CN116478257A - 一种基于新型载体蛋白偶联GnRH多肽制备生殖疫苗的方法及产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于新型载体蛋白偶联GnRH多肽制备生殖疫苗的方法及产品，所述载体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码所述载体蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2所示，将编码所述的载体蛋白的基因进行原核表达，再经亲和层析、阴离子交换层析纯化，TEV酶切去除标签蛋白，然后经亲和层析、过分子筛得到纯化的载体蛋白，最后与GnRH多肽的共价偶联，得到所述生殖疫苗，本发明制备的生殖疫苗具备避孕效果，且可大规模获得高质量、低成本的重组蛋白疫苗用于商业化。

Description

一种基于新型载体蛋白偶联GnRH多肽制备生殖疫苗的方法及 产品

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于新型载体蛋白偶联GnRH多肽制备生殖疫苗的方法，还涉及所述方法制备得到的产品。

背景技术

当今社会，人们对于宠物饲养的需求越来越多。为了避免宠物因性成熟在求偶季的相关性行为为饲主带来的困扰，例如雌性求偶的长时间鸣叫，雄性标记领地意识增强而导致的随处撒尿，而此时由于求偶期间激素水平的变化导致尿液中刺激性气味的明显增强等。此外，由于宠物无意的配种成功导致幼崽出生，及宠物年龄的增长导致的生殖相关疾病等，也将给饲主带来相关的经济压力。基于此，很多饲主都会选择对宠物进行绝育，通过手术形式，摘掉性腺。然而，通过该方式将永久性的致使宠物失去生殖能力，此外，该方式对于类似于狗这样较高智商的宠物在一定程度上也会导致其出现心理问题，进而影响饲主与宠物之间的关系。

促性腺激素释放激素(GnRH)是由下丘脑合成的促进动物性腺成熟的多肽荷尔蒙，其主要作用与生殖和性行为有关联。已有研究证明，抑制GnRH的释放在雌雄动物中均能起到避孕效果，此外GnRH的缺失也能用于治疗例如前列腺癌等恶性肿瘤中。因此，GnRH目前已被选用作为生殖疫苗进行开发。

重组蛋白疫苗是一类将病原体特征性多糖或多肽通过共价连接方式整合到载体蛋白所获得的合成疫苗。载体蛋白作为重组蛋白疫苗成功与否的关键，可激发T细胞依赖性的免疫反应，从而刺激Germinal center中的抗原呈递，促进Memory B细胞的分化筛选。目前，重组蛋白疫苗主要依赖CRM197(白喉毒素)、DT(人工制备的失活白喉毒素)、TT(甲醛处理的破伤风梭菌制备物)、OMP(外膜蛋白复合物)、PD(源自Haemophilus influenzae的表面脂蛋白)这5种载体蛋白。其中，仅有CRM197和PD是成分单一的重组蛋白。

CRM197是白喉毒素(DT)的无毒突变株，具有第52位甘氨酸被谷氨酸替代的单个突变，其毒性消失但仍保留与DT相同的免疫刺激特性。CRM197最初用白喉棒状杆菌生产，其产量低，还需要复杂的实验室条件来培养白喉杆菌菌株。目前，CRM197可在异源重组系统如大肠杆菌中生产，产量更高，其获得的CRM197在结构和免疫学上类似于白喉杆菌产物，可用于结合疫苗开发的载体。但是，由于其单一成分的优势，目前市面上绝大不得基于载体蛋白构建的疫苗皆采用CRM197及PD两类，进而致使相关疫苗的开发受限于载体蛋白的选择。因此，筛选新型载体蛋白，并成功研发相关疫苗显得尤为重要。

