CN116254211A - 一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用 - Google Patents

一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术和代谢工程领域，涉及一种高产5‑氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用。本发明通过过表达谷氨酰‑tRNA连接酶gltX基因与tRNAGlu提高5‑氨基乙酰丙酸的前体谷氨酰‑tRNA的合成，过表达谷氨酰‑tRNA还原酶hemA基因和谷氨酰‑1‑半醛氨基转移酶hemL基因，强化谷氨酰‑tRNA下游基因的表达，增强5‑氨基乙酰丙酸的合成能力。本发明还公开了利用构建的重组大肠杆菌菌体进行全细胞催化生产ALA的方法，从50mM谷氨酸盐中可产生4.56g/L ALA，底物转化率为75.60％。本发明还公开了固定化细胞催化生产ALA的方法，其固定化细胞可以多次重复使用。

Description

一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的构建方法及其 应用
技术领域
本发明涉及一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用，属于生物技术和代谢工程领域。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一种非蛋白质类的5碳氨基酸，作为四吡咯化合物的重要前体，参与叶绿素、血红素及维生素B12的合成，广泛存在于微生物，动物及植物细胞中。ALA在农业、医药领域具有广泛用途。在农业上，ALA作为植物生长调节剂，绿色除草剂和杀虫剂，在医药上，ALA作为光动力学药物可以治疗癌症。
目前ALA的合成主要包括化学合成法和生物合成法。化学合成法由于反应步骤多，副产物多以及得率低限制了其推广应用。绿色经济的生物合成法已成为未来研究发展的趋势，随着生物技术的进步，利用微生物生产ALA受到广泛关注。自然界中许多生物可以合成ALA，但是这些天然宿主的生产效率低，因此构建工程菌株被看作是提高ALA产量的有效手段。ALA C5合成途径主要涉及3种酶包括谷氨酰-tRNAGlu连接酶(由gltX基因表达)、谷氨酰-tRNAGlu还原酶(由hemA基因表达)及谷氨酰-1-半醛氨基转移酶(由hemL基因表达)。在目前的报道中，利用ALA C5合成途径构建工程菌株主要关注于强化hemA和hemL基因的表达，对于过表达gltX基因和tRNAGlu增加ALA的前体谷氨酰-tRNAGlu的合成从而提高ALA产量的研究未见报道。而且，目前报道中几乎所有的ALA工程菌株都是以葡萄糖为原料通过传统发酵进行生产，存在底物转化率低、发酵液杂质多等缺点，限制了生物法生产ALA的应用。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何进行ALA的高效发酵。
为解决本发明的技术问题，本发明提供一种产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因、tRNAGlu的编码基因、谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因。
上述重组大肠杆菌中，所述谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因、tRNAGlu的编码基因、谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因可以任意顺序排列。在本发明的实施例中，从3’到5’端，依次是谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因、tRNAGlu的编码基因、谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因。
上述重组大肠杆菌中，所述谷氨酰-tRNA连接酶为a1或a2的蛋白质：
a1氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
a2将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-tRNA连接酶活性的由a1衍生的蛋白质；
所述tRNAGlu为脱氧核糖核酸序列是SEQ ID No.3的转运RNA；
所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶为b1或b2的蛋白质：
b1氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
b2将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-tRNAGlu还原酶活性的由b1衍生的蛋白质；
所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶为c1或c2的蛋白质：
c1氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
c2将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-1-半醛氨基转移酶活性的由c1衍生的蛋白质。
上述重组大肠杆菌中，所述谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因为d1-d3中的任一种DNA分子：
d1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第1-1410位的cDNA分子或基因组DNA；
d2在严格条件下与d1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-tRNA连接酶的cDNA分子或基因组DNA；
d3与d1或d2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-tRNA连接酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述tRNAGlu的编码基因为e1-e3中的任一种DNA分子：
