CN114606173A

CN114606173A - 重组大肠杆菌klugin73及其应用

Info

Publication number: CN114606173A
Application number: CN202210349185.1A
Authority: CN
Inventors: 董颖军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN114606173B

Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌KLUGIN73及其应用，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022248；本发明的大肠杆菌KLUGIN73所产生的嗜热糖苷酶兼有水解葡萄糖苷和鼠李糖苷的能力，底物谱广，能实现淫羊藿苷的二糖基一次性水解，反应条件简单且单一，大幅降低酶法水解淫羊藿苷的成本；本发明涉及的水解淫羊藿苷工艺，目标产物单一，即淫羊藿素，没有副产物产生，产品的得率接近100％；本发明的重组糖苷酶可在纯水相中完全水解10mM的淫羊藿苷，其浓度远超其在水中溶解度的1000倍以上，使得酶法水解淫羊藿苷生产淫羊藿素工艺更具有工业化应用价值。

Description

重组大肠杆菌KLUGIN73及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种重组大肠杆菌KLUGIN73 及其应用。

背景技术

2022年1月10日，国家药品监督管理局批准淫羊藿素(阿可拉定)软胶囊为国家一类创新药，获批用于不适合或患者拒绝接受标准治疗，且既往未接受过全身系统性治疗的、不可切除的肝细胞癌。其核心成分淫羊藿素 (Icaritin，别名:3,5,7-三羟基-2-(4-甲氧苯基)-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基) -4H-1-苯并吡喃-4-酮，CAS号：118525-40-9)来源于传统草本中药—淫羊藿。

然而草本植物淫羊藿中，淫羊藿素几乎不存在，它通常以结合一分子葡萄糖和一分子鼠李糖的二糖苷形式存在。该糖苷被称为淫羊藿苷 (Icariin，别名:4′-O-甲基-8-γ，γ-dimethylallylkaempferol-3-鼠李糖苷素-7- 葡糖苷，CAS号489-32-7)，属于8-异戊烯基黄酮苷类化合物，在淫羊藿草本中含量低于0.1％。因此必须将淫羊藿苷上两分子糖基水解后才能发挥药效。但是哺乳动物细胞自身无法生产糖苷酶，只能依靠肠道中某些微生物产生的糖苷酶将糖苷水解而获取苷元，因此肠道微生物糖苷酶的活性决定了人体吸收中药有效成分的能力，这也就是中药“因人而异”的原因之一。

化学法利用强酸水解淫羊藿苷生产淫羊藿素，但由于酸水解效率不高，而且通常会导致烯烃键上的甲基和酚羟基脱水成环而不可避免地产生大量副产物-脱水淫羊藿素(CAS号38226-86-7)，导致产率低，生产成本高，且过量使用强酸对环境的压力大。

目前有报道用特殊葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶复配后，在常温，中强酸条件下水解淫羊藿苷生产淫羊藿素。该方法具有对环境友好，而且无副产物产生等诸多优点。但是其以下缺点也不容忽视：

1.由于酶对底物的特异性，目前只有生产两种催化剂(酶)才能获得淫羊藿素，因此催化剂的生产成本被提高。另外，两种酶水解条件的差异性，导致水解反应效率的下降；

2.底物淫羊藿苷的水溶性极低(溶于乙醇、乙酸乙酯，难溶于水，不溶于醚、苯、氯仿)，即使在甲醇中溶解度也不超过3mM。而常规的酶制剂只能在水相中，且无法耐受高浓度的有机溶剂。因此酶水解的工作浓度很低，最终导致水解体积过大，加大后续纯化工作的压力；

