FI64814C - Foerfarande foer effektivering av produktionen av aeggviteaemnen - Google Patents

Description

1 6481 4

Menetelmiä valkuaisaineen tuoton tehostamiseksi

Jakamalla erotettu hakemuksesta 804081 5

Keksinnön kohteena on menetelmä valkuaisaineen tuoton tehostamiseksi Bacillus-suvun bakteereissa. Keksinnön mukainen menetelmä perustuu uusiin yhdistelraä“ DNA-molekyyleihin, jotka syntetisoituvat Bacillus-suvun 10 bakteereissa ja jotka koodittavat Bacillus-suvun bakteerista erittyviä eksoentsyymejä, ja jotka esiintyvät useina kymmeninä kopioina Bacillus-suvun bakteereissa. Näissä uusissa yhdistelmä-DNA-molekyyleissä plasmidiin on liitetty Bacillus amyloliquefaciens-bakteerista eristetty CX-amy-15 laasia koodittava geeni.

Viimeaikainen kehitys molekyylibiologiassa on avannut uusia mahdollisuuksia proteiinien tuotolle bakteereissa yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Paitsi, että yhdis-telmä-DNA-tekniikan avulla on mahdollista tuottaa eukary-20 oottisolun proteiineja bakteereissa, voidaan bakteerien omien proteiinien synteesiä tehostaa merkittävästi lisäämällä halutun geenin kopioiden määrää solussa. Geenikopi-oiden lukumäärää bakteerisolussa voidaan nostaa liittämällä geeni sellaiseen plasmidi- tai virus-DNA-molekyyliin, 25 joka esiintyy solussa useana, yleensä 10-100 kopiona.

Kun tietyn geenin kopiomäärä nousee solussa, on seurauksena yleensä myös geenin ilmentämän proteiinin synteesin vastaava lisääntyminen.

Vaikka useita tämäntyyppisiä kokeita on tehty käyt-30 täen isäntäbakteerina E. colia ja siinä lisääntyviä plasmidi- tai virus-DNA-molekyylejä, on Bacillus-suvun bakteerien käyttö isäntinä vasta alkamassa (Gryczan et ai., Molecular General Genet 177, 459-467 (1979)); Keggins et ai., Proc. Natl. Acad. Sei (US) 75, 1423 - 1427 (1978); 35 Yoneda et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun, 91, 1556 -1564 (1979). Nämä menetelmät eivät kuitenkaan kohdistu Bacillus-suvun bakteerin eksoentsyymin tuoton lisäämiseen 2 64814

Bacillus-suvun bakteereissa tavalla, jossa eksoentsyymiä koodittava geeni on monistettu liittämällä se Bacillus-suvun bakteerissa useana kopiona esiintyvään plasmidiin.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 0 034 470 (FI-5 hakemus 810 425), hakija CPC International Inc., on esitetty systeemi, jossa eksoentsyymin tuottoa on lisätty kloonaamalla, mutta primäärisenä vektorina on ollut faagi ja isäntäbaktee-rina E. coli. B. amyloliguefaciens bakteerista esitettyä, Ct-amylaasia koodittavaa geeniä ei mainitussa menetelmässä ole 10 kuitenkaan mahdollista käyttää, koska tämä geeni ei ole stabiili esitetyissä olosuhteissa (I. Palva, väitöskirja, painossa).

Mainitussa hakemuksessa (sivu 36) on lisäksi todettu, että muodostettu B. subtilis klooni on stabiili ainoastaan klor-15 amfenikolin läsnäollessa. Teollisessa mitassa aiheuttavat antibioottipitoiset kasvatusalustat hävittämisongelmia ja itse asiassa antibiootteja ei tulisi olla elintarvikkeisiin tarkoitetuissa entsyymeissä (15th Report of the Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives, 1971, No 488).

20 Kuviossa 1 on kaavio tämän keksinnön suoritustavasta.

0(-amylaasia tuottavasta Bacillus-suvun bakteerista eristetään koko bakteerin genomi, joka pilkotaan restriktioent-syymillä. Halutun kokoiset DNA-pätkät liitetään yhteen rest-25 riktioentsyymillä avatun plasmidimolekyylin kanssa.

Tämän keksinnön mukaisesti bakteerin genomi voidaan pilkkoa restriktioentsyymillä Mbo I ja plasmidina voidaan käyttää pUB 110:tä, joka voidaan avata restriktioentsyymillä BamH I. On huomattava, että vastaava yhdistelmä-DNA-mole-30 kyyli voidaan valmistaa myös muita restriktioentsyymejä tai plasmideja käyttämällä, ja alaan perehtynyt asiantuntija voi valita erilaisia restriktioentsyymi-plasmidi-yhdistelmiä poikkeamatta tämän keksinnön piiristä.

