CN116003537A

CN116003537A - 一种弹状病毒重组g蛋白、包括其的重组细胞及其应用

Info

Publication number: CN116003537A
Application number: CN202310031757.6A
Authority: CN
Inventors: 李中圣; 罗律; 马俊; 曹梦蕊; 刘文娜
Original assignee: Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Current assignee: Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Priority date: 2023-01-10
Filing date: 2023-01-10
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2043-01-10
Also published as: CN116003537B

Abstract

本发明公开了一种弹状病毒重组G蛋白、包括其的重组细胞及其应用，涉及生物技术领域。弹状病毒重组G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其具有很好的免疫原性，能够刺激机体产生较高的抗体水平，从而使机体能够有效抵御弹状病毒。用于饲喂小鼠、杂交鳢和大口黑鲈，均能够刺激机体产生高水平特异性抗体。对杂交鳢和大口黑鲈的相对保护率分别达81.8％和67.8％。

Description

一种弹状病毒重组G蛋白、包括其的重组细胞及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种弹状病毒重组G蛋白、包括其的重组细胞及其应用。

背景技术

近年来，随着消费升级和养殖技术进步，鳜鱼、鲈鱼、乌鳢、笋壳鱼等“特种鱼”的消费增幅明显。但淡水养殖的病害问题一直是限制水产养殖规模化的关键因素，特种鱼原发病按照病原种类分为寄生虫病、细菌病和病毒病，鱼类病毒病有品种差异性、种类多、病原复杂、无特效防控手段。弹状状病毒是特种鱼养殖的重要病原之一，其感染宿主包括鳜鱼、鲈鱼、乌鳢、笋壳鱼、鳗鱼等，弹状病毒可感染各年龄段的鱼，对1克以内幼鱼致死率可达80％以上，主要症状为体色发黑，停止摄食，病鱼在水面窜游，有些做翻转游动，停靠池边后死亡，对病鱼解剖发现肝脾肿大出血。

疫苗免疫是预防弹状病毒感染的最有效途径，鱼苗期无法注射免疫，单独的浸泡免疫需要活毒及多次免疫，成本高、可操作性差。在多种免疫方案中，口服免疫具有大规模免疫方便的优势。因此，提供一种能够有效免疫弹状病毒的疫苗很重要。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种弹状病毒重组G蛋白，能够有效提高鱼类对弹状病毒的免疫应答。

本发明还提供编码上述弹状病毒重组G蛋白的核酸分子。

本发明还提供表达上述弹状病毒重组G蛋白的重组载体。

本发明还提供用于表达弹状病毒重组G蛋白的重组细胞。

本发明还提供重组细胞的制备方法。

本发明还提供上述弹状病毒重组G蛋白/核酸分子/重组载体/重组细胞在制备用于预防病毒感染、防治病毒相关疾病的产品中的应用。

本发明还提供用于预防病毒感染、防治病毒相关疾病的产品。

根据本发明的第一方面实施例的一种弹状病毒重组G蛋白，所述弹状病毒重组G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明实施例的弹状病毒重组G蛋白，至少具有如下有益效果：

实施例的弹状病毒重组G蛋白具有很好的免疫原性，能够刺激机体产生较高的抗体水平，从而使机体能够有效抵御弹状病毒。用于饲喂小鼠、杂交鳢和大口黑鲈，均能够刺激机体产生高水平特异性抗体。对杂交鳢和大口黑鲈的相对保护率分别达81.8％和67.8％。

根据本发明的第二方面实施例的编码本发明第一方面实施例所述的弹状病毒重组G蛋白的核酸分子。

根据本发明的一些实施例，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的第三方面实施例的一种表达本发明第一方面实施例所述的弹状病毒重组G蛋白的重组载体。

根据本发明的一些实施例，所述重组载体包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在克隆载体或表达载体的多克隆位点插入所述弹状病毒重组G蛋白的编码基因，得到的重组载体。