e1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第1411-1486位的cDNA分子或基因组DNA；
e2在严格条件下与e1限定的DNA分子杂交且编码所述tRNAGlu的cDNA分子或基因组DNA；
e3与e1或e2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述tRNAGlu的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因为f1-f3中的任一种DNA分子：
f1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第1487-2737位的cDNA分子或基因组DNA；
f2在严格条件下与f1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶的cDNA分子或基因组DNA；
f3与f1或f2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因为g1-g3中的任一种DNA分子：
g1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第2738-4030位的cDNA分子或基因组DNA；
g2在严格条件下与g1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA；
g3与g1或g2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA。
上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％ SDS和1×SSC,0.1％ SDS各洗膜一次。
上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述重组大肠杆菌中，所述重组大肠杆菌按照下述的方法构建。
为解决本发明的技术问题，本发明还提供构建重组大肠杆菌的方法，包括A1或A2：
A1提高作为出发菌的大肠杆菌中谷氨酰-tRNA连接酶、tRNAGlu、谷氨酰-tRNAGlu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因的表达量，得到重组大肠杆菌；
A2在作为出发菌的所述大肠杆菌中导入谷氨酰-tRNA连接酶、tRNAGlu、谷氨酰-tRNAGlu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因，得到重组大肠杆菌。
上述导入可通过同源重组实现。
上述构建方法中，所述重组大肠杆菌通过重组表达载体将含有上文所述的谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因、tRNAGlu的编码基因、谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因的重组表达载体导入所述出发菌中实现。
上述重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述重组大肠杆菌菌体中的的谷氨酰-tRNA连接酶、tRNAGlu、谷氨酰-tRNAGlu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的表达量高于作为出发菌的大肠杆菌；或所述重组大肠杆菌菌体中的谷氨酰-tRNA连接酶、tRNAGlu、谷氨酰-tRNAGlu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的含量高于作为出发菌的大肠杆菌。
上述重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述出发菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述重组大肠杆菌可为BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL。
本发明还保护上述重组载体，所述重组表达载体可pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL。
本发明还提供上述重组大肠杆菌在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用，以及上述构建方法在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。
本发明还提供一种制备5-氨基乙酰丙酸的方法，包括将上述重组大肠杆菌作为细胞催化剂，催化底物谷氨酸盐生成5-氨基乙酰丙酸。
上述制备方法中，所述产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株可优选进行固定化。所述固定化优选为以海藻酸钠作为载体进行包埋。
本发明构建了一种用于生产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的方法：通过过表达谷氨酰-tRNA连接酶gltX基因和tRNAGlu提高5-氨基乙酰丙酸的前体谷氨酰-tRNA的合成，过表达谷氨酰-tRNAGlu还原酶hemA基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶hemL基因，强化谷氨酰-tRNA下游基因的表达，增强5-氨基乙酰丙酸的合成能力。本发明还公开了利用全细胞催化生产ALA的方法，以谷氨酸盐为底物，诱导基因表达后的重组大肠杆菌菌体为细胞催化剂，从50mM谷氨酸盐中可产生4.56g/L ALA，底物转化率为75.60％。本发明还公开了固定化细胞催化生产ALA的方法，以海藻酸钠作为固定化载体以本发明中的重组大肠杆菌为对象来制备固定化细胞，不仅提高了生物法合成ALA的底物转化率，而且其固定化细胞可以多次重复使用。
附图说明
图1为本发明实施例2中以重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL全细胞催化反应生产ALA的ALA产量和底物谷氨酸钠转化率。
