CN116234919A - 借由细胞制造中性岩藻糖基化寡糖的混合物 - Google Patents

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Abstract

本发明处于合成生物学及代谢工程改造的技术领域中。更特定言之，本发明处于经代谢工程改造的细胞的培养或发酵的技术领域中。本发明描述一种经代谢工程改造以用于制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的细胞。此外，本发明提供一种用于借由细胞制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物以及自培养纯化所述中性寡糖中的至少一者的方法。

Description

借由细胞制造中性岩藻糖基化寡糖的混合物
本发明处于合成生物学及代谢工程改造的技术领域中。更特定言之，本发明处于经代谢工程改造的细胞的培养或发酵的技术领域中。本发明描述一种经代谢工程改造以用于制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的细胞。此外，本发明提供一种用于借由细胞制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物以及自培养纯化所述中性寡糖中的至少一者的方法。
背景技术
常常以与蛋白质及脂质的糖结合形式存在的寡糖参与许多生命现象，诸如与受精、胚胎发生、发炎、癌转移及宿主病原体黏附的发生及进展相关的分化、发育及生物识别过程。寡糖亦可以非结合聚糖形式存在于体液及人乳中，其中寡糖亦调节重要的发育及免疫过程(Bode，Early Hum.Dev.1-4(2015)；Reily等人，Nat.Rev.Nephrol.15，346-366(2019)；Varki，Glycobiology 27，3-49(2017))。由于寡糖的广泛功能谱，对寡糖混合物存在巨大科学及商业关注。然而，寡糖混合物的可用性受到限制，因为制造依赖于化学或化学酶合成或依赖于自天然来源，诸如动物乳的纯化。化学合成方法为费力且耗时的，且由于所涉及的大量步骤，所述方法难以扩大规模。使用糖基转移酶的酶促路径提供优于化学合成的许多优势。糖基转移酶催化糖部分自活化核苷酸-糖供体转移至糖或非糖受体上(Coutinho等人，J.Mol.Biol.328(2003)307-317)。此等糖基转移酶为生物技术人员合成寡糖的来源且用于(化学)酶促路径以及基于细胞的制造系统中。然而，糖基转移酶的立体特异性及区位选择性仍为难对付的挑战。另外，化学酶促路径需要原位再生核苷酸-糖供体。寡糖的细胞制造需要严格控制足够水准的核苷酸-糖供体在互补糖基转移酶附近的时空可用性。由于此等困难，当前方法通常使得合成单一寡糖而非寡糖混合物。
本发明的一目标为提供一种工具及方法，借助于所述工具及方法，包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性寡糖混合物可借由细胞，较佳地单一细胞，以高效、有时间效益及成本效益的方式，且视需要以连续制程制造。
根据本发明，此目标及其他目标是借由提供一种用于制造包含至少四种不同中性及岩藻糖基化寡糖的中性岩藻糖基化寡糖混合物的细胞及方法来实现，其中该细胞经遗传修饰以用于制造所述中性岩藻糖基化寡糖。
发明内容
出人意料地，现已发现，有可能借由单一细胞制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性岩藻糖基化寡糖混合物。本发明提供一种经代谢工程改造的细胞及用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性岩藻糖基化寡糖混合物的方法。该方法包含以下步骤：提供一种表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶及至少一种额外糖基转移酶且能够合成GDP-岩藻糖及至少一种或多种作为该(等)额外糖基转移酶的供体的核苷酸-糖的细胞，及在容许制造该中性岩藻糖基化寡糖混合物的条件下培养该细胞。本发明亦提供自中性岩藻糖基化寡糖混合物分离所述中性寡糖中的至少一者，较佳全部的方法。此外，本发明提供一种经代谢工程改造以用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性岩藻糖基化寡糖混合物的细胞。
定义
用于本说明书中以描述本发明的字组及其各种实施方式应不仅以其通常所定义含义的意义来理解，而且应包括在通常所定义含义的范围以外的在本说明书中特定定义的结构、物质或作用。因此，若元件在本说明书的上下文中可理解为包括超过一个含义，则其在申请专利范围中的使用必须理解为由本说明书及字组自身支援的一般至所有可能含义。
本文所揭示的本发明的各种实施方式及实施方式的态样应不仅以本说明书中特定描述的次序及情形来理解，而且包括任何次序及其任何组合。每当情形需要时，将认为以单数形式使用的所有字组包括复数形式，且反之亦然。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语一般具有与本发明所属技术领域中具有通常知识者通常所理解相同的含义。一般而言，本文所使用的命名法及本文所描述的细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合为所属领域中熟知且常用的命名法、细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合。使用标准技术进行核酸及肽合成。一般而言，纯化步骤是根据制造商说明书进行。
在本说明书中，已揭示本发明的实施方式，且尽管采用特定术语，但所述术语仅以描述性意义使用且并非出于限制本发明的范围的目的，本发明的范围阐述于以下申请专利范围中。必须理解，已仅出于示例的目的阐述所说明的实施方式，且不应视为限制本发明。所属技术领域中具有通常知识者将显而易见，改变、其他实施方式、改良、细节及用途可根据本文中本发明的文字及精神且在本发明的范围内进行，本发明的范围仅由申请专利范围限制，根据包括等同原则的专利法予以解释。在以下申请专利范围中，仅为便于描述，提供用以指明申请专利范围步骤的参考字元，且所述参考字元并不意欲暗示用于执行所述步骤的任何特定次序。
在此文件及其申请专利范围中，动词「包含(to comprise)」及其词形变化形式以其非限制性意义使用，意谓包括该字组之后的项目，但不排除未具体提及的项目。在整个申请案中，动词「包含(to comprise)」可由「由……组成(to consist)」或「基本上由……组成(to consist essentially of)」替换，且反之亦然。另外，动词「由……组成」可由「基本上由……组成」替换，意谓如本文所定义的组成物可包含除具体鉴别的组分外的(多种)额外组分，所述额外组分不改变本发明的独特特征。另外，除非上下文明确要求存在一个元件且仅存在一个元件，否则借由不定冠词「一(a/an)」提及一元件并不排除存在超过一个元件的可能性。因此不定冠词「一」通常意谓「至少一个(at least one)」。在整个申请案中，除非另外明确陈述，否则冠词「一(a及an)」较佳由「至少两个(at least two)」置换，更佳由「至少三个(at least three)」置换，甚至更佳由「至少四个(at least four)」置换，甚至更佳由「至少五个(at least five)」置换，甚至更佳由「至少六个(at least six)」置换，最佳由「至少七个(at least seven)」置换。
除非另外指示，否则如本文中鉴别的各实施方式可组合在一起。本说明书中所提及的所有公开案、专利及专利申请案均以引用的方式并入本文中，其引用程度如同特定及个别地指示将各个别公开案、专利或专利申请案以引用的方式并入一般。优先权申请案，包括EP20190198、EP20190200、EP20190201、EP20190204及EP20190205的全部内容，亦以引用的方式并入本文中，其引用程度如同特定及个别地指示将所述优先权申请案以引用的方式并入一般。
根据本发明，术语「聚核苷酸(polynucleotide)」一般是指可为未修饰RNA或DNA或经修饰RNA或DNA的任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸。「聚核苷酸」包括但不限于单股及双股DNA；为单股及双股区或单股、双股及三股区的混合物的DNA；单股及双股RNA；及为单股及双股区的混合物的RNA；包含可为单股或更典型地双股或三股区、或单股及双股区的混合物的DNA及RNA的杂合分子。另外，如本文所用，术语「聚核苷酸」是指包含RNA或DNA或RNA及DNA两者的三股区。此类区中的股可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包括所述分子中的一或多者的全部，但更典型地仅涉及具有所述分子中的一些的区。三螺旋区的分子中的一者常为寡核苷酸。如本文所用，术语「聚核苷酸」亦包括含有一或多个经修饰碱基的如上文所描述的DNA或RNA。因此，具有出于稳定性或出于其他原因进行修饰的主链的DNA或RNA为根据本发明的「聚核苷酸」。此外，包含不常见碱基(诸如肌苷)或经修饰碱基(诸如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA应理解为由术语「聚核苷酸」覆盖。应了解，已对DNA及RNA进行多种修饰，此用于所属技术领域中具有通常知识者已知的许多适用目的。术语「聚核苷酸」在本文使用时涵盖此类经化学、酶促或代谢修饰的形式的聚核苷酸，以及病毒及细胞(包括(例如)简单及复杂细胞)所特有的DNA及RNA的化学形式。术语「聚核苷酸」亦涵盖通常称为寡核苷酸的短聚核苷酸。
「多肽(polypeptide)」是指包含两个或更多个借由肽键或经修饰肽键彼此接合的氨基酸的任何肽或蛋白质。「多肽」是指短链(通常称为肽、寡肽及寡聚物)及长链(通常称为蛋白质)。多肽可含有除20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。「多肽」包括借由自然过程(诸如加工及其他转译后修饰)以及借由化学修饰技术修饰的多肽。此类修饰充分描述于基本文本及更详细的专论中以及大量研究文献中，且其为所属技术领域中具有通常知识者所熟知。相同类型的修饰可在既定多肽中若干位点处以相同或不同程度存在。此外，既定多肽可含有多种类型的修饰。修饰可出现在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链及氨基端或羧基端。修饰包括例如：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血基质部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酸肌醇的共价连接、交联、环化、双硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、焦麸氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、脂质连接、硫酸化、麸氨酸残基的γ-羧化、羟基化及ADP-核糖基化、硒化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(诸如精胺酰化)及泛素化。多肽可为分支链的或在存在或不存在分支情况下为环状的。环状、分支链及分支链环状多肽可由转译后自然过程产生，且亦可借由完全合成方法制备。
如本文所用，术语「编码多肽的聚核苷酸(polynucleotide encoding apolypeptide)」涵盖包括编码本发明多肽的序列的聚核苷酸。术语亦涵盖如下聚核苷酸，其包括编码多肽的单个连续区或非连续区(例如间杂有整合噬菌体或插入序列或编辑)以及亦可含有编码序列及/或非编码序列的其他区。
「经分离(isolated)」意谓自天然状态「人工(by the hand of man)」改变，亦即若其存在于自然界中，则其自其原始环境改变或移除或两者。举例而言，天然存在于活生物体中的聚核苷酸或多肽未「经分离」，但与其天然状态的共存物质分离的相同聚核苷酸或多肽「经分离」，如该术语在本文中所用。类似地，如本文所用的术语「合成(synthetic)」序列意谓已以合成方式产生且不直接自天然来源分离的任何序列。如本文所用的术语「合成」意谓任何合成产生的序列且不直接自天然来源分离。
如本文中提及细胞或宿主细胞所用，术语「重组(recombinant)」或「转殖基因(transgenic)」或「经代谢工程改造(metabolically engineered)」或「经遗传修饰(genetically modified)」可互换使用，且指示细胞复制异源核酸，或表现由异源核酸(亦即，「对该细胞外来(foreign to said cell)」的序列或「对该细胞中的该位置或环境外来(foreign to said location or environment in said cell)」的序列)编码的肽或蛋白质。此类细胞描述为经至少一种异源或外源基因转型，或描述为借由引入至少一种异源或外源基因转型。经代谢工程改造或重组或转殖基因细胞可含有在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因。重组细胞亦可含有天然形式的细胞中所发现的基因，其中基因借由人工手段修饰且再引入至细胞中。所述术语亦涵盖含有对于细胞而言内源的核酸的细胞，该核酸已经修饰或其表现或活性已经修饰而无需自该细胞移除该核酸；此类修饰包括借由基因置换、启动子置换；位点特异性突变；及相关技术获得的修饰。相应地，「重组多肽(recombinant polypeptide)」是借由重组细胞产生的多肽。如本文所用，「异源序列(heterologous sequence)」或「异源核酸(heterologous nucleic acid)」是源自对特定细胞而言外来的来源(例如来自不同物种)，或若来自相同来源则自其原始形式或基因体中的位置进行修饰的序列或核酸。因此，与启动子可操作地连接的异源核酸是来自与衍生启动子的来源不同的来源，或若来自相同来源，则自其原始形式或基因体中的位置进行修饰。异源序列可例如借由转染、转型、结合或转导稳定引入至宿主微生物细胞的基因体中，其中可视细胞及待引入的序列而定来应用技术。各种技术为所属领域中具有通常知识者所已知且例如揭示于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中。如在本发明的上下文中所用的术语「突变(mutant)」细胞或微生物是指经遗传修饰的细胞或微生物。
