CN102965387A - Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法，主要包括以下步骤：克隆hPTN基因，得质粒hPTN/pMD20-T；构建原核表达载体，得重组载体pET32a(+)/hPTN；将重组载体转化到大肠杆菌宿主中，得到大肠杆菌表达菌株转化子；将所得转化子经IPTG诱导得Trx-hPTN融合蛋白；利用镍亲和层析、PBS透析和超滤浓缩纯化，得纯度90%以上的Trx-hPTN融合蛋白。本发明所述的生产方法，利用pET32-a(+)作为载体、优化组合诱导表达条件，最终可高效表达可溶Trx-hPTN融合蛋白的方法，既保证了Trx-hPTN融合蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。

Description

Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及一种Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法。

背景技术

多效生长因子（pleiotrophin，PTN）最早是从牛的子宫中发现的，对成纤维细胞具有微弱增殖作用的一种肝素结合细胞因子。PTN基因包含5个外显子及一个小的非翻译的外显子，编码168个氨基酸，其中包括一个与分泌有关的32个氨基酸组成的信号肽识别序列，最终分泌的具有生物功能的成熟蛋白由136个氨基酸残基组成。研究表明其具有多种信号功能，包括促进神经系统的发育和胶质母细胞的特异性分化，促进血管发生，刺激细胞增殖和迁移、促进神经系统及骨发育等功能。

PTN正常表达于胚胎期，在成年的健康组织中很少表达，但目前已发现包括乳腺癌在内的多种肿瘤中都有PTN的高表达及内源性PTN的持续活化。PTN是一种肿瘤相关信号因子已被越来越多的研究证实，其在不同类型乳腺癌中的表达也有大量报道。PTN的生物学活性分别由3种独立的受体介导：

SDC3(N-Syndecan)、受体蛋白酪氨酸磷酸酶和间变性淋巴瘤激酶。在PTN刺激15min后的细胞中，β-catenin与E-cadherin免疫共沉淀显著地减少，从而导致细胞间黏附力降低，该作用是由PTN调节β-catenin的酪氨酸磷酸化水平而引起的。而这种细胞间黏附力的减弱恰恰是肿瘤从原位走向侵袭和转移的开始。研究发现，PTN/RPTPβ/ζ信号通路能活化下游的黏附因子和PI3K通路，抑制肺癌细胞的迁移。综上所述，PTN可通过下游信号通路调节包括MMP在内的多种靶基因的表达，从而促进乳腺癌的浸润和转移。

科学家日前通过实验确认，多效生长因子可促进造血干细胞扩张和再生。他们将多效生长因子注入骨髓生长被抑制的实验鼠体内，后者的骨髓干细胞生长速度与未注射多效生长因子的实验鼠相比提高了10倍，而且不会导致实验鼠出现癌变。这项成果将来有望使更广泛的人群受益于脐带血移植，对正在接受化疗或放疗的患者而言，利用多效生长因子进行治疗或许具有加速患者血液和免疫系统恢复的潜力。

随着对人多效生长因子（human pleiotrophin，hPTN）作用机制的不断深入，人hPTN作为药物，其需求量将大大增加。目前，虽然该蛋白已利用大肠杆菌菌进行了表达，但它们的方法都存在诸多不足之处。例如：目标蛋白的表达量很低或表达产物通常以包涵体形式存在，要通过变性复性得复杂操作才能得到活性形式的hPTN，从而减少了活性蛋白的产率；其次以融合蛋白的形式进行了表达，但融合的片段分子量很大且影响到了表达的重组蛋白的生物活性，所以必须要切除融合的片段，而要将PTN蛋白、融合、未经切割的融合蛋白及加入的将融合片段与目标蛋白切除的相应蛋白酶分离开来需要很多的蛋白质纯化步骤，纯化的步骤多，蛋白质的得率就明显降低，且更可能导致目标产物的失活。因此，开发出一种可以大量、快速、低成本的制备具有生物活性的PTN蛋白是十分必要的。

发明内容

基于此，本发明提供一种Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法，根据该方法可获得大量稳定、可溶且具有生物活性的Trx-hPTN融合蛋白。

解决上述问题的技术方案如下：

一种Trx-hPTN融合蛋白的生产方法，主要包括以下步骤：

（1）克隆hPTN基因：用特异引物扩增出完整的基因片段，所用hPTN特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒hPTN/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；

（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32a(+)和步骤（1）所得的质粒hPTN/pMD20-T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32a(+)/hPTN；