图2为本发明实施例3中以固定化的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL重复进行全细胞催化反应生产ALA的ALA产量和底物谷氨酸钠剩余量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、材料与试剂
下述实施例中，质粒提取选用北京康润生物科技有限公司提供的质粒小提试剂盒；DNA片段回收选用天根生化科技有限公司提供的产物纯化试剂盒；细菌基因组提取选用天根生化科技有限公司提供的基因组提取试剂盒；DNA片段扩增选用Takara公司提供的PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增；载体与基因片段的连接选用碧云天生物技术有限公司提供的无缝克隆试剂盒；限制性内切酶选用Takara公司提供的限制性内切酶；DH5α感受态、BL21(DE3)感受态购自博迈德生物科技有限公司；pET30a(+)质粒作为大肠杆菌表达质粒购自博迈德生物科技有限公司；希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)CN-32为ATCC保藏菌株(ATCC BAA-1097)购自宁波明舟生物科技有限公司，产品编号B81303。
下述实施例中，pH 4.6的乙酸钠缓冲液的具体配制方法可为：量取5.7mL冰乙酸，称取8.2g无水乙酸钠，加水定容至100mL，存于4℃备用。
下述实施例中，Ehrlich’s试剂的具体配制方法可为：称取1g对-二甲氨基苯甲醛，加入30mL冰乙酸，然后加入8mL高氯酸(70％)，用冰乙酸定容至50mL，现配现用或暂存于4℃。
下述实施例中，硼酸盐缓冲液的具体配制方法可为：将硼砂和氢氧化钠溶于水定容，使硼砂浓度为0.05M、氢氧化钠浓度为0.2M，调pH值为9.5。
下述实施例中，邻苯二甲醛溶液的具体配制方法可为：将5.0mg邻苯二甲醛溶于100μl甲醇中，加入50μl巯基乙醇，加入pH值为9.5的硼酸缓冲液稀释至1.0ml。
下述实施例中，LB液体培养基的具体配制方法可为：将酵母粉、蛋白胨和氯化钠溶于水定容，使酵母粉浓度为5g/L，蛋白胨浓度为10g/L，氯化钠浓度为10g/L，121℃高温灭菌20min。
下述实施例中，LB液体培养基的具体配制方法可为：将酵母粉、蛋白胨、氯化钠和琼脂粉溶于水定容，使酵母粉浓度为5g/L，蛋白胨浓度为10g/L，氯化钠浓度为10g/L，琼脂粉浓度为20g/L，121℃高温灭菌20min后自然冷却凝固。
下述实施例中，全细胞催化溶液配方为：50mM HEPES-Na(pH＝7.8)，25mM MgCl2。
2、引物及序列
下述实施例中，如无特殊说明，各核苷酸序列的首位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。下述实施例中，各引物按照无缝克隆原理进行引物设计，引物合成和测序由华大基因公司完成，生产ALA大肠杆菌工程菌构建相关引物名称及核苷酸序列具体如下：
gltX-F：tcgagctccgtcgacaagcttATGACAACTAAGACGCGTTTT(小写字母指示的是pET30a(+)质粒骨架序列第5230-5250位的同源序列，斜体字母指示的是HindⅢ限制性内切酶识别序列，下划线指示的是与SEQ ID No.1第1-21位(属于gltX基因)结合的核苷酸序列，)
gltX-R：cgaaggggacTTAGGAATTTATTCTATCTGCTACA(小写字母指示的是与SEQ IDNo.1第1411-1420位(属于tRNAGlu基因)结合的核苷酸序列，下划线指示的是与SEQ ID No.1第1386-1410位(属于gltX基因)结合的核苷酸序列)；
tRNA-F：aaattcctaaGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCTAG(小写字母指示的是与SEQ IDNo.1第1401-1410位(属于gltX基因)结合的核苷酸序列，下划线指示的是与SEQ ID No.1第1411-1433位(属于tRNAGlu基因)结合的核苷酸序列)；
tRNA-R：caaggctcatTGGTATCCCCTAGGGGATTCGAAC(小写字母指示的是与SEQ IDNo.1序列第1487-1496位(属于hemA基因)结合的核苷酸序列，下划线指示的是与SEQ IDNo.1第1463-1486位(属于tRNAGlu基因)结合的核苷酸序列)；
hemA-F：ggggataccaATGAGCCTTGTAGCAATCGGT(小写字母指示的是与SEQ ID No.1序列第1477-1486位(属于tRNAGlu基因)结合的核苷酸序列，下划线指示的是与SEQ ID No.1第1487-1507位(属于hemA基因)结合的核苷酸序列)；
hemA-R：aacgggtcatTTAGTTTTTATCTAATCCAAGCGCT(小写字母指示的是与SEQ IDNo.1第2738-2747位(属于hemL基因)结合的核苷酸序列，下划线指示的是与SEQ ID No.1第2713-2737位(属于hemA基因)结合的核苷酸序列)；
hemL-F：taaaaactaaATGACCCGTTCCGAAGCAC(小写字母指示的是与SEQ ID No.1第2728-2737位(属于hemA基因)结合的核苷酸序列，下划线指示的是与SEQ ID No.1第2738-2756位(属于hemL基因)结合的核苷酸序列)；
hemL-R：ctcgagtgcggccgcaagcttTTAACTTTCGGTTTTCATACTCGC(小写字母指示的是与pET30a(+)质粒骨架序列第5245-5265位结合的核苷酸序列，斜体指示的是HindⅢ限制性内切酶识别序列，下划线指示的是与SEQ ID No.1第4007-4030位(属于hemL基因)结合的核苷酸序列)。
下述实施例中，所有质粒及DNA的测序工作由华大基因研究中心进行。
3、方法
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的部分实验方法的详细步骤如下：
I、ALA产量的测定：
