WO2024063050A1 - リパーゼ変異体 - Google Patents

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WO2024063050A1
WO2024063050A1 PCT/JP2023/033910 JP2023033910W WO2024063050A1 WO 2024063050 A1 WO2024063050 A1 WO 2024063050A1 JP 2023033910 W JP2023033910 W JP 2023033910W WO 2024063050 A1 WO2024063050 A1 WO 2024063050A1
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貴大 日置
彰人 川原
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花王株式会社
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the present invention relates to lipase mutants.
  • Lipases contribute to the removal of oil-containing stains by hydrolyzing ester bonds in lipids to produce fatty acids, and are useful in cleaning applications.
  • lipase derived from Thermomyces lanuginosus (hereinafter referred to as TLL) is sold under the trade name LIPOLASE (registered trademark).
  • Patent Document 1 discloses that lipase Lipr139 derived from Cedecea sp-16640 strain has superior cleaning performance compared to TLL.
  • US Pat. No. 5,001,203 discloses variants of lipases from Proteus bacteria (hereinafter PvLip) that have improved cleaning performance when compared to one or more reference lipolytic enzymes.
  • Patent Document 3 discloses that metagenome-derived lipase Lipr138 has superior cleaning performance compared to TLL.
  • Lipr139, PvLip, and Lipr138 are lipases belonging to the same clade (Proteus/Yersinia clade) that includes lipases derived from Proteus and Yersinia bacteria.
  • Non-Patent Document 1 Many of the lipases derived from Gram-negative bacteria require a lipase-specific chaperone for folding into an active form (Non-Patent Document 1), and there is a problem in inexpensive production by heterologous expression. It has been reported that co-expression of specific chaperones improves heterologous expression (Non-Patent Document 2), but the productivity is low and there are still major problems in inexpensive production by heterologous expression.
  • bacterial lipases of the Proteus/Yersinia clade do not require specific chaperones and have an advantage in inexpensive production through heterologous expression (Non-Patent Documents 3, 4). As described above, bacterial lipases of the Proteus/Yersinia clade have excellent potential as cleaning enzymes in terms of both their suitability for cleaning and their low cost production.
  • Non-Patent Documents 5 and 6 show the excellent performance of LipC12 (same sequence as Lipr138) in ester synthesis applications, and bacterial lipases of the Proteus/Yersinia clade are expected to be useful not only in cleaning but also in a variety of industrial applications. be done.
  • Substrate specificity such as positional specificity of ester bonds in acylglycerol, fatty acid chain length specificity, and enantioselectivity in optical resolution, differs greatly depending on the lipase species. Differences in substrate specificity are observed even among lipases with closely related sequences, and in order to perform optimal reactions, it is necessary to screen lipases for each reaction system. Therefore, there is a need to expand the sequence diversity of industrially available lipases.
  • Patent Document 1 Japanese Translation of PCT Publication No. 2015-523078 (Patent Document 2) International Publication No. 2020/046613 (Patent Document 3) Japanese Patent Publication No. 2015-525248 (Non-Patent Document 1) Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686. (Non-Patent Document 2) Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12. (Non-Patent Document 3) Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
  • Non-patent Document 4 Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
  • Non-patent Document 5 Madalozzo, Aline Dutra, et al. Journal of molecular catalysis b: enzymatic 116 (2015): 45-51.
  • Non-patent Document 6 Madalozzo, Aline Dutra, et al. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 8 (2016): 294-300.
  • the present invention relates to the following 1) to 11).
  • a lipase variant having at least two amino acid residues selected from G at a position corresponding to position 186 and G at a position corresponding to position 186;
  • a lipase consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and having C at the position corresponding to position 90 and L at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Mutant 3) An enzyme composition containing the lipase variant according to 1) or 2). 4) A polynucleotide encoding the lipase variant according to 1) or 2). 5) A vector or DNA fragment comprising the polynucleotide described in 4). 6) A transformed cell containing the vector or DNA fragment described in 5). 7) A method for producing a lipase mutant, comprising the step of culturing the transformed cell according to 6).
  • a method for producing a lipase variant comprising any step selected from the following (i) to (xxii): (i) In a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 82% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having lipase activity, the amino acid residue at the position corresponding to position 118 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is D a step of replacing with; (ii) In a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having lipase activity, the amino acid residue at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with Y a step of replacing with; (iii) In a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 91% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having lipase activity, the amino acid residue at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • a method for producing a lipase variant comprising any step selected from the following (xxiii) to (xxvii): (xxiii) In a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having lipase activity, at positions 31, 32, 90, and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Amino acid residues at least two positions selected from the corresponding positions are Y at the position corresponding to position 31, G at the position corresponding to position 32, C at the position corresponding to position 90, and the position corresponding to position 181.
  • lipase refers to triacylglycerol lipase (EC3.1.1.3), and refers to a group of enzymes that have the activity of hydrolyzing ester bonds in lipids to produce fatty acids. Lipase activity is typically esterase activity and can be determined by measuring the rate of increase in absorbance associated with the release of 4-nitrophenol by hydrolysis of 4-nitrophenyl octoate. Specific procedures for measuring lipase activity are detailed in the Examples below.
  • Proteus/Yersinia clade refers to a clade that includes lipases derived from Proteus and Yersinia bacteria on a rooted phylogenetic tree representing protein evolution, and includes, for example, SEQ ID NOs: 2, 4, Amino acid sequences 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 and 32 are all amino acid sequences of lipases belonging to the Proteus/Yersinia clade.
  • the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYX Ver. It is calculated by performing an analysis using a search homology program of 12 with Unit size to compare (ktup) set to 2.
  • amino acid sequences and nucleotide sequences refers to 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 92% or more, even more preferably 94% or more. % or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, still more preferably 99.5% or more.
  • At least 81% identity means 81% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 92% or more, even more preferably 94% or more, still more preferably 95% or more, and The identity is preferably 96% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and still more preferably 99.5% or more.
  • At least 83% identity means 83% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 92% or more, even more preferably 94% or more, still more preferably 95% or more, and The identity is preferably 96% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and still more preferably 99.5% or more.
  • At least 91% identity means 91% or more, preferably 92% or more, more preferably 94% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 98% or more, and Preferably it means an identity of 99% or more, more preferably 99.5% or more.
  • At least 94% identity means 94% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, even more preferably 99.5% or more. It refers to the identity of "At least 97% identity” refers to an identity of 97% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, even more preferably 99.5% or more.
  • a "corresponding position" on an amino acid sequence or a nucleotide sequence refers to alignment (alignment) of a target sequence and a reference sequence (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) to give maximum homology. ) can be determined by Alignment of amino acid or nucleotide sequences can be performed using known algorithms and procedures are known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, J.D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) with default settings. Alternatively, Clustal W2 or Clustal omega, which are revised versions of Clustal W, can also be used.
  • Clustal W, Clustal W2 and Clustal omega are available on the Clustal website [www. clustal. org], the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]), and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www.ddbj.nig] operated by the National Institute of Genetics). .ac.jp/searches-j.html]).
  • a position of the target sequence aligned to an arbitrary position of the reference sequence by the above-mentioned alignment is considered to be a "corresponding position" to the arbitrary position.
  • amino acid sequence alignment can further fine-tune the amino acid sequence alignment obtained above to optimize it.
  • Such optimal alignment is preferably determined by taking into consideration the similarity of amino acid sequences, the frequency of inserted gaps, and the like.
  • Amino acid sequence similarity here refers to the ratio (%) of the number of positions where identical or similar amino acid residues exist in both sequences to the total number of amino acid residues when two amino acid sequences are aligned.
  • Similar amino acid residues refer to amino acid residues among the 20 types of amino acids constituting proteins that have similar properties to each other in terms of polarity and charge and that cause so-called conservative substitutions.
  • Such groups of similar amino acid residues are well known to those skilled in the art and are, for example, arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and asparagine or arginine; leucine. and isoleucine, but are not limited to these.
  • amino acid residue refers to the 20 types of amino acid residues that make up proteins, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L ), lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W) , tyrosine (Tyr or Y) and valine (Val or V).
  • amino acid positions and variants are described using the officially recognized IUPAC one-letter amino acid abbreviations as follows.
  • the amino acid at a given position is expressed as [amino acid, position].
  • phenylalanine at position 31 is designated as "F31.”
  • Amino acid "substitutions” are expressed as [original amino acid, position, substituted amino acid].
  • substitution of phenylalanine for tyrosine at position 31 is designated as "F31Y.” If different modifications can be introduced at one position, the different modifications are separated by a slash ('/'), for example, 'I222A/T/H/G' means that the isoleucine at position 222 is alanine, threonine, histidine or Represents substitution with glycine.
  • operable linkage between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. means. Procedures for "operably linking" genes and control regions are well known to those skilled in the art.
  • upstream and downstream in relation to a gene refer to the upstream and downstream of the transcription direction of the gene.
  • a gene located downstream of a promoter means that the gene is present on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand
  • upstream of a gene means the region on the 5' side of the gene in the DNA sense strand.