DNA-pätkien ja plasmidimolekyylien yhdistämisen jäl-35 keen syntyneet yhdistelmä-DNA-molekyylit siirretään isäntä-bakteeriin ja näiden joukosta seulotaan ne bakteerisolut, jotka ovat saaneet plasmidiin liittyneen et-amylaasia koo-dittavan geenin. Seulonta perustuu transformoidun solun saamaan kykyyn tuottaa <A-amylaasia.

3 64 81 4

Isäntäbakteerina keksinnössä käytetään B. subtilis-kantaa. Kun kantaan on siirretty em. yhdistelmä-DN A-mole-kyyli, esiintyy ok-amylaasia koodittava geeni kannassa noin 50 kopiona. Tämä lisää kannan o^-amylaasituotannon noin 5 2 500-kertaiseksi normaaliin B. subtilis-kantaan verrattuna, c^-amylaasituoton kohoaminen 2 500-kertaiseksi aiheutuu osaltaan 1) lähtökantana käytetyn B. amyloliquefaciens-kannan ϊλ -amylaasigeenin säätelyosasta, joka on tehokkaampi kuin 10 B. subtilis- e^-amylaasigeenin säätelyosa, ja osaltaan 2) d\-amylaasigeenin lukumäärän kasvusta 50-kertaiseksi.

Laboratorio-olosuhteissa yhdistelmä-DNA-molekyylin sisältävä B. subtilis-kanta tuottaa noin 5 kertaa enemmän ^-amylaasia kuin geenin eristämiseen käytetty B. amylolique- 15 faciens-kanta.

Yhdistelmä-DNA-molekyyli eristetään B. subtilis-kan-nasta ja karakterisoidaan restriktioentsyymien ja emäsjärjestyksen määrittämisen avulla. Kuviossa 2 esitetään saadun yhdistelmä-DNA-molekyylin pKTHl0, Oi-amylaasigeenissä tai sen 20 säätelyosassa sijaitsevat ainutkertaiset restriktioentsyymin katkaisukohdat, ja yhdistelmä-DNA-molekyylin yleinen rakenne. Kuvioissa 3a ja 3b esitetään Bacillus amyloliquefaciensin CK-amylaasigeenin täydellinen nukleotidisekvenssi ja kodonien antama proteiinien aminohappojärjestys.

25 Yksityiskohtainen selostus keksinnön suorittamisesta

Genomin eristys, puhdistus ja pilkkominen Bacillus- suvun bakteereista

Bakteerikantana käytettiin B. amyloliquefaciens-kantaa. Kanta kasvatettiin yli yön rikkaassa ravintonesteessä, solut 30 kerättiin ja pestiin 0,0015-M natriumsitraatti-0,015-m NaCl- 11 puskurilla. Pestyt solut suspensoitiin (2*10 solua eli 200 ml:n viljelyerä) 2 ml:aan 20-% w/v sakkaroosi-50mM Tris-HCl-liuosta (pH 8,0). Tähän lisättiin 20 mg lysotsyymiä, 20 mg pronaasia ja 4 6481 4 2 ml 1-% w/v Sarkosyl®- 0,1-m EDTA-liuosta (pH 8,0), ja inkuboitiin 15 h 37°C:ssa. Saatuun lysaattiin lisättiin 6,5 ml H20, ja kiinteätä CsClraa sellainen määrä, että lysaatin taitekertoimeksi tuli 1,4100, jonka 5 jälkeen lysaatti sentrifugoitiin; Beckman Ti 50-rootto-ri, 36 000 rpm 48 h 10°C. Sentrifugoitu lysaatti jaettiin fraktioihin, ja ne fraktiot, joissa bakteerin ge-nomi viskositeetin perusteella arvioiden sijaitsi, kerättiin talteen ja dialysoitiin 30 h 10mM Tris-HCl - 1-mM 10 EDTA -0,1-M NaCl-puskuria (pH 8,0) vastaan 4°C:ssa.

Näin saatu genomipreparaatti uutettiin kolme kertaa fenolilla, ja fenoli poistettiin eetteriuutoksella.

DNA puhdistettiin sentrifugoimalla lineaarisessa 15—> 30-% w/v sakkaroosi - 0,1-M NaCl - 50mM Tris-HCl - 1mM 15 EDTA, 0,1 % natriumlauryylisulfaatti (pH 8,0)-gradien-tissa? Beckman SW27-roottori, 22 000 rpm 16 h 22°C, jonka jälkeen gradientti fraktioitiin, ja ne fraktiot, joissa DNA-pätkien koko oli > 15-10^ daltonia, otettiin talteen, ja DNA saostettiin etanolilla.

20 Täten eristetty B. amyloliquefaciens-genomipre- paraatti pilkottiin epätäydellisestä restriktioentsyy-millä Mbo I, ja pilkotut DNA-pätkät eroteltiin kokonsa mukaan ylläkuvatussa sakkaroosigradientissa, Beckman SW 27-roottori 25 000 rpm, 24 h 22°C. Ne fraktiot, joissa 25 olevien DNA-pätkien koko oli 1,5 - 5*10^ daltonia, otettiin talteen ja DNA saostettiin etanolilla.