在本发明的上下文内，术语「内源(endogenous)」是指任何作为细胞的天然部分且存在于其在细胞染色体中的天然位置处且与作用于其表现的天然控制机制相比，表现的控制尚未改变的聚核苷酸、多肽或蛋白质序列。术语「外源(exogenous)」是指任何来源于研究下的细胞的外部且不来源于细胞的天然部分或不存在于其在细胞染色体或质体中的天然位置处的聚核苷酸、多肽或蛋白质序列。
当提及聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶使用时，术语「异源」是指来自宿主生物体物种之外的源或源自宿主生物体物种之外的源的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相比之下，本文使用「同源」聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶指示源自宿主生物体物种的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。当提及用于维持或操纵基因序列的基因调节序列或辅助核酸序列(例如，启动子、5′非转译区、3′非转译区、聚A添加序列、内含子序列、剪接位点、核糖体结合位点、内部核糖体进入序列、基因体同源区、重组位点等)时，「异源」意谓调节序列或辅助序列不与该调节或辅助核酸序列在构筑体、基因体、染色体或游离基因体中与其并置的基因天然相关。因此，可操作地连接于在自然状态下(亦即以非基因工程改造生物体的基因体形式)不可与启动子操作连接的基因的启动子在本文中称为「异源启动子(heterologouspromoter)」，即使该启动子可源自与其连接的基因相同的物种(或在一些情况下，源自相同的生物体)。
术语蛋白质或酶的「经修饰活性(modified activity)」与蛋白质或酶的活性相比于该蛋白质或酶的野生型(亦即天然)活性的变化有关。该经修饰活性可为与蛋白质或酶的野生型活性相比，该蛋白质或酶的消除、减弱、降低或延迟的活性，但亦可为与蛋白质或酶的野生型活性相比，该蛋白质或酶的加速或增强的活性。蛋白质或酶的经修饰活性借由该蛋白质或酶的经修饰表现获得或借由蛋白质或酶的经修饰(亦即突变)形式的表现获得。酶的经修饰活性进一步关于酶的表观米氏常数(apparent Michaelis constant)Km及/或表观最大速度(Vmax)的修饰。
术语基因的「经修饰表现(modified expression)」是关于与在经编码蛋白质的制造过程的任何阶段中该基因的野生型表现相比的表现的变化。该经修饰表现相比于野生型为较低或较高表现，其中在内源基因的情况下，术语「较高表现(higher expression)」亦定义为该基因的「过度表现(overexpression)」，或在野生型菌株中不存在的异源基因的情况下，定义为「表现(expression)」。较低表现或减少的表现是借助于所属技术领域中具有通常知识者的常见熟知技术获得(诸如使用siRNA、CrispR、CrispRi、核糖开关、重组工程、同源重组、ssDNA突变诱发、RNAi、miRNA、asRNA、突变基因、剔除基因、转位子突变诱发、……)，所述技术用于以使得基因不太能够(亦即与功能性野生型基因相比统计上显著『不太能够』)或完全不能(诸如剔除基因)产生功能性最终产物的方式改变基因。如本文所用的术语「核糖开关(riboswitch)」定义为信使RNA的一部分，该信使RNA折叠成借由干扰转译而阻断表现的错综结构。效应分子的结合诱导构形变化，允许转录后的调节表现。随后以使得如上文所描述获得较低表现的方式改变相关的基因，亦可借由改变转录单元、启动子、非转译区、核糖体结合位点、夏因达尔加诺(Shine Dalgarno)序列或转录终止子获得较低表现。较低表现或减少的表现可例如借由使启动子序列中的一或多个碱基对突变或将启动子序列完全改为具有与野生型相比更低的表现强度的持续型启动子或引起经调节的表现的可诱导型启动子或引起经调节的表现的可抑制型启动子来获得。过度表现或表现是借助于所属技术领域中具有通常知识者的常见熟知技术获得(诸如使用人工转录因子、重新设计启动子序列、核糖体工程改造、在真染色质处引入或再引入表现模组、使用高复本数的质体)，其中该基因为「表现卡匣(expression cassette)」的一部分，该表现卡匣是关于其中存在启动子序列、非转译区序列(含有核糖体结合序列、夏因达尔加诺或科扎克(Kozak)序列)、编码序列及视情况选用的转译终止子且引起功能性活性蛋白质的表现的任何序列。该表现为持续型或调节性的。
术语「持续型表现(constitutive expression)」定义为在某些生长条件下不受除RNA聚合酶的次单元以外的转录因子(例如，如σ70、σ54的细菌δ因子或相关σ因子；及与RNA聚合酶核心酶共缔合的酵母粒线体RNA聚合酶特异性因子MTF1)调节的表现。此类转录因子的非限制性实例为大肠杆菌中的CRP、LacI、ArcA、Cra、IclR，或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的Aft2p、Crz1p、Skn7，或枯草杆菌(B.subtilis)中的DeoR、GntR、Fur。此等转录因子结合于特异性序列上且可阻断或增强在某些生长条件下的表现。RNA聚合酶为用于自DNA模板合成RNA的催化机构。RNA聚合酶结合特异性序列以例如经由原核宿主中的δ因子或经由酵母中的MTF1使转录起始。持续型表现在不需要诱导或抑制的情况下提供恒定表现量。
术语「借由天然诱导物的表现(expression by a natural inducer)」定义为仅在宿主的某一天然条件(例如生物体在分娩中或在泌乳期间)下表现的基因的兼性或调节表现，作为对环境变化(例如包括但不限于激素、热、冷、光、氧化或渗透应激/信号传导)的反应，或取决于发育阶段的位置或该宿主细胞的细胞周期，包括但不限于细胞凋亡及自体吞噬。
术语「控制序列(control sequence)」是指借由细胞转录及转译系统识别的序列，允许聚核苷酸序列转录及转译成多肽。此类DNA序列因此为在特定细胞或生物体中表现可操作地连接的编码序列所必需的。此类控制序列可为(但不限于)启动子序列、核糖体结合序列、夏因达尔加诺序列、科扎克序列、转录终止子序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、视情况选用的操纵序列及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号及强化子。若前序列或分泌性前导序列的DNA表现为参与多肽分泌的前蛋白，则其可与该多肽的DNA可操作地连接；若启动子或强化子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点经定位以便有助于转译，则其与编码序列可操作地连接。所述控制序列可另外经外部化学物质，诸如(但不限于)IPTG、阿拉伯糖、乳糖、别位乳糖(allo-lactose)、鼠李糖或岩藻糖经由诱导型启动子或经由诱导或抑制该聚核苷酸转录或转译成多肽的基因回路控制。
一般而言，「可操作地连接(operably linked)」意谓所连接的DNA序列为连续的且在分泌性前导序列的情况下，为连续的且处于阅读阶段(reading phase)。然而，强化子不必为连续的。
术语「野生型(wild type)」是指其在自然界中存在时通常已知的遗传或表型情况。
如本文所用的术语「蛋白质的经修饰表现(modified expression of aprotein)」是指与野生型(亦即天然)蛋白质相比，i)内源蛋白的较高表现或过度表现，ii)异源蛋白的表现或iii)具有较高活性的变异蛋白的表现及/或过度表现。
如本文所用，术语「乳腺细胞(mammary cell)」大体上是指乳腺上皮细胞、乳腺上皮管腔细胞或哺乳动物上皮肺泡细胞或其任何组合。如本文所用，术语「乳腺样细胞(mammary-like cell)」大体上是指具有类似于(或实质上类似于)天然乳腺细胞但衍生自非乳腺细胞来源的表型/基因型的细胞。此类乳腺样细胞可经工程改造以移除至少一个非所需遗传组件及/或包括乳腺细胞所特有的至少一个预定遗传构筑体。乳腺样细胞的非限制性实例可包括乳腺上皮样细胞、乳腺上皮管腔样细胞、呈现乳腺细胞谱系的细胞的一或多个特征的非乳腺细胞或其任何组合。乳腺样细胞的其他非限制性实例可包括具有与天然乳腺细胞类似(或实质上类似)的表型，或更特定言之与天然乳腺上皮细胞类似(或实质上类似)的表型的细胞。具有表型或展现至少一种与天然乳腺细胞或乳腺上皮细胞类似(或实质上与其类似)的特征的细胞可包含展现天然或已经工程改造以能够表现至少一种乳汁组分的细胞(例如衍生于乳腺细胞谱系或非乳腺细胞谱系)。
如本文所用，术语「非乳腺细胞(non-mammary cell)」一般可包括任何非乳腺谱系的细胞。在本发明的上下文中，非乳腺细胞可为能够经工程改造以表现至少一种乳汁组分的任何哺乳动物细胞。此类非乳腺细胞的非限制性实例包括肝细胞、血球、肾细胞、脐带血细胞、上皮细胞、表皮细胞、肌细胞、纤维母细胞、间叶细胞或其任何组合。在一些情况下，分子生物学及基因体编辑技术可经工程改造以同时消除、沉默或减弱无数基因。
在整个本申请案中，除非另外明确地陈述，否则表述「能够……＜动词＞(capableof...＜verb＞)」及「能够……＜动词＞(capable to…＜verb＞)」较佳地用该动词的主动语态替换，且反之亦然。举例而言，表述「能够表现(capable of expressing)」较佳地用「表现(express)」替换，且反之亦然，亦即「表现」较佳地用「能够表现」替换。
如本文所用，术语「变异体(variant)」为分别与参考聚核苷酸或多肽不同但保持基本特性的聚核苷酸或多肽。聚核苷酸的典型变异体与另一参考聚核苷酸在核苷酸序列方面不同。变异体的核苷酸序列的变化可能会或可能不会改变由参考聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所论述，核苷酸变化可能在参考序列编码的多肽中引起氨基酸取代、添加、缺失、融合及截断。多肽的典型变异体与另一参考多肽在氨基酸序列方面不同。通常，差异是有限的，以致参考多肽的序列与变异体的序列总体上十分相似且在许多区中一致。借由呈任何组合的一或多个取代、添加、缺失，变异体与参考多肽可在氨基酸序列方面不同。取代或插入的氨基酸残基可为或可不为由遗传密码编码的残基。聚核苷酸或多肽的变异体可为天然产生的，诸如对偶基因变异体，或其可为未已知为天然产生的变异体。聚核苷酸及多肽的非天然产生变异体可借由突变诱发技术、借由直接合成及借由所属领域中具有通常知识者已知的其他重组方法制得。
如本文所用，术语多肽的「衍生物(derivative)」是可在多肽的氨基酸序列内含有氨基酸残基的缺失、添加或取代，但引起沉默变化，由此产生功能上等效的多肽的多肽。氨基酸取代可基于所涉及残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性及/或两亲媒性性质的类似性进行。举例而言，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、白氨酸、异白氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；平面中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及麸酰氨酸；带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、离氨酸及组氨酸；且带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及麸氨酸。在本发明的上下文内，如本文所用的衍生物多肽是指能够展现与原始多肽在试管内及/或活体内活性方面实质上类似的多肽，如借由多种标准(包括但不限于酶活性)中的任一者所判定，且其可在转译期间或转译之后差异修饰。此外，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物以取代或添加形式引入至原始多肽序列中。
在一些实施方式中，本发明涵盖借由修饰如本发明中所用的酶的结构来制备功能变异体。变异体可借由氨基酸取代、缺失、添加或其等的组合产生。举例而言，可合理地预期，白氨酸用异白氨酸或缬氨酸的独立置换、天冬氨酸用麸氨酸的独立置换、苏氨酸用丝氨酸的独立置换或氨基酸用结构上相关的氨基酸的类似置换(例如保守突变)不会对所得分子的生物活性产生重大影响。保守置换为在侧链相关的氨基酸家族内发生的置换。本发明多肽的氨基酸序列变化是否产生功能同源物可容易地借由评定变异体多肽以类似于野生型多肽的方式在细胞中产生反应的能力来测定。
如本文所用的术语「功能同源物(functional homolog)」描述具有序列相似性(换言之，同源性)且亦共有至少一种功能性特征(诸如生物化学活性)的彼等分子(Altenhoff等人，PLoS Comput.Biol.8(2012)e1002514)。功能同源物典型地将产生类似但未必相同程度的相同特征。功能上同源的蛋白质产生相同特征，其中借由一种同源物产生的定量量测值为另一者的至少10％；更典型地，为由原始分子产生的定量量测值的至少20％，在约30％与约40％之间；例如在约50％与约60％之间；在约70％与约80％之间；或在约90％与约95％之间；在约98％与约100％之间，或大于100％。因此，在分子具有酶活性的情况下，功能同源物将具有与原始酶相比以上所列举的酶活性百分比。在分子为DNA结合分子(例如多肽)的情况下，与原始分子相比，如借由结合分子的重量所量测，同源物将具有结合亲和力的以上所列举百分比。
功能同源物及参考多肽可为天然存在的多肽，且序列相似性可归因于趋同或趋异进化事件。功能同源物有时被称为异种同源物，其中「异种同源物(ortholog)」是指作为另一物种中所参考的基因或蛋白质的功能等效物的同源基因或蛋白质。
异种同源基因为借由最后共同祖先的单一基因的垂直传递产生的不同物种中的同源基因，其中基因及其主要功能为保守性的。同源基因为由共同祖先在两个物种中遗传的基因。
当参考来自给定物种的氨基酸或核苷酸/核酸序列使用时，术语「异种同源物」是指来自不同物种的相同氨基酸或核苷酸/核酸序列。应理解，两个序列在其经由线性传递衍生自共同祖先序列时为彼此的异种同源物，及/或就其序列及其生物功能两者而言在其他方面为紧密相关的。异种同源物通常将具有高度序列一致性但可能不(且通常将不)共有100％序列一致性。