  • the "parent" polypeptide of a given mutant polypeptide refers to a polypeptide that becomes the mutant polypeptide by making a predetermined mutation in its amino acid residues.
  • the "parent” polypeptide is the polypeptide before the mutation is added to the mutant polypeptide.
  • Such parent polypeptide may be a native (wild type) polypeptide or a variant thereof.
  • the present inventors investigated the heterologous expression in Bacillus subtilis for 16 diverse lipases belonging to the Proteus/Yersinia clade, which includes lipases derived from Proteus and Yersinia bacteria, on a rooted phylogenetic tree representing protein evolution. Although there are reports that lipases from the Proteus/Yersinia clade have an advantage in heterologous expression, clear expression was confirmed in only three species. We discovered for the first time that the diversity of sequences that can be expressed heterologously in lipases is actually small. Accordingly, the present invention relates to providing lipase variants with improved heterologous expressibility.
  • the lipase mutant of the present invention has improved heterologous expressibility compared to the parent lipase.
  • Such lipase mutants can be produced at low cost through heterologous expression, and can be used not only for cleaning purposes but also for general industrial applications such as optical resolution, biofuel production, oil and fat processing, wastewater treatment, pulp production, and leather production.
  • Lipase mutants and their production methods The present invention provides lipase mutants with improved heterologous expression and methods for producing the same.
  • the present invention provides a method for producing a lipase variant.
  • the method of the present invention includes substituting an amino acid residue at a predetermined position in the parent lipase with a predetermined numbering based on SEQ ID NO: 2.
  • An example of a parent lipase of the lipase mutant of the present invention includes a polypeptide that has an amino acid sequence having at least 82% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and has lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having lipase activity is Serratia sp.
  • the lipase SspLip NCBI Accession No.
  • WP_025122441.1 derived from The parent lipase, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 82% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having lipase activity, has E at the position corresponding to position 118 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. is preferred.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 118 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with D in the parent lipase.
  • E at the position corresponding to position 118 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with D in the parent lipase.
  • a parent lipase is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80, 91 or 94% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having lipase activity is the lipase PfLip derived from Pseudomonas frederiksbergensis (NCBI Accession No. WP_123598507.1).
  • the parent lipase which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least the above-described identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having lipase activity, has F at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. , those having E at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, those having A at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or those having E at position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • those having V at the corresponding positions are preferred, those having F and E at positions corresponding to positions 31 and 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and those corresponding to positions 90 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. More preferably, those having A and V at the positions corresponding to positions 32 and 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, respectively, or those having E and A at positions corresponding to positions 32 and 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; It is more preferable to have F, E, A and V at the positions corresponding to the 90th, 90th and 181st positions, respectively.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y, or The amino acid residue at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or the amino acid residue at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with C, or The amino acid residue at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with L, or the amino acid residue is selected from the positions corresponding to positions 31, 32, 90, and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • At least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues are Y at the position corresponding to position 31, G at the position corresponding to position 32, C at the position corresponding to position 90, and It is substituted with L at the position corresponding to position 181. More preferably, in the parent lipase, the amino acid residue at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or the amino acid residue at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G.
  • amino acid residues of SEQ ID NO: 2 are substituted with Y and G, respectively, or the amino acid residues corresponding to positions 90 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with C and L, respectively, or the amino acid residues of SEQ ID NO: 2 are substituted with C and L, respectively.
  • amino acid residues at positions corresponding to positions 32 and 90 of the amino acid sequence are substituted with G and C, respectively, or positions corresponding to positions 31, 32, 90, and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. amino acid residues are substituted with Y, G, C and L, respectively.
  • F at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y. or, E at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with G, or A at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with C, or SEQ ID NO: V at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with L, or F at the position corresponding to position 31, E at the position corresponding to position 32, or E at position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • At least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues selected from A at the corresponding position and V at the position corresponding to the 181st position are Y at the position corresponding to the 31st position, and Y at the 32nd position.
  • G is substituted at the corresponding position
  • C is substituted at the position corresponding to the 90th position
  • L is substituted at the position corresponding to the 181st position.
  • E at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with G
  • a at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with C.
  • V at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with L, or F and E at the positions corresponding to positions 31 and 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are respectively substituted.
  • Y and G, or A and V at positions corresponding to positions 90 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with C and L, respectively, or position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • E and A at positions corresponding to position 90 are replaced with G and C, respectively, or F, E, and A at positions corresponding to positions 31, 32, 90, and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • V are replaced with Y, G, C and L, respectively.
  • a parent lipase is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and having lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and having lipase activity is the lipase EtLip derived from Enterobacillus tribolii (NCBI Accession No. WP_115457195.1).
  • the parent lipase which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and having lipase activity, has I at the position corresponding to position 222 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. is preferred.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 222 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with A, T, H, or G in the parent lipase.
  • polypeptide having lipase activity and consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:8 is lipase YeLip (NCBI Accession No. WP_064517898.1) derived from Yersinia entomophaga.
  • the parent lipase which is a polypeptide having lipase activity and consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, preferably has V at the position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, V at the position corresponding to position 125 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, E at the position corresponding to position 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, or S at the position corresponding to position 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, and more preferably has V and E at the positions corresponding to positions 125 and 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, or S at the positions corresponding to positions 39 and 40 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • V, E, and S are those having V, E, and S at positions corresponding to positions 125, 126, and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, those having V, V, and E at positions corresponding to positions 39, 125, and 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, or those having V, E, and S at positions corresponding to positions 39, 126, and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, and even more preferred are those having V, V, E, and S at positions corresponding to positions 39, 125, 126, and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with K, or The amino acid residue at the position corresponding to position 125 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with T, or the amino acid residue at the position corresponding to position 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with P, or The amino acid residue at the position corresponding to position 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or is selected from the positions corresponding to positions 39, 125, 126, and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • At least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues are K at the position corresponding to position 39, T at the position corresponding to position 125, P at the position corresponding to position 126, and It is substituted with G at the position corresponding to position 293. More preferably, in the parent lipase, the amino acid residue at the position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with K, or the amino acid residue at the position corresponding to position 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with K.
  • amino acid residues of SEQ ID NO: 2 are substituted with T and P, respectively, or the amino acid residues corresponding to positions 39 and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with K and G, respectively, or the amino acid residues of SEQ ID NO: 2 are substituted with K and G, respectively.
  • Amino acid residues at positions corresponding to positions 125, 126, and 293 of the amino acid sequence are substituted with T, P, and G, respectively, or correspond to positions 39, 125, and 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid residues at positions corresponding to positions 39, 126, and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are replaced by K, P, and G, respectively. or the amino acid residues at positions corresponding to positions 39, 125, 126, and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with K, T, P, and G, respectively.
  • V at the position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with K. or, V at the position corresponding to position 125 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with T, or E at the position corresponding to position 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with P, or SEQ ID NO: S at the position corresponding to position 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or V at the position corresponding to position 39, V at the position corresponding to position 125, or V at position 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: At least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues selected from E at the corresponding position and S at the position corresponding to position 293 are K at the position corresponding to position 39, and K at the position corresponding to position 125.
  • T is substituted with T at the corresponding position, P at the position corresponding to the 126th position, and G at the position corresponding to the 293rd position.
  • V at the position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with K
  • E at the position corresponding to position 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with P.
  • S is substituted with G at the position corresponding to position 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or V and E at positions corresponding to positions 125 and 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are respectively substituted.
  • V and S at positions corresponding to positions 39 and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with K and G, respectively, or position 125 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, V, E and S at positions corresponding to positions 126 and 293 are replaced with T, P and G, respectively, or V at positions corresponding to positions 39, 125 and 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, V and E are replaced with K, T and P, respectively, or V, E and S at positions corresponding to positions 39, 126 and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are replaced with K, P and G, respectively. or V, V, E, and S at positions corresponding to positions 39, 125, 126, and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with K, T, P, and G, respectively.
  • a parent lipase is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and having lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and having lipase activity is lipase AnLip derived from Arsenophonus nasoniae (NCBI Accession No. WP_026822497.1).
  • the parent lipase which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and having lipase activity, has C at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • those having F at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 those having A at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or those having A at position 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • those having R at the corresponding positions are preferable, and those having C and R at positions corresponding to positions 29 and 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are more preferable, and those having R at positions 29 and 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are more preferable. More preferred are those having C, F, A and R at the positions corresponding to the 32nd, 32nd and 186th positions, respectively.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y, or The amino acid residue at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y, or the amino acid residue at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or The amino acid residue at the position corresponding to position 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or is selected from the positions corresponding to positions 29, 31, 32, and 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • At least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues are Y at the position corresponding to position 29, Y at the position corresponding to position 31, G at the position corresponding to position 32, and It is substituted with G at the position corresponding to position 186. More preferably, in the parent lipase, the amino acid residue at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y, or the amino acid residue at the position corresponding to position 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y.
  • amino acid residues at positions corresponding to positions 29 and 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with Y and G, respectively, or the amino acid residues at position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with Y and G, respectively.