取稀释至适宜倍数的发酵液上清400μl，加入200μl pH 4.6的乙酸钠缓冲液(0.2M)，立即加入100μl乙酰丙酮，充分混匀后沸水浴条件下缩合15min，自然冷却至室温，加入700μl新鲜配置的Ehrlish’s试剂显色，充分混匀后静置15min显色。用分光光度计在554nm下进行测定。注意，比色应在半小时内完成。以ALA(梯希爱上海化成工业发展有限公司货号：A0325)为标准品采用标准曲线法(外标法)进行定量分析ALA。
绘制5-氨基乙酰丙酸的标准曲线：
以2、5、8、10、12mg/L 5-氨基乙酰丙酸标准品，分别取400μl不同浓度的5-氨基乙酰丙酸标准品，加入200μl pH 4.6的乙酸钠缓冲液和100μl乙酰丙酮，沸水浴15min。冷却至室温后，加入700μl Ehrlich’s试剂，充分混匀反应15min，使用分光光度计在554nm下进行检测。
Ehrlich’s的配制：称1g对二甲氨基苯甲醛，加入30ml冰乙酸中，然后加入8ml高氯酸(70％)用冰乙酸定容至50ml，并且现配现用。
ALA产量＝0.0854*OD554吸光值+0.0723
II、谷氨酸钠剩余量的测定：
利用高效液相色谱检测，C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：10％乙腈+30mM乙酸钠-乙酸缓冲液(pH6.5)，流速：0.6ml/min。柱温40℃。检测波长254nm。样品处理：取100μl样品加入200μl硼酸盐缓冲液，然后加入200μl邻苯二甲醛溶液反应1min取20μl反应后的液体进样分析。
高效液相色谱分析中，以谷氨酸钠(国药集团化学试剂有限公司货号：62010636)为标准品根据标准品的保留时间定性和峰面积制作谷氨酸钠的标准曲线。
实施例1构建生产ALA的重组大肠杆菌菌株
本实施例中的出发菌株大肠杆菌BL21(DE3)含gltX基因、tRNAGlu基因、hemA基因及hemL基因，但是活性不高，大肠杆菌BL21(DE3)不积累ALA。
(1)gltX、tRNAGlu、hemA及hemL基因的PCR扩增
采用细菌基因组提取试剂盒提取希瓦氏菌CN-32基因组DNA。
以希瓦氏菌CN-32基因组DNA为模板，以gltX-F/gltX-R为引物，用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶PCR扩增出前后带有用于无缝克隆的同源臂序列的gltX基因片段，该片段中gltX基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1第1-1410位所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
以希瓦氏菌CN-32基因组DNA为模板，以tRNA-F/tRNA-R为引物，用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶PCR扩增出前后带有用于无缝克隆的同源臂序列的tRNAGlu基因片段，该片段中tRNAGlu基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1第1411-1486位所示，该基因不编码蛋白质，是以RNA的形式发挥功能，其RNA序列如SEQ ID No.3所示。
以希瓦氏菌CN-32基因组DNA为模板，以hemA-F/hemA-R为引物，用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶PCR扩增出前后带有用于无缝克隆的同源臂序列的hemA基因片段，该片段中hemA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1第1487-2737位所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
以希瓦氏菌CN-32基因组DNA为模板，以hemL-F/hemL-R为引物，用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶PCR扩增出前后带有用于无缝克隆的同源臂序列的hemL基因片段，该片段中hemL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1第2738-4030位所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
上述PCR扩增的扩增体系见表1，反应程序见表2：
表1 PCR扩增体系
组成 用量
ddH2O 31μl
25mM dNTP 8μl
Reaction buffer 50μl
引物F 2.5μl
引物R 2.5μl
PrimeSTAR HS DNA聚合酶 1μl
基因组模板 5μl
表2 PCR反应程序
Figure SMS_1
扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，分别得到gltX基因片段、tRNAGlu基因片段、hemA基因片段及hemL基因片段。
(2)构建含有gltX、tRNAGlu、hemA及hemL基因的重组质粒
利用pET30a(+)质粒进行HindⅢ限制性内切酶单酶切线性化，获得线性化载体，反应体系见表3：
表3酶切反应体系
组成 用量
pET30a(+)质粒 42.5μl
10x反应缓冲液 5μl
HindⅢ 2.5μl
37℃反应3h，之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，得到线性化的pET30a(+)质粒。
用无缝克隆试剂盒将上述步骤(1)获得的gltX基因片段、tRNAGlu基因片段、hemA基因片段及hemL基因片段与上述获得的线性化的pET30a(+)质粒进行连接反应，连接反应体系见表4:
表4无缝克隆连接体系
Figure SMS_2
50℃反应30min，获得连接产物。
