CN1101945A - 胰岛素前体基因在酵母中的分泌表达和人胰岛素的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种用单链胰岛素前体基因在酵母中
分泌表达和人胰岛素的制备方法,包括基因合成,表
达质粒和工程菌构建及表达产物的分离纯化和转化
成结晶人胰岛素等。猪胰岛素单链前体表达量达40
—50mg/l,转化为结晶人胰岛素达15—20mg/l,并
能不断提高,本发明可发展成为基因工程人胰岛素生
产的工业体系。
Description
胰岛素是由A、B两条多肽链组成的蛋白质激素。在体内,胰岛素是以一条肽链形式被合成,称前胰岛素原(Preproinsulin)。在成熟过程中前胰岛素原相继被转变为仍为一条肽链的胰岛素原(Proinsulin)和胰岛素(Steiner,D.F.et al.,Fec.Proc.Fed.Am.Soc.Exp.Biol.,1974,33:2105;Science,1967,157:697.)。
胰岛素作为治疗糖尿病的特效药物,用于临床已有70多年了(Banting,F.G.&Best,C.H.,J.Lab.Clin.Med.,1922,7:251;Banting,F.G.,et al.,Canadian Med.Associ.J.,1922,12:141.)。由于糖尿病患者在世界人口中的比例相当高,对胰岛素的需求量很大,是临床上用量最大的蛋白质类药物。因此,有关胰岛素的生产和研究一直在吸引着人们的密切关注和浓厚兴趣。在胰岛素的生产方面,不仅表现在对传统的生产技术的革新和改进,而且不断吸收和采用新的科技成果。重组DNA技术出现后,胰岛素是最早被表达的蛋白质之一(Ullrich,A.et al.,Science,1977,196:1313;Crea,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1978,75:5764)。基因工程人胰岛素是第一个被投放市场的生物工程药物,并正在取代着经典的由家畜胰脏中抽提的动物胰岛素(Klausner,A.,Bio/Technology,1993,11:S35.)。
有关胰岛素的基因工程的报道很多,目前能用于生产胰岛素的主要可归纳为以下三种类型:其中有两种类型是用大肠杆菌系统发展起来的,即表达产物以融合蛋白的形式沉淀于细胞浆中(Goeddel,D.V.,et al.,Proc.Natl.Amer.Sci.USA,1979,76:106;Chance,R.E.,etak.,Peptide:Synthesis-Structure-Function,1981,ed.D.H.Rich&E.Gross,pp.721-728,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL;Chance,R.E.,et al.,Diabetes Care,1981,4:147.),或者是通过信号肽将表达产物分泌到菌体外周空间(Talmadge,K.,et al.,Proc.Natl.Amer.Sci.USA,1980,77:3988;Chan,S.J.,et al.,Proc.Nalt.Amer.Sci.USA,1981,78:5401)。第三种类型是用酵母系统,使表达产物通过细胞壁分泌到培养基中(Markussen,J.,et al.,Diabetologia,1986,29:568A;Thim,L.,et al.,Proc.Nalt.Amer.Sci.USA,1986,83:6766;Markussen,J.,et al.,Protein Engineering,1987,1:215)。所得表达产物经过不同的加工处理,最后得到基因工程胰岛素。与本发明最为接近是Markussen的工作,其专利和有关文献报道为:Markussen,J.,et al(1985),European Patent O 427 296 Al.Markussen,J.,et al(1987),Protein Engineering 1,(3)215.Markussen,J.,et al(1986),Peptides 1986,Walter de Gruyter & CO;Berlin-New York,pp189-194.