  • amino acid residues at positions corresponding to positions 31, 32, and 186 are substituted with Y, Y, G, and G, respectively.
  • C at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y. or, F at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y, or A at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or SEQ ID NO: R at the position corresponding to position 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or C at the position corresponding to position 29, F at the position corresponding to position 31, or F at position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • At least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues selected from A at the corresponding position and R at the position corresponding to the 186th position are Y at the position corresponding to the 29th position, and Y at the 31st position. It is substituted with Y at the corresponding position, G at the position corresponding to the 32nd position, and G at the position corresponding to the 186th position. More preferably, in the parent lipase, C at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y, or R at the position corresponding to position 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with G.
  • An example of a parent lipase of the lipase mutant of the present invention includes a polypeptide that has an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and has lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and having lipase activity is lipase YfLip derived from Yersinia frederiksenii (NCBI Accession No. WP_145530745.1).
  • the parent lipase which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and having lipase activity, has G at the position corresponding to position 206 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. is preferred.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 206 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Q in the parent lipase.
  • a parent lipase is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80, 83 or 97% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and having lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and having lipase activity is Pseudomonas sp.
  • the lipase PspLip NCBI Accession No.
  • WP_056840927.1 derived from The parent lipase, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least the above-described identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and having lipase activity, has F at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. , those having D at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, those having R at the position corresponding to position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or those having R at position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Those having M at the corresponding positions are preferred, and those having F and D at positions corresponding to positions 31 and 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, respectively, or those having M at positions 77 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • those having R and M at the corresponding positions are more preferable, and those having F, D and M at positions corresponding to positions 31, 32 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are even more preferable, and SEQ ID NO: More preferred are those having F, D, R, and M at positions corresponding to positions 31, 32, 77, and 181 of the amino acid sequence of No. 2, respectively.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y, or The amino acid residue at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with G, or the amino acid residue at the position corresponding to position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with K.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with L, or it is selected from the positions corresponding to positions 31, 32, 77, and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • At least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues are Y at the position corresponding to position 31, G at the position corresponding to position 32, K and 181 at the position corresponding to position 77. It is substituted with L at the position corresponding to the position. More preferably, in the parent lipase, the amino acid residue at the position corresponding to position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with K, or the amino acid residue at the position corresponding to positions 31 and 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with K.
  • amino acid residues of SEQ ID NO: 2 are substituted with Y and G, respectively, or the amino acid residues corresponding to positions 77 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted with K and L, respectively, or the amino acid residues of SEQ ID NO: 2 are substituted with K and L, respectively.
  • Amino acid residues at positions corresponding to positions 31, 32, and 181 of the amino acid sequence are substituted with Y, G, and L, respectively, or positions 31, 32, 77, and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid residues at the corresponding positions are substituted with Y, G, K, and L, respectively.
  • F at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 is replaced with Y
  • D at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 is replaced with G
  • R at the position corresponding to position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 is replaced with K
  • M at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 is replaced with L
  • at least two (preferably three, more preferably four) amino acid residues selected from F at the position corresponding to position 31, D at the position corresponding to position 32, R at the position corresponding to position 77, and M at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 are replaced with Y at the position corresponding to position 31, G at the position corresponding to position 32, K at the position corresponding to position 77, and L at the position corresponding to position 18
  • R at the position corresponding to position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 is replaced with K
  • F and D at the positions corresponding to positions 31 and 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 are replaced with Y and G, respectively
  • R and M at the positions corresponding to positions 77 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 are replaced with K and L, respectively
  • F, D and M at the positions corresponding to positions 31, 32 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 are replaced with Y, G and L, respectively
  • F, D, R and M at the positions corresponding to positions 31, 32, 77 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 are replaced with Y, G, K and L, respectively.
  • a parent lipase is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80 or 81% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and having lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and having lipase activity is Pseudomonas sp.
  • the lipase PspLip2 (NCBI Accession No.
  • WP_088424928.1 derived from The parent lipase, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least the above-described identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and having lipase activity, has A at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. , or those having V at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are preferable, and those having A and V at positions corresponding to positions 90 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are more preferable. .
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with C, or The amino acid residue at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with L, or the amino acid residue at the position corresponding to position 90 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with C and L, respectively. Replaced.
  • a at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with C. or, V at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with L, or A and V at the positions corresponding to positions 90 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are replaced with C and V, respectively. Replaced by L.
  • a parent lipase is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and having lipase activity.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and having lipase activity is the lipase PaLip derived from Pseudomonas abietaniphila (NCBI Accession No. WP_062381422.1).
  • the parent lipase which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and having lipase activity, has M at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. is preferred.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Y in the parent lipase.
  • M at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 in the parent lipase is replaced with Y.
  • the present invention also provides lipase variants.
  • the lipase variant of the present invention is a lipase consisting of an amino acid sequence in which amino acid residues at predetermined positions in numbering based on SEQ ID NO: 2 are substituted with predetermined amino acid residues in the amino acid sequence of the parent lipase. It is a polypeptide that has activity.
  • the lipase mutant of the present invention is any lipase mutant selected from the following (a) to (v) and (aa) to (ae).
  • a lipase variant having at least two amino acid residues selected from G at a position corresponding to position 186 and G at a position corresponding to position 186;
  • a lipase consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and having C at the position corresponding to position 90 and L at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Mutant.
  • lipase variants (a) to (v) preferred lipase variants are lipase variants (a), (c) to (g), (i) to (k), (n), (o), (r) and (t) to (v).
  • the lipase variant (aa) is preferably the lipase variants (aa-1) to (aa-4) shown below, the lipase variant (ab) is preferably the lipase variants (ab-1) to (ab-6) shown below, the lipase variant (ac) is preferably the lipase variants (ac-1) to (ac-2) shown below, and the lipase variant (ad) is preferably the lipase variants (ad-1) to (ad-4) shown below.
  • (aa-1) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and having Y at the position corresponding to position 31 and G at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • (aa-2) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and having C at the position corresponding to position 90 and L at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • (aa-3) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, wherein the lipase variant has G at the position corresponding to position 32 and C at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • (aa-4) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with
  • the lipase mutant of the present invention is a substitute for the parent lipase, that is, before the substitution of the amino acid residue at the predetermined position. Compared to lipase, expression in different species is improved.
  • amino acid residue substitution sites are indicated by numbering based on SEQ ID NO:2.
  • Table 1 shows the amino acid residue substitution sites for each parent lipase, numbered based on the amino acid sequence of each parent lipase and numbered based on the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • the substitution of the amino acid residue with Y at the position corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence having at least the above-described identity with SEQ ID NO: 10 or 34, This is a common substitution when a polypeptide having lipase activity is used as a parent lipase.
  • Substitution of the amino acid residue with Y at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least the predetermined identity with SEQ ID NO: 4, 10, or 14 and having lipase activity. This is a common substitution when using a peptide as a parent lipase.
  • Substitution of the amino acid residue with G at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 results in a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least the above predetermined identity with SEQ ID NO: 4, 10, or 14, and having lipase activity. This is a common substitution when using a peptide as a parent lipase.
  • Substitution of the amino acid residue with C at the position corresponding to position 90 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 results in a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least the above-described identity with SEQ ID NO: 4 or 16 and having lipase activity. This is a common substitution when used as a parent lipase.
  • Substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with L consists of an amino acid sequence having at least the predetermined identity with SEQ ID NO: 4, 14, or 16, and has lipase activity. This is a common substitution when using a peptide as a parent lipase.
  • the lipase mutants of the present invention may include mutations at any other positions relative to the parent lipase (e.g., deletions, substitutions, additions, insertions) as long as they do not interfere with heterologous expression. It may also have the following.
  • the mutation may be naturally occurring or artificially introduced.
  • Lipase variants of the invention can be produced using a variety of mutagenesis techniques known in the art. For example, a polynucleotide encoding an amino acid residue to be replaced in a parent lipase gene (reference lipase gene) encoding the standard amino acid sequence is mutated into a polynucleotide encoding the amino acid residue after the substitution, and then the mutation It can be produced by expressing a mutant from a gene.
  • the polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention may be in the form of single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or artificial nucleic acid, or may be cDNA or chemically synthesized DNA without introns.
  • mutagenesis techniques known in the art can be used as means for mutating the amino acid residues of the parent lipase.
  • a polynucleotide that encodes the amino acid sequence of a parent lipase hereinafter also referred to as a parent gene
  • mutating a nucleotide sequence that encodes an amino acid residue to be mutated into a nucleotide sequence that encodes the amino acid residue after the mutation A polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention can be obtained by this method.
  • Introduction of a desired mutation into a parent gene can basically be performed using various site-directed mutagenesis methods well known to those skilled in the art.
  • the site-directed mutagenesis method can be performed by any method such as inverse PCR method or annealing method.
  • Commercially available site-directed mutagenesis kits e.g., Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, QuickChange Multi Site-Directed Mutagen) esis Kit, etc.