3.高温会导致酶失活，因此通常酶的工作温度为25-40℃。但是这样的温度过低，不利于底物在水相中溶解，变相降低了酶促反应速度，最终到账时空产率低；

4.目前报道酶法生产淫羊藿素的生产周期为48-96小时，反应周期长，酶容易失活，时空产率不高，最终导致生产成本上升。

基于酶法水解淫羊藿苷生产淫羊藿素的优缺点，我们必要进一步寻找一种高效的、耐底物浓度高、热稳定性强且底物谱广的糖苷酶，以满足大规模工业生产淫羊藿素的需要。

发明内容

本发明针对目前酶法水解淫羊藿苷生产淫羊藿素存在底物耐受低，时空产率不高，工业化应用成本高的问题，提供了一株重组大肠杆菌 KLUGIN73，该菌表达一种嗜热糖苷酶，在高温下快速水解淫羊藿苷生产淫羊藿素，有效提升了酶解反应的时空产率。本发明的重组大肠杆菌 KLUGIN73生产的嗜热酶，底物谱广，耐高底物浓度，对葡萄糖基和鼠李糖基都实现快速切除，且高温下热稳定性极好，降低酶解反应过程中酶活下降的风险，大幅降低催化剂的使用成本。

为实现上述目的，本发明所设计一株重组大肠杆菌KLUGIN73，所述重组大肠杆菌KLUGIN73，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022248。

上述重组菌命名为大肠杆菌KLUGIN73，命名为：Escherichia coli KLUGIN73；并于2022年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022248。

进一步地，所述重组大肠杆菌KLUGIN73中含有blg-XT1412基因， blg-XT1412基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1。

再进一步地，所述大肠杆菌为BL21。

本发明还提供了一种上述的重组大肠杆菌KLUGIN73在制备嗜热糖苷酶中的应用。

本发明还提供了一种上述的重组大肠杆菌KLUGIN73在发酵工艺中的应用。

本发明还提供了一种上述的重组大肠杆菌KLUGIN73生产糖苷酶的方法，包括以下步骤：

1)将重组大肠杆菌KLUGIN73活化，

2)将活化的重组大肠杆菌KLUGIN73置于发酵培养基中发酵，得到发酵产物；

3)将发酵产物中IPTG诱导产酶处理，得到含有重组蛋白XT1412 的大肠杆菌KLUGIN73。

进一步地，所述步骤2)中，

发酵培养基配方为：

碳源：甘油1-3％；氮源：酵母浸粉0.2-1.5％，胰蛋白胨1-3％；无机盐：磷酸二氢钾0.1-0.4％，磷酸氢二钾0.1-0.3％，硫酸铵0.05-0.2％；pH： 6-8；

发酵条件：接种量为：0.1-2％(体积比)；培养时间：12-24小时；培养温度：25-40℃；搅拌速度：100-250r/min。

所述步骤3)中，产酶条件：IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的终浓度0.05mM；培养时间：4-12小时；培养温度：15-35℃；搅拌速度： 50-200r/min。

本发明还提供了一种上述的重组大肠杆菌KLUGIN73在水解生产淫羊藿素工艺中的应用。

进一步地，所述应用中，

反应温度为60℃～100℃，反应pH值为5.0～7.5，反应淫羊藿苷底物浓度为5～12mM；

淫羊藿苷和重组大肠杆菌KLUGIN73发酵液投料比为0.5～5g/L；

水解时间为2.5～5小时。

再进一步地，所述应用中，

反应温度为80℃～100℃，最优选为95℃

反应pH值为5.5～7，最优选为6.5

反应淫羊藿苷底物浓度为8～10mM；最优选为10mM

淫羊藿苷和重组大肠杆菌KLUGIN73发酵液投料比为1～3g/L；最优选为2g/L

水解时间为3～4小时，最优选为3小时。

本发明的有益效果：

1)本发明的大肠杆菌KLUGIN73所产生的嗜热糖苷酶兼有水解葡萄糖苷和鼠李糖苷的能力，底物谱广，能实现淫羊藿苷(葡萄糖、鼠李糖二糖苷)的二糖基一次性水解，反应条件简单且单一，大幅降低酶法水解淫羊藿苷的成本；