根据本发明的一些实施例，所述重组载体具体可为pET系列载体。

根据本发明的第四方面实施例的一种用于表达弹状病毒重组G蛋白的重组细胞，所述重组细胞包括本发明第三方面实施例所述的重组载体。

根据本发明的一些实施例，所述重组细胞为将所述重组载体导入出发细胞得到的重组细胞。

根据本发明的一些实施例，所述重组细胞为原核细胞或真核细胞。

根据本发明的一些实施例，所述原核细胞可以为细菌或藻。

根据本发明的一些实施例，所述原核细胞包括重组枯草芽孢杆菌。

根据本发明的一些实施例，所述真核细胞可以为酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。

能够表达本发明第一方面所述的重组G蛋白的枯草芽孢杆菌及其诱导表达的重组G蛋白可作为口服疫苗抗原，用于激发淡水鱼对弹状病毒的免疫应答。且通过枯草芽孢杆菌表达的重组G蛋白产量高。枯草芽孢杆菌作为口服疫苗抗原，其还具有安全性好、成本低的优点。而利用全病毒培养、哺乳动物细胞及昆虫细胞重组表达虽然可制备出具有完整生物学活性的G蛋白，但是用于口服免疫的成本高、应用推广难；由大肠杆菌表达的重组G蛋白主要以包涵体形式存在，制备蛋白抗原须经去内毒素、蛋白变性和复性、亲和层析等多项工艺，制备工艺复杂；乳酸菌对重组G蛋白的表达量低；酵母虽然表达重组G蛋白的水平高，但是存在安全性差的问题。

根据本发明的第五方面实施例的本发明第四方面实施例所述的重组细胞的制备方法，包括以下步骤：

将本发明第三方面实施例所述的重组载体转化入目标细胞中。

根据本发明的第六方面实施例的(1)至(4)任一项在制备用于预防病毒感染、防治病毒相关疾病的产品中的应用，

(1)本发明第一方面实施例所述的弹状病毒重组G蛋白；

(2)本发明第二方面实施例所述的核酸分子；

(3)本发明第三方面实施例所述的重组载体；

(4)本发明第四方面实施例所述的重组细胞。

根据本发明的第七方面实施例的一种用于预防病毒感染、防治病毒相关疾病的产品，所述产品包括本发明第一方面实施例所述的弹状病毒重组G蛋白、本发明第二方面实施例所述的核酸分子、本发明第三方面实施例所述的重组载体、本发明第四方面实施例所述的重组细胞、本发明第四方面实施例所述的重组细胞的发酵产物、本发明第四方面实施例所述的重组细胞的发酵上清中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述重组细胞的发酵产物可按照包括如下步骤的方法制备：培养所述重组细胞，使弹状病毒重组G蛋白的编码基因表达，得到所述重组细胞的发酵产物。

根据本发明的一些实施例，所述重组细胞的发酵上清可按照包括如下步骤的方法制备：将所述发酵产物进行固液分离，弃去固相，即得所述重组细胞的发酵上清。

根据本发明的一些实施例，所述产品包括疫苗。

根据本发明的一些实施例，所述疫苗为口服疫苗，所述口服疫苗还包括鱼粉、肉骨粉、豆粕、面粉、血细胞蛋白粉、膨化大豆、磷酸二氢钙、赖氨酸、钙、磷、粗灰分、LTB溶液中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，按质量百分比计，按质量百分数，所述口服疫苗包括30-35％鱼粉、5-7％肉骨粉、17-21％豆粕、15-18％面粉、2-4％血细胞蛋白粉、3-6％膨化大豆、2-3％磷酸二氢钙、1-1.5％赖氨酸、1.5-1.9％钙、1.1-1.5％磷、6-8％粗灰分、1-1.5％LTB溶液。LTB溶液的浓度优选为2-7mg/mL；进一步优选为5mg/mL。

根据本发明的一些实施例，还可以采用湿法制粒设备用邻苯二甲酸乙酸纤维素(乙酸纤维素肽酸酯，CAP)包衣，常温烘干，得到丸剂。优选烘干时间为6～8小时。该丸剂可于2～8℃干燥6个月以上，性能无差异性变化。微丸结构和CAP包衣膜能够使蛋白抗原在口服时免受胃酸破坏，疫苗中有粘膜免疫增强剂LTB。

所述口服疫苗的用量为按照鱼重的1.5～1.8wt％投喂含20～25wt％所述口服疫苗的饲料。优选地，所述口服疫苗中的活菌数为10⁸CFU～10¹⁰CFU。进一步优选为10⁹CFU。

根据本发明的一些实施例，还可以通过食用胶水将微丸疫苗在饲料表面，便于饲喂。所述食用胶水包括但不限于褐藻酸钠溶液。所述褐藻酸钠溶液中，褐藻酸钠的质量浓度优选为3～5％。所述口服疫苗、食用胶水和饲料的质量比为1：1～2：4～5。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

图1是本发明一实施例的不同弹状病毒G蛋白编码基因进化关系分析结果；

图2是本发明一实施例的枯草芽孢杆菌表达系统的重组G蛋白的Western blot检测结果；其中，M为蛋白marker，1为未经诱导的pHT43-RdmG-WB800n菌体蛋白；2、3分别为pHT43-RdmG-WB800n经IPTG诱导4h后的培养基上清、菌体蛋白；泳道4、5分别为pHT43-RdmG-WB800n经IPTG诱导16h后的培养基上清、菌体蛋白；