本发明是用酵母分泌表达化学合成的猪单链胰岛素前体(PSCI)基因,然后在体外通过转肽方法将PSCI转变为人胰岛素。PSCI为猪B1-30-Xn-Y-猪A1-21或猪B1-29-Wn-Xn-Y-猪A1-21,其中W和X为除Lys或Arg以外的任一天然氨基酸,Y为Lys或Arg,n=1-15。
用于转化酵母的质粒由质粒pVT(Vernet,T.,et al.,Gene,1987,52:225)组建而成。PSCI基因用DNA合成仪合成,编码酵母α交配因子前导序列(α-MFL)的DNA片段,用聚合酶链式反应(PCR)以酵母总DNA为模板复制获得。将PSCI基因和α-MFL的DNA片段连接后,插入到质粒pVT102-U中的醇脱氢酶1的启动子(ADHp)和3'端终止序列之间的多克隆部位,构建成分泌表达质粒pVT102-U/α-MFL-PSCI。进一步,用磷酸甘油酸激酶启动子(PGKp)代替pVT102-U/α-MFL-PSCI中的ADHp,得到了另一个分泌表达质粒pPGK/PSCI。选用酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(XV-700-6B),同上述质粒构建成工程菌种,酵母菌Saccharomyces cerevisiae YS90,PVT102U/α-MFL-SCI(XV-700-6B)(CCTCC NO:M93050)和醇母菌Saccharomyces cerevisiae YS91,pPGK/SCI(XV-700-6B),(CCTCC NO:M93051)(保藏在中国·武汉·武汉大学校内,中国典型培养物保藏中心)。用构建的工程菌培养,实现了PSCI在酵母中的高分泌表达,表达量达到40-50mg/L,并建立了简便的分离纯化表达产物的方法。表达产物经分离纯化和转肽得到15-20mg/L结晶人胰岛素,其氨基酸组成和序列与人胰岛素相符,受体结合能力和生物活力与天然猪胰岛素相同。
本发明的技术特征在下述的实施例中作具体描述。
本发明的附图作以下说明:
图1.α-MFL DNA片段的PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.ψX174的HaeⅢ酶解片段。
2.PCR扩增产物。
3.4.纯化的PCR扩增产物。
5.pBR322的HaeⅢ酶解片段。
溴乙啶染色。
图2.pVT102U/α-MFL-PSCI转化子的原位杂交。
图3.质粒pVT102U/α-MFL-PSCI的构建。
图4.1.4%的琼脂糖电泳
1.ψ×174的HindⅢ酶切片段;
2.以酵母总DNA为模板扩增的PGKp,主要条带约为620bp(片段1)。
图5.酶切片段的1%琼脂糖电泳
1.λ-DNA的HindⅢ酶切片段;
2.pVT102-U/αMFL-PSCI的EcoRI+SphI酶切片段;
3.pVT102-U/αMFL-PSCI的EcoRI+BamHI酶切片段。
图6.质粒pRGK/PSCI的构建。
图7.点杂交的放射自显影图。
A:以Primer S作探针;
B:以PSCI片段作探针。
图8.pVT102-U/αMFL-PSCI和pPGK/PSCI酶切片段的1%琼脂糖电泳图。
1.分子量标准pBR328 DNA·BglI+pBR322 DNA·HinfI;
2.pVT102-U/αMFL-PSCI的SphI酶切片段;
3.pPGK/PSCI的SphI的酶切片段;
4.pVT102-U/αMFL-PSCI的SphI+BamHI酶切片段;
5.pPGK/PSCI的SphI+BamHI酶切片段;
6.质粒pVT102-U/αMFL-PSCI。
图9.PSCI的Sephadex G-50(2.6×150cm)凝胶过滤。
图10.PSCI的PAGE图谱。
a.PSCI;
b.猪胰岛素。
图11.PSCI结晶(乙醇系统)。
图12.转肽反应6小时混合物HPLC图谱:
峰1(18.29分),PSCI:峰2(19.95分),DAI;
峰3(26.24分),[B30ThrOBut]hIns。