Siirtovektorin eristys ja pilkkominen restriktio-entsyymillä

Siirtovektorina käytettiin plasmidia pUB 110.

30 Plasmidi eristettiin ja puhdistettiin Bacillus subtilis-kannasta SB 202, kuten aiemmin on kuvattu (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134=318 - 329, 1978). Puhdistettu plasmidi-preparaatti pilkottiin restriktioentsyymillä BamH I, 5 6481 4 jolla on ainoastaan yksi katkaisukohta plasmidimole-kyylissä. Plasmidimolekyylin lineaarisuus tarkistettiin geelielektroforeesin avulla.

B. amyloliguefaciens-genomin pätkien liittäminen 5 siirtovektoriin

Mbo I-entsyymillä pilkotut ja koon mukaan valitut B. amyloliguefaciens-genomin pätkät sekoitettiin yhteen BamH I-entsyymillä avatun pUB 110 plasmidin kanssa 1OmM Tris-HCl - 1mM EDTA-puskurissa (pH 8,0) DNA-10 moolisuhteessa 1:3, kokonaistilavuuden ollessa 120 jul ja DNA:n kokonaiskonsentraation ollessa 180 pg/ml. Seos kuumennettiin 5 min 65°C:ssa ja jäähtyneeseen seokseen lisättiin 13 μΐ660 nM Tris-HCl - 66 mM MgC^ - 100 mM ditiotreitoli - 10 mM ATP-puskuria (pH 7,8) ja 5 pl 15 T^-DNA-ligaasia (20 Weiss-yksikköä). Ligaatioseosta in-kuboitiin 3 h 23°C:ssa, ja ligaatiotapahtuman tulos tarkistettiin geelielektroforeesin avulla.

Yhdistelmä-DNA-molekyylin siirto isäntäbakteeriin Isäntäbakteerina käytettiin B. subtilis 1A197-20 kantaa, jonka genotyyppi oli sacA321, metB5, aroI907, amy . Kanta saatiin Bacillus Genetic Stock Center'istä (Ohio State University, USA) ja siinä oleva Amy -ilmaisu kartoitettiin bakteerigeneettisillä menetelmillä mutaatioiksi Ctf-amylaasia koodittavan entsyymin ra-25 kennegeenissä. Kanta tehtiin kompetentiksi eli kykeneväksi ottamaan sisäänsä DNA:ta aiemmin kuvatulla menetelmällä (Anagnostopoulos et ai., J. Bacteriol. 81:741 -746, 1961). Edellisessä kohdassa ligaatiolla valmistetut yhdistelmä-DNA-molekyylit sekoitettiin kompeten-30 teiksi tehtyjen isäntäbakteerien kanssa ja seosta pidettiin 30 min 37°C:ssa. Tämän jälkeen seos levitettiin bakteerimaljoille, joissa käytettiin kanamysiini-anti-bioottia estämään kaikkien niiden bakteerien kasvu, jot- 6 6481 4 ka eivät saaneet plasmidia sisäänsä. Maljoja pidettiin 30 h 37°C:ssa, jolloin plasmidin tai siihen liittyneen B. amyloliquefaciens-genomin pätkän saaneet isäntäbak-teerit kasvoivat pieniksi pesäkkeiksi.

5 Sellaisten isäntäbakteerien löytäminen, joissa on B. amyloliquefaciensin CX-aroylaasia koodattava geeni plasmidiin pUB 110 liittyneenä Edellisessä kohdassa kuvatut bakteeripesäkkeet replikoitiin uusille elatusainemaljoille, jotka kasva-10 tettiin 30 h 37°C:ssa. Saadut bakteeriviljelmät käsiteltiin I-KI-liuoksella aiemmin kuvatun menetelmän mukaisesti (J. Bacteriol. 119, 416 - 424, (1974)), jolloin sellaisten bakteeripesäkkeiden ympärille, jotka olivat saaneet CX-amylaasia koodittavan geenin sisältämän yh-15 distelmä-DNA-molekyylin, muodostui valkea rengas. Tällaisen pesäkkeen vastinpesäke poimittiin alkuperäiseltä bakteerimaljalta ja siinä oleville bakteereille suoritettiin useita peräkkäisiä puhdistusviljelyjä.