  • site-directed mutagenesis kits e.g., Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, QuickChange Multi Site-Directed Mutagen
  • Site-specific mutation introduction into a parent gene can most commonly be performed using a mutation primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • the mutation primer anneals to a region containing a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated in the parent gene, and replaces the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated with the mutated amino acid. It may be designed to include a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding a residue. Those skilled in the art can appropriately recognize and select the nucleotide sequences (codons) encoding the amino acid residues before and after mutation based on standard textbooks.
  • site-directed mutagenesis is performed by splicing by overlap extension (SOE), which amplifies DNA fragments on the upstream and downstream sides of the mutation site using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced, respectively.
  • SOE overlap extension
  • a method of linking them together by PCR (Gene, 1989, 77(1): p61-68) can also be used.
  • Template DNA containing the parent gene can be prepared by extracting genomic DNA from the above-mentioned lipase-producing microorganism by a conventional method, or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription.
  • a corresponding nucleotide sequence may be chemically synthesized based on the amino acid sequence of the parent lipase and used as the template DNA.
  • DNA sequences containing base sequences encoding lipases consisting of amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 34, respectively, were SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, Nos. 11, 13, 15 and 33.
  • the mutation primer can be produced by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4esearch, 1989, 17:7059-7071). Such primer synthesis can also be carried out using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (manufactured by ABI, etc.).
  • a polynucleotide encoding a lipase mutant of the present invention having a desired mutation is obtained by performing site-directed mutagenesis as described above using a primer set containing the mutation primer and using the parent gene as a template DNA. be able to.
  • the polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention may comprise single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA, or other artificial nucleic acid.
  • the DNA, cDNA, and RNA may be chemically synthesized.
  • the polynucleotide may also comprise a nucleotide sequence of an untranslated region (UTR) in addition to an open reading frame (ORF).
  • the polynucleotide may also be codon-optimized according to the species of the transformant used to produce the mutant polypeptide of the present invention. Information on codons used by various organisms is available from the Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
  • the obtained polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention can be incorporated into a vector.
  • the type of vector containing the polynucleotide is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, phage, phagemid, cosmid, virus, YAC vector, or shuttle vector.
  • the vector is preferably, but not limited to, a vector that can be amplified in a bacterium, preferably a bacterium of the genus Bacillus (for example, Bacillus subtilis or a mutant strain thereof), and more preferably a vector capable of amplifying the introduced gene in a bacterium of the genus Bacillus.
  • shuttle vectors which are vectors that can be replicated in both Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the pase mutant of the present invention.
  • preferred vectors include, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No. 3492935), pHY300PLK (an expression vector capable of transforming both Escherichia coli and Bacillus subtilis; Jpn J Genet, 1985, 60: Shuttle vectors such as pAC3 (Nucleic Acids Res, 1988, 16:8732); Examples include plasmid vectors that can be used to transform bacteria belonging to the genus Bacillus.
  • plasmid vectors derived from E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • the above-mentioned vector may include a DNA region containing a DNA replication initiation region or an origin of replication.
  • a promoter region, a terminator region, or an expressed protein for initiating transcription of the gene is provided upstream of the polynucleotide encoding the lipase mutant of the present invention (i.e., the lipase mutant gene).
  • a control sequence such as a secretion signal region for secretion to the outside of the cell may be operably linked.
  • control sequences such as the promoter region, terminator region, secretion signal region, etc. are not particularly limited, and commonly used promoters and secretion signal sequences can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
  • suitable examples of control sequences that can be incorporated into vectors include Bacillus sp.
  • Examples include the cellulase gene promoter and secretion signal sequence of the KSM-S237 strain.
  • the vector of the present invention may further incorporate a marker gene (for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.) for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced. You can leave it there.
  • a marker gene for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.
  • a gene encoding a required nutrient synthesizing enzyme may be incorporated into the vector as a marker gene.
  • a gene related to the metabolism may be incorporated into the vector as a marker gene.
  • An example of such a metabolism-related gene is an acetamidase gene for utilizing acetamide as a nitrogen source.
  • the polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention can be linked to a control sequence and a marker gene by a method known in the art, such as the SOE (splicing by overlap extension)-PCR method (Gene, 1989, 77:61-68).
  • SOE splicing by overlap extension
  • the procedure for introducing the linked fragment into a vector is well known in the art.
  • Transformed cells By introducing into a host a vector containing a polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention, or by introducing a DNA fragment containing a polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention into the genome of the host, Transformed cells can be obtained.
  • Examples of host cells include microorganisms such as bacteria and filamentous fungi.
  • bacteria include Escherichia coli, bacteria belonging to the genus Staphylococcus, genus Enterococcus, genus Listeria, and genus Bacillus. Bacteria of the genus Bacillus are preferred, bacteria of the genus Bacillus are more preferred, and Bacillus subtilis (eg, Bacillus subtilis Marburg No. 168 or a mutant strain thereof) is even more preferred.
  • Bacillus subtilis mutants include J. subtilis mutants. Biosci. Bioeng. , 2007, 104(2): 135-143, and the protease 9-deficient strain KA8AX, as well as Biotechnol.
  • the D8PA strain is a protease octad-deficient strain with improved protein folding efficiency.
  • filamentous fungi include Trichoderma, Aspergillus, Rhizopus, and the like.
  • a method for introducing the vector into the host methods commonly used in the field, such as protoplast method and electroporation method, can be used. By selecting a strain into which the introduction has been properly carried out using marker gene expression, auxotrophy, etc. as indicators, it is possible to obtain the desired transformant into which the vector has been introduced.
  • a fragment in which a polynucleotide encoding a lipase variant of the present invention, a control sequence, and a marker gene are linked can be directly introduced into the host genome.
  • a DNA fragment is constructed by adding sequences complementary to the host's genome to both ends of the above-mentioned ligated fragment by SOE-PCR method, etc., and this is introduced into the host to create a gap between the host genome and the DNA fragment.
  • a polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention is introduced into the genome of the host.
  • the thus obtained transformant into which the polynucleotide encoding the lipase variant of the present invention or the vector containing the same has been introduced is cultured in an appropriate medium, the gene encoding the protein on the vector will be expressed.
  • the lipase variants of the invention are then produced.
  • the medium used for culturing the transformant can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of microorganism of the transformant.
  • the lipase mutant of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the lipase mutant of the present invention or a transcription product thereof using a cell-free translation system.
  • a "cell-free translation system” is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which reagents such as amino acids necessary for protein translation are added to a suspension obtained by mechanically disrupting host cells. It is composed of
  • the lipase variant of the present invention produced in the above culture or cell-free translation system can be isolated or purified by using a general method used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., either alone or in appropriate combination.
  • the protein recovered from the culture may be further purified by known means.
  • the thus obtained lipase variants of the present invention have improved heterologous expression properties compared to the parent lipase.
  • "Improved heterologous expression” means that the expression level of the lipase is higher than that of the parent lipase when expressed in a species different from that of the parent lipase.
  • the heterologous species is not particularly limited as long as it is a species different from that of the parent lipase, but is preferably a microorganism widely used in protein expression systems, more preferably Escherichia coli or Bacillus bacteria, even more preferably Bacillus bacteria, and even more preferably Bacillus subtilis.
  • the expression level of the lipase variant of the present invention may be measured by a method for measuring the expression level of a protein known to those skilled in the art, or may be measured using the lipase activity of the lipase variant as an index.
  • the heterologous expression level of the lipase variant of the present invention (expression level of the lipase variant in a heterologous species) may be preferably 130% or more, more preferably 150% or more, compared to that of the parent lipase.
  • the present invention provides a method for improving heterologous expression of lipase.
  • the method of the present invention includes substituting an amino acid residue at a predetermined position in the parent lipase with a predetermined numbering based on SEQ ID NO: 2.
  • the details of the method are the same as the method for producing the lipase mutant of the present invention described above.
  • lipase variants In addition to ester hydrolysis, lipase catalyzes various reactions such as ester synthesis, transesterification, and acidolysis. Taking advantage of this reactivity, lipases are used in a variety of industrial applications, including cleaning, optical resolution, biofuel production, oil and fat processing, wastewater treatment, pulp production, and leather production. Since the lipase mutant of the present invention has improved heterologous expression compared to the parent lipase, it can be industrially advantageously produced in large quantities by heterologous expression, and is suitable for use in such industrial applications. can do.
  • the lipase mutant sequences of the present invention can be used to search for suitable lipases depending on substrates and uses. Therefore, the lipase variant of the present invention can be used as a cleaning agent, an optical resolution agent, a catalyst for ester synthesis, a catalyst for oil and fat processing, a wastewater treatment agent, a pulp treatment agent, a leather treatment agent, etc., and preferably can be used as a cleaning agent.
  • cleaning agents include clothing detergents, dishwashing agents, bleaching agents, hard surface cleaning agents, drain cleaners, denture cleaners, and disinfectant cleaners for medical instruments.