（3）大肠杆菌表达菌株转化子的筛选：利用T4DNA连接酶连接，将步骤（2）所得的重组载体pET32a(+)/hPTN转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32a(+)/hPTN；用热激法将重组载体pET32a(+)/hPTN转入到大肠杆菌表达菌株Rosetta中，LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组质粒pET32a(+)/hPTN的大肠杆菌表达菌株转化子；

（4）Trx-hPTN融合蛋白的表达：将步骤（3）所得的大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD₆₀₀为0.4-0.8时加入浓度为0.05-1.0mM的IPTG，于25-37℃诱导4-10小时，超声破碎，离心取上清液，得到重组融合蛋白Trx-hPTN；

（5）Trx-hPTN融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析对Trx-hPTN融合蛋白进行纯化。

在其中一些实施例中，步骤（1）所述特异引物为：

PTN-上游引物：5’-GCGGATCCATGCAGGCTC AACAGTACCAG-3’；

PTN-下游引物：5’-GCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGTTTC-3’。

在其中一些实施例中，步骤（3）所述的表达菌株为大肠杆菌Rosetta。

在其中一些实施例中，步骤（5）所述的镍亲合层析方法中：所用的洗脱液为100-400mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液；所得Trx-hPTN融合蛋白的纯度为90%以上。

在其中一些实施例中，步骤（5）所述的Trx-hPTN融合蛋白的纯化方法为利用镍亲合层析对Trx-hPTN融合蛋白进行纯化，然后再采用PBS透析和超滤浓缩。

在其中一些实施例中，步骤（5）所述的镍亲合层析方法中：所用的洗脱液为含有400mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液。

本发明所述的一种Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法具有以下优点：

一是利用pET32-a(+)载体和菌株Rosetta，实现了表达产物与增溶因子Trx融合，得到大量可溶形式的Trx-hPTN融合蛋白；

二是在该表达系统内，Trx-hPTN融合蛋白按适当的方式折叠，并保持天然构象；三

是摸索出一条有效纯化活性重组Trx-hPTN的方法；

四是测定了大肠杆菌表达的Trx-hPTN融合蛋白的生物活性，测定结果表明：细胞增殖试验和信号通路激活实验都证明表达的Trx-hPTN融合蛋白具有很好的生物活性。

附图说明

图1为hPTN基因PCR结果示意图；

图2为载体构建示意图；

图3为表达载体的酶切验证图；

图4为表达产物的优化图；

图5为表达产物的纯化过程的优化；

图6为纯化蛋白经透析和超滤浓缩后的结果及WB验证图；

图7为重组蛋白的质谱验证结果；

图8为表达产物的活性测定；

图9为密码子未经优化的转化子经诱导后的可溶性蛋白的表达情况。

具体实施方式

实施例1

本发明选用大肠杆菌表达菌株Rosetta、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32-a(+)均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1）LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2）LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的氨苄青霉素（Ampicillin），充分混均后倒板，4℃避光保存；

3）LB/Amp培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Ampicillin（100mg/ml），充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4）50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/LEDTA（pH 8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5）50mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6）5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl（pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装（约500μL每份）后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8）考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-2500.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9）考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存；

本实施例所述的一种Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法，主要包括以下步骤：

（1）克隆hPTN基因：根据人PTN基因成熟蛋白的一级结构，按大肠杆菌的密码子偏好性，人工合成了成熟PTN基因。用hPTN特异引物扩增出完整人重组hPTN基因片段，所用hPTN特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，RT-PCR条件为：95℃预变性，4min，一个热循环；94℃热变性30s，55℃褪火30s，72℃延伸45s，34个热循环；72℃复性10min。所获得的扩增片断连接到pMD20-T载体（购自于广州TAKARA公司），得质粒hPTN/pMD20-T，用PCR、酶切和核酸测序鉴定，测定序列与人工合成的hPTN的DNA序列一致。

