼬리
    를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 아미노 및 카르복시 말단 선별 시그널을 코딩하는 DNA 서열들 사이에 위치하는 1개 이상의 제한 엔도뉴클레아제 (다중 클로닝 부위, MCS)에 대한 인식 서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 발현 벡터가 추가로 세포 표면으로부터 멀리 융합 단백질을 물리적으로 위치시키는 다양한 크기를 갖는 단백질 스페이서 또는 링커 서열을 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 링커 서열이 프로테아제 인식 서열 및 C-말단 선별 시그널 영역 사이에 포함되는 방법.
  45. 제33항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 유전자 마커를 발현시키는 숙주에게 선택적 이점을 제공하기에 충분한 염색체외 유전자 마커를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 유전자 마커가 항생제 유전자, 중금속 내성 유전자, 및 영양 결정인자인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 유전자 마커가 대장균에서 및 그람 양성 숙주에서 모두 발현될 수 있는 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 추가로 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 폴리링커 또는 다중 클로닝 부위를 포함하는 방법.
  49. 제39항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터가 M6 리보좀 결합 부위, 번역 개시 코돈 (ATG), 42개의 아미노산 리더 서열 (-42 내지 -1) 및 5개 이상의 아미노산 길이인 성숙 N-말단의 일부분을 코딩하는 서열들을 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 N-말단을 코딩하는 부분이 -42 내지 +16 잔기를 포함하는 방법.
  51. 제33항에 있어서, 상기 벡터가 SPEX2 시리즈의 벡터들 중의 하나인 방법.
  52. 제33항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 금속 킬레이트화 크로마토그래피를 사용하여 정제되는 방법.
  53. 제33항에 있어서, 상기 비필수 N-말단 잔기가 TEV NIa 프로테이나제 처리로 제거될 수 있는 방법.
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