  • the above agent may be the lipase mutant of the present invention alone, or may be an enzyme composition containing it.
  • an enzyme composition may be a solid composition such as a powder, or a liquid composition.
  • the enzyme composition containing the lipase variant of the present invention may contain, in addition to the lipase variant, any additives such as an inactive carrier, a pH adjuster, a dispersant, a buffer, a preservative, etc., as appropriate.
  • the lipase variant contained in the enzyme composition may be one type or a combination of two or more types.
  • the content of the lipase variant of the present invention in the enzyme composition of the present invention is not particularly limited as long as the lipase variant exhibits activity, but for example, preferably 0.1 mg or more per 1 kg of the enzyme composition, or more. It is preferably 1 mg or more, more preferably 5 mg or more, and preferably 50,000 mg or less, more preferably 5,000 mg or less, and even more preferably 500 mg or less. Further, the amount is preferably 0.1 to 50,000 mg, more preferably 1 to 5,000 mg, and even more preferably 5 to 500 mg.
  • any lipase variant selected from the following (a) to (v): (a) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 82% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having D at the position corresponding to position 118 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having Y at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (c) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 91% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having G at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (d) a lipase variant consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and
  • a lipase variant having at least two amino acid residues selected from G at a position corresponding to position 186 and G at a position corresponding to position 186;
  • a lipase consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and having C at the position corresponding to position 90 and L at the position corresponding to position 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the lipase mutant according to ⁇ 1> which is a lipase mutant.
  • the lipase mutant according to ⁇ 2> which is any lipase mutant selected from the following (aa-1) to (ae): (aa-1) Consists of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, with Y at the position corresponding to position 31 and G at the position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a lipase variant with (aa-4) consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, Y at the position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, G at the position corresponding to position 32, a lipase variant having a C at a position corresponding to position 90 and an L at a position corresponding to position 181; (ab-1) Consists of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, with T at the position corresponding to position 125 and P at the position corresponding to position 126 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a lipase variant with (ab-3) consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, T at the position corresponding to position 125 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, P at the position corresponding to position 126, and a lipase variant with a G at a position corresponding to position 293; (ab-4) consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, K at the position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, T at the position corresponding to position 125, and a lipase variant with P at a position corresponding to position 126; (ab-5) consists of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, K at the position corresponding to position 39 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, P at the position corresponding to position 126, and a lipase variant with a G at a position
  • the enzyme composition according to ⁇ 5> which is a detergent, an optical resolution agent, a catalyst for ester synthesis, a catalyst for oil and fat processing, a wastewater treatment agent, a pulp treatment agent, or a leather treatment agent, preferably a cleaning agent.
  • ⁇ 7> A polynucleotide encoding the lipase variant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • ⁇ 8> A vector or DNA fragment comprising the polynucleotide according to ⁇ 7>.
  • ⁇ 9> A transformed cell containing the vector or DNA fragment according to ⁇ 7>.
  • ⁇ 10> The transformed cell according to ⁇ 9>, which is a microorganism.
  • the transformed cell according to ⁇ 10> which is Escherichia coli or a bacterium belonging to the genus Bacillus, preferably a bacterium belonging to the genus Bacillus, and more preferably Bacillus subtilis.
  • ⁇ 12> A method for producing a lipase mutant, comprising the step of culturing the transformed cell according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>.
  • a method for producing a lipase variant comprising any one of the steps (i) to (xxii) below: (i) substituting an amino acid residue at a position corresponding to position 118 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 with D in a polypeptide having lipase activity and consisting of an amino acid sequence having at least 82% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:2; (ii) substituting an amino acid residue at a position corresponding to position 31 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 with Y in a polypeptide having lipase activity, the polypeptide having an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:4; (iii) substituting, in a polypeptide having lipase activity and consisting of an amino acid sequence having at least 91% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, an amino acid residue at a position corresponding to position 32 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 with G;
  • a method for producing a lipase variant comprising any one of the steps selected from the following (xxiii) to (xxvii): (xxiii) substituting amino acid residues at at least two positions selected from positions 31, 32, 90 and 181 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 with Y at the position corresponding to position 31, G at the position corresponding to position 32, C at the position corresponding to position 90 and L at the position corresponding to position 181 in a polypeptide having an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:4 and having lipase activity; (xxiv) substituting amino acid residues at at least two positions selected from positions 39, 125, 126 and 293 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 with K at the position corresponding to position 39, T at the position corresponding to position 125, P at the position corresponding to position 126 and G at the position corresponding to position 293 in a polypeptide having an amino acid sequence having at least
  • ⁇ 15> A method for improving heterologous expression of lipase, comprising any one of the steps (i) to (xxii) above.
  • ⁇ 16> A method for improving heterologous expression of lipase, comprising any one of the steps selected from the above (xxiii) to (xxvii).
  • ⁇ 17> The method according to ⁇ 13> or ⁇ 15>, wherein the step is any one of the steps (i), (iii) to (vii), (ix) to (xi), (xiv), (xv), (xviii), and (xx) to (xxii).
  • lipase expression plasmid was constructed using the plasmid for expressing VHH of SEQ ID NO: 26 containing the Bacillus subtilis spoVG gene-derived promoter described in WO2021/153129 as a template. It was constructed by replacing each lipase gene with the full length ORF containing the VHH gene of the above plasmid by In-Fusion reaction.
  • pHY-SspLip pHY-PfLip
  • pHY-EtLip pHY-YeLip
  • pHY-AnLip pHY-YfLip
  • pHY-PaLip pHY-PspLip2
  • pHY-SaLip pHY-BbLip
  • pHY-EspLip pHY-AspLip
  • pHY-YeLip2 pHY-YmLip
  • pHY-EspLip2 pHY-MiLip
  • pHY-PaLip pHY-PaLip
  • the wild-type lipase expression plasmid or empty vector pHY300PLK (TaKaRa) obtained in (1) was introduced into Bacillus subtilis strain Dpr9 (see Microbial cell factories 20.1 (2021): 1-13.) by the protoplast method, and 2 ⁇ L - Maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate pentahydrate, 0.04% calcium chloride dihydrate, 10 ppm tetracycline; % is ( w/v)%) at 30°C for 3 days, the culture supernatant was collected by centrifugation.
  • 2 ⁇ L - Maltose medium 2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate pentahydrate, 0.04% calcium chloride dihydrate, 10 ppm tetracycline; % is ( w/v
  • the culture supernatant was mixed with an equal volume of 2 ⁇ Laemmli Sample buffer (Bio-Rad) containing 100 mM DTT, and incubated at 100° C. for 3 minutes. After each sample was applied to Any kD TM Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free TM Protein Gel (Bio-Rad), electrophoresis was performed at a constant voltage of 200V. The gel after electrophoresis was photographed using Chemi Doc MP Imaging system (Bio-Rad). Comparing with the empty vector, mark " ⁇ ” if a clear band was confirmed near the molecular weight of lipase, " ⁇ " if a slight band was confirmed, and "-” if no band was confirmed. It is shown in Table 3.
  • PaLip mutant PaLip (SEQ ID NO: 34), which is a lipase closely related to the Proteus/Yersinia clade lipase, was expressed heterologously in the same manner as in (2).
  • 2 ⁇ L of culture supernatant diluted 100 times with 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 100 ⁇ L of substrate solution were mixed in each well of a 96-well assay plate, and the change in absorbance at 405 nm (OD/min) was measured at 30°C. .
  • 2mM 4-nitrophenyl octoate in 20mM Tris-HCl (pH 7.0) was used as the substrate solution.

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Abstract

異種発現性が向上したリパーゼ変異体の提供。親リパーゼのアミノ酸配列に対して、配列番号２を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、リパーゼ変異体。

Description

リパーゼ変異体
　本発明は、リパーゼ変異体に関する。
　リパーゼは、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与し、洗浄用途において有用である。洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａ　ｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２には、１つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下ＰｖＬｉｐ）の変異体が開示されている。特許文献３にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８はＰｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード（Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード）に属するリパーゼである。
　グラム陰性菌由来のリパーゼの多くは、活性型への折りたたみにリパーゼ特異的シャペロンを必要とし（非特許文献１）、異種発現による安価製造に課題を有する。特異的シャペロンの共発現によって異種発現が改善することが報告されている（非特許文献２）が、その生産性は低く、異種発現による安価製造には依然として大きな課題がある。一方、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは特異的シャペロンを必要とせず、異種発現による安価製造において優位性を持つ（非特許文献３、４）。
　以上のように、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは洗浄への適性と安価製造可能性の両者において、洗浄用酵素として優れたポテンシャルを有する。
　リパーゼは、エステル加水分解反応以外にも、エステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシスなど様々な反応を触媒する。この反応性を利用して、洗浄、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造など様々な用途でリパーゼが利用されている。非特許文献５及び６にはＬｉｐＣ１２（Ｌｉｐｒ１３８と同配列）のエステル合成用途における優れた性能が示されており、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは洗浄に限らず多様な産業用途における有用性が期待される。
　アシルグリセロール中のエステル結合の位置特異性、脂肪酸鎖長特異性、光学分割におけるエナンチオ選択性といった基質特異性はリパーゼ種によって大きく異なる。近縁配列のリパーゼ間でもこれらの基質特異性には違いが見られ、最適な反応を行うためには反応系ごとにリパーゼのスクリーニングを行う必要がある。そのため、産業上利用できるリパーゼの配列多様性を広げることが求められている。
　　（特許文献１）特表２０１５－５２３０７８号公報
　　（特許文献２）国際公開公報第２０２０／０４６６１３号
　　（特許文献３）特表２０１５－５２５２４８号公報
　　（非特許文献１）Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686.