图3是本发明一实施例的乳酸菌表达系统的重组G蛋白的Western blot检测结果；其中，M为蛋白marker，1为未经诱导的pNZ8149-RdmG-NZ9000菌体蛋白；2～5分别为不同克隆的pNZ8149-RdmG-NZ9000经Nisin诱导72h后的菌体蛋白；

图4是本发明一实施例的毕赤酵母表达系统的重组G蛋白的Western blot检测结果；其中，M为蛋白marker，1为未经诱导的pPIC9K-RdmG-X33菌体蛋白，2～10为经甲醇诱导48h后的不同pPIC9K-RdmG-X33克隆子的菌体蛋白；

图5是本发明一实施例的pHT43-RdmG-WB800n发酵优化结果；其中，M为蛋白marker，1为未经诱导的pHT43-RdmG-WB800n菌体蛋白，2、3分别为诱导4h后的pHT43-RdmG-WB800n培养基上清和菌体蛋白；4、5分别为诱导8h后的pHT43-RdmG-WB800n培养基上清和菌体蛋白，6、7分别为诱导12h后的pHT43-RdmG-WB800n培养基上清和菌体蛋白，8、9分别为诱导16h后的pHT43-RdmG-WB800n培养基上清和菌体蛋白；

图6是本发明一实施例的免疫组小鼠血清中和抗体检验结果；

图7是本发明一实施例的免疫组和对照组杂交鳢血清中弹状病毒G蛋白特异性抗体IgM的ELISA检测结果；*表示B.subtilis-G与Control相比，p<0.05，*表示B.subtilis-G与Control相比，p<0.01；

图8是本发明一实施例的免疫组杂交鳢血清中和抗体含量检验结果；

图9是本发明一实施例的免疫组和对照组杂交鳢的累积死亡率(Cumulativemortality)统计结果；

图10是本发明一实施例的免疫组和对照组大口黑鲈血清中弹状病毒G蛋白特异性抗体IgM的ELISA检测结果；*表示B.subtilis-G与Control相比，p<0.05，*表示B.subtilis-G与Control相比，p<0.01；

图11是本发明一实施例的免疫组大口黑鲈血清中和抗体含量检验结果；

图12是本发明一实施例的免疫组和对照组大口黑鲈的累积死亡率统计结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

若无特殊说明，本发明中“约”表示允许误差在±2％之内。

若无特殊说明，本发明中“常温”表示25±5℃。

不同来源弹状病毒的分离和同源性分析

用条纹月鳢细胞E11分离得到了不同鱼种的弹状病毒，包括：鳜鱼弹状病毒(SCRV)、大口黑鲈弹状病毒(MSRV)和杂交鳢弹状病毒(HSHRV)。病毒液经纯粹性和无菌鉴定，均合格。分别测定病毒滴度，SCRV为10^5.8TCID₅₀/0.1mL，MSRV为10⁶TCID₅₀/0.1mL，HSHRV为10^7.8TCID₅₀/0.1mL。

用特异性引物扩增SCRV、MSRV和HSHRV的G蛋白编码基因，测序后，与Genebank中报道的12个淡水鱼弹状病毒全序列进行合并分析，并利用Clustal Omga软件包分析不同来源弹状病毒G蛋白编码基因进化关系。

分析结果见图1。

不同弹状病毒同源性较高，为91％以上，SCRV和MSRV的G蛋白编码基因在同一分支，HSHRV位于邻近分支；HSHRV的G蛋白氨基酸序列与SCRV、MSRV的同源性分别为91.14％和93.7％；差异氨基酸残基为第13～15位、62～68位、99～101位、159～161位、186～196位、208-211位和345-351位氨基酸。

SCRV、MSRV和HSHRV的毒力测定

将SCRV、MSRV和HSHRV的原始毒株的病毒液分别按10⁰、10^-1、10^-2、10^-3和10^-4稀释，配制梯度稀释病毒液，每稀释度为一组，分别腹腔注射2～5g重的健康加州鲈，每尾鱼腹腔注射病毒液剂量为0.1mL，40尾/组。以注射等体积PBS的组作为对照组，培养水温控制在25～28℃，观察记录注射后加州鲈死亡情况，按Reed-Muench法计算半数致死量。

SCRV，MSRV和HSHRV均可感染加州鲈，但对加州鲈的致病性存在差异。SCRV的半数致死剂量为2.1×10^5.4TCID₅₀、MSRV的半数致死剂量为3.3×10^5.1TCID₅₀，HSHRV的半数致死剂量为2.7×10^4.9TCID₅₀。三种弹状病毒针对特定宿主的致病性差异，可能与部分毒力基因差异导致的宿主适应性有关。