2)本发明的重组糖苷酶最适反应温度为95℃，该温度下底物淫羊藿苷溶解度相较于常温下更高，有利于水解反应发生，反应速率相较于常温酶提高15-30倍；

3)本发明涉及的水解淫羊藿苷工艺，目标产物单一，即淫羊藿素，没有副产物产生(酸水解法会产生大量副产物—脱水淫羊藿素)，产品的得率接近100％，如图1所示；

4)本发明的重组糖苷酶可在纯水相中完全水解10mM的淫羊藿苷，其浓度远超其在水中溶解度的1000倍以上，使得酶法水解淫羊藿苷生产淫羊藿素工艺更具有工业化应用价值；

5)本发明涉及的水解淫羊藿苷工艺，在纯水相中进行，无需添加有机溶剂、无机强酸和盐，对环境友好；

6)本发明可实现淫羊藿素(阿可拉定)≥1.28g/L/h的时空产率。

附图说明

图1为重组大肠杆菌KLUGIN73水解淫羊藿苷的HPLC-MS图；

图2为pET24a-blg-XT1412环状质粒图；

图3为水解温度优化图；

图4为水解pH优化图；

图5为最佳底物浓度优化图；

图6为投料比优化图；

图7为最佳水解反应时间时间优化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1重组大肠杆菌KLUGIN73的构建

1.blg-XT1412酶基因的克隆

1.1引物设计

根据blg-XT1412基因序列利用GeneFisher软件在线设计简并引物：

上游引物：5'-ttaGCGGCCGCATGTCCCCCATCCTC-3'；

下游引物：5'-ggcGAATTCTTAGTGATGGTGATG-3'。

1.2模板制备

用100ml的液体YPD培养基，活化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XT1412(乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XT1412公开于公开号为CN10812936A，发明名称为“乳酸克鲁维酵母突变株及其糖苷酶和应用”的中国发明专利)，28℃，250rpm连续培养2天。培养结束后5000rpm离心10min，收集菌体抽提基因组DNA，产物于-20℃保藏待用。

1.3基因扩增

以步骤1.2中产物为模板，用实施例1.1中设计的简并引物和DNA 聚合酶进行PCR，具体反应条件如下：

反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳确认基因大小，并将出现1500-1600 bp片段，用甘油管于-20℃保藏。

2.构建pET24a-bgl-XT1412环状质粒

上述步骤1.3中回收基因片段测序结果正确后，利用Not I和EcoR I 对PCR产物进行双酶切。酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳分离，将 1512bp的片段分别切胶回收，于-20℃保藏。

利用Not I和EcoR I对pET24a载体进行双酶切。酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳分离，将5284bp的片段切胶回收，于-20℃保藏。

在10μl体系中，加入0.5μl线性化pET24a载体，5μl经双酶切的 PCR产物，1μl 10×buffer，1μl T4连接酶，2.5μl无菌ddH₂O。于16℃连接过夜。

连接反应结束后，转化到大肠杆菌DH5α。鉴定为阳性克隆后，抽提质粒，得到pET24a-bgl-XT1412环状质粒，于-20℃载体保藏，该环状质粒图谱如图2所示。

3.重组大肠杆菌KLUGIN73的构建

3.1电转化

将置于冰上的大肠杆菌BL21感受态细胞，加入2中保藏的 pET24a-bgl-XT1412环状质粒，混合均匀进行电击转化。转化结束后将电转化杯中的所有液体转移到无菌Eppendorf管，30℃水浴，2h，10000rpm 离心l min，弃上清，菌体用无菌水悬浮后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基平板上，37℃静置培养1天出现克隆。

3.2重组子基因鉴定

从实施例3.1中随机挑取克隆子，接入含有50μg/ml卡那霉素的LB 液体培养基中37℃，250rpm培养12小时。培养结束后5000rpm离心 10min，收集菌体。使用与1.3中相同引物和条件与DNA聚合酶进行PCR 反应。

反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳确认基因大小。出现1512bp片段的克隆子为阳性，将该克隆子用甘油管于-20℃保藏。