Yhdistelmä-DNA-molekyylin pKTH 10 eristäminen ja 20 karakterisointi

Yhdistelmä-DNA-molekyyli pKTH 10 eristettiin ja puhdistettiin isäntäbakteerista aiemmin kuvatulla menetelmällä (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134, 318 - 329, 1978). Molekyyli karakterisoitiin eri restriktioentsyymien a-25 vulla ja ίΧ-amylaasia koodittavan geenin sijainti määritettiin alustavasti seuraamalla geenin inaktivoitu-mista liitettäessä yhdistelmä-DNA-molekyylin eri kohtiin ylimääräisiä DNA-pätkiä. Tämän jälkeen Of-amylaasia koodittavan geenin emäsjärjestys määritettiin aiemmin kuva-30 tulla menetelmällä (Maxam, A.ja Gilbert, W., Natl. Acad. Sei (US) 74, 560 - 564 (1977)). Kuvioissa 3a ja b on merkitty Cfc-amylaasigeenin nukleotidisekvenssin yläsäie 5' > 3' suuntaan. Clal restriktioentsyymin katkaisukohta on mielivaltaisesti valittu nukleotidiksi 1. Geenin koo-35 dittavan alueen aminohappojärjestys on merkitty vastaavien nukleotidien yläpuolelle. Päälleviivattuna on 5'-päästä 7 64814 lähtien promoottorialue, signaalisekvenssialue (aminohapot -31...-1) ja transkription terminaatioalue. Tähdet kohdissa 1718, 1719 ja 1720 kuvaavat CX-amylaasigeenin translaation stop-kodonia.

Ql-amylaasi-aktiivisuuden määrittäminen Modifioitua isäntäbakteeria B. subtilis IHO 6064 (Kansanterveyslaitos, Helsinki) (sacA321, metB5), jossa on Ct-amylaasia koodittava geeni plasmidissa pUB 110 viljeltiin nestemäisessä elatusaineessa (Luria lihaliemi + 10 % tärkkelys) ilmastaen 37°C:ssa. Viljelynesteestä määritettiin Oi.-amyl aasi aktiivisuus 45 h:n kasvatuksen jälkeen käyttäen Sumnerin (J. Biol. Chem. 65, 393 — 395, 1925) menetelmää modifioidulla DNS-reagenssilla (Biochem. Prep. 8, 27 - 33, 1961). Kontrolleina määrityksessä käytettiin B. subtilis IHO 6064-kantaa ilman plasmidia ja Ä-amylaasigeenin eristyksessä käytettyä B. amyloliquefaciens El8-kantaa.

Tulokset on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Kanta Ct-amylaasi aktiivisuus (U/ml) B. subtilis IHO 6064 0,4 B.amyloliquefaciens E 18 220 B. subtilis IHO 6064/ pKTH 10 1100 ^"amylaasin tuotto fermenttorikasvatuksessa

Modifioitua B. subtilis-kantaa kasvatettiin ilman antibioottLpainetta 3 l:n laboratoriofermenttorissa alustalla, jonka koostumus oli: 8% o(-amy.laasilla nesteytetty ohratärkkelys (DE 5 - 30),2% tryptoni, 1% hiivauute, 2%

NaCl. Ilmastus oli kasvatuksen aikana 2 1/min, lämpötila 37°C ja sekoitusnopeus 600 kier./min. Kasvatusaika oli 40 h. Manipuloitu kanta tuotti tällä alustalla 4500 o^-amylaasi-yksikköä/ml, kun taas B. amyloliquefaciens E 18 tuotti r * samalla "-alustalla ja samoissa olosuhteissa 850 yksikköä/ml.

8 64814

Eristetyn o^-amylaasin N-terminaalisen aminohappojärjestyksen määrittäminen B.subtilis IHO 6064-kantaa, joka sisälsi hybridiplasmidin pKTH 10, kasvatettiin edellä kuvatulla tavalla. Alustasta, 5 josta bakteerit oli poistettu, saostettiin erittyneet pro teiinit lisäämällä vastaava tilavuus kylmää (0°C) asetonia. Tunnin kuluttua sakka sentrifugoitiin (16 000 xg, 30 min), pestiin kerran kylmällä asetonilla ja kylmäkuivattiin.

Sakka liuotettiin 25 mM Na-asetaattiin, pH 6,0, 1 mM fenyy-10 limetyylisulfonyylifluoridia (PMSF, Sigma) ja sentrifugoi tiin (10 000 xg, 30 min). Kirkas proteiiniliuos varastoitiin -20°C:ssa. Liuos ajettiin Biogel P-100 kolonnin (1,5 x 70 cm, 25 mM Na-asetaattia, pH 6,0, 1 mM PMSF) läpi ja eluoitiin asetaattipuskurilla. Ck-amylaasin sisältävät 15 fraktiot kerättiin, konsentroitiin ja säilytettiin -20°C:ssa.

Edman hajoitusreaktiot tehtiin manuaalisesti aikaisemmin kuvatun menetelmän mukaisesti (Peterson et ai. J. Biol. Chem. 247, 4866-4871 (1972)). Tiatsolijohdannaiset inku-boitiin 0,2 mlrssa IN HC1 80°C:ssa 10 min ja aminohappojen 20 fenyylitiohydantoin(PTH-)johdannaiset analysoitiin korkea- painenestekromatografilla UV-detektorilla käyttäen Spherisorb S5 ODS 2-kolonnia (4,5 x 250 mm) ja asetonit-riiligradienttia 10 mM Na-asetaatissa, pH 4,8 (Zimmerman et ai, Anal. Biochem. 77, 569-573 (1977)).