杂交鳢弹状病毒G蛋白的重组表达和口服疫苗的制备

弹状病毒G蛋白位于病毒囊膜表面，与病毒对宿主细胞侵入、病毒组装和免疫识别等密切相关。G蛋白与病毒毒力密切相关，不同毒力毒株G蛋白的基因序列存在差异。

HSHRV的G基因开放阅读框包含1524个碱基，编码508个氨基酸残基。利用SMART和TMHMM软件包对照分析G蛋白氨基酸序列。HSHRV的G蛋白(HSHRV G)是典型的跨膜蛋白，基于signalIP4结构分析及参比与同属于弹状病毒科的水疱性口炎病毒(VSV)的G蛋白外结构(PDB:512S)，HSHRV G氨基端16个氨基组成疏水结构应为蛋白信号肽序列。

G蛋白胞外区6个二硫键对维持单体级构、组装为三聚体发挥功能有重要作用。选择HSHRV G胞外区第17～453位氨基酸作为靶序列，并在羧基端串联免疫增强多肽(IgG分子Fc片段第289～292位氨基酸)，通过三个表达系统(枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌表达系统)表达HSHRV重组G蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MPLFVPIRLQGWHDVKLDTLMCPSYASELNKEAAWPQIGLRHLAATDHYEVKGTICHKTTWVKTCDFRWYGPRYITTKISYAPVTGLECQQAIVKASKDELETPYMPEDNCNWATISDNEKTFITVQKSNIFMDPYNMVYVSTVLKGGRCASTVCPLEMHGGIWIPSEAPRESCKLGSSITSHINPNNASRLVTEASYLVTEYRRQLPFLGACRMSMCGEVGMRFKSGEWYKIESSDGRVLSFIASVPMCDGELTVSIHDSSATYHKLSQEILDLSAQIACISELRRAREKKAVSNYLLSFLTPNHGGFGTAYRVLNGQLQASKATYVRVKLGALSTATNWGQLDDGSAYSSEDVTGEIVNGPLFNGNRMDNGTLRVVQNAILGQTLEDEDLYEHSAKEILHPHLTILSSNESDVLSAFRPVGAQGDIIHAVGEWVGTGGSGGTKPRTKPRTKPRTKPR(SEQ ID NO.1)。

1、不同表达系统对HSHRV重组G蛋白的表达情况

(1)枯草芽孢杆菌表达系统

利用pHT枯草芽孢杆菌表达系统(Mobitec)表达HSHRV重组G蛋白，按枯草芽孢杆菌密码子偏好优化表达序列(如SEQ ID NO.2所示)，按照说明书构建重组枯草芽孢杆菌pHT43-RdmG-WB800n，利用IPTG诱导pHT43-RdmG-WB800n表达，并通过Western blot检验重组G蛋白的表达情况。

ATGCCGTTGTTCGTCCCAATACGTCTACAAGGCTGGCATGACGTGAAGCTCGATACACTGATGTGCCCAAGCTACGCCTCAGAGCTTAATAAAGAAGCAGCTTGGCCGCAAATCGGTTTGCGGCACTTGGCGGCTACAGATCATTATGAAGTCAAAGGTACAATTTGCCATAAGACAACATGGGTTAAAACATGTGATTTTCGCTGGTACGGTCCTCGTTATATTACAACGAAAATCAGCTATGCGCCTGTTACTGGGCTTGAATGCCAGCAGGCGATTGTAAAGGCTTCAAAAGATGAGCTTGAAACGCCGTATATGCCTGAAGACAACTGCAATTGGGCGACGATTTCTGACAACGAGAAGACGTTTATCACAGTGCAAAAAAGTAATATTTTTATGGACCCTTATAATATGGTGTATGTCAGTACGGTCTTGAAAGGCGGACGCTGTGCATCCACTGTTTGTCCACTGGAAATGCATGGCGGGATTTGGATTCCCTCCGAAGCTCCTAGAGAAAGCTGCAAGCTGGGCAGCTCCATCACGTCTCATATCAACCCGAATAACGCATCGCGTCTCGTCACTGAAGCGAGTTACTTGGTAACGGAATACCGCCGCCAGCTGCCGTTTCTTGGCGCCTGCAGAATGTCAATGTGCGGAGAAGTAGGAATGAGATTTAAAAGCGGTGAATGGTATAAAATTGAATCATCTGACGGTAGAGTTTTATCCTTTATTGCCTCTGTTCCAATGTGTGACGGTGAGCTGACCGTGAGTATTCATGATTCTTCTGCCACATATCATAAATTGTCCCAGGAAATCTTAGATTTATCAGCTCAAATAGCATGTATTTCCGAACTGAGGCGGGCCCGGGAGAAAAAAGCGGTAAGCAATTATTTACTCTCATTCCTAACACCTAATCACGGCGGCTTCGGAACGGCATACAGGGTATTAAACGGACAATTACAGGCAAGCAAAGCAACGTATGTTAGAGTGAAGCTAGGGGCTCTCAGCACCGCCACCAACTGGGGGCAGCTTGATGATGGAAGTGCTTACTCTTCAGAAGACGTAACTGGCGAAATTGTCAACGGCCCGCTTTTTAATGGAAACCGGATGGATAATGGCACTTTACGCGTTGTACAAAATGCGATCCTCGGCCAAACACTTGAGGATGAAGATCTGTATGAGCATTCAGCAAAAGAGATACTTCATCCGCACCTGACCATCCTTTCGAGCAATGAATCTGATGTGCTGTCAGCGTTCCGACCGGTTGGGGCACAGGGAGATATCATTCACGCTGTCGGCGAGTGGGTGGGTACCGGGGGATCCGGCGGAACTAAACCGAGAACGAAGCCGCGAACAAAACCTCGTACAAAGCCAAGA(SEQ ID NO.2)。