3.3糖苷酶的酶活鉴定

将实施例3.2中重组子发酵后收集菌体，用磷酸钠缓冲液悬浮，以邻硝基苯酚β-D葡萄糖苷(pNPG)为底物进行测定。测活的体系为：磷酸钠缓冲液0.05ml(100mM,pH 7.0)+0.05ml待测菌溶液+15μl pNPG(100 mM,溶于DMSO中)，以不加酶液为空白对照，反应温度为95℃，反应时间1min。加入0.1ml浓度为1M Na₂CO₃终止反应；用酶标仪，在405 nm下取吸光度值(OD)。

3.4重组子鉴定和保藏

将实施例3.2阳性克隆子接种到液体含有50ug/ml卡那霉素液体培养基中，37℃，250rpm培养12小时。当OD600值大于0.4，加入IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其终浓度为0.05mM，30℃，150rpm 诱导4小时离心收集菌体。利用实施例3.3中所述方法测定酶活，将一株酶活阳性的菌株接入无菌甘油管，于-20℃保藏，得到重组菌命名为大肠杆菌KLUGIN73，命名为：Escherichia coli KLUGIN73；并于2022年3 月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022248。

实施例2重组大肠杆菌KLUGIN73的生产发酵工艺

2.1发酵培养基的确定发酵培养基由碳源，氮源和无机盐组成，适用于5-10000L发酵罐，具体成分如下：

碳源：甘油1-3％；

氮源：酵母浸粉0.2-1.5％，胰蛋白胨1-3％；无机盐：磷酸二氢钾 0.1-0.4％，磷酸氢二钾0.1-0.3％，硫酸铵0.05-0.2％，pH：6-8(氨水调节)。

2.2发酵培养和诱导产酶条件的确定

发酵培养基如2.1所示，发酵培养条件具体如下：

接种量：0.1-2％(体积比)；

培养时间：12-24小时；

培养温度：25-40℃

搅拌速度：100-250r/min

培养结束后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其终浓度为0.05mM，开启产酶发酵，培养条件具体如下：

培养时间：4-12小时

培养温度：15-35℃

搅拌速度：50-200r/min

培养结束后(发酵液OD600＝35-50)，根据实施例3.3所示方法确定酶活力。离心，收集菌体于4℃保藏待用。

上述方案适用于5L-10000L发酵罐。

实施例3重组大肠杆菌KLUGIN73生产糖苷酶的方法

1)将重组大肠杆菌KLUGIN73活化，

2)将活化的重组大肠杆菌KLUGIN73置于发酵培养基中发酵，得到发酵产物；其中，发酵培养基配方为：

碳源：甘油1-3％；氮源：酵母浸粉0.2-1.5％，胰蛋白胨1-3％；无机盐：磷酸二氢钾0.1-0.4％，磷酸氢二钾0.1-0.3％，硫酸铵0.05-0.2％；pH： 6-8(氨水调节)；

发酵条件：接种量：0.1-2％(体积比)；培养时间：12-24小时；培养温度：25-40℃；搅拌速度：100-250r/min；

3)将发酵产物诱导产酶处理，得到含有重组蛋白XT1412的大肠杆菌KLUGIN73；其中，

产酶条件：向发酵产物中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其终浓0.05mM；培养时间：4-12小时；培养温度：15-35℃；搅拌速度： 50-200r/min。

实施例4重组大肠杆菌KLUGIN73水解淫羊藿苷生产淫羊藿素工艺

4.1水解温度优化

取实施例2的2.2中，重组大肠杆菌KLUGIN73，在pH 6.0的50mM 磷酸盐缓冲液中，加入5mM淫羊藿苷，分别在30-100℃下连续反应10 分钟，利用HPLC-MS检测淫羊藿苷的转化率，确定最佳反应温度；

结果如图3所示：反应温度为30℃～100℃，优选为60℃～100℃，更优选为80℃～100℃，最优选为95℃。

4.2水解温度优化

取实施例2的2.2中，重组大肠杆菌KLUGIN73，分别在pH4.5-8.0 的50mM磷酸盐缓冲液中，加入5mM淫羊藿苷，在95℃下连续反应 10分钟，利用HPLC-MS检测淫羊藿苷的转化率，确定最佳反应pH；