2 5

Tulokset on esitetty taulukossa 2 TAULUKKO 2

Hajoitusvaihe Identifioitu johdannainen B. substilis B. amylolique- B. subtilis IHO 6064/ faciens

pKTHlO

1 Vai Vai Leu 2 Asn Asn Thr 35 3 Gly Gly Ala 4 Thr Thr Pro 5 Leu Leu Ser 6 Met Met Ile 9 64814 7 Gin Gin Lys 8 Tyr Tyr Ser 9 Phe Phe Gly 10 Glu Glu Thr 11 Trp Trp Ile 5 12 Tyr Tyr Leu 13 Thr Thr 14 Pro Pro

Tulos osoittaa, että tuotettu <A.-amylaasi vastaa sek- 1 0 venssoidun nukleotidijärjestyksen antamaa aminohappojärjestystä ja eroaa selvästi B. subtiliksen omasta oSramylaasista (Mäntsälä & Zalkin, J. Biol. Chem. 254, 8540-8547 (1979) vert. Chung & Friedberg, Biochem. J. 185, 387-395 (1980)). Lisäksi se todistaa, että preamylaasi prosessoidaan oikein B. subtilis-isännässä.

Eritetyn &camylaasin koon määrittäminen dv.-amylaasiproteiini ajettiin SDS-PAGE geelielektrofo-reesilla Laemmlin kuvaaman menetelmän mukaisesti (Nature 20 277, 680-685 (1970)). Tulokset on esitetty kuviossa 4.

Geelin kaivoihin laitettiin kuhunkin 50 ^,ul viljelmän supernatanttia. Kannat olivat: kaivo 1, B. subtilis IHO 6064, jossa plasmidipKTH 10; kaivo 2, B. subtilis IHO 6064 jossa ei ole plasmidia, kaivo 3, B. awyloliquefaciens; kaivo 4, 25 M^-standardit: fosforylaasi B (94 000), albumiini (67 000), ovalalbumiini (43 000) ja karbonianhydraasi (30 000).

(λ—amylaasi on merkitty kirjaimella "a" ja kontaminoiva flagelliini-proteiini kirjaimella ”b". Tulos osoittaa, että (A-amylaasi erittyy oikeankokoisena alustaan ja että koko 30 vastaa virherajojen sisällä geenin nukleotidijärjestyksestä saatua molekyylipainoa 54 778. B. subtilis ei ilman vektoria eritä samankokoista proteiinia alustaansa.

10 6481 4 fl.-amylaasin tunnistaminen iimnunokemiallisesti

Kaksinkertainen imxnunodiffuusiokoe tehtiin aiemmin kuvatun menetelmän mukaisesti (Ouchterlony, Handbook of experimental immunology, toim. D.M. Weir, Blackwell Scientific Publication, Oxford, s. 655-706 (1967)).

Tulos on esitetty kuviossa 5. Keskuskaivossa A on 20 ^ul kaupalliselle B. amyloliquefaciens (Sigma A6380) <S.-amy-laasille tuotettua antiseerumia ja keskuskaivossa B B. subtiliksen (X-amylaasille tuotettua antiseerumia.

Kaivo 1 sisältää kaupallista Sigma A6380 o^-amylaasia, 1 0 kaivo 2 viljelmän supernatanttia, jossa on kasvatettu B. amyloliquefaciens-kantaa, josta geeni on eristetty, kaivo 3 viljelmän supernatanttia, jossa on kasvatettu B. subtilis IHO 6064-kantaa, joka sisältää pKTH 10 ja kaivo 4 sisältää B. subtilis Ot-amylaasia. Tulos osoittaa, 15 - että vektorin avulla tuotettu CV-amylaasi on lmmunokemi- allisesti identtinen kaupallisesti tuotetun B. amylolique- faciens c^-amylaasin kanssa eikä sillä ole ristikkäisreak- tiivisuutta B. subtilis Q(-amylaasin kanssa.

I * .

11 S A A Λ o 4 ö I 4

Bacillus amyloliqucfnciens BaciUus subt.ilis/pUB1 10 DNA:n eristys ja Plasmidin eristys ja puhdistus puhdistus N* ------* “" — — — — 4 /'"""n / \

Osittaman pilkkominen | pUB110 ! / restriktioentsyyniillä Mbo I / ^

., BamH I

IIIZIIIII Restriktioentsyymi- . — — 4- käsittely BamH I: llä IT Z “ RestriktiopStkien valinta ''N, koon perusteella f pUB110 ) \ /

Ligaatio ΠΠΠη \ y \ \ j \ j i

Transformaatio B.suhtilis kantaan, kanamysiini selektio

Kuvio 1 Transforuianttien seulonta “^-amylaasi- aktiivisuuden mukaan

Yhdistelinä-DNA-moiekyylin eristys ja karakterisointi Ä->‘t 12 64 814

Bamll I

ν' ' / ' v ' v

/ n X Κρη I

EcoR 1/ / N '\ .