人工合成的hPTN基因的DNA序列如下：

SEQ ID NO:1：

GGGAAGAAAGAGAAACCAGAAAAGAAAGTGAAGAAGTCTGACTGTGGA

GAATGGCAGTGGAGTGTGTGTGTGCCCACCAGTGGAGACTGTGGGCTGG

GCACACGGGAGGGCACTCGGACTGGAGCTGAGTGCAAACAAACCATGAA

GACCCAGAGATGTAAAATCCCCTGCAACTGGAAGAAGCAATTTGGCGCG

GAGTGCAAATACCAGTTCCAGGCCT GGGGAGAATGTGACCTGAACACAG

CCCTGAAGACCAGAACTGGAAGTCTGAAGCGAGCCCTGCACAATGCCGA

ATGCCAGAAGACTGTCACCATCTCCAAGCCCTGTGGCAAACTGACCAAGC

CCAAACCTCAAGCAGAATCTAAGAAAAAGAAAAAGGAAGGCAAGAAAC

AGGAGAAGATGCTGGAT

PCR扩增引物为：

SEQ ID NO:2：

PTN-上游引物：5’-GCGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCAG-3’（斜体加下划线部分序列代表BamH I位点）；

SEQ ID NO:3：

PTN-下游引物：5’-GCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGTTTC-3’（斜体加下划线部分序列代表Hind III位点）；

PCR结果示意图如图1所示。

（2）构建原核表达载体

①用Hind III和BamH I双酶切重组质粒hPTN/pMD20-T，获得目的片断hPTN，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

②用Hind III和BamH I双酶切pET32a(+)，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

③由①及②步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；构建示意图见图2。

④回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，反应体系如下：

得重组载体pET32a(+)/hPTN。

（3）大肠杆菌表达菌株转化子的筛选

①转化重组载体至大肠杆菌TOP10

pET32a(+)/hPTN连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布LB Amp平板，37℃恒温培养箱中培养12小时；挑取培养板上长出的转化子，接入5mLAmp+/LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，提取重组质粒；对来自不同单克隆菌落的重组质粒进行酶切，15μL酶切体系：

酶切条件：37℃水浴，3h。

酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定克隆结果，表达载体的酶切验证图，如图3所示。

②转化重组载体至大肠杆菌表达菌Rosetta

将阳性克隆的重组载体pET32a(+)/hPTN热激转化到大肠杆菌Rosetta感受态细胞，涂板，37℃恒温培养箱中培养12小时，即LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32a(+)/hPTN的Rosetta转化子。

（4）Trx-hPTN融合蛋白的表达：奖得到的大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD₆₀₀为0.4－0.8时加入浓度为0.05mM-1.0mM的IPTG，25-37℃诱导4小时以上（根据成本，可为4-10小时），诱导表达重组蛋白体，表达产物的优化图，如图4所示。

可溶表达诱导条件的优化：

得到的大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD₆₀₀为0.5时，分别加入0mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM和1.0mM的IPTG，于25-37℃诱导5小时，超声破碎后，离心取上清液，加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析，确定IPTG的浓度为0.05mM-1.0mM时（图4所示），都可以得到可溶性Trx-hPTN融合蛋白的较高水平表达；为节约成本，缩短生产周期，我们采用低浓度的IPTG（0.05-0.1mM）进行诱导表达，菌体最佳收获期为诱导5小时左右；而没有经过优化的人PTN基因的大肠杆菌转化子的Trx-hPTN融合蛋白量无法从SDS-PAGE胶中观察到（图9）。

（5）Trx-hPTN融合蛋白的纯化

经扩大培养和诱导表达（37℃，0.05mM IPTG诱导5小时），收集经IPTG诱导后的表达菌的菌体，将菌体重悬液于50ml缓冲液A（50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0）用超声破碎仪进行破碎，功率300W，破碎5s，间隙9s，90次；破碎后的菌液进行离心，4℃，30000g，15min；离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；经100ml缓冲液B（50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20-40mM咪唑和0.5-1.0%Triton X-114，pH 8.0，先于冰浴上预冷至0-4℃）漂洗蛋白纯化柱子后（以上操作均在4℃的环境中开展），加入不同浓度咪唑的（40mM、60mM、80mM、100mM、200mM和400mM）缓冲液C（50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH 8.0）将蛋白洗脱下来，利用400mM的咪唑可以得到纯度达90%的重组蛋白，融合蛋白的分子量约为35-40kDa，表达产物的纯化过程的优化如图5所示；所得蛋白经WB分析，WB结果表明，该蛋白是Trx-hPTN融合蛋白，融合蛋白的分子量约在35-40kDa之间（图6所示）。以上蛋白经PBS透析后，超滤浓缩7-10倍，经上述纯化步骤，1L诱导表达的菌液可纯化得到约10mg的重组蛋白（纯化效率如表1所示），纯度超过90%，纯化的蛋白质经质谱分析，进一步证明该蛋白就是Trx-hPTN融合蛋白（图7所示）。