将连接产物使用热激转化法导入至大肠杆菌DH5α感受态细胞，于含有卡那霉素浓度为50μg/ml的LB平板培养，挑取单菌落转至LB培养基，取菌液抽提重组质粒，测序，通过软件SnapGene进行序列比对，结果表明重组质粒是将核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段插入pET30a(+)质粒上HindⅢ限制性内切酶酶切位点之间，保持pET30a(+)质粒的其它序列不变，得到的gltX基因、tRNAGlu基因、hemA基因和hemL基因的重组表达载体，将此重组质粒命名为pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL。pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL含有gltX基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1-1410位)、tRNAGlu基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1411-1486位)、hemA基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1487-2737位)和hemL基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第2738-4030位)。
(3)重组质粒pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL转化至BL21(DE3)表达菌株
将步骤(2)获得的测序正确的重组质粒pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL使用热激转化法导入至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，以含有卡那霉素浓度为50μg/ml的LB平板培养，长出的单菌落为重组工程菌株BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL，即为本发明生产ALA的重组大肠杆菌菌株。
实施例2重组大肠杆菌菌株的产ALA效果
(1)诱导重组菌株中基因的表达
将实施例1构建完成的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL，挑取单菌落转接入含有卡那霉素浓度为50ug/ml的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养8h；按照1％接种量转接到200ml含有卡那霉素浓度为50μg/ml的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.8-1.0，加入终浓度为0.15mM IPTG，降温至25℃，200rpm继续振荡培养6h，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL的培养物。
(2)利用全细胞催化反应生产ALA
将步骤(1)培养结束后的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL的培养物离心(5000rpm，5min)收集菌体，用20ml全细胞催化溶液重悬菌体(OD600＝30)，加入终浓度50mM谷氨酸钠后于30℃200rpm培养9h，结束培养后取上清，以上文的方法测定ALA产量和谷氨酸钠剩余量。
实验设置3次重复，结果取平均值。结果如图1所示，ALA产量达到4.56g/L，底物(谷氨酸钠)转化率达到75.60％。
实施例3重组大肠杆菌菌株的固定化
(1)固定化重组大肠杆菌细胞
将实施例2中步骤(1)培养结束后的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL的培养物离心(5000rpm，5min)收集菌体，用10ml全细胞催化溶液重悬菌体(OD600＝60)与40％(w/v)的海藻酸钠溶液等体积混合得到混合液，通过注射器将上述混合液逐滴滴入5g/L CaCl2溶液中，制备包埋重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET30a(+)-gltX-tRNAGlu-hemA-hemL的凝胶珠。
(2)利用固定化重组大肠杆菌生产ALA
将上述制备的凝胶珠转移至20ml全细胞催化溶液并加入终浓度50mM谷氨酸钠后于30℃150rpm培养9h，结束培养后得到反应液，取上清，以上文的方法测定ALA产量和谷氨酸钠剩余量。实验设置3次重复，结果取平均值。
结果如图2所示，ALA产量达到4.09g/L，底物(谷氨酸钠)转化率达到68.41％。
(3)固定化细胞的重复使用
将上述(2)中的反应液静置后移除上清，按上述反应体系将凝胶珠转移至20ml全细胞催化溶液并加入终浓度50mM谷氨酸钠后于30℃150rpm培养9h，反应结束后取上清，以上文的方法测定ALA产量和谷氨酸钠剩余量，重复反应6次，检测固定化细胞的催化效率。结果如图2所示，固定化细胞循环6次后，ALA产量仍能达到第一次的73.71％，反应6次后，总转化率为65.02％。
本发明构建了一种用于生产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的方法：通过过表达谷氨酰-tRNA连接酶gltX基因和tRNAGlu提高5-氨基乙酰丙酸的前体谷氨酰-tRNA的合成，过表达谷氨酰-tRNAGlu还原酶hemA基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶hemL基因，强化谷氨酰-tRNA下游基因的表达，增强5-氨基乙酰丙酸的合成能力。本发明还公开了利用全细胞催化生产ALA的方法，以谷氨酸盐为底物，诱导基因表达后的重组大肠杆菌菌体为细胞催化剂，从50mM谷氨酸盐中可产生4.56g/L ALA，底物转化率为75.60％。本发明还公开了固定化细胞催化生产ALA的方法，以海藻酸钠作为固定化载体以本发明中的重组大肠杆菌为对象来制备固定化细胞，不仅提高了生物法合成ALA的底物转化率，而且其固定化细胞可以多次重复使用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
本发明所涉序列如下：
SEQ ID.1
ATGACAACTAAGACGCGTTTTGCCCCTAGTCCTACCGGTTTCTTGCATGTTG
GTGGTGCCCGTACTGCACTTTATTCTTGGTTACAAGCCCGTGCCAATAACGGTGA
GTTTGTATTACGTATTGAAGATACGGATATTGAGCGTTCAACTCAAGCTGCTTGC