图13.转肽反应混合物PAGE图谱:
a.转肽反应0时;b.转肽反应2小时;c.[B30ThrOBut]hIns和猪1ns混合物;d.转肽反应4小时;e.转肽反应6小时。
图14.[B30ThrOBut]hIns经TFA处理后HPLC图谱。
图15.[B30ThrOBut]hIns经TFA处理后PACE图谱。
a.PSCI;b.转肽反应混合物;c.[B30ThrOBut]hIns;d.hIns;e.[B30ThrOBut]hIns和猪1ns混合物。
图16.人胰岛素结晶。
图17.基因工程人胰岛素和猪胰岛素与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合曲线。
实施例1.单链胰岛前体基因PSCI分泌表达质粒的构建
1.菌种、噬菌体、质粒和克隆步骤
克隆步骤按常规方法进行(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,2nded,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)。大肠杆菌JM103在2YT培养基中生长,并用氯化钙方法转化。转化后的大肠杆菌在含有氨苄青霉素(Ap,100μg/ml)的2YT培养基中生长。穿梭质粒pVT102-U(Vernet,T.,et al.,Gene,1987,52:225)为Thierry Vernet所赠。辅助噬菌体R408为MichaelSmith所赠。酵母菌XV700-6B(Leu-2,Ura-3,pep-4,Michael Smith所赠)在YPD培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)中培养,并用氯化锂方法转化(Broker,M.,BioTechniques,1987,5:516)。转化子在含2%琼脂、0.67%酵母氮源、2%葡萄糖、氨基酸(每种200μg/ml)、腺嘌呤(50μg/ml)和肌醇(200μg/ml)的培养基上选择。将转化的酵母菌接种在YPD培养基中,在30℃培养。
2.分泌表达质粒pVT102-U/α-MFL-PSCI的构建
(1).用基因扩增法(PCR)制备编码α-MFL的DNA片段及其在大肠杆菌中的克隆
PCR(Mullis,K.B.&Faloona,F.A.,Methods in Enzymolgy,1987,155:335)以手工方法在不同温度的三个水浴中进行。100μl的缓冲液中含10mM的四种脱氧核苷三磷酸各5μl,膜板DNA 1μg和两种引物各10-50pmole,将上述溶液在100℃加热五分钟,然后在45℃退火2分钟。Taq DNA聚合酶2.5单位,在72℃使引物延伸1.5分钟。反应循环进行25至35次,每一循环包括在92℃变性0.5分钟,在45℃复性1分钟和在72℃延伸1.5分钟。反应产物的大小和产率用5μl样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
引物B(GGATCCATGAGATTTCCTTCA)和引物X(TCTAGAGATACCCTTCTTCTTT)用ABI380A型DNA合成仪合成并用16%聚丙烯酰胺-8M尿素凝胶电泳纯化。得到的PCR产物为具有下列改变的编码α-MFL的DNA片段:
GGATCCATGAGATTTCCTTCA---------AAAGAAGAAGGGGTATCTCTAGA
CCTAGGTACTCTAAAGGAAGT---------TTTCTTCTTCCCCATAGAGATCT
与原来α-MFL顺序(Kurjan,J.&Herskowitz,I.,Cell,1982,30:933)相比较,在碱基No.1的前面加上了BamHI的位点;亮氨酸的密码TTG(碱基No.244-246)改为CTA,和前面的T及后面的GA形成XbaI位点。琼脂糖凝胶电泳分析表明PCR的主要产物为250bp左右的编码α-MFL的DNA片段(图1)。将其克隆到pVT102-U,形成pVT102-U/α-MFL。