目前，虽然已有基于GnRH的生殖疫苗制备的相关报道，但是没有基于重组蛋白疫苗的生殖疫苗出现，尤其是基于新型载体蛋白的生殖疫苗尚未问世。而该类疫苗因其大规模、高质量、低成本生产使其在疫苗行业中具备一定的竞争优势，而基于新型载体蛋白的生殖疫苗的成功研发及投入使用也可以使得与基于CRM197载体蛋白的其他疫苗构建多联疫苗成为可能。此外，该类疫苗的面世将降低宠物用生殖疫苗的价格，使饲主的爱宠可不必经历手术过程就可达到避孕效果，而当饲主有能力、有意愿需要其爱宠具备生殖能力时，可随时恢复。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种载体蛋白；本发明的目的之二在于提供编码权利要求1所述载体蛋白的基因；本发明的目的之三在于提供一种基于所述载体蛋白偶联GnRH多肽制备生殖疫苗的方法；本发明的目的之四在于提供所述方法制备得到的生殖疫苗；本发明的目的之五在于提供所述生殖疫苗在雄性动物去势方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种载体蛋白，所述载体蛋白是基于CRM197衍生而来，所述载体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2、编码权利要求1所述载体蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3、一种基于所述载体蛋白偶联GnRH多肽制备生殖疫苗的方法，包含如下制备步骤：

将编码权利要求1所述的载体蛋白的基因进行原核表达，再经亲和层析、阴离子交换层析纯化，TEV酶切去除标签蛋白，然后经亲和层析、过分子筛得到纯化的载体蛋白，与GnRH多肽的共价偶联，得到所述生殖疫苗。

本发明优选的，所述原核表达的载体为pET-28a，所述原核表达的菌株为BL21(DE3)。

本发明优选的，所述共价偶联为使用戊二醛偶联。

本发明优选的，所述戊二醛的终浓度为体积百分比1％。

本发明优选的，所述GnRH多肽与载体蛋白摩尔比为30:1。

4、所述方法制备得到的生殖疫苗。

5、所述生殖疫苗在雄性动物去势方面的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明所制备的重组蛋白疫苗主要由基于毒性消失但仍保留与DT相同的免疫刺激特性的CRM197重组蛋白载体，经过EvoDesign算法重新设计而来。在本发明中，首先获得了5种不同的新载体蛋白序列及相关结构，随后验证了5种不同新型载体蛋白在小鼠中的抗体交叉反应及相应的滴度，最后确定了D3及D5可用于后续研究。通过对D3和D5的再次设计，本发明又获得了4中基于D3和D5的突变体，在进行了与CRM197交叉反应测试后，最终确定了D3M1作为本发明后续使用的新型载体蛋白，通过共价连接对生殖及性行为起到关键调节功能的GnRH多肽，最终获得新型疫苗。

为获得大规模、高纯度D3M1重组蛋白，本发明选取了原核表达系统表达制备D3M1重组蛋白。选取BL21(DE3)菌株作为表达D3M1重组蛋白的大肠杆菌菌株，使用pET-28a作为原核表达载体。待诱导表达获得大量菌株后，进行高压破碎，获得含有D3M1重组蛋白的细菌裂解混合液，经过亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化获得携带由亲和层析纯化标签的D3M1重组蛋白，随后使用TEV Protease对亲和层析纯化标签进行切割，进而获得D3M1重组蛋白及亲和层析纯化标签的混合物；接下来使用亲和层析去除混合物中的标签，结合凝胶过滤层析最终获得结构正确、高纯度的D3M1重组蛋白。

随后将对D3M1重组蛋白与GnRH多肽的高效偶联方式进行筛选。在本发明中，首先采用SMCC方法进行偶联，然而该方法经检测后仍存在大量为交联的多肽，致使疫苗产量降低，不适用于该发明；随后，又采用了EDC方式进行偶联，然而EDC偶联的发生需要将溶液pH调至4.5-5.0之间，但是D3M1在该pH条件下会出现蛋白析出，因此该偶联方式同样不适用本发明；最后，本发明采用戊二醛偶联方式进行尝试，结果显示使用该方法可获得处于混合状态的交联产物，因此该偶联方式适合该发明获得疫苗。

最后，本发明对经过上述步骤获得的D3M1与GnRH多肽偶联的生殖疫苗进行动物水平的评价。对4周龄雄性小鼠每2周共3次注射分别溶于SDA及MF59佐剂中的D3M1与GnRH偶联生殖疫苗(D3M1多肽)，待第3针注射2周后(D42)开始对免疫小鼠血清中的总IgG滴度及实验组雄性小鼠生殖能力进行测试。实验结果表明，与阴性对照PBS组相比，不论是溶于MF59佐剂还是SDA佐剂的D3M1多肽，均能在免疫小鼠体内产生高浓度总IgG滴度。此外，经D3M1多肽处理的雄鼠，较野生型完全丧失生殖能力，提示该疫苗在能够抑制生殖能力，起到避孕效果。