　　（非特許文献２）Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12.
　　（非特許文献３）Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
　　（非特許文献４）Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
　　（非特許文献５）Madalozzo, Aline Dutra, et al. Journal of molecular catalysis b: enzymatic 116 (2015): 45-51.
　　（非特許文献６）Madalozzo, Aline Dutra, et al. Biocatalysis and Agricultural
 Biotechnology 8 (2016): 294-300.
　本発明は、下記１）～１１）に係るものである。
　１）下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体。
　２）下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
　３）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
　４）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
　５）４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
　６）５）に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
　７）６）に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
　８）下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をＤに置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をＱに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程。
　９）下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
　１０）上記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
　１１）上記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
各リパーゼのエステラーゼ活性。ｐＨＹ３００ＰＬＫはリパーゼをコードしていない空ベクターの結果を示す。
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を指し、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、典型的にはエステラーゼ活性であり、オクタン酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
　本明細書において、「Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード」とは、タンパク質の進化を表す有根系統樹上でＰｒｏｔｅｕｓ属細菌及びＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含むクレードを指し、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２のアミノ酸配列は、いずれもＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼのアミノ酸配列である。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも８１％の同一性」とは、８１％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも８３％の同一性」とは、８３％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも９１％の同一性」とは、９１％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも９４％の同一性」とは、９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも９７％の同一性」とは、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
　当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記を用いて、以下のように表記される。
　所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置３１のフェニルアラニンは、「Ｆ３１」と示される。
　アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置３１のフェニルアラニンのチロシンへの置換は、「Ｆ３１Ｙ」と示される。
　１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はスラッシュ（「／」）によって分けられ、例えば、「Ｉ２２２Ａ／Ｔ／Ｈ／Ｇ」は、位置２２２のイソロイシンのアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンへの置換を表す。
　本明細書において、プロモーターなどの制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
　本明細書において、所与の変異ポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、変異ポリペプチドに当該変異が加えられる前のポリペプチドである。斯かる親ポリペプチドは、天然（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。
　本発明者らは、タンパク質の進化を表す有根系統樹上でＰｒｏｔｅｕｓ属細菌及びＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含むＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する多様な１６種のリパーゼについて、枯草菌における異種発現性を評価したところ、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼは異種発現にて優位性を持つとの報告があるにもかかわらず、明確な発現が確認できたのは３種のみであり、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて異種発現可能な配列の多様性が実際には小さいという課題を初めて見出した。よって、本発明は、異種発現性が向上したリパーゼ変異体を提供することに関する。
　本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、上記１６種のうちの８種のリパーゼ及びこれらに近縁の１種のリパーゼを用い、リパーゼの異種発現性を向上させる変異を見出した。
　本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比べて異種発現性が向上している。斯かるリパーゼ変異体は、異種発現による安価製造が可能であり、洗浄用途だけでなく、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造などの産業用途全般に使用できる。
＜１．リパーゼ変異体及びその製造方法＞
　本発明は、異種発現性が向上したリパーゼ変異体、及びその製造方法を提供する。
　一態様において、本発明は、リパーゼ変異体の製造方法を提供する。当該本発明の方法は、親リパーゼにおいて、配列番号２を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基を所定のアミノ酸残基に置換することを含む。
　本発明のリパーゼ変異体の親リパーゼの一例としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号２のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．由来のリパーゼＳｓｐＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿０２５１２２４４１．１）である。配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＥを有するものが好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基がＤに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のＥがＤに置換される。
　親リパーゼの別の一例としては、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０、９１又は９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号４のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ由来のリパーゼＰｆＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿１２３５９８５０７．１）である。配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＦを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＥを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＡを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＶを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２に相当する位置にそれぞれＦ及びＥを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＡ及びＶを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の３２位及び９０位に相当する位置にそれぞれＥ及びＡを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＦ、Ｅ、Ａ及びＶを有するものがさらに好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基がＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基がＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＣ及びＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位及び９０位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＧ及びＣに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｇ、Ｃ及びＬに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＥがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のＡがＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＶがＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦ、３２位に相当する位置のＥ、９０位に相当する位置のＡ及び１８１位に相当する位置のＶから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＥがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のＡがＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＶがＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のＦ及びＥがそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のＡ及びＶがそれぞれＣ及びＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３２位及び９０位に相当する位置のＥ及びＡがそれぞれＧ及びＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置のＦ、Ｅ、Ａ及びＶがそれぞれＹ、Ｇ、Ｃ及びＬに置換される。
　親リパーゼの別の一例としては、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号６のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｉｂｏｌｉｉ由来のリパーゼＥｔＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿１１５４５７１９５．１）である。配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＩを有するものが好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基がＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のＩがＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換される。
　親リパーゼの別の一例としては、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号８のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ由来のリパーゼＹｅＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿０６４５１７８９８．１）である。配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＶを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＶを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＥを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＳを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位及び１２６位に相当する位置にそれぞれＶ及びＥを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ及びＳを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｅ及びＳを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位及び１２６位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｖ及びＥを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２６位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｅ及びＳを有するものがさらに好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｖ、Ｅ及びＳを有するものがさらに好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位及び１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＴ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＴ、Ｐ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位及び１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ、Ｔ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２６位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ、Ｐ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ、Ｔ、Ｐ及びＧに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のＶがＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のＶがＴに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のＥがＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のＳがＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のＶ、１２５位に相当する位置のＶ、１２６位に相当する位置のＥ及び２９３位に相当する位置のＳから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ及び２９３位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のＶがＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のＥがＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のＳがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位及び１２６位に相当する位置のＶ及びＥがそれぞれＴ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位及び２９３位に相当する位置のＶ及びＳがそれぞれＫ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のＶ、Ｅ及びＳがそれぞれＴ、Ｐ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位及び１２６位に相当する位置のＶ、Ｖ及びＥがそれぞれＫ、Ｔ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２６位及び２９３位に相当する位置のＶ、Ｅ及びＳがそれぞれＫ、Ｐ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のＶ、Ｖ、Ｅ及びＳがそれぞれＫ、Ｔ、Ｐ及びＧに置換される。
　親リパーゼの別の一例としては、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１０のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ａｒｓｅｎｏｐｈｏｎｕｓ　ｎａｓｏｎｉａｅ由来のリパーゼＡｎＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿０２６８２２４９７．１）である。配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＣを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＦを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＡを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＲを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の２９位及び１８６位に相当する位置にそれぞれＣ及びＲを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置にそれぞれＣ、Ｆ、Ａ及びＲを有するものがさらに好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９位及び１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｙ、Ｇ及びＧに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＣがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＡがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のＲがＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＣ、３１位に相当する位置のＦ、３２位に相当する位置のＡ及び１８６位に相当する位置のＲから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ及び１８６位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＣがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のＲがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９位及び１８６位に相当する位置のＣ及びＲがそれぞれＹ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置のＣ、Ｆ、Ａ及びＲがそれぞれＹ、Ｙ、Ｇ及びＧに置換される。
　本発明のリパーゼ変異体の親リパーゼの一例としては、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１２のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ由来のリパーゼＹｆＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿１４５５３０７４５．１）である。配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＧを有するものが好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基がＱに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のＧがＱに置換される。