结果如图4所示：反应pH值为4.5～8，优选为5.0～7.5，更优选为5.5～7，最优选为6.5。

4.3淫羊藿苷浓度优化

取实施例2的2.2中，重组大肠杆菌KLUGIN73，在pH 6.5的50mM 磷酸盐缓冲液中，加入0.5～20mM淫羊藿苷，在95℃下连续反应10分钟，利用HPLC-MS检测淫羊藿苷的含量，确定最佳水解速率；

结果如图5所示：淫羊藿苷底物浓度0.5～20mM，优选为5～12mM，更优选为8～10mM，最优选为10mM。

4.4投料比优化(淫羊藿苷(g)：重组大肠杆菌KLUGIN73发酵体积(L))

取实施例2的2.2中，重组大肠杆菌KLUGIN73，投料比分别为0.1～10 g/L，在pH6.5的50mM磷酸盐缓冲液中，95℃下连续反应10分钟，利用HPLC-MS检测淫羊藿素的产率确定最佳投料比；

结果如图6所示：投料比0.1～10g/L，优选为0.5～5g/L，更优选为1～3 g/L，最优选为2g/L。

4.5水解时间优化

取实施例2的2.2中，重组大肠杆菌KLUGIN73，投料比分别为2g/L，在pH 6.5的50mM磷酸盐缓冲液中，95℃下连续反应10分钟，利用 HPLC-MS检测淫羊藿素的产率确定最佳水解时间；

结果如图7所示：反应时间0.5～8小时，优选为2.5～5小时，更优选为3～4小时，最优选为3小时。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 董颖军