穿梭质粒pVT系列(Vernet,T.,et al.,Gene,1987,52:225)具有醇脱氢酶1的启动子(ADHp)和3'终止序列,中间是多克隆部位(MCS)。同时,通过辅助噬菌体(helper phage)的感染,可以从pVT方便地得到单链DNA,无需再克隆即能测定DNA顺序或进行基因定位突变。因此,利用辅助噬菌体R408制备了单链DNA(Russel,M.,et al.,Gene,1986,45:335)并用Sanger等(Sanger,F.G.,et al.,Proc.Nalt.Amer.Sci.USA,1977,74:5463)末端终止法测定DNA顺序,确认了产物α-MFL的顺序。
这里,利用PCR方法同时完成了α-MFL序列的扩增,突变和在两端加上了所需的酶切位点。
(2).PSCI基因的合成及其在大肠杆菌中的克隆
将PSCI基因分成8个片段,用ABI 380A型DNA合成仪合成,用16%聚丙烯酰胺-8M尿素凝胶电泳纯化后,用T4DNA连接酶连接成175bp左右的大片段,其序列如下:
LDKRFVNQHLCGSHLV
CTAGATAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCACTT,GGTT-
TATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACGCCAAGGGTGAA-CCAA-
EALYLVCGERGFFYTP
G-AAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT.TCTACACTC-CT-
C.TTCGAAACATGAACCAAACGCCACTTTCTCCAAAGA-AGATGTGAG.GA-
KAAKGIVEQCCTSICS
AAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGTACC,TCCATCTG-CTCC-
TTCCGACGATTCCCATAACAGCTTGTTACGACATGG-AGGTAGAC.GAGG-
LYQLENYCN
TTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGA
AACATGGTTAACCTTTTGATGACGTTGATCTTCGA
这个片段含有Leu、Asp、Lys和Arg的密码子和PSCI基因,在基因的5'端和3'端有XbaI和HindⅢ酶切位点的黏性末端。将此片段克隆到pVT102-U/α-MFL,得到PSCI基因分泌表达质粒PVT102-U/α-MFL-PSCI并用其转化大肠杆菌。以PSCI基因为模板,用PCR方法制备含32P脱氧核苷酸的高放射活性探针。用此探针作菌落杂交,筛选转化子(图2)。
制备pVT102-U/α-MFL-PSCI的单链DNA(Russel,M.,et al.,Gene,1986,45:335)并用DNA测序方法确认了PSCI基因的顺序。
从pVT102-U构建pVT102-U/α-MFL-PSCI的过程见图3。
3.分泌表达质粒pPGK/PSCI的构建
磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)基因是酵母中最有效的表达基因之一。PGK启动子(PGKp)已被用来构建了一系列高效表达载体,并成功地表达了若干真核基因。为了用PGKp代替pVT102-U/α-MFL-PSCI中的ADHp,首先用PCR从酵母的总DNA中扩增了PGKp(Ogden,J.E.,et al.,Mol.Cell.Biol.,1986,6:4335)顺序(615bp),并分别在其5'和3'端加上了SphI和BamHI酶切位点(图4)。扩增引物S(CCGCATGCTCATACTATT-ATCAGGGCCA)和B(GGGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGTAAAA)用ABI 380A型DNA合成仪合成,用16%聚丙烯酰胺-8M尿素凝胶电泳纯化。