检测结果如图2所示。

经IPTG诱导4h后，重组G蛋白仅显著表达于菌体蛋白；诱导16h后，重组G蛋白在培养基上清与菌体蛋白中均可显著表达。

进一步用上述经诱导发酵后的pHT43-RdmG-WB800n菌体及发酵液，每日对小鼠进行灌胃，给菌量为10⁷CFU/kg·bw，以进行安全性评价。饲喂一周后，试验小鼠健康活泼无异常。

(2)乳酸菌表达系统

利用商品化乳酸菌系统(Mobitec)表达HSHRV重组G蛋白，按乳酸菌密码子偏好优化表达序列(如SEQ ID NO.3所示)，按照说明书构建重组乳酸菌pNZ8149-RdmG-NZ9000，用Nisin诱导pNZ8149-RdmG-NZ9000表达，并通过Western blot检验重组G蛋白的表达情况。

ATGCCCCTTTTCGTACCTATCCGCCTTCAGGGATGGCATGATGTGAAACTTGATACTTTGATGTGTCCTTCATATGCTTCAGAATTAAACAAAGAAGCGGCTTGGCCACAAATTGGTCTTCGTCATTTAGCAGCCACAGATCATTATGAAGTCAAAGGAACGATTTGTCATAAAACAACTTGGGTTAAAACCTGCGATTTCCGTTGGTATGGTCCTCGTTATATTACAACCAAAATATCGTACGCTCCAGTCACAGGACTTGAATGTCAACAAGCCATTGTTAAGGCATCTAAAGATGAGTTGGAAACACCTTATATGCCAGAGGATAATTGCAATTGGGCTACAATTTCTGACAACGAAAAAACTTTTATTACTGTCCAAAAAAGCAATATTTTTATGGACCCATATAATATGGTTTACGTTTCGACTGTTTTGAAAGGTGGACGTTGTGCTTCAACAGTTTGTCCACTCGAAATGCACGGCGGTATATGGATTCCAAGCGAAGCTCCTCGTGAAAGTTGTAAATTAGGCAGTTCTATTACCTCTCATATTAATCCAAATAATGCAAGTCGTCTAGTGACGGAAGCCTCTTATTTGGTCACTGAATATAGACGTCAATTACCATTCTTAGGTGCCTGTCGAATGTCAATGTGCGGAGAAGTTGGAATGCGTTTTAAATCAGGTGAGTGGTATAAAATTGAATCTTCGGATGGCCGCGTACTCAGTTTTATAGCCAGTGTTCCAATGTGTGATGGTGAATTAACGGTAAGTATCCACGATAGCTCCGCAACTTATCATAAGCTGAGTCAAGAAATCCTTGACCTATCAGCGCAAATTGCTTGTATTAGTGAACTCCGGAGAGCAAGAGAAAAAAAAGCTGTCTCAAATTATCTGTTGTCATTTTTAACTCCTAATCATGGTGGTTTTGGAACCGCGTACAGGGTGTTGAATGGTCAACTTCAAGCATCTAAAGCAACTTACGTTCGTGTAAAGTTAGGCGCTCTTTCCACAGCAACAAACTGGGGACAGTTGGATGATGGATCCGCTTATTCATCAGAAGACGTAACTGGGGAAATTGTGAATGGGCCCCTTTTTAATGGAAATCGAATGGATAACGGAACGCTAAGAGTTGTTCAAAATGCTATTTTAGGGCAAACATTAGAAGACGAAGATTTATATGAGCATTCTGCAAAAGAAATTCTTCATCCACATTTAACCATCCTTTCATCAAATGAATCTGATGTTTTATCTGCTTTTAGACCTGTTGGTGCTCAAGGAGATATTATCCACGCAGTTGGCGAGTGGGTAGGAACTGGTGGGTCTGGTGGTACAAAGCCACGGACAAAACCGAGAACTAAACCTCGAACAAAACCGCGC(SEQ ID NO.3)。