同种同源基因为借由基因复制事件产生的同源基因。同种同源基因通常属于相同物种，但此并非必需的。同种同源物可分裂成同种内同源物(in-paralog)(在物种形成事件之后出现的同种同源对)及同种外同源物(out-paralog)(在物种形成事件之前出现的同种同源对)。在物种之间，同种外同源物为由于在物种形成之前复制而存在于两个生物体之间的同种同源物对。在物种内，同种外同源物为存在于同一生物体中但其复制事件发生在物种形成之后的同种同源物对。同种同源物典型地具有相同或类似功能。
可借由分析核苷酸及多肽序列比对来鉴别功能同源物。举例而言，对核苷酸或多肽序列的资料库执行查询可鉴别相关多肽的同源物，如生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质或膜蛋白。序列分析可涉及分别使用生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质或膜蛋白的氨基酸序列作为参考序列对非冗余资料库的BLAST、Reciprocal BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列是自核苷酸序列推导出。典型地，资料库中具有超过40％序列一致性的彼等多肽为进一步评估是否适合分别作为生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质或膜运输蛋白的候选物。氨基酸序列相似性允许保守氨基酸取代，诸如一个疏水性残基经另一疏水性残基取代或一个极性残基经另一极性残基取代或一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代或一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代等。较佳地，借由保守取代，意指以下组合，诸如甘氨酸借由丙氨酸取代，且反之亦然；缬氨酸、异白氨酸及白氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；天冬氨酸借由麸氨酸取代，且反之亦然；天冬酰胺借由麸酰氨酸取代，且反之亦然；丝氨酸借由苏氨酸取代，且反之亦然；离氨酸借由精氨酸取代，且反之亦然；半胱氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；及苯丙氨酸及酪氨酸借由色氨酸取代，且反之亦然。视需要，可进行此类候选物的人工检验以便限制待进一步评估的候选物的数目。人工检验可借由选择似乎具有存在于制造力调节多肽中的域(例如保守功能域)的彼等候选物来进行。
就聚核苷酸而言，「片段(Fragment)」是指纯系或聚核苷酸分子的任何部分，尤其保留全长聚核苷酸分子的可用功能特征的聚核苷酸的一部分。有用片段包括可用于杂合或扩增技术或用于调节复制、转录或转译的寡核苷酸及聚核苷酸。「聚核苷酸片段(polynucleotide fragment)」是指聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的任何子序列，其典型地包含本文所提供的聚核苷酸序列中的任一者的至少约9、10、11、12个连续核苷酸或由其组成，例如至少约30个核苷酸或至少约50个核苷酸。例示性片段可另外或替代地包括包含编码多肽的保守性家族域的区、基本上由其组成或由其组成的片段。例示性片段可另外或替代地包括包含多肽的保守域的片段。因此，聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段较佳意谓包含该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)或由其组成的核苷酸序列，其中不超过200、150、100、50或25个连续核苷酸缺失，较佳不超过50个连续核苷酸缺失，且该核苷酸序列保留可借由所属技术领域中具有通常知识者经由常规实验评定的全长聚核苷酸分子的可用功能特征(例如活性)。替代地，聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段较佳意谓一种核苷酸序列，其包含来自该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的一定量的连续核苷酸或由其组成，且其中该一定量的连续核苷酸为该聚核苷酸SEQ ID NO(或GenbankNO.)的全长的至少50.0％、60.0％、70.0％、80.0％、81.0％、82.0％、83.0％、84.0％、85.0％、86.0％、87.0％、88.0％、89.0％、90.0％、91.0％、92.0％、93.0％、94.0％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、100％，较佳至少80％，更佳至少87％，甚至更佳至少90％，甚至更佳至少95％，最佳至少97％且保留全长聚核苷酸分子的可用功能特征(例如活性)。因此，聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段较佳意谓包含该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)或由其组成的核苷酸序列，其中一定量的连续核苷酸缺失且其中该量不超过该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的全长的50.0％、40.0％、30.0％，较佳不超过该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的全长的20.0％、15.0％、10.0％、9.0％、8.0％、7.0％、6.0％、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.0％、0.5％，更佳不超过15％，甚至更佳不超过10％，甚至更佳不超过5％，最佳不超过2.5％，且其中该片段保留可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的全长聚核苷酸分子的可用功能特征(例如活性)。
在整个申请案中，聚核苷酸序列可由SEQ ID NO或可替代地由GenBank NO表示。因此，除非另外明确陈述，否则术语「聚核苷酸SEQ ID NO(polynucleotide SEQ ID NO)」及「聚核苷酸GenBank NO.(polynucleotide GenBank NO.)」可互换使用。
片段可另外或可替代地包括多肽及蛋白质分子的子序列，或多肽的子序列。在一些情况下，片段或域为多肽的子序列，其按与完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似程度执行完整多肽的至少一种生物功能。如本文所定义的「多肽的子序列(subsequence of thepolypeptide)」是指衍生自多肽的连续氨基酸残基的序列。举例而言，多肽片段可包含可识别的结构模体或功能域，诸如结合于DNA启动子区、活化域或蛋白质-蛋白质相互作用域的DNA结合位点或域，且可引发转录。片段的尺寸可自少至3个氨基酸残基至完整多肽的全长变化，例如长度为至少约20个氨基酸残基，例如长度为至少约30个氨基酸残基。因此，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的片段较佳意谓一种多肽序列，其包含该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)或由其组成，其中不超过80、60、50、40、30、20或15个连续氨基酸残基缺失，较佳不超过40个连续氨基酸残基缺失，且其按与可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似或更大程度执行完整多肽的至少一种生物功能。替代地，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或GenbankNO.)的片段较佳意谓一种多肽序列，其包含来自该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或GenbankNO.)的一定量的连续氨基酸残基或由其组成，且其中该一定量的连续氨基酸残基为该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的全长的至少50.0％、60.0％、70.0％、80.0％、81.0％、82.0％、83.0％、84.0％、85.0％、86.0％、87.0％、88.0％、89.0％、90.0％、91.0％、92.0％、93.0％、94.0％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、100％，较佳至少80％，更佳至少87％，甚至更佳至少90％，甚至更佳至少95％，最佳至少97％，且其按与可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似或更大程度执行完整多肽的至少一种生物功能。因此，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的片段较佳意谓一种多肽序列，其包含该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)或由其组成，其中一定量的连续氨基酸残基缺失且其中该量不超过该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的全长的50.0％、40.0％、30.0％，较佳不超过该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的全长的20.0％、15.0％、10.0％、9.0％、8.0％、7.0％、6.0％、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.0％、0.5％，更佳不超过15％，甚至更佳不超过10％，甚至更佳不超过5％，最佳不超过2.5％，且其按与可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似或更大程度执行完整多肽的至少一种生物功能。
在整个申请案中，多肽序列可由SEQ ID NO或可替代地由UniProt ID或GenBankNO表示。因此，除非另外明确陈述，否则术语「多肽SEQ ID NO(polypeptide SEQ ID NO)」及「多肽UniProt ID(polypeptide UniProt ID)」及「多肽GenBank NO.(polypeptideGenBank NO.)」可互换使用。
较佳地，多肽的片段为衍生自多肽的较佳以类似或更大程度具有多肽的至少一种特性或活性的功能片段。功能片段可例如包括多肽的功能域或保守域。应理解，多肽或其片段可具有对多肽的活性实质上无作用的保守氨基酸取代。借由保守取代，意指一种疏水性氨基酸经另一种疏水性氨基酸取代或一种极性氨基酸经另一种极性氨基酸取代或一种酸性氨基酸经另一种酸性氨基酸取代或一种碱性氨基酸经另一种碱性氨基酸取代等。较佳地，借由保守取代，意指以下组合，诸如甘氨酸借由丙氨酸取代，且反之亦然；缬氨酸、异白氨酸及白氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；天冬氨酸借由麸氨酸取代，且反之亦然；天冬酰胺借由麸酰氨酸取代，且反之亦然；丝氨酸借由苏氨酸取代，且反之亦然；离氨酸借由精氨酸取代，且反之亦然；半胱氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；及苯丙氨酸及酪氨酸借由色氨酸取代，且反之亦然。域可例如借由Pfam(El-Gebali等人，Nucleic Acids Res.47(2019)D427-D432)或保守域资料库(Conserved Domain Database；CDD)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)(Lu等人，Nucleic Acids Res.48(2020)D265-D268)名称表征。各资料库的内容在每次发布时为固定的且不改变。当特定资料库的内容改变时，此特定资料库接收具有新发布日期的新发布版本。各资料库的所有发布版本及其对应发布日期及如在此等特定发布日期标注的特定内容均为可获得的且为本领域中所属技术领域中具有通常知识者已知。本文所用的PFAM资料库(https：//pfam.xfam.org/)为在2020年6月11日发布的Pfam版本33.1。蛋白质序列资讯及功能资讯可由蛋白质序列及标注资料的全面资源提供，如例如通用蛋白质资源(UniProt)(www.uniprot.org)(Nucleic Acids Res.2021，49(D1)，D480-D489)。UniProt包含称为UniProt知识库(UniProtKB)的专门及充分管理的蛋白质资料库，以及UniProt参考序列集(UniRef)及UniProt档案(UniParc)。UniProt标识符(UniProt ID)对于存在于资料库中的各蛋白质为特有的。如本文所用的UniProt ID为2021年5月05日的UniProt资料库版本中的UniProt ID。在本文中使用如存在于2021年5月05日的NIH基因序列资料库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)(Nucleic AcidsRes.2013，41(D1)，D36-D42)版本中的各别Genbank寄存编号(GenBank NO.)提及不具有UniProt ID的蛋白质。
如本文所用的术语「糖基转移酶(glycosyltransferase)」是指能够催化糖部分自活化供体分子转移至特异性受体分子，从而形成糖苷键的酶。由此合成的寡糖可具有直链类型或分支链类型且可含有多个单糖建构嵌段。已描述使用核苷酸二磷酸-糖、核苷酸单磷酸-糖及磷酸糖及相关蛋白将糖基转移酶分类成不同的基于序列的家族(Campbell等人，Biochem.J.326，929-939(1997))且可在CAZy(碳水化合物活性酶)网站(www.cazy.org)上获得。