//* X*\ Hind III

/ \ A '; \ I '»»

l J

pKTI-110 -f-L. EcoR I

i 1 \\ \ \ f / \ \ rt

\ \ SC/ Cla I

\ V. / Λ» \\ \ X V /

Mbo 1/ BarnH I

Bgl II Kuvio 2 13 6481 4 CGATTGTTTG AGAAAACAAG AAGACCATAA AAATACCTTG TCTCTCATCA GACAGGCTAT TTTTTATGCT CTCCAGACTC TCOGCTGTCT AAAAATAAGG AATAAAGGGG OGTTCTTATT 20 40 60 8U 100 ; 30 -31 -2:

. ......... MET ILE GLN LYS ARC LYS ARG THR VAL SEP PHE

ATTTTACTGA TATCTAAAAf ATAATTTGTA TAACAAAATG AGAGGCAGAG GAAAC ATGATTCAAAAACGAAAGCGGACAGTTTCGT 140 160 180 200 , LHL JM. .US fCT Cg- Ja .ua.lflt FHK VAL SER LEU PRO ILE THR LTS THR SER kla

TCAGACTTGTGCTTATGTGCACCCTGTTATTTCTCAGTTTGCCGATTACAAAAACATCAG

220 240 260

♦ 1 20 VAL ASN GLY TOR LEU 7ET GLN TYR PHE GLU TRP TYR THR PRO AS» ASP GLY GLN HIS TRP

CCGT AAATGGCACGCTGATGCAGT ATTTTGAATGGTATACGCCGAACGACGGCCAGCATT

2 SO 300 oio 40

LYS ARG LEU GLN ASN ASP ALA GLU HIS LEU SER ASP ILE CLY ILE THR ALA VAL TRP ILE

GCAAACGATTCCA9AATGATGCGGAACATTTATCGGATATCGCAATCACTGCCCTCTGGA

340 3έθ 3Ϊ0

PRO PRO ALA TYR LYS GLY LEU SER CL» SER ASP AS» GLY TYR GLY PRO TYR ASP LEU TO

ttcctcccgcatacaaaggattgagccaatccgataacggatacggaccttatgatttgt 4Ö0 4Ϊ0 440 eo

ASP LEU Q.Y CLU PHE GLN GLN LYS tt,Y THR VAL ARG THR LYS TYR GLY THR LYS SER GLU

ATGATTTAGCAGAATTCCACCAAAAAGGGACGGTCACAACGAAATACCGCACAAAATCAG

460 480 500

LcoKI

100'

LEU GLN ASP ALA ILE CLY SER LEU HIS SER ARC ASN VAL GLN VAL TYR O.Y ASP VAL VAL

AGCTTCAACATCCGATCCGCTCACTGCATTCCCgCAACGTCCAAGTATACGGAGATGTOG 520 540 560 120

LEU ASN HIS LYS ALA GLY ALA ASP ALA THR GLU ASP VAL THR ALA VAL ΟΛ1 VAL ASN PRO

TTTTGAATCATAAGGCTGGTGCTGATGCAACACAAGATGTAACTGCCCTCGAAGTCAATC 580 6ÖO fciO

140

ALA ASN ARC ASM GLN GLU THR SER GLU GLU TYR GLN ILE LYS ALA TRP THR ASP PHE ARG

CCCCCAATACAAATCAGGAAACTTCGCAGGAATATCAAATCAAACCGTGGACGGATTTTC

640 6&0 680

PHE PRO GLY ARG GLY ASN THR TYR SER ASP PHE LYS TRP HIS TRP TYR HIS PHE ASP CLY

CTTTTCCGGCCCGTGGAAACACGTACAGTGATTTTAAATGGCATTCGTATCATTTCCACC

7Ö0 7Ϊ0 240 180

ALA ASP TRP ASP GLU SER ARG LYS ILE SER ARG ILE PHE LYS PHE ARG GLY GLU CLY LYS

CAGCCGACTCCCATGAATCCCGGAAGATCAGCCgCATCTTTAAGTTTCGTGGGgAAGGAA

760 780 800

2 CO

ALA TRP ASP TRP GLU VAL SER SER GLU ASN GLY ASH TYR ASP TYR LEU 5ΕΓ TYR ALA ASP

AAGCGTGGGATTGgCAACTATCAAGTGAAAACGGCAACTATGACTATTTAATGTATCCTG

820 eio BiO

220

VAL ASP TYR ASP HIS PRO ASP VAL VAL ALA GLU THR LYS LYS TRP CLY ILE TRP TYR ALA

ATGTTGACTACCAgCACCCTGATGTCGTGGCACAGACAAAAAAATGCGCTArCXCGTATC 880 ϊ6θ »20 240

ASN GLU LEU SER LEU ASP CLY PHE ARG ILE ASP ALA ALA LYS HIS ILE LYS PHE SER PHE

cgaatgaactgtcattagacggcttccgtattcatgccgccaaacatattaaattttcat 940 960 980 (jatk.) KUVIO 3a.