经反复优化，重组乳酸菌对HSHRV重组G蛋白的表达量非常低(每升发酵液中的G蛋白含量低于1μg)，不利于作为HSHRV重组G蛋白的表达系统。菌体蛋白表达检测结果如图3所示。

(3)毕赤酵母表达系统

利用商品化毕赤酵母表达系统(Thermo Fisher Scientific)表达HSHRV重组G蛋白。按酵母细胞密码子偏好优化表达序列(如SEQ ID NO.4所示)，按照说明书构建重组毕赤酵母pPIC9K-RdmG-X33，用甲醇诱导筛选高拷贝子，并通过Western blot检验重组G蛋白的表达情况。

ATGCCTCTCTTTGTGCCTATTCGCCTTCAAGGCTGGCATGATGTAAAGCTAGACACGCTGATGTGCCCCAGTTACGCCTCGGAACTTAACAAAGAGGCCGCCTGGCCCCAAATAGGCCTCCGGCATCTGGCCGCAACTGACCATTACGAAGTCAAAGGCACTATCTGCCATAAAACCACCTGGGTTAAGACCTGCGATTTCCGTTGGTACGGCCCAAGATATATAACAACAAAGATCTCATATGCACCGGTTACGGGACTGGAGTGCCAGCAAGCTATAGTGAAGGCTTCTAAAGATGAATTGGAGACTCCCTATATGCCGGAAGATAACTGTAACTGGGCTACGATCAGTGATAACGAAAAGACGTTCATAACGGTGCAAAAATCTAATATATTTATGGACCCGTACAATATGGTATACGTCTCCACAGTACTTAAAGGTGGCCGTTGCGCGTCAACCGTTTGTCCATTGGAGATGCACGGTGGTATCTGGATTCCCTCTGAGGCTCCGCGGGAATCCTGTAAGCTAGGATCGAGCATAACAAGCCACATCAATCCGAATAATGCGTCCAGACTGGTAACTGAAGCCAGTTATCTTGTCACTGAGTACAGGAGACAACTCCCTTTTCTTGGCGCTTGTCGCATGTCAATGTGTGGCGAAGTAGGAATGCGCTTCAAAAGCGGAGAATGGTATAAGATAGAGAGTAGCGATGGCCGTGTGTTGTCCTTTATTGCGTCCGTGCCAATGTGCGACGGTGAGTTAACAGTGTCAATTCATGACAGCTCGGCCACCTACCACAAGCTATCCCAGGAAATATTGGATCTATCAGCGCAGATTGCATGTATTTCGGAGCTACGAAGGGCTCGGGAGAAAAAGGCAGTCTCCAATTACTTATTGAGTTTTTTAACTCCCAACCATGGGGGGTTCGGAACCGCTTATAGGGTACTCAACGGTCAACTCCAAGCATCAAAAGCAACATATGTCCGTGTTAAACTAGGAGCATTATCGACAGCTACAAACTGGGGTCAGTTGGACGACGGTTCAGCCTACTCTAGTGAGGACGTCACCGGGGAGATCGTTAATGGGCCTCTCTTCAATGGGAACAGGATGGACAACGGGACGCTGCGGGTCGTTCAGAATGCGATTCTCGGACAGACGCTGGAAGATGAAGATTTATATGAACACTCTGCGAAGGAGATCCTGCACCCCCACTTAACGATTTTATCCTCGAACGAGTCTGACGTTCTTAGTGCATTTCGACCTGTGGGGGCCCAGGGGGATATCATTCACGCGGTAGGCGAATGGGTCGGAACTGGGGGAAGCGGTGGTACGAAGCCTCGAACCAAACCGAGAACTAAACCACGAACTAAGCCACGC(SEQ ID NO.4)。