如本文所用，糖基转移酶可选自包含(但不限于)以下者的清单：岩藻糖基转移酶(例如α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3/1，4-岩藻糖基转移酶、α-1，6-岩藻糖基转移酶)、半乳糖基转移酶(例如β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶、α-1，4-半乳糖基转移酶)、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(例如β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶)、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶(例如α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶)、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺(altrosamine)转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶。
岩藻糖基转移酶为将岩藻糖残基(Fuc)自GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。岩藻糖基转移酶包含α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，其催化经由α-糖苷键使Fuc残基自GDP-Fuc转移至聚糖受体上。岩藻糖基转移酶可发现但不限于为GT10、GT11、GT23、GT65及GT68 CAZy家族。半乳糖基转移酶为将半乳糖苷基(Gal)自UDP-半乳糖(UDP-Gal)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。半乳糖基转移酶包含β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，其经由α-或β-糖苷键将Gal残基自UDP-Gal转移至聚糖受体上。半乳糖基转移酶可发现但不限于为GT2、GT6、GT8、GT25及GT92 CAZy家族。葡萄糖基转移酶为将葡萄糖基(Glc)自UDP-葡萄糖(UDP-Glc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。葡萄糖基转移酶包含α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，其经由α-或β-糖苷键将Glc残基自UDP-Glc转移至聚糖受体上。葡萄糖基转移酶可发现但不限于为GT1、GT4及GT25 CAZy家族。甘露糖基转移酶为将甘露糖基(Man)自GDP-甘露糖(GDP-Man)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。甘露糖基转移酶包含α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，其经由α-糖苷键将Man残基自GDP-Man转移至聚糖受体上。甘露糖基转移酶可发现但不限于为GT22、GT39、GT62及GT69 CAZy家族。N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶为将N-乙酰基葡萄糖氨基(GlcNAc)自UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶可发现但不限于为GT2及GT4 CAZy家族。
N-乙酰基半乳糖氨基转移酶为将N-乙酰基半乳糖氨基(GalNAc)自UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。N-乙酰基半乳糖氨基转移酶可发现但不限于为GT7、GT12及GT27 CAZy家族。N-乙酰基甘露糖氨基转移酶为将N-乙酰基甘露糖氨基(ManNAc)自UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。木糖基转移酶为将木糖残基(Xyl)自UDP-木糖(UDP-Xyl)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。木糖基转移酶可发现但不限于为GT61及GT77 CAZy家族。鼠李糖基转移酶为将鼠李糖残基自GDP-鼠李糖供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。鼠李糖基转移酶可发现但不限于为GT1、GT2及GT102 CAZy家族。N-乙酰基鼠李糖基转移酶为将N-乙酰基鼠李糖胺残基自UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。UDP-4-氨基-4，6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶为使用UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-阿拉伯糖(arabino)-4-己酮糖用于伪氨酸(pseudaminic acid)的生物合成的糖基转移酶，该伪氨酸为用于修饰鞭毛蛋白的唾液酸类糖。UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶(murA)为将烯醇丙酮酰基自磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)转移至UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDPAG)以形成UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酸盐的糖基转移酶。岩藻糖氨基转移酶为将N-乙酰基岩藻糖胺残基自dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺或UDP-N-乙酰基岩藻糖胺供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。
术语「核苷酸-糖(nucleotide-sugar)」、「核苷酸活化糖(nucleotide-activatedsugar)」或「活化糖(activated sugar)」在本文中可互换使用且是指单糖的活化形式。活化单糖的实例包括但不限于UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-来苏糖(lyxo)-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(pneumosamine)(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖、GDP-鼠李糖或UDP-木糖。核苷酸-糖在糖基化反应中充当糖基供体。糖基化反应为借由糖基转移酶催化的反应。
如本文所用的术语且如目前先进技术中通常所理解，「寡糖(Oligosaccharide)」是指含有少量、典型地三至二十个简单糖(亦即单糖)的糖聚合物。如本文所用的单糖为还原糖。寡糖可为还原或非还原糖且具有还原及非还原端。还原糖为能够还原另一种化合物且本身经氧化的任何糖，亦即糖的羰基碳经氧化成羧基。如本发明中所用的寡糖可为直链结构或可包括分支。两个糖单元之间的键(例如糖苷键、半乳糖苷键、葡萄糖苷键等)可表示为例如1，4、1-＞4或(1-4)，在本文中可互换使用。举例而言，术语「Gal-b1，4-Glc」、「β-Gal-(1-＞4)-Glc」、「Galβ1-4-Glc」及「Gal-b(1-4)-Glc」具有相同含义，亦即半乳糖(Gal)的碳-1与葡萄糖(Glc)的碳-4的β-糖苷键键联。各单糖可呈环状形式(例如呋喃糖形式的哌喃糖)。个别单糖单元之间的键联可包括α1-＞2、α1-＞3、α1-＞4、α1-＞6、α2-＞1、α2-＞3、α2-＞4、α2-＞6、β1-＞2、β1-＞3、β1-＞4、β1-＞6、β2-＞1、β2-＞3、β2-＞4及β2-＞6。寡糖可含有α-糖苷键及β-糖苷键或可仅含有β-糖苷键。较佳地，如本文所描述的寡糖含有选自如本文下文所用的清单的单糖。寡糖的实例包括但不限于路易斯型(Lewis-type)抗原寡糖、哺乳动物乳寡糖及人乳寡糖。如本文所用，「基于乳-N-二糖(LNB)的寡糖(LNB(lacto-N-biose)-based oligosaccharide)」是指如本文所定义的寡糖，其在其还原端处含有LNB。如本文所用，「基于N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)的寡糖(LacNAc(N-acetyllactosamine)-basedoligosaccharide)」是指如本文所定义的寡糖，其在其还原端处含有LacNAc。
如本文所用的术语「单糖(monosaccharide)」是指借由水解不可分解为更简单的糖，经醛糖或酮糖分类，且每分子含有一或多个羟基的糖。单糖为含有仅一个简单糖的糖。单糖的实例包含己糖、D-葡萄哌喃糖、D-半乳呋喃糖、D-半乳哌喃糖、L-半乳哌喃糖、D-哌喃甘露糖、D-别哌喃糖(Allopyranose)、L-阿卓哌喃糖、D-古洛哌喃糖(Gulopyranose)、L-艾杜哌喃糖(Idopyranose)、D-塔罗哌喃糖(Talopyranose)、D-呋喃核糖、D-哌喃核糖、D-阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)、D-阿拉伯哌喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯哌喃糖、D-木哌喃糖、D-来苏哌喃糖、D-赤呋喃糖(Erythrofuranose)、D-苏糖呋喃糖(Threofuranose)、庚糖、L-甘油-D-甘露-庚糖哌喃糖(LDmanHep)、D-甘油-D-甘露-庚糖哌喃糖、(DDmanHep)、6-去氧-L-阿卓哌喃糖、6-去氧-D-古洛哌喃糖、6-去氧-D-塔罗哌喃糖、6-去氧-D-半乳哌喃糖、6-去氧-L-半乳哌喃糖、6-去氧-D-甘露哌喃糖、6-去氧-甘露哌喃糖、6-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-去氧-D-阿拉伯糖-己糖、2-去氧-D-赤-戊糖、2，6-二去氧-D-阿拉伯糖-己哌喃糖、3，6-二去氧-D-阿拉伯糖-己哌喃糖、3，6-二去氧-L-阿拉伯糖-己哌喃糖、3，6-二去氧-D-木糖-己哌喃糖、3，6-二去氧-D-核糖-己哌喃糖、2，6-二去氧-D-核糖-己哌喃糖、3，6-二去氧-L-木糖-己哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-别哌喃糖、2-氨基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-氨基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-塔罗哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-别哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-塔罗哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-二去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-半乳哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-甘露哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-二去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-二去氧-D-塔罗哌喃糖、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、D-核糖-己-2-酮哌喃糖、D-阿拉伯糖-己-2-酮呋喃糖(D-呋喃果糖)、D-阿拉伯糖-己-2-酮哌喃糖、L-木糖-己-2-酮哌喃糖、D-来苏糖-己-2-酮哌喃糖、D-苏糖-戊-2-酮哌喃糖、D-阿卓-庚-2-酮哌喃糖、3-C-(羟甲基)-D-赤呋喃糖、2，4，6-三去氧-2，4-二氨基-D-葡萄哌喃糖、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖、2，6-二去氧-3-甲基-D-核糖-己糖、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰氨基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-羟乙酰基酰氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰基葡萄糖胺、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、N-乙酰基甘露糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、鼠李糖、果糖及多元醇。
术语多元醇意指含有多个羟基的醇。举例而言，甘油、山梨糖醇或甘露糖醇。如本文所用，术语「双糖(disaccharide)」是指由两个单糖单元构成的糖。双糖的实例包含乳糖(Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二糖(Gal-b1，3-GlcNAc)、N-乙酰基乳糖胺(Gal-b1，4-GlcNAc)、LacDiNAc(GalNAc-b1，4-GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖氨基葡萄糖(GalNAc-b1，4-Glc)。