GATGCGATTTTAGAAGGCATGAACTGGCTAGGTTTGACATGGGACGAAGGCCCA
TATTACCAAACTAAGCGTTTTGACCGTTATAACGAAATCATTGCTCAAATGTTAG
AAAAGGGCACAGCGTATAAATGTTACTGTTCACGTGAGCGAATCGATGCCTTAA
GAGAATCACAGGCCGCTAACGGTGAAGCGCAAAAATACGATGGTTGCTGCCGT
GATTTGCCTGCCCGTGACACTGATGAGCCTTTTGTGGTGCGTTTTAAAAATCCAA
TCGGTGGTTCAGTGGTATTTGATGACCATGTTCGTGGTCGTATTGAATTTTCTAAT
GACGCATTAGATGATTTGATCATTGCTCGTACCGACGGTGTGCCAACATATAACT
TCTGCGTAGTCGTTGATGATTGGGATATGGGGATTACCTGTGTGGTGCGTGGTGA
AGATCATATCAATAATACGCCTCGTCAAATTAACATCCTCAAAGCGTTAGGTGCA
CCAATTCCTGAATATGCGCATGTATCGATGATTTTGGGTGATGACGGCGCTAAGTT
ATCTAAGCGCCATGGCGCTGTTAGCGTAATGCAGTACCGTGATGATGGCTATTTA
CCTGAAGCGTTGCTCAACTATTTAGTGCGTTTAGGTTGGTCACACGGTGATCAA
GAAGTTTTCTCTTTAGAGGAAATGAAGCAATACTTTAAGCTAGACGATATTAATA
AAGCGCCTTCAGCCTTTAATACCGATAAGCTGGTTTGGTTGAACCAACACTATAT
TAAGACGCTTGACCCTGAATATGTGGCAACTCACTTACAATGGCACATGGACGA
CCAAAAGATTGATACCTCAAATGGCCCAGCATTAGCCGAAGTGGTCACAGCATT
AGCTGAACGCGCTAAGACGTTAAAGGAATTAGCCGCTTCTAGTCGTTACTTCTAT
GAAGACTTTGCAGACTTTGATGCTGAGCAGGCGAAAAAACATTTACGTGGTGTT
GCGTTAGAACCGTTGCAATTGGTGCAACAAAAATTAGCCGCATTAACTGAATGG
ACGGTTGAAGCAATACATCTGGCAATTGAACAAACGGCAACTGAATTAGATGTA
GGTATGGGGAAAGTTGGCATGCCTCTGCGTGTTGCTGTAACGGGAGCAGGGCA
GTCTCCAGGTTTAGATATCACATTATTTTTAATAGGAAGAAGTCGCTCTGAGCAA
AGAATATCCAAAGCGATTGAATTTGTAGCAGATAGAATAAATTCCTAAGTCCCCT
TCGTCTAGAGGCctAGGACACCGCCCTTTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATC
CCCTAGGGGATACCAATGAGCCTTGTAGCAATCGGTATTAACCACAAAACAGCC
ACGGTAGACCTGCGTGAGAAAGTTGCCTTCTCTCCAGACAAAATTCATGACGCC
ATGAAGAGTCTGGCCAGTCGTACGCGCTCGGGTGAAGCCGTTATTGTCTCGACC
TGTAATCGCACTGAGTTGTATTGCAACAATGGCGATGAGGCTGACATCATTGAAT
GGCTTGAAGAATATCATGGCCTAGATCATAAAGATGTGGCGCCTTGCCTATACAA
TTACCACGGCCAAACCGCGGTTAAGCATTTGATGCGTGTTGCTTCAGGGCTTGA
TTCGTTAATTTTAGGTGAGCCGCAAATTCTAGGGCAGGTGAAGCAAGCCTTCGC
GAAAGCCAAGGAAGCGGGCACAGTTGCTTTAACCATAGATCGCCTTTTCCAAAA
TACCTTTTCCGTTGCCAAAAAAGTGCGCACCGAAACGGAAATTGGCGCTGCTGC
TGTGTCGGTGGCTTTTGCCGCTGTGAGTATGGCGAAGCATATCTTCTCCTCACTG
TCGACCACTAAGGTGCTGTTGATTGGTGCGGGTGAAACGATAGAATTGGTAGCC
AAGCATTTAAAAGATAATGGTGTGGCCTCCATGGTGGTGGCAAACCGTACTTTA
GAGCGTGCTCAGGGCATGTGTGAAGAGTTTGGTGCGACTGCAATTACGCTGGCG
CAAATACCAGATTATCTCCCTAAAGCCGATATCGTGATATCCTCTACCGCCAGCCC
GCTACCAATCCTTGGTAAAGGCATGGTCGAAAAAGCGCTAAAGCAGCGTCGCCA
TCAACCTATGTTATTGGTTGATATAGCAGTTCCCCGGGATATTGAGCCGGAAGTC
GCCGATTTGGATGACGCGTTTCTGTATACAGTGGACGACCTGCATAGCATCATTG
AACAGAATATGGCTTCTCGAAAAGAAGCCGCCGAGCAAGCTGAATTAATTACTG
AAGAACAATCTTACCTGTTTATGGATTGGGTACGTTCTTTAGAGTCGGTCGACAG
TATTCGCGAGTATCGCAATCAGAGTATGGCGATAAAAGATGAGTTAGTAGAACGC
GCCCTGAATAAATTAGCTCAAGGGGGCGATACTGAGCAGGTATTGATTGAATTAG
CCAATCGCCTGACGAACAAACTTATTCACGCACCAACCCAAGCCCTCACTGCGG
CGAGCCGTCAGGGTGATTTGAATACACTAGGTCAGTTAAGAACAGCGCTTGGAT
TAGATAAAAACTAAATGACCCGTTCCGAAGCACTATTTGAACAGGCTAAAAAAA
CCATCCCCGGCGGTGTTAACTCTCCGGTTCGTGCATTTAATGGTGTAGGCGGTTC