　親リパーゼの別の一例としては、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８３又は９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１４のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．由来のリパーゼＰｓｐＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿０５６８４０９２７．１）である。配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＦを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＤを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＲを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＭを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置にそれぞれＦ及びＤを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の７７位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＲ及びＭを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＦ、Ｄ及びＭを有するものがさらに好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＦ、Ｄ、Ｒ及びＭを有するものがさらに好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ及びＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｇ及びＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｇ、Ｋ及びＬに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＤがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のＲがＫに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＭがＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦ、３２位に相当する位置のＤ、７７位に相当する位置のＲ及び１８１位に相当する位置のＭから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のＲがＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のＦ及びＤがそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位及び１８１位に相当する位置のＲ及びＭがそれぞれＫ及びＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位及び１８１位に相当する位置のＦ、Ｄ及びＭがそれぞれＹ、Ｇ及びＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置のＦ、Ｄ、Ｒ及びＭがそれぞれＹ、Ｇ、Ｋ及びＬに置換される。
　親リパーゼの別の一例としては、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０又は８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１６のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．由来のリパーゼＰｓｐＬｉｐ２（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿０８８４２４９２８．１）である。配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＡを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＶを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＡ及びＶを有するものがより好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基がＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＣ及びＬに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のＡがＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＶがＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のＡ及びＶがそれぞれＣ及びＬに置換される。
　親リパーゼの別の一例としては、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１６のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ由来のリパーゼＰａＬｉｐ（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＰ＿０６２３８１４２２．１）である。配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＭを有するものが好ましい。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換される。
　該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＭがＹに置換される。
　本発明はまた、リパーゼ変異体を提供する。本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼのアミノ酸配列に対して、配列番号２を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、リパーゼ活性を有するポリペプチドである。
　本発明のリパーゼ変異体は、具体的には、下記（ａ）～（ｖ）及び（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
　リパーゼ変異体（ａ）～（ｖ）のうち、好ましいリパーゼ変異体は、リパーゼ変異体（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）である。
　リパーゼ変異体（ａａ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａａ－１）～（ａａ－４）であり、リパーゼ変異体（ａｂ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａｂ－１）～（ａｂ－６）であり、リパーゼ変異体（ａｃ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａｃ－１）～（ａｃ－２）であり、リパーゼ変異体（ａｄ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａｄ－１）～（ａｄ－４）である。
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるＧ及び９０位に相当する位置におけるＣを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるＫ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
　上述の所定位置のアミノ酸残基の置換は、リパーゼの異種発現性を向上させるための置換であり、したがって、本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼ、すなわち所定位置のアミノ酸残基の置換前のリパーゼと比して、異種における発現性が向上している。
　本発明のリパーゼ変異体において、アミノ酸残基の置換部位（変異位置）は、配列番号２を基準とした番号付けで示される。下記表１に、各親リパーゼについて、アミノ酸残基の置換部位を、該各親リパーゼのアミノ酸配列を基準とした番号付けと配列番号２のアミノ酸配列を基準とした番号付けとで示す。
　表１に示すように、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＹへの置換は、配列番号１０又は３４と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＹへの置換は、配列番号４、１０又は１４と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＧへの置換は、配列番号４、１０又は１４と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＣへの置換は、配列番号４又は１６と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＬへの置換は、配列番号４、１４又は１６と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。
　本発明のリパーゼ変異体は、上記所定位置における変異に加えて、その異種発現性を妨げない限り、親リパーゼに対して他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有するものであってもよい。当該変異は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
＜２．本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド＞
　本発明のリパーゼ変異体は、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して製造することができる。例えば、その基準アミノ酸配列をコードする親リパーゼ遺伝子（基準リパーゼ遺伝子）内の置換対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、置換後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子から変異体を発現させることにより、製造することができる。
　本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
　本発明において、親リパーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親リパーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
　親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
　親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したリパーゼを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び３４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び３３に示した。
　変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　当該本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
＜３．ベクター又はＤＮＡ断片＞
　得られた本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のパーゼ変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）などのシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）を用いることもできる。
　上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわちリパーゼ変異体遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。
　上記プロモーター領域、ターミネーター領域、分泌シグナル領域などの制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列などが挙げられる。
　あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
　上記本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
＜４．形質転換細胞＞
　本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
　宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌が好ましく、バチルス属細菌がより好ましく、枯草菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ　Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）がさらに好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）などが挙げられる。
　宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
　あるいは、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
　斯くして得られた、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のリパーゼ変異体が生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
　あるいは、本発明のリパーゼ変異体は、無細胞翻訳系を使用して本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
　上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のリパーゼ変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
＜５．リパーゼの異種発現性の向上方法＞
　斯くして得られる本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して、異種発現性が向上している。
　「異種発現性の向上」とは、親リパーゼが由来する生物種と異なる生物種にて発現させた場合の発現量が親リパーゼより増加していることを意味する。ここで、異種とは、親リパーゼが由来する生物種と異なる生物種であれば特に制限されないが、タンパク質発現系に広く用いられる微生物が好ましく、大腸菌又はバチルス属細菌がより好ましく、バチルス属細菌がさらに好ましく、枯草菌がさらに好ましい。本発明のリパーゼ変異体の発現量は、当業者に公知のタンパク質の発現量の測定方法により測定してもよいし、該リパーゼ変異体のリパーゼ活性を指標として測定してもよい。本発明のリパーゼ変異体の異種発現性（異種におけるリパーゼ変異体発現量）は、親リパーゼに対して、好ましくは１３０％以上、より好ましくは１５０％以上であり得る。
　したがって、別の一態様において、本発明は、リパーゼの異種発現性の向上方法を提供する。当該本発明の方法は、親リパーゼにおいて、配列番号２を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基を所定のアミノ酸残基に置換することを含む。当該方法の詳細は、上述した本発明のリパーゼ変異体の製造方法と同様である。
＜６．リパーゼ変異体の用途＞
　リパーゼは、エステル加水分解反に加え、エステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシスなど様々な反応を触媒する。この反応性を利用して、洗浄、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造など様々な産業用途でリパーゼが利用されている。本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して、異種発現性が向上しているため、異種発現により工業的に有利に大量に製造することが可能となり、斯かる産業用途に好適に使用することができる。また本発明のリパーゼ変異体配列群は配列が多様であり様々な異なる特性を有することから、基質や用途に応じた好適なリパーゼの探索に使用することができる。よって、本発明のリパーゼ変異体は、洗浄剤、光学分割剤、エステル合成用触媒、油脂加工用触媒、廃水処理剤、パルプ処理剤、皮革処理剤などとなり得、好ましくは洗浄剤となり得る。洗浄剤としては、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などが挙げられる。
　上記剤は、本発明のリパーゼ変異体単体であってもよく、また、これを含有する酵素組成物であってもよい。斯かる酵素組成物は、粉末等の固形組成物であっても液体組成物であってもよい。
　本発明のリパーゼ変異体を含有する酵素組成物には、リパーゼ変異体に加えて、不活性担体、ｐＨ調整剤、分散剤、緩衝剤、防腐剤等の任意の添加剤を適宜配合することができる。酵素組成物に含まれるリパーゼ変異体は、１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　本発明の酵素組成物における本発明のリパーゼ変異体の含有量は、当該リパーゼ変異体が活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、酵素組成物１ｋｇ当たり好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５００００ｍｇ以下、より好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また０．１～５００００ｍｇであるのが好ましく、１～５０００ｍｇであるのがより好ましく、５～５００ｍｇであるのがより好ましい。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体。
＜２＞下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
＜３＞上記（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、＜１＞に記載のリパーゼ変異体。
＜４＞下記（ａａ－１）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、＜２＞に記載のリパーゼ変異体：
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるＧ及び９０位に相当する位置におけるＣを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるＫ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
＜６＞洗浄剤、光学分割剤、エステル合成用触媒、油脂加工用触媒、廃水処理剤、パルプ処理剤、又は皮革処理剤であり、好ましくは洗浄剤である、＜５＞記載の酵素組成物。
＜７＞＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
＜８＞＜７＞に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜９＞＜７＞に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜１０＞微生物である、＜９＞に記載の形質転換細胞。
＜１１＞大腸菌又はバチルス属細菌であり、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌である、＜１０＞に記載の形質転換細胞。
＜１２＞＜９＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
＜１３＞下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をＤに置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をＱに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程。
＜１４＞下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
＜１５＞上記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
＜１６＞上記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
＜１７＞工程が上記（ｉ）、（ｉｉｉ）～（ｖｉｉ）、（ｉｘ）～（ｘｉ）、（ｘｉｖ）、（ｘｖ）、（ｘｖｉｉｉ）及び（ｘｘ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程である、＜１３＞又は＜１５＞に記載の方法。
＜１８＞工程が下記（ｘｘｉｉｉ－１）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程である、＜１４＞又は＜１６＞に記載の方法：
（ｘｘｉｉｉ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、かつ１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、かつ１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
＜１９＞リパーゼ変異体が、親リパーゼに比べて異種発現性が向上している、＜１３＞～＜１８＞のいずれか１項に記載の方法。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）リパーゼ発現プラスミドの構築