如本文所用，「哺乳动物乳寡糖(mammalian milk oligosaccharide)」(MMO)是指诸如但不限于以下者的寡糖：3-岩藻糖基乳糖、2′-岩藻糖基乳糖、6-岩藻糖基乳糖、2′，3-二岩藻糖基乳糖、2′，2-二岩藻糖基乳糖、3，4-二岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-三糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、单岩藻糖基对-乳-N-六糖、单岩藻糖基乳-N-六糖III、异构岩藻糖基化乳-N-六糖III、异构岩藻糖基化乳-N-六糖I、二岩藻糖基-对-乳-N-六糖、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基乳-N-六糖a、二岩藻糖基乳-N-六糖c、半乳糖基化聚葡萄胺糖、中性岩藻糖基化寡糖。哺乳动物乳寡糖(MMO)包含在泌乳期间的任何阶段中发现的乳汁中所存在的寡糖，该乳汁包括来自人类(亦即人乳寡糖或HMO)及哺乳动物的初乳，所述哺乳动物包括但不限于牛(欧洲牛(Bos Taurus))、绵羊(绵羊(Ovis aries))、山羊(家畜山羊(Capraaegagrus hircus))、双峰骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus))、马(欧洲野马(Equusferus caballus))、猪(野猪(Sus scropha))、犬(家犬亚种(Canis lupus familiaris))、虾夷棕熊(ezo brown bear)(日本棕熊(Ursus arctos yesoensis))、北极熊(海熊(Ursusmaritimus))、日本黑熊(亚洲黑熊(Ursus thibetanus japonicus))、条纹臭鼬(条纹臭鼬(Mephitis mephitis))、冠海豹(冠海豹(Cystophora cristata))、亚洲大象(亚洲象(Elephas maximus))、非洲大象(非洲象(Loxodonta africana))、巨食蚁兽(大食蚁兽(Myrmecophaga tridactyla))、真瓶鼻海豚(瓶鼻海豚(Tursiops truncates))、北极小须鲸(小须鲸(Balaenoptera acutorostrata))、尤金袋鼠(尤金袋鼠(Macropus eugenii))、红袋鼠(红袋鼠(Macropus rufus))、普通袋狐(帚尾袋貂(Trichosurus Vulpecula))、无尾熊(考拉(Phascolarctos cinereus))、东袋鼬(细脚袋鼩(Dasyurus viverrinus))、鸭嘴兽(鸭嘴兽(Ornithorhynehus anatinus))。人乳寡糖(human milk oligosaccharide；HMO)亦称为人类一致乳寡糖，其在化学上与人类母乳中发现的人乳寡糖一致，但为生物技术产生的(例如使用不含细胞的系统或细胞及包含细菌、真菌、酵母菌、植物、动物或原虫细胞的生物体，较佳经基因工程改造的细胞及生物体)。人类一致乳寡糖以名称HiMO出售。
如本文所用，「基于乳糖的哺乳动物乳寡糖(lactose-based mammalian milkoligosaccharide)(MMO)」是指如本文中所定义的MMO，其在其还原端含有乳糖。
如本文中所使用，术语「路易斯型抗原(Lewis-type antigen)」包含以下寡糖：H1抗原，其为Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc，或简言之2′FLNB；Lewisa(或Lea)，其为三糖Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或简言之4-FLNB；Lewisb(或Leb)，其为四糖Fucα1-2Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或简言之DiF-LNB；H2抗原，其为Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，或另外称作2′岩藻糖基-N-乙酰基乳糖胺，简言之2′FLacNAc；Lewisx(或Lex)，其为三糖Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc，或另外称为3-岩藻糖基-N-乙酰基乳糖胺，简言之3-FLacNAc；及Lewisy(或Ley)，其为四糖Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc。
术语「LNB」及「乳-N-二糖(Lacto-N-biose)」可互换使用且是指双糖Gal-b1，3-GlcNAc。
术语「LacNAc」及「N-乙酰基乳糖胺(N-acetyllactosamine)」可互换使用且是指双糖Gal-b1，4-GlcNAc。
如本文所用且如目前先进技术中一般所理解，『中性岩藻糖基化寡糖(neutralfucosylated oligosacchafide)』为携有岩藻糖-残基的非带电中性寡糖。如本文所用，且如目前先进技术中一般所了解，中性寡糖为不具有源自羧酸基的负电荷的寡糖。此类中性岩藻糖基化寡糖为包含经由糖苷键彼此连接的至少三个单糖次单元的糖结构，其中该单糖次单元中的至少一者为岩藻糖。中性岩藻糖基化寡糖可含有超过一个岩藻糖残基，例如两个、三个或更多个。岩藻糖可经由α-糖苷键连接至包含葡萄糖、半乳糖、GlcNAc的其他单糖次单元，该α-糖苷键包含α-1，2、α-1，3、α-1，4、α-1，6键。
实例包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP V)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP VI)、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-二岩藻六糖I(LDFHI)、乳-N-二岩藻六糖II(LDFH II)、单岩藻糖基乳-N-六糖III(MFLNH III)、二岩藻糖基乳-N-六糖(DFLNHa)、二岩藻糖基-乳-N-新六糖。如本发明中所用的术语「α-1，2-岩藻糖基转移酶(alpha-1，2-fucosyltransferase)」、「α1，2岩藻糖基转移酶(alpha 1，2fucosyltransferase)」、「2-岩藻糖基转移酶(2-fucosyltransferase)」、「α-1，2-岩藻糖基转移酶(α-1，2-fucosyltransferase)」、「α1，2岩藻糖基转移酶(α1，2fucosyltransferase)」、「2岩藻糖基转移酶(2 fucosyltransferase)」、「2-FT」或「2FT」可互换使用且是指催化岩藻糖自供体GDP-L-岩藻糖转移至α-1，2-键中的受体分子的糖基转移酶。如本发明中所用的术语「2′岩藻基乳糖(2′fucosyllactose)」、「2′-岩藻基乳糖(2′-fucosyllactose)」、「α-1，2-岩藻基乳糖(α-1，2-fucosyllactose)」、「α1，2岩藻基乳糖(α1，2fucosyllactose)」、「α-1，2-岩藻基乳糖(α-1，2-fucosyllactose)」、「α1，2岩藻基乳糖(α1，2 fucosyllactose)」、「Galβ-4(Fucα1-2)Glc」、「2FL」或「2′FL」可互换使用且是指借由催化α-1，2-岩藻糖基转移酶将岩藻糖残基自GDP-L-岩藻糖移转至α-1，2-键中的乳糖获得的产物。如本发明中所用的术语「二岩藻基乳糖(difucosyllactose)」、「二-岩藻基乳糖(di-fucosyllactose)」、「乳糖二岩藻四糖(lactodifucotetraose)」、「2′，3-二岩藻基乳糖(2′，3-difucosyllactose)」、「2′，3二岩藻基乳糖(2′，3 difucosyllactose)」、「α-2′，3-岩藻基乳糖(α-2′，3-fucosyllactose)」、「α2′，3岩藻基乳糖(fucosyllactose)」、「Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)Glc」、「DFLac」、「2′，3diFL」、「DFL」、「DiFL」或「diFL」可互换使用。
如本发明中所用的术语「α-1，3-岩藻糖基转移酶(alpha-1，3-fucosyltransferase)」、「α1，3岩藻糖基转移酶(alpha 1，3 fucosyltransferase)」、「3-岩藻糖基转移酶(3-fucosyltransferase)」、「α-1，3-岩藻糖基转移酶(α-1，3-fucosyltransferase)」、「α1，3岩藻糖基转移酶(α1，3 fucosyltransferase)」、「3岩藻糖基转移酶(3 fucosyltransferase)」、「3-FT」或「3FT」可互换使用且是指催化岩藻糖自供体GDP-L-岩藻糖转移至α-1，3-键中的受体分子的糖基转移酶。如本发明中所用的术语「3-岩藻基乳糖(3-fucosyllactose)」、「α-1，3-岩藻基乳糖(alpha-1，3-fucosyllactose)」、「α1，3岩藻基乳糖(alpha 1，3 fucosyllactose)」、「α-1，3-岩藻基乳糖(α-1，3-fucosyllactose)」、「α1，3岩藻基乳糖(α1，3 fucosyllactose)」、「Galβ-4(Fucα1-3)Glc」、「3FL」或「3-FL」可互换使用且是指借由催化α-1，3-岩藻糖基转移酶将岩藻糖残基自GDP-L-岩藻糖移转至α-1，3-键中的乳糖获得的产物。
『中性寡糖(neutral oligosaccharide)』包含在其聚糖结构中含有一或多个岩藻糖次单元的非带电岩藻糖基化寡糖以及缺乏任何岩藻糖次单元的非带电非岩藻糖基化寡糖。如本文所用的『中性寡糖』的实例包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3FL)、2′，3-二岩藻糖基乳糖(diFL)、乳-N-三糖II(LN3)、乳N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6′-半乳糖基乳糖、3′-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖、二岩藻糖基-乳-N-六糖及二岩藻糖基-乳-N-新六糖。
如本文所用，人类ABO血型系统的抗原为寡糖。人类ABO血型系统的此类抗原不限于人类结构。所述结构涉及存在于包含Gal-β1，3-GlcNAc、Gal-β1，4-GlcNAc、Gal-β1，3-GalNAc及Gal-β1，4-Glc的双糖核心结构上的A决定子GalNAc-α1，3(Fuc-α1，2)-Gal-、B决定子Gal-α1，3(Fuc-α1，2)-Gal-及H决定子Fuc-α1，2-Gal-。
如本发明中所用的术语「LNT II」、「LNT-II」、「LN3」、「乳-N-丙糖II(lacto-N-triose II)」、「乳-N-丙糖II(lacto-N-triose II)」、「乳-N-丙糖(lacto-N-triose)」、「乳-N-丙糖(lacto-N-triose)」或「GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LNT」、「乳-N-四糖(lacto-N-tetraose)」、「乳-N-四糖(lacto-N-tetraose)」或「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LNnT」、「乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)」、「乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)」、「新-LNT(neo-LNT)」或「Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
术语「GalNAc-LNFP-I」及「A血型抗原六糖I型(blood group A antigen hexaosetype I)」可互换使用且是指GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc。
术语「LNFP-II」及「乳-N-岩藻五糖II(lacto-N-fucopentaose II)」可互换使用且是指Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc。
术语「LNFP-III」及「乳-N-岩藻五糖III(lacto-N-fucopentaose III)」可互换使用且是指Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc。
术语「LNFP-V」及「乳-N-岩藻五糖V(lacto-N-fucopentaose V)」可互换使用且是指Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc。
术语「LNFP-VI」、「LNnFP V」及「乳-N-新岩藻五糖V(lacto-N-neofucopentaoseV)」可互换使用且是指Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc。
术语「LNnFP I」及「乳-N-新岩藻五糖I(Lacto-N-neofucopentaose I)」可互换使用且是指Fuc-a1，2-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc。
术语「LNDFH I」、「乳-N-二岩藻六糖(Lacto-N-difucohexaose I)」、「LNDFH-I」、「LDFHI」、「Leb-乳糖」及「路易斯-b六糖(Lewis-b hexasaccharide)」可互换使用且是指Fuc-a1，2-Gal-b1，3-[Fuc-a1，4]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc。
术语「LNDFH II」、「乳-N-二岩藻六糖II(Lacto-N-difucohexaose II)」、「路易斯a-路易斯x(Lewis a-Lewis x)」及「LDFH II」可互换使用且是指Fuc-a1，4-(Gal-b1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc。
术语「LNnDFH」、「乳-N-新二岩藻六糖(Lacto-N-neoDiFucohexaose)」及「路易斯x六糖(Lewis x hexaose)」可互换使用且是指Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc。
术语「α-四糖(alpha-tetrasaccharide)」及「A-四糖(A-tetrasaccharide)」可互换使用且是指GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，4-Glc。