•M.'t ; : > 14 6481 4 (jatk.)

LEU ARC ASP TRP VAL GLN ALA VAL ARC CLN ALA THR GLY LYS GLU ICT PHE THR VAL ALA

TTCTGCCTGATTGgCTTCAGGCGGTCAGACAGGgGACGGGAAAAGAAATCTTTACGGTTG

1000 1020 1040

GLU TYH TRP GLN ASN ASN AU aY LYS LEU aU ASN TYR LEU ASN LYS TOR SER PHE ASN

CGGAGTATTGGCAGAATAATGCCGGGAAACTCCAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTA 1060 1080 1100

T ^ ASP VAL PR0 LEU His PHE ASN LEU GLN ALA ALA SEP SER GLN GLY GLY

ATCAATCCGTGTTTOATCTTCCGCTTCATTTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAACGAG

1120 1140 1160 »20

GLY TYR ASP PET ARG ARG LEU LEU ASP GLY THR VAL VAL SER ARC HIS PRO GLU LYS ALA

GCCGAT ATGAT ATpAGGCGTTTGCTGGACGGT ACCGTTGTGTCCAGGCATCCGGAAAAGG

Π80 1200 1220

VAL THR PHE VAL GLU ASN HIS ASP THR GLN PRO GLY GLN SER LEU GLU SER THR VAL GLN

CGGTTACATTTGTTGAAAATCATGACACACAGCQGGGACAGTCATTGCAATCGACACTCC 1240 1260 12*80 THR TRP PHE LYS PRO LEU ALA TYR ALA PHE ILE LEU THR ARG au SER GLY TYR PRO o!n

AAACTTGGTTTAA AC CGCTTGCATACOCCTTTATTTTCACAAGAGAATCCGGTTATCCTC

1300 1320 i340 . = oTo tTo ,Ττ oTjo?. .To ,Tc «To ,T. oTo ,To cT. »To «T» »Tr c&° / 1380 UOO y

T G fT A T 4*?T * r^r r*rr r -H?* -L1? Ä LYS CLU TYR AU TYR GLY PRO CLN HIS

TGAAAGATAATAT^GAGCCGATTTTAAAACCGCQTAAGGACTACGCATACCGGCCCCAGC

1420 1440 1460 420

ASP TYR ILE ASP HIS PRO ASP VAL ILE CLY TRP TOR ARG GLU GLY ASP SER SER AU AU

ACGATTATATTGAgCACCCGGATCTGATCGGATGGACGAGGGAAGGTGACAGCTCCGCCC 1480 1500 1520 440

LYS SER GLY LEU AU ALA LEU ILE TOR ASP GLY PRO GLY GLY SER LYS ARG PET TYR AU

ccaaatcaggtttqgccgctttaatcacggacgqacccggcggatcaaagcggatgtatc 1540 1560 1560 460

GLY LEU LYS ASN AU CLY GLU THR TRP TYR ASP ILE THR aY ASN ARG SER ASP THR VAL

CCGGCCTGAAAAATGCCGGCGAGACATGGTATCACATAACGGGCAACCGTTCAQATACTG 1600 1620 1640 480

LYS ILE GLY SER ASP aY TRP GLY GLU PHE HIS VAL ASN ASP aY SER VAL SER ILE TYR

TAAAAATCGCATCJGACGCCTGGGGAGAGTTTCATGTAAACGATGGCTCCCTCTCCATTT 1660 1680 1700 483 VAL CLN LYS »*» _ _ ___ _ _ ATGTTCAGAAATAA GCTAATAAAA AAACACCTCg AAGCTGAGTC CGGCTATCAQ CITOGAGCTC ΟηΤΓΑΓΠΤ TTCAGCCCTA TGACMGGTC GGCATCAGCT 1720 1740 1760 1780 1800 GTCACAAATA CCCTATGCTG OCTGTCATAQ GTGACAAATC COGCTTTTOg GCCCTTTGGC TTTTTCACAT CTCTGATTTT TGTATAATCA ACAGGCACGG AGCCGCAATC TTTOGCOTG 1820 IB40 1860 1880 1900 1920 GAAAAATAAC CGGOCATOGT AGCTGCTTCC AATATGGATT GTTCATCGGG ATCGCTGCTT TTAATCACAA CGTGGGATCC 1940 1960 I960 2000 KUVIO 3b.

r 15 6481 4

m -67 K

asr·· 3§jj|v\ . — 4 3 K

:¾^ .# ^ ***** r1 - 1 j '· ! - -:--¾ a :.i - >. s

»I

KUVIO 4. CX-amylaasiproteiinin SDS-PAGE

geelielektroforeettinen analyysi.

Kaivo 1: B. subtilis IHO 6064 + plasmidi pKTH 10;

Kaivo 2: B. subtilis IHO 6064 ilman plasmidia;

Kaivo 3: B. amyloliquefaciens;

Kaivo 4: M -standardit, r 16 6481 4 1¾ · ^ ' * ’ - , ' · * ' . i·.* KUVIO 5. Immunodiffuusiokoe.