<120> 重组大肠杆菌KLUGIN73及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1512

<212> DNA

<213> 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

<400> 1

atgtccccca tcctcggtta ctggaagatc aagggtctcg tccgcttccc caagcagggt 60

cccctcggtt tcggttactc ctggtccggt ttccagttcg agatgggtct gcccggttcc 120

gaggtcgagt ccgactggtg ggtctgggtc cacgacaagg agaacatcgc ctccggtctg 180

gtctccggtg acctgcccga gaacggtccc gcctactggc acctgtacaa gcaggaccac 240

gacatcgccg agaagctggg tatggactgc atccgcggtg gtatcgagtg ggcccgcatc 300

ttccccaagc ccaccttcga cgtcaaggtc gacgtcgaga aggacgagga gggtaacatc 360

atctccgtcg acgtccccga gtccaccatc aaggagctgg agaagatcgc caacatggag 420

gccctggagc actaccgcaa gatctactcc gactggaagg agcgcggtaa gaccttcatc 480

ctgaacctgt accactggcc cctgcccctg tggatccacg accccatcgc cgtccgcaag 540

ctgggtcccg accgcgcccc cgccggttgg ctggacgaga agaccgtcgt cgagttcgtc 600

aagttcgccg ccttcgtcgc ctaccacctg gacgacctgg tcgacatgtg gtccaccatg 660

aacgagccca acgtcgtcta caaccagggt tacatcaacc tgcgctccgg tttccccccc 720

ggttacctgt ccttcgaggc cgccgagaag gccaagttca acctgatcca ggcccacatc 780

ggtgcctacg acgccatcaa ggagtactcc gagaagtccg tcggtgtcat ctacgccttc 840

gcctggcacg accccctggc cgaggagtac aaggacgagg tcgaggagat ccgcaagaag 900

gactacgagt tcgtcaccat cctgcactcc aagggtaagc tggactggat cggtgtcaac 960

tactactccc gcctggtcta cggtgccaag gacggtcacc tggtccccct gcccggttac 1020

ggtttcatgt ccgagcgcgg tggtttcgcc aagtccggtc gccccgcctc cgacttcggt 1080

tgggagatgt accccgaggg tctggagaac ctgctgaagt acctgaacaa cgcctacgag 1140

ctgcccatga tcatcaccga gaacggtatg gccgacgccg ccgaccgcta ccgcccccac 1200

tacctggtct cccacctgaa ggccgtctac aacgccatga aggagggtgc cgacgtccgc 1260

ggttacctgc actggtccct gaccgacaac tacgagtggg cccagggttt ccgcatgcgc 1320

ttcggtctgg tctacgtcga cttcgagacc aagaagcgct acctgcgccc ctccgccctg 1380

gtcttccgcg agatcgccac ccagaaggag atccccgagg agctggccca cctggccgac 1440

ctgaagttcc agcccacccg cctcctcctc gagtacctcg tcaccaagcg ccatcaccat 1500

caccatcact aa 1512

<210> 2

<211> 503

<212> PRT

<213> 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

<400> 2

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Phe

1 5 10 15

Pro Lys Gln Gly Pro Leu Gly Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly Phe Gln

20 25 30

Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp Trp Trp Val

35 40 45

Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Val Ser Gly Asp

50 55 60

Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu Tyr Lys Gln Asp His

65 70 75 80

Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys Ile Arg Gly Gly Ile Glu

85 90 95

Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr Phe Asp Val Lys Val Asp Val

100 105 110

Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile Ile Ser Val Asp Val Pro Glu Ser

115 120 125

Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu His

130 135 140

Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe Ile

145 150 155 160

Leu Asn Leu Tyr His Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro Ile

165 170 175

Ala Val Arg Lys Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu Asp

180 185 190

Glu Lys Thr Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala Tyr

195 200 205

His Leu Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn

210 215 220

Val Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro Pro

225 230 235 240

Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu Ile

245 250 255

Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser Glu Lys

260 265 270

Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro Leu Ala Glu

275 280 285

Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys Asp Tyr Glu Phe

290 295 300

Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp Trp Ile Gly Val Asn

305 310 315 320

Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys Asp Gly His Leu Val Pro

325 330 335

Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu Arg Gly Gly Phe Ala Lys Ser

340 345 350

Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly Leu

355 360 365

Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met Ile

370 375 380

Ile Thr Glu Asn Gly Met Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro His

385 390 395 400

Tyr Leu Val Ser His Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu Gly

405 410 415

Ala Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu

420 425 430

Trp Ala Gln Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp Phe

435 440 445

Glu Thr Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg Glu

450 455 460

Ile Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala Asp

465 470 475 480

Leu Lys Phe Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Val Thr Lys

485 490 495

Arg His His His His His His

500

Claims

1.一株重组大肠杆菌KLUGIN73，其特征在于：所述重组大肠杆菌KLUGIN73，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022248。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌KLUGIN73，其特征在于：所述重组大肠杆菌KLUGIN73中含有blg-XT1412基因，blg-XT1412基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌KLUGIN73，其特征在于：所述大肠杆菌为BL21。

4.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌KLUGIN73在制备嗜热糖苷酶中的应用。

5.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌KLUGIN73在发酵工艺中的应用。

6.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌KLUGIN73生产糖苷酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将重组大肠杆菌KLUGIN73活化，

3)将发酵产物中IPTG诱导产酶处理，得到含有重组蛋白XT1412的大肠杆菌KLUGIN73。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，

发酵培养基配方为：

碳源：甘油1-3％；氮源：酵母浸粉0.2-1.5％，胰蛋白胨1-3％；无机盐：磷酸二氢钾0.1-0.4％，磷酸氢二钾0.1-0.3％，硫酸铵0.05-0.2％；pH：6-8；

发酵条件：接种量为：0.1-2％；培养时间：12-24小时；培养温度：25-40℃；搅拌速度：100-250r/min。

所述步骤3)中，产酶条件：IPTG的终浓度0.05mM；培养时间：4-12小时；培养温度：15-35℃；搅拌速度：50-200r/min。

8.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌KLUGIN73在水解生产淫羊藿素工艺中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用中，

淫羊藿苷和重组大肠杆菌KLUGIN73发酵液投料比为0.5～5g/L；

水解时间为2.5～5小时。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用中，

反应温度为80℃～100℃，反应pH值为5.5～7，反应淫羊藿苷底物浓度为8～10mM；

淫羊藿苷和重组大肠杆菌KLUGIN73发酵液投料比为1～3g/L；

水解时间为3～4小时。