如本文所用的『岩藻糖基化路径(fucosylation pathway)』是由以下者组成的生化路径：酶及其各别基因，甘露糖-6-磷酸盐异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶及/或再利用路径L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶，以及产生α1，2、α1，3、α1，4及/或α1，6岩藻糖基化寡糖的岩藻糖基转移酶。
如本文所用的『半乳糖基化路径(galactosylation pathway)』为由以下者组成的生化路径：酶及其各别基因，半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶及/或葡萄糖磷酸变位酶，以及产生寡糖的2、3、4及/或6羟基上的α或β结合半乳糖的半乳糖基转移酶。
如本文所用的『N-乙酰基葡萄糖胺碳水化合物路径(N-acetylglucosaminecarbohydrate pathway)』为由以下者组成的生化路径：酶及其各别基因，L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶及/或葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，以及产生寡糖的3、4及/或6羟基上的α或β结合N-乙酰基葡萄糖胺的糖基转移酶。
如本文所用的『N-乙酰基半乳糖氨基化路径(N-acetylgalactosaminylationpathway)』为包含酶及其各别基因中的至少一者的生化路径，所述酶及其各别基因选自包含以下者的清单：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及/或UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶，以及产生GalNAc修饰的化合物的糖基转移酶，该化合物包含在单-、二-或寡糖上具有α或β结合N-乙酰基半乳糖胺的该单-、二-或寡糖。
如本文所用的『甘露糖基化路径(mannosylation pathway)』为包含酶及其各别基因中的至少一者的生化路径，所述酶及其各别基因选自包含以下者的清单：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶及/或甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，以及产生甘露糖基化化合物的糖基转移酶，该化合物包含在单-、二-或寡糖上具有α或β结合甘露糖的该单-、二-或寡糖。
如本文所用的『N-乙酰基甘露糖氨基化路径(N-acetylmannosaminylationpathway)』为包含酶及其各别基因中的至少一者的生化路径，所述酶及其各别基因选自包含以下者的清单：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶及/或ManNAc激酶，以及产生ManNAc修饰的化合物的糖基转移酶，该化合物包含在单-、二-或寡糖上具有α或β结合N-乙酰基甘露糖胺的该单-、二-或寡糖。
术语「甘露糖-6-磷酸异构酶(mannose-6-phosphate isomerase)」、「磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase)」、「甘露糖磷酸异构酶(mannose phosphateisomerase)」、「磷酸已糖异构酶(phosphohexoisomerase)」、「磷酸甘露糖异构酶(phosphomannoisomerase)」、「磷酸甘露糖-异构酶(phosphomannose-isomerase)」、「磷酸已糖变位酶(phosphohexomutase)」、「D-甘露糖-6-磷酸盐酮醇-异构酶(D-mannose-6-phosphate ketol-isomerase)」及「manA」可互换使用且是指催化D-果糖6-磷酸盐可逆地转化为D-甘露糖6-磷酸盐的酶。
术语「磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase)」、「甘露糖磷酸变位酶(mannosephosphomutase)」、「磷酸甘露糖变位酶(phosphomannose mutase)」、「D-甘露糖1，6-磷酸变位酶(D-mannose 1，6-phosphomutase)」及「manB」可互换使用且是指催化D-甘露糖6-磷酸盐可逆地转化为D-甘露糖1-磷酸盐的酶。
术语「甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(mannose-1-phosphateguanylyltransferase)」、「GTP-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)」、「磷酸甘露糖异构酶-鸟苷5′-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶(phosphomannose isomerase-guanosine 5′-diphospho-D-mannosepyrophosphorylase PIM-GMP)」、「GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannosepyrophosphorylase)」、「鸟苷5′-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶(guanosine 5′-diphospho-D-mannose pyrophosphorylase)」、「鸟苷二磷酸甘露糖焦磷酸化酶(guanosinediphosphomannose pyrophosphorylase)」、「鸟苷三磷酸-甘露糖1-磷酸鸟苷酰基转移酶(guanosine triphosphate-mannose 1-phosphate guanylyltransferase)」、「甘露糖1-磷酸鸟苷酰基转移酶(三磷酸鸟苷)(mannose 1-phosphate guanylyltransferase(guanosine triphosphate))」及「manC」可互换使用且是指使用GTP将D-甘露糖-1-磷酸盐转化为GDP-甘露糖及二磷酸盐的酶。
术语「GDP-甘露糖4，6-脱水酶(GDP-mannose 4，6-dehydratase)」、「鸟苷5′-二磷酸盐-D-甘露糖氧化还原酶(guanosine 5′-diphosphate-D-mannose oxidoreductase)」、「鸟苷二磷酸甘露糖氧化还原酶(guanosine diphosphomannose oxidoreductase)」、「鸟苷二磷酸甘露糖4，6-脱水酶(guanosine diphosphomannose 4，6-dehydratase)」、「GDP-D-甘露糖脱水酶(GDP-D-mannose dehydratase)」、「GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶(GDP-D-mannose4，6-dehydratase)」、「GDP-甘露糖4，6-氢-解离酶(GDP-mannose 4，6-hydro-lyase)」、「GDP-甘露糖4，6-氢-解离酶(形成GDP-4-脱氢-6-去氧-D-甘露糖)(GDP-mannose 4，6-hydro-lyase(GDP-4-dehydro-6-deoxy-D-mannose-forming))」及「gmd」可互换使用且是指在GDP-鼠李糖及GDP-岩藻糖的生物合成中形成第一步骤的酶。
术语「GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase)」、「GDP-4-酮-6-去氧-D-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3，5-epimerase-4-reductase)」、「GDP-L-岩藻糖：NADP+4-氧化还原酶(3，5-表异构化)(GDP-L-fucose：NADP+4-oxidoreductase(3，5-epimerizing))」及「fcl」可互换使用且是指在GDP-岩藻糖的生物合成中形成第二步骤的酶。
术语「L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(L-fucokinase/GDP-fucosepyrophosphorylase)」、「L-岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-P鸟苷酰基转移酶(L-fucokinase/L-fucose-1-P guanylyltransferase)」、「GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(GDP-fucosepyrophosphorylase)」、「GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GDP-L-fucose pyrophosphorylase)」及「fkp」可互换使用且是指催化使用GTP将L-岩藻糖-1-磷酸盐转化为GDP-岩藻糖的酶。
术语「L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(L-glutamine-D-fructose-6-phosphate aminotransferase)」、「麸酰氨酸---果糖-6-磷酸转胺酶(异构化)(glutamine---fructose-6-phosphate transaminase(isomerizing))」、「磷酸己糖氨基转移酶(hexosephosphate aminotransferase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸异构酶(形成麸酰氨酸)(glucosamine-6-phosphate isomerase(glutamine-forming)」、「麸酰氨酸-果糖-6-磷酸转胺酶(异构化)(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase(isomerizing))」、「D-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(D-fructose-6-phosphate amidotransferase)」、「果糖-6-磷酸氨基转移酶(fructose-6-phosphate aminotransferase)」、「磷酸葡萄糖胺异构酶(glucosaminephosphate isomerase)」、「葡萄糖胺6-磷酸合酶(glucosamine 6-phosphatesynthase)」、「GlcN6P合酶(GlcN6P synthase)」、「GFA」、「glms」、「glmS」及「glmS*54」可互换使用且是指催化使用L-麸酰氨酸将D-果糖-6-磷酸盐转化为D-葡萄糖胺-6-磷酸盐的酶。
术语「葡萄糖胺-6-P脱胺酶(glucosamine-6-P deaminase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶(glucosamine-6-phosphate deaminase)」、「GlcN6P脱胺酶(GlcN6P deaminase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸异构酶(glucosamine-6-phosphate isomerase)」、「glmD」及「nagB」可互换使用且是指催化葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcN6P)的可逆异构化-脱胺作用以形成果糖-6-磷酸盐及铵离子的酶。
术语「磷酸葡萄糖胺变位酶(phosphoglucosamine mutase)」及「glmM」可互换使用且是指催化葡萄糖胺-6-磷酸盐转化成葡萄糖胺-1-磷酸盐的酶。磷酸葡萄糖胺变位酶亦可催化自葡萄糖-1-P形成葡萄糖-6-P，尽管速率要低1400倍。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺-6-P去乙酰酶(N-acetylglucosamine-6-Pdeacetylase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶(N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase)」及「nagA」可互换使用且是指催化N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcNAc-6-P)的N-乙酰基的水解以产生葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcN6P)及乙酸盐的酶。
N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-酰基-D-葡萄糖胺＝N-酰基-D-甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶、GlcNAc 2-表异构酶、N-酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶及N-乙酰基葡萄糖胺表异构酶。
UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含UDP-N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-GlcNAc-2-表异构酶及UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶。
N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺6-磷酸盐＝N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸盐的酶。