综上，经由本发明所述方式筛选获得的新型载体蛋白D3M1与GnRH多肽偶联的生殖疫苗具备避孕效果，且可大规模获得高质量、低成本的重组蛋白疫苗用于商业化。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同设计载体蛋白结构示意图(紫色代表氮端，红色代表碳端)；

图2为不同设计载体蛋白免疫小鼠抗体交叉反应及滴度测定(A，小鼠免疫及样本采集时间轴；B-F，D1-D5载体蛋白免疫小鼠抗体间交叉反应及滴度柱状图。D、F中红框所示为D3及D5抗体间交叉反应及滴度，结果显示该两种载体蛋白与CRM197之间的交叉反应较弱。)；

图3为CRM197与D3、D5不同突变体交叉反应测试(A，小鼠免疫及样本采集时间轴；B-F，CRM197、D3M1、D3M2、D5M1、D5M2与CRM197交叉反应柱状图。B、C中红框所示显示，D3M1载体蛋白与CRM197之间几乎无交叉反应。)；

图4为改造后的pET-28a质粒完整图谱；

图5为D3M1经亲和层析纯化后各组分蛋白含量胶图(箭头所示为目的蛋白)；

图6为阴离子交换层析纯化目的蛋白洗脱区域展示(A，阴离子交换层析纯化不同洗脱区间蛋白胶图展示；B，阴离子交换层析纯化不同洗脱区间蛋白峰图展示，红框所示区域为目的蛋白洗脱区域。)；

图7为经TEV Protease处理及亲和层析纯化前后蛋白胶图(箭头所示为目的蛋白)；

图8为凝胶过滤层析纯化目的蛋白洗脱区域展示(A，凝胶过滤层析纯化不同洗脱区间蛋白胶图展示；B，凝胶过滤层析纯化不同洗脱区间蛋白峰图展示。)；

图9为使用SMCC法偶联D3M1与多肽产物Ellman’s Reagent检测峰图(红色箭头所示为未被交联多肽位置)；

图10为pH4.5-5.0条件下D3M1蛋白析出(红框所示区域为析出的D3M1蛋白沉淀)；

图11为经戊二醛交联后的D3M1与GnRH产物电泳胶图(左边红色箭头所示为D3M1蛋白，中间列红色箭头所示为不同状态的D3M1与GnRH交联产物)；

图12为D3M1与GnRH多肽偶联生殖疫苗动物水平免疫测试分组及时间示意图(A，不同注射组中注射物简表；B，3次注射免疫时间示意图。)；

图13为D42各组免疫小鼠模型血清中总IgG滴度；

图14为经D3M1偶联GnRH多肽的生殖疫苗处理雄鼠丧失生殖能力。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明的具体实施方式主要包括新型载体蛋白设计及筛选，D3M1重组蛋白的表达及纯化，D3M1与GnRH多肽的高效共价偶联，及疫苗在动物水平的免疫效果评价。

实施例1、新型载体蛋白D3M1设计及筛选

本发明中采用的是由本实验室针对CRM197的结构框架进行的蛋白质重设计后产物，其重设计的CRM197变体毒性消失但仍保留与DT相同的免疫刺激特性，具备更好的稳定性和可溶性，并且其具备更加丰富的T细胞表位。基于EvoDesign算法进行设计，最终挑选5条设计序列及相关结构(图1)进行后续实验。经大肠杆菌异源表达后获得不同设计蛋白，随后对5条设计蛋白进行动物水平的抗体交叉反应和滴度检测。参考已发表文献，本发明在Day1，Day14分别在小鼠中注射总量为20μg的5种不同设计蛋白，并在D21取血进行下游检测。结果显示，5种设计中，Design3和5(D3和D5)与CRM197之间的交叉反应相对较弱(图2)。