表1Trx-hPTN融合蛋白和纯化效率表

（6）Trx-hPTN融合蛋白的生物学活性分析

（A）将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）于10cm细胞培养板中，在含20%FBS的M199培养基中培养至细胞密度达90%以上（培养基中加入了L-Glutamine2mM，ECGS 100μg/ml，肝素40U/ml）。PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶消化1分钟，终止消化并加入含20%FBS的M199培养基，并将细胞制成细胞悬液；800rpm离心5min后收集细胞，向收集的细胞中加入含20%FBS（经CM阳离子柱处理过的）的M199培养基（L-Glutamine 2mM，肝素40U/ml），调节细胞密度至1-2×10⁵cell/ml。将上述细胞悬液加至96孔板中，每孔加100μl，并向每孔中加入不同浓度的Trx-hPTN融合蛋白。将细胞培养板于温箱中培养72h，向每个孔中加入10μl MTT，于温箱中培养4小时，吸去培养基，向每孔中加入100μl的DMSO，震荡10分钟后于575nm测定吸光值。细胞增殖实验表明，纯化得到的重组人Trx-hPTN融合蛋白具有促进人脐静脉内皮细胞增殖的功能。表明该方法测得的重组人Trx-hPTN融合蛋白具有生物活性（图8）。

（B）将人脐静脉内皮细胞于10cm细胞培养板中，在含20%FBS的M199培养基中培养至细胞密度达90%以上（培养基中加入了L-Glutamine 2mM，ECGS100μg/ml，肝素40U/ml）。PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶消化1分钟，终止消化并加入含20%FBS的M199培养基（培养基中加入了L-Glutamine 2mM，ECGS 100μg/ml，肝素40U/ml），并将细胞制成细胞悬液。将细胞悬液于6孔板中培养至细胞密度约为80-90%时，吸去培养基，仅加入M199培养液，于温箱中饥饿6小时。向上述各孔细胞中加入不同终浓度的Trx-hPTN融合蛋白，于细胞培养箱中培养30分钟后，加入100μL的RIPA裂解细胞，离心收集蛋白上清；每个时间分别做3个重复；收集的蛋白上清经测定浓度后，调整各样品蛋白至相同浓度，经10%SDS-PAGE后，转膜、封闭、一抗、二抗及显影；WB结果表明，在该浓度下经30分钟后Akt的磷酸化水平明显提高，该方法表达和纯化的Trx-hPTN融合蛋白能激活相关信号通路，表达纯化的产物具有生物活性（图8）。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种Trx-hPTN融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（1）克隆hPTN基因：用特异引物扩增出完整的基因片段，所用hPTN特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒hPTN/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；

（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32a(+)和步骤（1）所得的质粒hPTN/pMD20-T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32a(+)/hPTN；

（3）大肠杆菌表达菌株转化子的筛选：利用T4DNA连接酶连接，将步骤（2）所得的重组载体pET32a(+)/hPTN转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32a(+)/hPTN；用热激法将重组载体pET32a(+)/hPTN转入到大肠杆菌表达菌株Rosetta中，LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32a(+)/hPTN的大肠杆菌表达菌株转化子；

（4）Trx-hPTN融合蛋白的表达：将步骤（3）所得的大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD₆₀₀为0.4-0.8时，加入浓度为0.05-1.0mM的IPTG，于25-37℃诱导4-10小时，超声破碎，离心取上清液，得到重组融合蛋白Trx-hPTN；

（5）Trx-hPTN融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对Trx-hPTN融合蛋白进行纯化。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）所述hPTN特异引物为：

PTN-上游引物：5’-GCGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCAG-3’；

PTN-下游引物：5’-GCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGTTTC-3’。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（3）所述的表达菌株为大肠杆菌Rosetta。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（5）所述的镍亲合层析方法中：所用的洗脱液为含有100-400mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液；所得的Trx-hPTN融合蛋白的纯度为90%以上。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（5）所述的Trx-hPTN融合蛋白的纯化方法为利用镍亲合层析对Trx-hPTN融合蛋白进行纯化，然后再采用PBS透析和超滤浓缩。

6.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤（5）所述的镍亲合层析方法中：所用的洗脱液为含有400mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液。

7.根据权利要求1－6任一项所述的生产方法制得的Trx-hPTN融合蛋白。

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