检测结果如图4所示。

经诱导表达，HSHRV重组G蛋白仅表达于毕赤酵母菌体蛋白，培养基上清中HSHRV重组G蛋白含量低。

进一步离心收集上述经诱导发酵后的pPIC9K-RdmG-X33酵母菌、用生理盐水洗涤3次后，每日对小鼠进行灌胃，给菌量为10⁶CFU/kg·bw，以进行安全性评价。饲喂一周后，试验小鼠皮毛蓬松、行动迟缓或死亡，有明显中毒症状。并且，利用层析法去除酵母细胞或裂解液中甲醇的工艺成本较高。

综上，枯草芽孢杆菌表达系统具有表达量高、安全性好、成本低，便于推广应用的优点。因此，选择重组枯草芽孢杆菌pHT43-RdmG-WB800n及其诱导表达的重组G蛋白作为后续研究的口服疫苗抗原。

2、重组枯草芽孢杆菌pHT43-RdmG-WB800n的发酵优化

在5L发酵罐中进行发酵实验，采用正交试验分析影响蛋白产出关键要素，分步优化培养基、补液时机和补液量、IPTG诱导时间和诱导剂用量。优化后的发酵方案经50L分级放大、验证，在300L发酵罐发酵并诱导表达重组G蛋白。

发酵条件为：按发酵罐装液量1/2准备TB培养基，121℃，30min灭菌；按1％接种量接种pHT43-RdmG-WB800n；发酵罐设置参数为：温度37℃，转速100rpm，pH7.0，通气量8L/min，溶氧浓度(DO)30％；每1～2h取样、测定OD_600nm，当OD_600nm为2～3时，采用流加的方式补料，补料液为2×TB培养基，流速为1mL/min；当OD_600nm为8～10时，开始降温，发酵液温度降到30℃时，流加100mM IPTG进行诱导(发酵罐中IPTG终浓度为1mM)，流速为2～5mL/min；诱导时长16h，每隔4h取样，于4℃暂存样品，用于镜检、湿重称重和表达检验。发酵结束，发酵罐于室温暂存。

Western blot检测结果如图5所示。

经诱导4h后，重组G蛋白在菌体蛋白中显著表达；经诱导12h后，重组G蛋白在培养基上清中也出现显著表达。经ELISA检测，以色谱法标定的纯化G蛋白为标准品，发酵液中的重组G蛋白浓度不低于250μg/mL。且按现行《中国兽药典》方法检验，pHT43-RdmG-WB800n发酵液的纯粹性和性能检验合格，可用于后续口服疫苗的制备。

3、制备口服疫苗

向质检合格的发酵液中加入：30wt％鱼粉、5wt％肉骨粉、20wt％豆粕、15wt％面粉、2wt％血细胞蛋白粉、4wt％膨化大豆、2wt％磷酸二氢钙、1.5wt％赖氨酸、1.5wt％钙、1.2wt％磷、6wt％粗灰分、1wt％LTB溶液(浓度为5mg/mL)，粉碎，搅拌混匀后，采用湿法制粒设备制备得到直径0.6mm的丸剂，用邻苯二甲酸乙酸纤维素(乙酸纤维素肽酸酯，CAP)包衣，常温烘干6～8小时后，于2～8℃干燥长期保存。每150L发酵液可制备得到160～180kg口服疫苗(枯草芽孢杆菌G⁺包衣颗粒)。

向1份口服疫苗中加入1-2份3～5％褐藻酸钠溶液和4～5份颗粒饲料，搅拌拌匀，即得含口服疫苗的饲料。

动物效力试验

1、小鼠免疫实验

将40只7周龄健康昆明小鼠(雌性)随机分为两组，自由进食，一组每日饲喂添加2g上述实施例制备的枯草芽孢杆菌G⁺包衣颗粒(活菌数10⁹CFU)的饲料，作为免疫组；另一组饲喂不经任何处理的饲料，作为对照组。分别在饲喂14天、21天和28天时，每组随机选择5只小鼠采血，分离血清，用于检测其中的弹状病毒中和抗体PD50。

检测结果如图6所示。

饲喂14天时，免疫组小鼠血清中无可检出的中和抗体；连续饲喂21天后，血清中产生弹状病毒中和抗体，PD50均值为1/73；连续饲喂28天后，PD50均值为1/196。对照组小鼠血清中全程无可检出的中和抗体。

2、杂交鳢免疫攻毒试验

(1)将400尾的健康杂交鳢(体重约为30g)随机均分为两组，自由进食，一组每日饲喂含20wt％枯草芽孢杆菌G⁺包衣颗粒(活菌数10⁹CFU)的饲料，作为免疫组(B.subtilis-G)；另一组饲喂不经任何处理的饲料，作为对照组(Control)。试验期间，按照鱼总重的1.8wt％的投喂量饲喂杂交鳢，连续饲喂28天，分别在饲喂14天、21天和28天时，每组随机捞10尾杂交鳢尾进行静脉采血，分离血清，通过ELISA法(以重组G蛋白为抗原)检测杂交鳢血清中弹状病毒G蛋白特异性抗体IgM的含量，并检测弹状病毒中和抗体PD50。