随后又对D3和D5进行进一步改造，获得4种基于D3和D5的突变体D3M1、D3M2、D5M1、D5M2并开展相关动物测试，实验结果显示D3M1与CRM197之间几乎无交叉反应(图3)，最终确定了作为本发明后续使用的新型载体蛋白。因此本发明中使用的载体蛋白D3M1是经过筛选所得的新型载体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码D3M1的核酸序列如SEQ IDNO.2所示，该蛋白是基于CRM197衍射而来，并且与CRM197之间几乎无交叉反应，而基于该载体蛋白疫苗可以以基于CRM197蛋白构建的疫苗一起制备多联疫苗，进而得到进一步的应用。

实施例二、载体蛋白D3M1的原核表达与纯化

为获得大规模、高纯度D3M1重组蛋白，本发明选取了原核表达系统表达制备D3M1重组蛋白。选取BL21(DE3)菌株作为表达D3M1重组蛋白的菌株，使用改造的pET-28a作为原核表达载体序列，在本发明中将pET-28a表达载体具体改造方法为，在T7 promoter后面，利用XbaI及BamHI酶切位点，插入了6xHis-MBP tag及TEV site序列(改造后的质粒完整图谱见图4)。将SEQ ID NO.2所示的D3M1的核酸序列经由BamHI及NheI酶切位点克隆到改造后的pET-28a质粒中，转化BL21(DE3)菌株，待诱导表达获得大量菌株后，进行高压破碎，获得含有D3M1重组蛋白的细菌裂解混合液，经过亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化获得携带由亲和层析纯化标签的D3M1重组蛋白，随后使用TEV Protease对亲和层析纯化标签进行切割，进而获得D3M1重组蛋白及亲和层析纯化标签的混合物；接下来使用亲和层析去除混合物中的标签，结合凝胶过滤层析最终获得结构正确、高纯度的D3M1重组蛋白。

1、D3M1载体蛋白诱导表达

(1)取50μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞，冰上融化后加入50ng含D3M1的核酸序列(SEQ ID NO.2)的pET-28a质粒，轻轻混匀，冰上放置30分钟；

(2)42℃水浴热激45秒后置于冰上2min，该过程不要摇动离心管；

(3)向离心管中加入400μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于摇床37℃、220rpm培养45min，复苏细菌；

(4)室温2000rpm离心2min后去掉300μL上清，轻轻吹打混匀剩余培养基和细菌沉淀，滴在LB平板(Kanamycin 50μg/mL)上并涂布均匀，待干后倒置于37℃烘箱过夜；

(5)挑取平板上的单克隆菌落至5mL LB培养基(Kanamycin 50μg/mL)中，甘油菌则吸取10μL至培养基中，摇床37℃、220rpm过夜培养14-16h；

(6)1L LB培养基(Kanamycin 50μg/mL)于摇床中37℃预热，将Day 2的5mL菌液加入以扩大培养，37℃、220rpm培养至菌液OD₆₀₀＝1.0-1.2左右开始诱导；

(7)待摇床温度降至16℃，加入终浓度为0.2mM的IPTG(1L加入200μL的1M IPTG母液)诱导蛋白表达，16℃、220rpm过夜培养14-16h。

2、收样及高压破碎

(1)预冷大容量离心机至4℃，使用1L收菌桶来收集菌液，3800rpm离心15min；

(2)离心后弃上清，用20mL lysis buffer(25mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，0.5mM TCEP)重悬沉淀，再加入终浓度为1mM的PMSF；

(3)高压破碎仪工作温度设置为4℃，用ddH₂O冲洗进样杯和管道，再用上述lysisbuffer冲洗管道，将出样管冲洗干净后放到进样杯中；

(4)菌液倒入进样杯，开启循环系统，循环流速为45-50mL/min；

(5)加压至800bar(每次加压不超过100bar)裂解菌液，一般循环裂解2-4min；

(6)裂解完成后降低系统压力至0，并将进样杯中的裂解液转移出来，此时可见菌液会变成透亮状态；

(7)将裂解后的菌液转移至高速离心管中，高速离心机17000rpm、4℃条件下离心30min。

3、亲和层析纯化(Ni-NTA)

(1)Ni-NTA柱材用上述lysis buffer润洗；

(2)将上述高速离心后的上清液转移至干净的离心管中，向其中加入4mL(适量)润洗过的Ni-NTA柱，4℃孵育40min，孵育时将离心管置于旋转混匀仪上，旋转过程中以低转速和上清液不起气泡为标准；