pVT102-U/α-MFL-PSCI用EcoRI+SphI酶切后,得三个片段,分别约为1.2Kb,1.85Kb和4.25Kb。回收1.85Kb片段(图5)。而以EcoRI+BamHI酶切该质粒,得到分别约为2.5Kb和5Kb的两个片段,回收5Kb片段(图5)。
将回收的5Kb和1.85Kb片段与PCR扩增的PGKp片段混合在一起,连接,得到分泌表达质粒pPKG/PSCI,该质粒的构建过程见图6。
用pPKG/PSCI转化大肠杆菌JM103,取20个转化菌落,抽提质粒DNA,点在尼龙膜上,以扩增PGKp时用的引物S和PSCI片段为探针,作点杂交(图7)。转化子质粒DNA的酶切图谱如图8所示。用SphI+BamHI酶切,可分别将pPKG/PSCI和pVT102-U/α-MFL-PSCI中的启动子切下来,前者约600bp,后者约400bp,分别与PGKp和ADHp大小相符(PGKp为620bp,ADHp为415bp)(图8)。
实施例2.PSCI基因在酵母中的分泌表达
用pPGK/PSCI或pVT102-U/α-MFL-PSCI转化的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae XV700-6B细胞(分别称YS-91和YS-90)在选择培养基中,于30℃生长48小时。取转化子接种于5mlYPD培养液中,生长过夜,转接到50mlYPD培养液,继生长约20小时后,转入盛有YPD的摇瓶或10L发酵罐培养三天。用胰岛素放射免疫方法测定YS-91在摇瓶和10升发酵罐中PSCI的浓度分别为24mg/L和40-50mg/L。
实施例3.表达产物PSCI的分离纯化和鉴定
离心除去菌体,取发酵液于0-4℃加丙酮或三氯醋酸沉淀蛋白质,在4℃静置过夜,离心收集沉淀,用少量乙酸溶解后,上Sephadex G-50柱,用10%乙酸洗脱,收集与胰岛素相应位置的峰(图9),冷冻干燥,再用上述Sephadex G-50柱分离一次,冷冻干燥。所得PSCI用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带(图10)。PSCI的结晶(乙醇系统,pH6.8)如图11所示。
用上述分离纯化程序,从1升发酵液中可得到纯的PSCI 30-40mg。
实施例4.转肽和人胰岛素产物的鉴定
1.转肽
取定量PSCI溶于DMSO/1,4-丁二醇/水的混合液中,加过量叔丁酯保护的Thr(ThrOBut),调pH至6.5,加胰蛋白酶(蛋白质∶酶=5∶1)于25℃反应6小时,加酸终止反应(朱尚权 崔大敷,科学通报,1984,20:1263)。HPLC分析表明,反应混合物有三个峰(图12),峰1是未反应的PSCI,峰2为去B30Ala胰岛素(DAI),峰3是转肽产物,即B30苏氨酸为叔丁酯保护的人胰岛素([B30ThrOBut]hIns)。图13是反应混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。
由图12中的峰计算,[B30ThrOBut]hIns为51%,PSCI为41%,DAI为8%。PSCI和DAI回收后可以再进行转肽。
[B30ThrOBut]hIns经三氟乙酸(TFA)处理,脱去叔丁酯保护基,得到人胰岛素。HPLC分析表明人胰岛素为单一峰(图14),回收率几乎100%。图15为[B30ThrOBut]hIns经TFA处理后的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
用上述转肽条件,从每升发酵液中可得纯的人胰岛素15-20mg。应该指出,41%的PSCI和8%的DAI(图12)回收后仍可进行转肽。因此,人胰岛素的最终得率还可进一步提高。
2.基因工程人胰岛素的鉴定
经转肽得到的人胰岛素的结晶如图16所示。氨基酸组成与理论值相符(表1):
表1:猪胰岛素(P-Ins)和人胰岛素(h-Ins)的氨基酸分析
p-Ins. h-Ins.