饲喂28天后，分别从免疫组和对照组各随机选取90尾杂交鳢，每尾鱼注射滴度为100LD₅₀的HSHRV病毒液，控制养殖水温在25～28℃，观察15天，记录累积死亡率。

血清中特异性抗体(IgM)水平在口服免疫21天、28天显著升高。如图7所示。

连续饲喂21天，血清中产生弹状病毒特异性中和抗体PD50均值为1/107；28天后，PD50均值为1/252。对照组杂交鳢血清中全程无可检出的中和抗体。如图8所示。

攻毒后免疫组杂交鳢累积死亡率为8.8％，对照组累积死亡率为78.9％，口服疫苗饲喂28天后的相对保护率为81.8％。如图9所示。

(2)将枯草芽孢杆菌G⁺包衣颗粒于2～8℃保存6个月后，重复上述(1)中的杂交鳢免疫攻毒试验，杂交鳢血清中弹状病毒G蛋白特异性抗体IgM的含量、弹状病毒中和抗体PD50、相对保护率等与上述(1)中结果无显著性差异。

3、大口黑鲈免疫攻毒试验

将320尾健康大口黑鲈(体重约为40g)随机均分为两组，自由进食，一组每日饲喂含20wt％枯草芽孢杆菌G⁺包衣颗粒(活菌数10⁹CFU)的饲料，作为免疫组(B.subtilis-G)；另一组饲喂不经任何处理的饲料，作为对照组(Control)。试验期间，按照鱼总重的1.8wt％的投喂量饲喂大口黑鲈，连续饲喂28天，分别在饲喂14天、21天和28天时，每组随机捞10尾大口黑鲈尾进行静脉采血，分离血清，通过ELISA法(以重组G蛋白为抗原)检测大口黑鲈血清中弹状病毒G蛋白特异性抗体IgM的含量，并检测弹状病毒中和抗体PD50。

饲喂28天后，分别从免疫组和对照组各选80尾大口黑鲈，每尾鱼注射滴度为100LD50的HSHRV病毒液，控制养殖水温在25～28℃，观察15天，记录累积死亡率。

血清中特异性抗体(IgM)水平在口服免疫21天、28天显著升高。如图10所示。

连续饲喂21天，血清中产生弹状病毒特异性中和抗体PD50均值为1/35；28天后，PD50均值为1/225。对照组大口黑鲈血清中全程无可检出的中和抗体。如图11所示。

攻毒后免疫组大口黑鲈累积死亡率为15％，对照组累积死亡率为78.75％，口服疫苗饲喂28天后的相对保护率为67.8％。如图12所示。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims

1.一种弹状病毒重组G蛋白，其特征在于，所述弹状病毒重组G蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的弹状病毒重组G蛋白的核酸分子。

3.一种表达权利要求1所述的弹状病毒重组G蛋白的重组载体。

4.一种用于表达弹状病毒重组G蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括原核细胞和真核细胞；

优选地，所述原核细胞包括重组枯草芽孢杆菌。

6.权利要求4或5所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求3所述的重组载体转化入目标细胞中。

7.(1)至(4)任一项在制备用于预防病毒感染、防治病毒相关疾病的产品中的应用，

(1)权利要求1所述的弹状病毒重组G蛋白；

(2)权利要求2所述的核酸分子；

(3)权利要求3所述的重组载体；

(4)权利要求4或5所述的重组细胞。

8.一种用于预防病毒感染、防治病毒相关疾病的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的弹状病毒重组G蛋白、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所示的重组载体、权利要求4或5所述的重组细胞、权利要求4或5所述的重组细胞的发酵产物、权利要求4或5所述的重组细胞的发酵上清中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品包括疫苗；

优选地，所述疫苗为口服疫苗，所述口服疫苗还包括鱼粉、肉骨粉、豆粕、面粉、血细胞蛋白粉、膨化大豆、磷酸二氢钙、赖氨酸、钙、磷、粗灰分、LTB溶液中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，按质量百分比计，所述口服疫苗包括30-35％鱼粉、5-7％肉骨粉、17-21％豆粕、15-18％面粉、2-4％血细胞蛋白粉、3-6％膨化大豆、2-3％磷酸二氢钙、1-1.5％赖氨酸、1.5-1.9％钙、1.1-1.5％磷、6-8％粗灰分、1-1.5％LTB溶液。