(3)孵育完成后3000rpm、4℃条件下离心5min，吸去大部分上清液，留10mL上清液与下层柱材混匀后转移至重力柱中，待上清液全部流出重力柱后准备洗脱；

(4)往重力柱中加入wash buffer(25mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，20mMimidazole pH 8.0，0.5mM TCEP)洗脱Ni-NTA柱材结合的杂蛋白，wash buffer每次加入10mL，共洗脱3次；

(5)往重力柱中加入elution buffer(25mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，250mMimidazole pH 8.0，0.5mM TCEP)以洗脱目的蛋白，elution buffer每次加入2mL；

(6)用Bradford 1×Dye Reagent监测洗脱情况，即取5μL重力柱流下的洗脱液，加入到100μL 1×Reagent中，如果Reagent变蓝，则继续洗脱，Reagent不再变蓝时，表明目的蛋白基本上已经洗脱完；

4、取样检测

亲和层析完成后需取样跑胶，所取样品分别是：破碎离心后的沉淀(P，precipitation)和上清(S，supernatant)、与Ni-NTA柱材孵育后流出重力柱的上清液(Fl，Flow)、wash buffer洗脱(W，wash)和elution buffer洗脱下来的目的蛋白(E，elution)、洗脱后的Ni-NTA柱材(R，resin)。为判断洗脱下来的蛋白是否是目的蛋白，可取20μL洗脱液E并加入2μL 2mg/mL的TEV Protease室温孵育15min(+T)，TEV Protease对照(T)。取好的样品加入loading Buffer，95℃孵育3min后短暂离心并跑胶。其具体使用步骤如下：

(1)所需试剂：5×loading Buffer：250mM Tris-HCl(pH 6.8)、10％(W/V)SDS、0.5％(W/V)溴酚蓝、50％(V/V)甘油、5％(W/V)DTT；10×SDS-PAGE Running buffer(Tris30.2g，Glycine 144g，SDS 10g，加入ddH2O定容到1L)；

(2)上样完成后250V电压跑胶30min后染色；

(3)染色液配方：95％乙醇420mL，冰乙酸80mL，ddH2O 500mL，R250 2g，用水脱色后观察蛋白胶确定目的蛋白。

实验结果显示，在本发明中可获得异源表达D3M1重组蛋白，且经elution buffer洗脱获得蛋白含量最高(图5)。

5、阴离子交换层析纯化

(1)亲和层析完的D3M1蛋白均进行下一步离子交换层析纯化；

(2)洗脱下的蛋白用阴离子交换层析A buffer(25mM Tris-HCl pH 8.0，0.5mMTECP)稀释为原体积的4倍体积，稀释后用0.22μM滤膜过滤待上样；

(3)装好HiTrap Q阴离子交换柱(5mL)(注意不要有气泡)，将纯化仪A泵放入1MNaOH中，设置参数如下：

Manual→Execute→Pumps→System flow设置为5mL/min→Insert

Alarm→precolumn pressure→设置为0.5MPa→Insert

Other→timer→Acc.volumn→20ml→End→Insert→Execute

(4)用20mL 1M NaOH清洗A柱；

(5)将纯化仪A泵和B泵分别放入A buffer和B buffer(25mM Tris-HCl pH 8.0，0.5mM TECP，1M NaCl)中，选择程序“Q 5ml High low salt”以完成Q柱平衡；

(6)此时电导率(ms/cm)应低于2，若电导率较高，程序设置如下：

Manual→Execute→Pumps→System flow设置为5mL/min→Insert

Alarm→precolumn pressure→设置为0.5MPa→Insert

Other→timer→Acc.volumn→15ml→Pause→Insert→Execute

(7)用A buffer再冲洗15mL后暂停；

(8)将A泵放入稀释过滤好的样品中上样，样品以5mL/min的流速与HiTrap Q离子交换柱结合，收集Q柱的流出液(Wa，waste)，具体参数如下：

Continue→Other→timer→Acc.volumn→45mL(稍少于样品体积)→insert

(9)暂停后手动上样(按仪器上的开始和结束键)至结束，切记勿吸入气泡。用ddH₂O水清洗A泵后放回至A buffer中，停止此时程序；

(10)纯化仪收样圆盘摆好EP管(一般为60个)后放在纯化仪下方接样器上。选择纯化仪设置好的“Q 5ml Elution”程序(100mL洗脱体积，B buffer线性增加，由0增加至100％，1.5mL/tube)→命名文件→Start；