氨基酸 实验值 理论值 实验值 理论值
Asx 3.08 3 3.21 3
Thr 1.99 2 3.10 3
Ser 2.59 3 2.66 3
Glx 7.00 7 7.63 7
Gly 4.00 4 4.00 4
Ala 2.12 2 1.31 1
VaL 3.69 4 4.00 4
Ile 1.70 2 1.80 2
Leu 5.98 6 6.03 6
Tyr 3.81 4 3.58 4
Phe 2.86 3 3.14 3
His 1.86 2 2.00 2
Lys 1.02 1 1.16 1
Arg 1.06 1 1.10 1
Pro 0.64 1 0.50 1
注:样品经6N HCl 20小时,110℃水解
用ABI公司的蛋白质顺序仪双头测定基因工程人胰岛素氨基酸顺序,所得结果与人胰岛素氨基酸序列完全相同。
由图17可见,基因工程人胰岛素具有与猪胰岛素相同的与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力(冯佑民等,生物化学与生物物理学报,1982,14:137)。小白鼠惊厥方法测定表明其体内生物活力也与猪胰岛素相同(表2):
表2:单组分猪胰岛素(MC-Ins)和基因工程人胰岛素(h-Ins)的小鼠惊厥反应活力测定
样品 h-Ins MC-Ins
μg
0.5 6/10 6/10
0.25 1/10 1/10
猪和人胰岛素的差别只在B30位的氨基酸残基不同,猪胰岛素为Ala,人胰岛素是Thr。因此,转肽时如果用叔丁酯保护的丙氨酸(AlaOBut)代替ThrOBut,即可得到猪胰岛素。
Claims (1)
1、一种用猪单链胰岛素前体基因在酵母中分泌表达和人胰岛素的制备方法,包括它的PSCI基因合成,编码酵母α-交配因子前导序列的DNA片段的制备,PVT102-U/α-MFL-PSCI质粒和pPGK/PSCI质粒的构建,用上述质粒转化酵母菌而得到工程菌YS-90及YS-91,以及分泌表达产物PSCI的分离纯化及转化为人胰岛素的转肽条件等,其特征在于:
a.使用了由化学合成的DNA片段,用T4DNA连接酶连接成175bp左右的大片段DNA(PSCI基因),其序列如下:
L D K R F V N Q H L C G S H L V
CTAGATAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCACTT.GGTT-TATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACGCCAAGGGTGAA-CCAA-
E A L Y L V C G E R G F F Y T P
G-AAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT.TCTACACTC-CT-C.TTCGAAACATGAACCAAACGCCACTTTCTCCAAAGA-AGATGTGAG,GA-
K A A K G I V E Q C C T S I C S
AAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGTACC.TCCATCTG-CTCC-TTCCGACGATTCCCATAACAGCTTGTTACGACATGG-AGGTAGAC,GAGG-
L Y Q L E N Y C N
TTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGA
AACATGGTTAACCTTTTGATGACGTTGATCTTCGA
这个片段含有Leu,Asp和Arg的密码子和猪单链胰岛素前体基因,在基因的5’端和3’端有XbaI和HindⅢ酶切位点的粘性末端;
PSCI为猪B1-30-Xn-Y-猪A1-21或猪B1-29-Wn-Xn-Y-猪A1-21,其中W和X为除Lys或Arg以外的任一天然氨基酸,Y为Lys或Arg,n=1-15;
b.将a中所述的PSCI基因克隆到质粒pVT102-U/α-MFL中,得到PSCI基的分泌表达质粒pVT102-U/α-MFL-PSCI,使用醇脱氢酶1启动子(ADHp)和醇脱氢酶1终止序列(ADHt);
c.使用磷酸甘油激酶启动子(PGKp)代替pVT102-U/α-MFL-PSCI中的ADHp,构建成分泌表达质粒pPKG/PSCI;
d.编码酵母α交配因子前导序列(α-MFL)的DNA片段,用聚合酶链式反应(PCR)由酵母总DNA为模板复制获得,得到的PCR产物为具有下列改变的编码α-MFL的DNA片段;
GGATCCATGAGATTTCCTTCA--------AAAGAAGAAGGGGTATCTCTAGA
CCTAGGTACTCTAAAGGAAGT--------TTTCTTCTTCCCCATAGAGATCT与原来α-MFL顺序相比较,在碱基No.l的前面加上了BamHI的位点;亮氨酸的密码TTG(碱基No.244-246)改为CTA,和前面的GA形成XbaI位点。
e.选用酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(XV-700-6B)和b中所述的表达质粒pVT102U/α-MFL-PSCI构建成工程菌Saccharomyces cerecisiae YS90,PVT102U/α-MFL-SCI(XV-700-6B);
f.选用酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(XV-700-6B)和c中所述的表达质粒pPKF/PSCI构建成工程菌Saccharomyces cerevisiaeYS91,pPGK/SCI(XV-700-6B);
g.分泌产物PSCI转化为胰岛素的转肽条件是DMSO/1,4-丁二醇/水,25℃反应6小时。
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