ACCCCTGTTTATTGAAAAAGCTAACGGCGCTTATATTTACGATGCCGATGGCAAA
GCTTATATCGACTATGTCGGTTCTTGGGGCCCGATGATCCTTGGCCACAACCATC
CTAAAATCCGTGCGGCGGTATTAGCGGCGGTGGAAAATGGCTTGTCTTTTGGTG
CGCCAACTGAGCTTGAAGTGCAAATGGCCGAGAAAGTCATCTCTATGGTGCCTT
CTATTGAGCAAGTACGCATGGTGAGTTCAGGCACGGAAGCTACTATGAGTGCTA
TCCGTTTAGCGCGTGGTTTTACCAATCGTGACAAGATCTTAAAATTTGAAGGCTG
TTACCACGGCCACGCAGATTGCCTGTTAGTGAAAGCTGGTTCTGGCGCATTAAC
TTTAGGTCAACCTAGTTCACCCGGTATTCCTGAAGATTTCGCCAAGCACACCCTC
ACCGCTGTGTATAACGATTTAGATTCAGTTAGAACCCTGTTCGAACAGTATCCAA
CTGAGATTTCTTGCATCATCATCGAACCCGTTGCCGGCAACATGAACTGTATTCC
ACCTGTCCCAGGTTTCCTCCAAGGTCTGCGTGATATGTGTGATGAGTTTGGCGCG
CTACTGATCATCGATGAAGTAATGACGGGTTTTCGCGTATCACAAAGTGGCGCG
CAGGGGTATTACGGCGTCACACCAGACCTGACCACACTCGGTAAAGTGATTGGT
GGCGGTATGCCAGTGGGTGCTTTCGGTGGCCGTAAAGATGTAATGCAATTTATCG
CACCGACTGGTCCAGTGTATCAAGCGGGTACTCTATCAGGTAACCCCATTGCGAT
GTCAGCGGGTCTGGCACAAATGGACGCCCTGTGTGAAGAAGGTTTGTACGAAG
CACTGAGTGCAAAAACCAAACGTATTGCAGAAGGCTTTAAAGCCGCGGCGGAT
AAGCACGGTATTCCAATGGCGATCAACTATGTTGGCGGCATGTTCGGCTTCTTCT
TTACCGAACAGGAGCAGATCACTCGCTTCGATCAAGTGACCAAGTGCAATATTG
AGCACTTCCGCACTTTCTACCACGGAATGTTAGACGAAGGTGTTTACTTAGCAC
CTAGCGCCTATGAAGCAGGCTTCCTATCTATGGCCCATGGTGAAGAAGAACTGC
GCCTAACCTTAGAAGCCGCAGATCGTGTTTTAGCGAGTATGAAAACCGAAAGTT
AA
SEQ ID.2
MTTKTRFAPSPTGFLHVGGARTALYSWLQARANNGEFVLRIEDTDIERSTQAA
CDAILEGMNWLGLTWDEGPYYQTKRFDRYNEIIAQMLEKGTAYKCYCSRERIDAL
RESQAANGEAQKYDGCCRDLPARDTDEPFVVRFKNPIGGSVVFDDHVRGRIEFSN
DALDDLIIARTDGVPTYNFCVVVDDWDMGITCVVRGEDHINNTPRQINILKALGAP
IPEYAHVSMILGDDGAKLSKRHGAVSVMQYRDDGYLPEALLNYLVRLGWSHGDQ
EVFSLEEMKQYFKLDDINKAPSAFNTDKLVWLNQHYIKTLDPEYVATHLQWHMD
DQKIDTSNGPALAEVVTALAERAKTLKELAASSRYFYEDFADFDAEQAKKHLRGV
ALEPLQLVQQKLAALTEWTVEAIHLAIEQTATELDVGMGKVGMPLRVAVTGAGQS
PGLDITLFLIGRSRSEQRISKAIEFVADRINS
SEQ ID.3
GTCCCCTTCGTCTAGAGGCCTAGGACACCGCCCTTTCACGGCGGTAACAGG
GGTTCGAATCCCCTAGGGGATACCA
SEQ ID.4
MSLVAIGINHKTATVDLREKVAFSPDKIHDAMKSLASRTRSGEAVIVSTCNRTEL
YCNNGDEADIIEWLEEYHGLDHKDVAPCLYNYHGQTAVKHLMRVASGLDSLILGE
PQILGQVKQAFAKAKEAGTVALTIDRLFQNTFSVAKKVRTETEIGAAAVSVAFAAVS
MAKHIFSSLSTTKVLLIGAGETIELVAKHLKDNGVASMVVANRTLERAQGMCEEFG
ATAITLAQIPDYLPKADIVISSTASPLPILGKGMVEKALKQRRHQPMLLVDIAVPRDI
EPEVADLDDAFLYTVDDLHSIIEQNMASRKEAAEQAELITEEQSYLFMDWVRSLES
VDSIREYRNQSMAIKDELVERALNKLAQGGDTEQVLIELANRLTNKLIHAPTQALT
AASRQGDLNTLGQLRTALGLDKN
SEQ ID.5
MTRSEALFEQAKKTIPGGVNSPVRAFNGVGGSPLFIEKANGAYIYDADGKAYI
DYVGSWGPMILGHNHPKIRAAVLAAVENGLSFGAPTELEVQMAEKVISMVPSIEQV
RMVSSGTEATMSAIRLARGFTNRDKILKFEGCYHGHADCLLVKAGSGALTLGQPSS
PGIPEDFAKHTLTAVYNDLDSVRTLFEQYPTEISCIIIEPVAGNMNCIPPVPGFLQGLR
DMCDEFGALLIIDEVMTGFRVSQSGAQGYYGVTPDLTTLGKVIGGGMPVGAFGGR
KDVMQFIAPTGPVYQAGTLSGNPIAMSAGLAQMDALCEEGLYEALSAKTKRIAEG
FKAAADKHGIPMAINYVGGMFGFFFTEQEQITRFDQVTKCNIEHFRTFYHGMLDEG
VYLAPSAYEAGFLSMAHGEEELRLTLEAADRVLASMKTES。

Claims (10)