双功能性UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶为催化反应UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基-D-甘露糖胺及反应N-乙酰基-D-甘露糖胺+ATP＝ADP+N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸盐的双功能性酶。
葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶为催化乙酰基自乙酰基-CoA转移至D-葡萄糖胺-6-磷酸盐从而产生游离CoA及N-乙酰基-D-葡萄糖胺6-磷酸盐的酶。替代名称包含氨基去氧葡萄糖磷酸乙酰基转移酶、D-葡萄糖胺-6-P N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺6-磷酸乙酰基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺-磷酸N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸乙酰基酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡萄糖胺乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺N-乙酰基酶磷酸葡萄糖胺N-乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺转乙酰基酶、GNA及GNA1。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶(N-acetylglucosamine-6-phosphatephosphatase)」是指使N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcNAc-6-P)去磷酸化由此合成N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)的酶。
术语「N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶(N-acetylmannosamine-6-phosphatephosphatase)」是指使N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸盐(ManNAc-6P)去磷酸化成N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)的酶。
术语「N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶(N-acetylmannosamine-6-phosphate 2-epimerase)」、「ManNAc-6-P异构酶(ManNAc-6-P isomerase)」、「ManNAc-6-P2-表异构酶(ManNAc-6-P 2-epimerase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-6P 2-表异构酶(N-acetylglucosamine-6P 2-epimerase)」及「nanE」可互换使用且是指将ManNAc-6-P转化为N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcNAc-6-P)的酶。
术语「磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase)」、「乙酰基葡萄糖胺磷酸变位酶(acetylglucosamine phosphomutase)」、「乙酰基氨基去氧葡萄糖磷酸变位酶(acetylaminodeoxyglucose phosphomutase)」、「二氧磷基-N-乙酰基葡萄糖胺变位酶(phospho-N-acetylglucosamine mutase)」及「N-乙酰基-D-葡萄糖胺1，6-磷酸变位酶(N-acetyl-D-glucosamine 1，6-phosphomutase)」可互换使用且是指催化将N-乙酰基-葡萄糖胺1-磷酸盐转化成N-乙酰基葡萄糖胺6-磷酸盐的酶。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase)」、「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺二磷酸酶(UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase)」、「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(uridine diphosphoacetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「UTP：2-乙酰氨基-2-去氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UTP：2-acetamido-2-deoxy-alpha-D-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(UDP-GlcNAcpyrophosphorylase)」、「GlmU尿苷酰基转移酶(GlmU uridylyltransferase)」、「乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(Acetylglucosamine 1-phosphateuridylyltransferase)」、「UDP-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(UDP-acetylglucosaminepyrophosphorylase)」、「二磷酸尿苷-N-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(uridinediphosphate-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺磷酸化酶(uridine diphosphoacetylglucosamine phosphorylase)」及「乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase)」可互换使用且是指催化借由转移尿苷5-单磷酸盐(自尿苷5-三磷酸盐(uridine 5-triphosphate；UTP)转移)将N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸盐(GlcNAc-1-P)转化为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的酶。
术语葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶是指催化乙酰基自乙酰基辅酶A转移至葡萄糖胺-1-磷酸盐(GlcN-1-P)以产生N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸盐(GlcNAc-1-P)的酶。
术语「glmU」是指具有N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶及葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性两者且催化UDP-GlcNAc的从头生物合成路径中的两个依序反应的双功能性酶。C端域催化乙酰基自乙酰基辅酶A转移至GleN-1-P以产生GlcNAc-1-P，其借由尿苷5-单磷酸盐的转移而转化成UDP-GlcNAc，此是由N端域催化的反应。
术语「半乳糖-1-表异构酶(galactose-1-epimerase)」、「醛糖1-表异构酶(aldose1-epimerase)」、「变旋酶(mutarotase)」、「醛糖变旋酶(aldose mutarotase)」、「半乳糖变旋酶(galactose mutarotase)」、「半乳糖1-表异构酶(galactose 1-epimerase)」及「D-半乳糖1-表异构酶(D-galactose 1-epimerase)」可互换使用且是指催化β-D-半乳糖转化为α-D-半乳糖的酶。
术语「半乳糖激酶(galactokinase)」、「半乳糖激酶(磷酸化)(galactokinase(phosphorylating))」及「ATP：D-半乳糖-1-磷酸转移酶(ATP：D-galactose-1-phosphotransferase)」可互换使用且是指催化使用ATP将α-D-半乳糖转化成α-D-半乳糖1-磷酸盐的酶。
术语葡萄糖激酶及「葡萄糖激酶(磷酸化)(glucokinase(phosphorylating))」可互换使用且是指催化使用ATP将D-葡萄糖转化成D-葡萄糖6-磷酸盐的酶。
术语「半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(galactose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「Gal-1-P尿苷酰基转移酶(Gal-1-P uridylyltransferase)」、「UDP-葡萄糖---己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UDP-glucose---hexose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「尿苷酰基转移酶(uridyl transferas)」、「己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(hexose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「尿苷酰基转移酶(uridyltransferase)」、「己糖1-磷酸尿苷酰基转移酶(hexose 1-phosphateuridyltransferase)」、「UDP-葡萄糖：α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UDP-glucose：alpha-D-galactose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「galB」及「galT」可互换使用且是指催化反应D-半乳糖1-磷酸盐+UDP-D-葡萄糖＝D-葡萄糖1-磷酸盐+UDP-D-半乳糖的酶。
术语「UDP-葡萄糖4-表异构酶(UDP-glucose 4-epimerase)」、「UDP-半乳糖4-表异构酶(UDP-galactose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖表异构酶(uridinediphosphoglucose epimerase)」、「半乳糖瓦尔登转化酶(galactowaldenase)」、「UDPG-4-表异构酶(UDPG-4-epimerase)」、「尿苷二磷酸半乳糖4-表异构酶(uridine diphosphategalactose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸-半乳糖-4-表异构酶(uridine diphospho-galactose-4-epimerase)」、「UDP-葡萄糖表异构酶(UDP-glucose epimerase)」、「4-表异构酶(4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶(uridine diphosphoglucose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶(uridine diphosphate glucose 4-epimerase)」及「UDP-D-半乳糖4-表异构酶(UDP-D-galactose 4-epimerase)」可互换使用且是指催化UDP-D-葡萄糖转化为UDP-半乳糖的酶。
术语「葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(glucose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「UTP---葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UTP---glucose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UDP glucosepyrophosphorylase)」、「UDPG磷酸化酶(UDPG phosphorylase)」、「UDPG焦磷酸化酶(UDPGpyrophosphorylase)」、「尿苷5′-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine 5′-diphosphoglucose pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphoglucose pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸-D-葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate-D-glucose pyrophosphorylase)」、「尿苷-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine-diphosphate glucose pyrophosphorylase)」及「galU」可互换使用且是指催化使用UTP将D-葡萄糖-1-磷酸盐转化为UDP-葡萄糖的酶。
术语「磷酸葡萄糖变位酶(α-D-葡萄糖-1，6-二磷酸依赖型)(phosphoglucomutase(alpha-D-glucose-1，6-bisphosphate-dependent))」、「葡萄糖磷酸变位酶(不明确)(glucose phosphomutase(ambiguous))」及「磷酸葡萄糖变位酶(不明确)(phosphoglucosemutase(ambiguous))」可互换使用且是指催化D-葡萄糖1-磷酸盐转化为D-葡萄糖6-磷酸盐的酶。