　リパーゼ発現プラスミドは、ＷＯ２０２１／１５３１２９に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含む配列番号２６のＶＨＨの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのＶＨＨ遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって各リパーゼ遺伝子を載せ替えることで構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子ＳｓｐＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＡｎＬｉｐ、ＹｆＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ２、ＳａＬｉｐ、ＢｂＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＡｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ２、ＹｍＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ２、ＭｉＬｉｐ、ＰａＬｉｐ（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１及び３３のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び３４のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－ＳｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｔＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ、ｐＨＹ－ＡｎＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｓｐＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＳａＬｉｐ、ｐＨＹ－ＢｂＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＡｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＹｍＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＭｉＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰａＬｉｐを構築した。各リパーゼへの変異導入は、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（１４）：ｅ１１５参照）によって行った。各リパーゼに導入した変異と変異導入位置（各親酵素を基準とした位置と配列番号２を基準とした位置）を表２に示す。尚、以下の実施例においては、各リパーゼの変異導入位置はそれぞれの親酵素を基準とした位置で示す。
（２）野生型リパーゼの発現性評価
　Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する多様な１６配列（ＳｓｐＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＡｎＬｉｐ、ＹｆＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ２、ＳａＬｉｐ、ＢｂＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＡｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ２、ＹｍＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ２、ＭｉＬｉｐ（それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２））を公共データベースから選定し、異種発現性を評価した。（１）で得た野生型リパーゼ発現プラスミドまたは空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴａＫａＲａ）を枯草菌Ｄｐｒ９株（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ　２０．１（２０２１）：１－１３．参照）にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）で、３０℃、３日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。培養上清を１００ｍＭ　ＤＴＴを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と等容量で混合し、１００℃で３分間インキュベートした。各サンプルをＡｎｙ　ｋＤＴＭ　Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）　ＴＧＸ　Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にアプライした後、２００Ｖの定電圧で電気泳動を行った。Ｃｈｅｍｉ　Ｄｏｃ　ＭＰ　Ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて泳動後のゲルを撮影した。
　空ベクターと比較して、リパーゼの分子量近傍に明確なバンドが確認できたものを”〇”、わずかにバンドが確認できたものを”△”、バンドが確認できなかったものを”－”で表３に示す。検証した１６配列のうち、明確なリパーゼのバンドが確認できたのは３配列のみであったことから、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて、異種大量発現可能な配列の多様性が小さいという課題があることを見出した。
（３）リパーゼ変異体の発現性評価
　（２）と同様の手法でリパーゼ変異体の異種発現を行った。リパーゼＰＳアマノＳＤ（富士フイルム和光純薬）を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に溶解し、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＢＳＡを標準として濃度を測定した。濃度既知のリパーゼＰＳアマノＳＤと共に培養上清を（２）と同様の手法でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。リパーゼＰＳアマノＳＤを標準として、バンド強度から培養上清中のリパーゼ濃度を定量した（表４）。Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードの様々なリパーゼについて、部位特異的改変により異種発現性が大幅に改善した。
（４）配列同一性の計算
　異種発現性が大幅に向上した変異体（ＳｓｐＬｉｐ　Ｅ１１８Ｄ、ＰｆＬｉｐ　Ｆ３０Ｙ　Ｅ３１Ｇ　Ａ８９Ｃ　Ｖ１８０Ｌ、ＥｔＬｉｐ　Ｉ２２２Ｇ、ＹｅＬｉｐ　Ｖ３８Ｋ　Ｖ１２４Ｔ　Ｅ１２５Ｐ　Ｓ２９２Ｇ、ＡｎＬｉｐ　Ｃ２４Ｙ　Ｆ２６Ｙ　Ａ２７Ｇ　Ｒ１８１Ｇ、ＹｆＬｉｐ　Ｇ２０６Ｑ、ＰｓｐＬｉｐ　Ｆ３０Ｙ　Ｄ３１Ｇ　Ｒ７６Ｋ　Ｍ１７９Ｌ、ＰｓｐＬｉｐ２　Ａ８９Ｃ　Ｖ１８０Ｌ）間の配列同一性を、Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて計算した（表５）。これらの変異体は、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて、異種大量発現可能な配列の多様性を大幅に拡張した。
（５）ＰａＬｉｐ変異体の発現性評価
　Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼと近縁のリパーゼであるＰａＬｉｐ（配列番号３４）について、（２）と同様の手法で異種発現を行った。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で１００倍に希釈した培養上清２μＬと基質溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２ｍＭ　オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。野生型ＰａＬｉｐでは培養上清中にエステラーゼ活性が検出されず活性型リパーゼは異種発現されていないと考えられたが、ＰａＬｉｐ　Ｍ２８Ｙ変異体では培養上清中にリパーゼに由来するエステラーゼ活性が検出された（図１）。

Claims (15)

  1. 　下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にアスパラギン酸を有するリパーゼ変異体；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
    （ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
    （ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にスレオニンを有するリパーゼ変異体；
    （ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にプロリンを有するリパーゼ変異体；
    （ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にグルタミンを有するリパーゼ変異体；
    （ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
    （ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
    （ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
    （ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体。
  2. 　下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
    （ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
    （ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
    （ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
    （ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
    （ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
  3. 　上記（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、請求項１に記載のリパーゼ変異体。
  4. 　下記（ａａ－１）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、請求項２に記載のリパーゼ変異体：
    （ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるグリシン及び９０位に相当する位置におけるシステインを有するリパーゼ変異体；
    （ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
    （ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるリジン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
    （ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
  7. 　請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
  8. 　請求項７に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
  9. 　微生物である、請求項８に記載の形質転換細胞。
  10. 　大腸菌又はバチルス属細菌である、請求項９記載の形質転換細胞。
  11. 　請求項８～１０のいずれか１項に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
  12. 　下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸に置換する工程；
    （ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
    （ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
    （ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンに置換する工程；
    （ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
    （ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換する工程；
    （ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をプロリンに置換する工程；
    （ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミンに置換する工程；
    （ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
    （ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
    （ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
    （ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
    （ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程。
  13. 　下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
    （ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、９０位に相当する位置ではシステイン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
    （ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではリジン、１２５位に相当する位置ではスレオニン、１２６位に相当する位置ではプロリン、及び２９３位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
    （ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではチロシン、３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、及び１８６位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
    （ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、７７位に相当する位置ではリジン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
    （ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程。
  14. 　下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法：
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸に置換する工程；
    （ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
    （ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
    （ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンに置換する工程；
    （ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
    （ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換する工程；
    （ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をプロリンに置換する工程；
    （ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミンに置換する工程；
    （ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
    （ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
    （ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
    （ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
    （ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
    （ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
    （ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程。
  15. 　下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法：
    （ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、９０位に相当する位置ではシステイン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
    （ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではリジン、１２５位に相当する位置ではスレオニン、１２６位に相当する位置ではプロリン、及び２９３位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
    （ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではチロシン、３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、及び１８６位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
    （ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、７７位に相当する位置ではリジン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200013439A (ko) * 2018-07-30 2020-02-07 한국생명공학연구원 에스터전이반응 효율이 향상된 변이 리파제 및 이를 이용한 바이오디젤 전환 기술
KR20200050438A (ko) * 2018-11-01 2020-05-11 한국생명공학연구원 활성 개선된 리조무코르 미에헤이 유래 변이 리파제 및 효모를 이용한 재조합 생산 방법
CN111218437A (zh) * 2020-02-27 2020-06-02 武汉轻工大学 一种高产的碱性脂肪酶及基因与菌株和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200013439A (ko) * 2018-07-30 2020-02-07 한국생명공학연구원 에스터전이반응 효율이 향상된 변이 리파제 및 이를 이용한 바이오디젤 전환 기술
KR20200050438A (ko) * 2018-11-01 2020-05-11 한국생명공학연구원 활성 개선된 리조무코르 미에헤이 유래 변이 리파제 및 효모를 이용한 재조합 생산 방법
CN111218437A (zh) * 2020-02-27 2020-06-02 武汉轻工大学 一种高产的碱性脂肪酶及基因与菌株和应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein 1 November 2021 (2021-11-01), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Yersinia alsatica]", XP093151094, retrieved from NCBI Database accession no. WP_145530745 *
DATABASE Protein 20 October 2018 (2018-10-20), ANONYMOUS : "MULTISPECIES: triacylglycerol lipase [Yersinia]", XP093151082, retrieved from NCBI Database accession no. WP_064517898 *
DATABASE Protein 24 April 2018 (2018-04-24), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Arsenophonus nasoniae]", XP093151091, retrieved from NCBI Database accession no. WP_026822497 *
DATABASE Protein 24 April 2018 (2018-04-24), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Pseudomonas abietaniphila]", XP093151102, retrieved from NCBI Database accession no. WP_062381422 *
DATABASE Protein 24 April 2018 (2018-04-24), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Pseudomonas sp. K2I15]", XP093151098, retrieved from NCBI Database accession no. WP_088424928 *
DATABASE Protein 24 April 2018 (2018-04-24), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Pseudomonas sp. Leaf127]", XP093151097, retrieved from NCBI Database accession no. WP_056840927 *
DATABASE Protein 24 September 2019 (2019-09-24), ANONYMOUS : "MULTISPECIES: triacylglycerol lipase [unclassified Serratia (in: enterobacteria)]", XP093151074, retrieved from NCBI Database accession no. WP_025122441 *
DATABASE Protein 7 October 2018 (2018-10-07), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Enterobacillus tribolii]", XP093151080, retrieved from NCBI Database accession no. WP_115457195 *
DATABASE Protein 9 December 2018 (2018-12-09), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Pseudomonas frederiksbergensis]", XP093151077, retrieved from NCBI Database accession no. WP_123598507 *

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