1.重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因、tRNAGlu的编码基因、谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述谷氨酰-tRNA连接酶为a1或a2的蛋白质：
a1氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
a2将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-tRNA连接酶活性的由a1衍生的蛋白质；
所述tRNAGlu为脱氧核糖核酸序列是SEQ ID No.3的转运RNA；
所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶为b1或b2的蛋白质：
b1氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
b2将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-tRNAGlu还原酶活性的由b1衍生的蛋白质；
所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶为c1或c2的蛋白质：
c1氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
c2将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-1-半醛氨基转移酶活性的由c1衍生的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因为d1-d3中的任一种DNA分子：
d1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第1-1410位的cDNA分子或基因组DNA；
d2在严格条件下与d1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-tRNA连接酶的cDNA分子或基因组DNA；
d3与d1或d2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-tRNA连接酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述tRNAGlu的编码基因为e1-e3中的任一种DNA分子：
e1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第1411-1486位的cDNA分子或基因组DNA；
e2在严格条件下与e1限定的DNA分子杂交且编码所述tRNAGlu的cDNA分子或基因组DNA；
e3与e1或e2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述tRNAGlu的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因为f1-f3中的任一种DNA分子：
f1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第1487-2737位的cDNA分子或基因组DNA；
f2在严格条件下与f1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶的cDNA分子或基因组DNA；
f3与f1或f2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-tRNAGlu还原酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因为g1-g3中的任一种DNA分子：
g1编码链的编码序列是SEQ ID No.1第2738-4030位的cDNA分子或基因组DNA；
g2在严格条件下与g1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA；
g3与g1或g2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌按照权利要求5或6所述的方法构建。
5.构建权利要求1-4中任一所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于：所述方法包括A1或A2：
A1提高作为出发菌的大肠杆菌中谷氨酰-tRNA连接酶、tRNAGlu、谷氨酰-tRNAGlu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因的表达量，得到重组大肠杆菌；
A2在作为出发菌的所述大肠杆菌中导入谷氨酰-tRNA连接酶、tRNAGlu、谷氨酰-tRNAGlu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因，得到重组大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌通过重组表达载体将含有权利要求1-3中任一所述的谷氨酰-tRNA连接酶的编码基因、tRNAGlu的编码基因、谷氨酰-tRNAGlu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因的重组表达载体导入所述出发菌中实现。
7.权利要求6中所述重组表达载体。
8.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌，或权利要求5-6任一所述的构建方法在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。
9.一种5-氨基乙酰丙酸的制备方法，其特征在于：将权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌作为细胞催化剂，催化底物谷氨酸盐生成5-氨基乙酰丙酸。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株进行固定化。
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