(11)当电导率超过60ms/cm时(此时大部分目的蛋白已经洗脱出来)，设置Pump→Gradient→Target:100％B，length:0CV→Execute，即直接以100％ B buffer高盐溶液冲洗Q柱。

采用阴离子交换层析进一步获取高纯度目的蛋白，结果表明可在31-36区间获得高浓度目的蛋白(图6)。

6、TEV酶酶切

将离子交换的组分转移至50mL离心管中，按10mL 100mAU离子交换层析图峰值加入100μL TEV Protease(2.0mg/mL)(按mAU值等比例放大加入酶的体积)于4℃酶切4-8h。

7、亲和层析去除His-MBP标签蛋白

(1)取两根用lysisi buffer润洗过的Ni-NTA柱材的重力柱，将酶切后的蛋白液加入重力柱使其流出(Fl，flow)，过完第一根柱子后过第二根；

(2)往重力柱中加入4-8mL wash buffer使其流出(W，wash)，洗脱完成后取样；

(3)酶切前混合液(Mix)、TEV Protease处理样品(+T)及Fl、W样品取10μL加入10μL2×loading Buffer后跑胶分析。

实验显示经亲和层析纯化可获得高纯度的去除亲和标签的目的蛋白(图7)。

8、凝胶过滤层析

(1)将上述步骤的Fl和W样品合并后加入30kD超滤管中，3200-3800rpm在4℃条件下离心浓缩至2mL，将浓缩管中的样品转移至2mL EP管中，15000rpm、4℃离心5min去除样品内气泡；

(2)分子筛平衡，使用Superdex Increase 200分离柱，点击A pump wash冲洗A泵，再安装好分离柱，使用前应用分子筛buffer(lysis buffer)平衡分离柱，设置如下：

Manual→Execute→Pumps→System flow设置0.5ml/min→Insert

Alarm→precolumn pressure→设置1.8MPa→Insert

Other→timer→Acc.volumn→30ml→End→Insert→Execute。

(3)分离柱平衡完成后上样，先用ddH2O冲洗adapter，再用2mL注射器吸入分子筛buffer冲洗2mL loop(尽量避免气泡进入)；

(4)注射器吸取2ml离心后的样品，轻轻打入loop中，避免气泡进入，纯化仪收样圆盘摆好EP管(一般为35个)后放在纯化仪下方接样器上，选择纯化仪设置好的“Superdex200Increase”程序(0.5mL/min流速，0.5mL/tube)→命名文件→Start；

(5)待程序停止后，取样跑胶；

(6)将分子筛样品转移至30kD超滤管中，3200-3800rpm在4℃条件下离心浓缩至500μL，将浓缩管中的样品转移至1.5mL EP管中，15000rpm、4℃离心5min去除样品内气泡；

(7)使用BCA法测定蛋白浓度后分装蛋白，液氮速冻后保存在-80℃。

亲和层析纯化后的TEV Protease处理蛋白，还需经过凝胶过滤层析，即还需要过分子筛，才能获得最终用于疫苗生产的高纯度D3M1蛋白。实验结果显示，在本发明中所采用的纯化方式可在6-9区间获得高浓度目的蛋白(图8)

实施例二、GnRN多肽的合成

由商业合成公司合成GnRH多肽序列：pEHWSYGLRPGGC，用于后续疫苗生产。

实施例三、载体蛋白D3M1与GnRH多肽偶联

1、使用SMCC法进行D3M1与多肽偶联

(1)使用buffer 1(25mM Tris 8.0,150mM NaCl,0.5mM TCEP)打开二硫键；

(2)使用Gel filtration换成buffer 2(PBS 7.2,0.5mM EDTA)；

(3)加入D3M1蛋白5.0mg/ml,800μl；Sulfo-SMCC 2.5mg/ml,200μl；15倍质量比的GnRH多肽，室温(25℃)孵育上述混合液60分钟；