Keskuskaivo A: kaupalliselle B. amyloliquefaciens -C\-amylaasille tuotettu antiseerumi;

Keskuskaivo B: B. subtiliksen Λ-amylaasille tuotettu antiseerumi;

Kaivo 1; kaupallinen Sigma A6380 ^-amylaasi;

Kaivo 2: B. amyloliquefaciens viljelmän supernatantti; Kaivo 3; B. subtilis IHO 6064-viljelmän supernatantti; Kaivo 4; B. subtilis- cX-amylaasi.

ί,γΜ:^'

Claims (5)

1. 6481 4
2. 1. Menetelmä valkuaisaineen tuoton tehostamiseksi Bacillus-suvun bakteereissa, liittämällä Bacillus-suvun 5 bakteerin erittyvän valkuaisaineen geeni yhdistelmä-DNA-tekniikalla Bacillus-suvun bakteereissa esiintyvään plas-midimolekyyliin, transformoimalla Bacillus-suvun isäntä-bakteeri, kuten Bacillus subtilis, saadulla yhdistelmä-DNA-molekyylillä ja viljelemällä transformoituja baktee-10 reja erittyvän valkuaisaineen tuottamiseksi, tunnet-t u siitä, että plasmidiin liitetty erittyvän valkuaisaineen geeni on Bacillus amyloliquefaciens'in ot-amylaasin geeni, ja että plasmidi on Bacillus-suvun bakteereissa useana kopiona esiintyvä plasmidimolekyyli, kuten pUB 110. 15 2. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on saatu liittämällä Bacillus amylolique-faciens'in (X-amylaasin geeni yhdistelmä-DNA-tekniikalla Bacillus-suvun bakteereissa useana kopiona esiintyvään plasmidimolekyyliin, kuten plasmidiin pUB 110.
3. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmä-DNA- molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää seu-raavan emäsjärjestyksen, tai osan siitä: 6481 4 AAGCCCCGCA CATACGAAAA GACTGGCTGA AAACATTGAG CCTTTGATGA CTGATGATTT TTCGGGGCGT GTATGCTTTT CTGACCGACT TTTGTAACTC GGAAACTACT GACTACTAAA GGCTGAAGAA GTGGATCGAT TGTTTGAGAA AAGAAGAAGA CCATAAAAAT ACCTTGTCTG CCGACTTCTT CACCTAGCTA ACAAACTCTT TTCTTCTTCT GGTATTTTTA TGGAACAGAC
4. 5 TCATCAGACA GGGTATTTTT TATGCTGTCC AGACTGTCCG CTGTGTAAAA ATAAGGAATA AGTAGTCTGT CCCATAAAAA ATACGACAGG TCTGACAGGC GACACATTTT TATTCCTTAT AAGGGGGGTT GTTATTATTT TACTGATATG ΤΛΛΑΛΤΛΤΑΑ TTTGTATAAG AAAATGAGAG TTCCCCCCAA CAATAATAAA ATGACTATAC ΛΤΤΤΤΑΤΑΤΤ AAACATATTC TTTTACTCTC GGAGAGGAAA CATGATTCAA AAACGAAAGC GGACAGTTTC GTTCAGACTT GTGCTTATGT 10 CCTCTCCTTT GTACTAAGTT TTTGCTTTCG CCTGTCAAAG CAAGTCTGAA CACGAATÄCA GCACGCTGTT ATTTGTCAGT TTGCCGATTA CAAAAACATC AGCCGTAAAT GGCACGCTGA CGTGCGACAA TAAACAGTCA AACGGCTAAT GTTTTTGTAG TCGGCATTTA CCGTGCGACT TGCAGTATTT TGAATGGTAT ACGCCGAACG ACGGCCAGCA TTGGAAACGA TTGCAGAATG 15 aGGtGataaa acttaCCATATGCGGCTTGC TGCCGGTCGT AACCTTTGCT AACGTCTTAC ATGCGGAACA TTTATCGGAT ATCGGAATCA CTGCCGTCTG GATTCCTCCC GCATACAAAG TACGCCTTGT AAATAGCCTA TAGCCTTAGT GACGGCAGAC CTAAGGAGGG CGTATGTTTC GATTGAGCCA ATCCGATAAC GGATACGGAC CTTATGATTT GTATGATTTA GGAGAATTCC CTAACTCGGT TAGGCTATTG CCTATGCCTG GAATACTAAA CATACTAAAT CCTCTTAAGG
5. 20 AGCAAAAAGG GACGGTCAGA ACGAAATACG GCACAA TCGTTTTTCC CTGCCAGTCT TGCTTTATGC CGTGTT jossa nuoli osoittaa Οί-amylaasigeenin signaalisekvenssin aloituskodonin, ja jossa tätä seuraava OL-amylaasigeeniä koodittava sekvenssi on alleviivattu. 6481 4