(4)透析过夜用以去除Sulfo-SMCC；

(5)使用Ellman’s Reagent检测未交联的-SH。

2、使用EDC法进行D3M1与多肽偶联

(1)D3M1溶解在偶联缓冲液(0.1M MES，pH4.5-5.0)，终浓度5mg/mL；

(2)将待偶联多肽溶解在偶联缓冲液(0.1M MES，pH4.5-5.0)，终浓度2mg/ml；

(3)D3M1和多肽溶液混合，多肽与载体蛋白摩尔比为10:1；

(4)将EDC在偶联缓冲液中配制成2mg/mL；

(5)缓慢滴加EDC溶液(EDC滴加的摩尔量与多肽相同)，25℃反应2h。

3、使用戊二醛法进行D3M1与多肽偶联

(1)将D3M1溶解在偶联缓冲液(0.1M碳酸盐，0.15M NaCl，pH8.5)，终浓度2mg/mL；

(2)将待偶联多肽溶解在偶联缓冲液中，终浓度2mg/mL；

(3)将D3M1和多肽溶液混合，多肽与载体蛋白摩尔比为30:1；

(4)加入戊二醛至终浓度为1％，4℃反应过夜。

本实施例对D3M1重组蛋白与GnRH多肽的高效偶联方式进行了筛选，首先采用SMCC方法进行偶联，然而该方法经Ellman’s Reagent检测后显示仍存在大量为交联的多肽(图9)，致使疫苗产量降低，不适用于本发明；随后，又采用了EDC方式进行偶联，然而EDC偶联的发生需要将溶液pH调至4.5-5.0之间，但是D3M1在该pH条件下会出现蛋白析出(图10)，因此该偶联方式同样不适用本发明；最后，本发明采用戊二醛偶联方式进行尝试，结果显示使用该方法可获得处于混合状态的交联产物(图11)，因此该偶联方式适合该发明获得疫苗。

实施例四、疫苗在动物水平的免疫效果评价

本发明对经过上述步骤获得的D3M1与GnRH多肽偶联的生殖疫苗进行动物水平的评价。对4周龄雄性小鼠每2周共3次腹腔注射分别溶于SDA及MF59佐剂中的D3M1与GnRH偶联生殖疫苗(D3M1多肽)20μg，待第3针注射2周后(D42)开始对免疫小鼠血清中的总IgG滴度及实验组雄性小鼠生殖能力进行测试(图12)。实验结果表明，与阴性对照PBS组相比，不论是溶于MF59佐剂还是SDA佐剂的D3M1多肽，均能在免疫小鼠体内产生高浓度总IgG滴度(图13)。该实验结果说明，D3M1与GnRH多肽偶联的生殖疫苗可以在动物水平获得高水平的免疫结果。

4周龄雄性小鼠于第28天注射完第三针后2周(D42)与未处理的、年龄在8-10周龄的野生型雌鼠以1：1密度进行合笼。合笼3-4周后观察并计算各组雌鼠产仔量，进行相关实验分析。结果显示，经D3M1偶联GnRH多肽的生殖疫苗处理雄鼠，较于野生型完全丧失生殖能力(图14)，提示该疫苗在能够抑制生殖能力，起到避孕效果。

综上，经由本发明所述方式筛选获得的新型载体蛋白D3M1与GnRH多肽偶联的生殖疫苗具备避孕效果，且可大规模获得高质量、低成本的重组蛋白疫苗用于商业化。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.一种载体蛋白，其特征在于：所述载体蛋白是基于CRM197衍生而来，所述载体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述载体蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示。

3.一种基于权利要求1所述载体蛋白偶联GnRH多肽制备生殖疫苗的方法，其特征在于，包含如下制备步骤：将编码权利要求1所述的载体蛋白的基因进行原核表达，再经亲和层析、阴离子交换层析纯化，TEV酶切去除标签蛋白，然后经亲和层析、过分子筛得到纯化的载体蛋白，最后与GnRH多肽的共价偶联，得到所述生殖疫苗。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述原核表达的载体为pET-28a，所述原核表达的菌株为BL21(DE3)。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述共价偶联为使用戊二醛偶联。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述戊二醛的终浓度为体积百分比1％。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述GnRH多肽与载体蛋白摩尔比为30:1。

8.权利要求4～7任一项所述方法制备得到的生殖疫苗。

9.权利要求8所述生殖疫苗在雄性动物去势方面的应用。