术语「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶(UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase)」、「UDP乙酰基葡萄糖胺表异构酶(UDP acetylglucosamine epimerase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺表异构酶(uridine diphosphoacetylglucosamineepimerase)」、「尿苷二磷酸N-乙酰基葡萄糖胺-4-表异构酶(uridine diphosphate N-acetylglucosamine-4-epimerase)」、「尿苷5′-二磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺-4-表异构酶(uridine5′-diphospho-N-acetylglucosamine-4-epimerase)」及「UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺4-表异构酶(UDP-N-acetyl-D-glucosamine 4-epimerase)」可互换使用且是指催化UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)差向异构化为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)的酶。
术语「N-乙酰基半乳糖胺激酶(N-acetylgalactosamine kinase)」、「GALK2」、「GK2」、「GalNAc激酶(GalNAc kinase)」、「N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)-1-磷酸激酶(N-acetylgalactosamine(GalNAc)-1-phosphate kinase)」及「ATP：N-乙酰基-D-半乳糖胺1-磷酸转移酶(ATP：N-acetyl-D-galactosamine 1-phosphotransferase)」可互换使用且是指催化使用ATP自N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)合成N-乙酰基半乳糖胺1-磷酸盐(GalNAc-1-P)的酶。
术语「UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylgalactosaminepyrophosphorylase)」及「UDP-GalNAc焦磷酸化酶(UDP-GalNAc pyrophosphorylase)」可互换使用且是指使用UTP催化N-乙酰基半乳糖胺1-磷酸盐(GalNAc-1-P)转化为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)的酶。
术语「N-乙酰基神经氨酸激酶(N-acetylneuraminate kinase)」、「ManNAc激酶(ManNAc kinase)」、「N-乙酰基-D-甘露糖胺激酶(N-acetyl-D-mannosamine kinase)」及「hank」可互换使用且是指使ManNAc磷酸化以合成N-乙酰基甘露糖胺-磷酸盐(ManNAc-6-P)的酶。
术语「乙酰基-辅酶A合成酶(acetyl-coenzyme A synthetase)」、「acs」、「乙酰基-CoA合成酶(acetyl-CoA synthetase)」、「AcCoA合成酶(AcCoA synthetase)」、「乙酸盐--CoA接合酶(acetate--CoA ligase)」、「酰基活化酶(acyl-activating enzyme)」及「yfaC」可互换使用且是指在ATP依赖性反应中催化乙酸盐转化为乙酰基-辅酶A(AcCoA)的酶。
术语「丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)」、「丙酮酸氧化酶(pyruvateoxidase)」、「POX」、「poxB」及「丙酮酸盐：泛醌-8氧化还原酶(pyruvate：ubiquinone-8oxidoreductase)」可互换使用且是指催化丙酮酸盐的氧化去羧以产生乙酸盐及CO2的酶。
术语「乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、「D-乳酸脱氢酶(D-lactatedehydrogenase)」、「ldhA」、「hslI」、「htpH」、「D-LDH」、「发酵性乳酸脱氢酶(fermentativelactate dehydrogenase)」及「D-特异性2-羟基酸脱氢酶(D-specific 2-hydroxyaciddehydrogenase)」可互换使用且是指催化乳酸盐转化成丙酮酸盐由此生成NADH的酶。
如本文所用，术语「细胞制造力指数(cell productivity index；CPI)」是指借由细胞产生的产物的质量除以培养物中产生的细胞的质量。
术语「纯化(purified)」是指实质上或基本上不含干扰生物分子活性的组分的物质。对于细胞、糖类、核酸及多肽，术语「纯化」是指实质上或基本上不含通常伴随如天然状态下所发现的物质的组分的物质。典型地，本发明的经纯化糖、寡糖、蛋白质或核酸为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％纯，通常至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯，如借由基于银染凝胶的条带强度或用于测定纯度的其他方法所量测。纯度或均质性可借由所属技术领域中熟知的多种方式指示，所述方式诸如蛋白质或核酸样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后在染色后进行观测。出于某些目的，将需要高解析度及采用HPLC或用于纯化的类似方式。对于寡糖，纯度可使用诸如(但不限于)薄层层析、气相层析、NMR、HPLC、毛细管电泳或质谱分析的方法测定。
如使用序列比较演算法或借由目视检查所量测，在针对最大对应性比较且比对时，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语「一致(identical)」或「一致性百分比(percent identity)」或「一致性％(％identity)」是指两个或更多个相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的序列或子序列。对于序列比较，一个序列充当参考序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较演算法时，将测试序列及参考序列输入至电脑中，必要时指定子序列座标，且指定序列演算法程式参数。接着，序列比较演算法根据所指定的程式参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。可在参考序列的全长序列内全局计算一致性百分比，产生整体一致性百分比评分。替代地，可在参考序列的部分序列内计算一致性百分比，产生局部一致性百分比评分。在局部序列比对中使用参考序列的全长产生测试与参考序列之间的整体一致性百分比评分。一致性百分比可使用不同演算法如例如BLAST及PSI-BLAST(Altschul等人，1990，J Mol Biol 215：3，403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res 25：17，3389-402)、Clustal Omega方法(Sievers等人，2011，Mol.Syst.Biol.7：539)、MatGAT方法(Campanella等人，2003，BMC Bioinformatics，4：29)或EMBOSS Needle测定。
比对的基本局部比对搜寻工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST)方法为由国家生物技术资讯中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)提供以使用预设参数比较序列的演算法。该程式比较核苷酸或蛋白质序列与序列资料库且计算统计显著性。位置特异性叠代基本局部比对搜寻工具(Position-SpecificIterative Basic Local Alignment Search Tool；PSI-BLAST)使用蛋白质-蛋白质BLAST(BLASTp)自超过给定分数临限值侦测的序列的多个序列比对导出位置特异性评分矩阵(position-specific scoring matrix；PSSM)或分布概况。BLAST方法可用于成对或多序列比对。成对序列比对用于鉴别具有相似性的区，其可以指示两个生物序列(蛋白质或核酸)之间的功能、结构及/或进化关是。BLAST的网页界面可在以下者获得：https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
Clustal Omega(Clustal W)为使用接种的引导树及HMM分布-分布技术(HMMprofile-profile technique)以在三个或更多个序列之间产生比对的多序列比对程式。其产生发散序列的生物学上有意义的多序列比对。Clustal W的网页介面可在https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/下获得。使用Clustal W方法进行多序列比对及蛋白质序列一致性百分比计算的预设参数为：启用输入序列的去比对：FALSE；启用mbed类集群引导树：TRUE；启用mbed类集群叠代：TRUE；(组合引导树/HMM)叠代的数目：预设(0)；最大引导树叠代：预设[-1]；最大HMM叠代：预设[-1]；命令：比对。
矩阵全局比对工具(MatGAT)是在不需要资料的预比对的情况下产生DNA或蛋白质序列的相似性/一致性矩阵的电脑应用。程式使用Myers及Miller全局比对演算法进行一系列成对比对，计算相似性及一致性，且接着将结果置于距离矩阵中。使用者可以指定采用何种类型的比对矩阵(例如BLOSUM50、BLOSUM62及PAM250)进行其蛋白质序列检查。
当考虑到其整个长度时，EMBOSS Needle(https：//galaxy-iuc.github.io/emboss-5.0-docs/needle.html)使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)全局比对演算法寻找两个序列的最佳比对(包括空位)。借由动态程式化方法借由探究所有可能的比对且选择最佳比对来确保最佳比对。尼德曼-翁施演算法为一类演算法的成员，其可按mn步骤的次序计算最佳评分及比对(其中『n』及『m』为两个序列的长度)。空位开放罚分(预设10.0)为当产生空位时所扣除的分数。预设值假设您将EBLOSUM62矩阵用于蛋白质序列。空位延伸(预设0.5)罚分被添加至空位中的每一碱基或残基的标准空位罚分。此为惩罚长空位的方式。
如本文所用，具有与参考多肽序列的全长序列至少80％序列一致性的氨基酸序列的多肽应理解为与参考多肽序列的氨基酸序列全长具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91.50％、92.00％、92.50％、93.00％、93.50％、94.00％、94.50％、95.00％、95.50％、96.00％、96.50％、97.00％、97.50％、98.00％、98.50％、99.00％、99.50％、99.60％、99.70％、99.80％、99.90％、100％序列一致性的序列。在整个申请案中，除非另外明确指定，否则包含/组成/具有与参考多肽(或核苷酸序列)的全长氨基酸序列(或核苷酸序列)具有至少80％序列一致性的氨基酸序列(或核苷酸序列)的多肽(或DNA序列)，通常用SEQ ID NO或UniProt ID或Genbank NO.指示，与全长参考序列较佳具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，更佳具有至少85％，甚至更佳具有至少90％，最佳具有至少95％的序列一致性。
出于本发明的目的，一致性百分比是使用MatGAT2.01(Campanella等人，2003，BMCBioinformatics 4：29)来测定。采用针对蛋白质的以下预设参数：(1)空位成本存在：12及延伸：2；(2)所用矩阵为BLOSUM65。在较佳实施方式中，序列一致性是基于指定SEQ ID NO或UniProt ID或GenBank NO.，亦即参考序列的全长序列或其一部分计算。其部分较佳意谓完整参考序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
术语「培养(cultivation)」是指培养或发酵细胞的培养基、细胞本身及由细胞在全培养液中产生的寡糖，亦即在细胞的内部(胞内)以及外部(胞外)产生。
术语「膜蛋白(membrane protein)」及「膜运输蛋白(membrane transporterprotein)」可互换使用且是指作为细胞膜的一部分或与细胞膜相互作用且控制分子流动及跨越细胞的资讯的蛋白质。因此，膜蛋白参与转运，不论其输入至细胞中或自细胞输出。
此类膜运输蛋白可为如由运输蛋白分类资料库(Transporter ClassificationDatabase)所定义的搬运蛋白(porter)、P-P-键水解驱动的运输蛋白、β-桶状孔蛋白(β-Barrel Porin)、辅助运输蛋白、推定运输蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，该资料库经由www.tcdb.org获得由Saier Lab Bioinformatics Group运作及管理且提供膜运输蛋白的功能性及系统发生分类。此运输蛋白分类资料库详述膜运输蛋白的IUBMB核准的综合分类系统，称为运输蛋白分类(Transporter Classification；TC)系统如此处所描述的TCDB分类搜寻是基于如2019年6月17日发布的TCDB.org而定义。
搬运蛋白为利用载体介导的过程的单向搬运蛋白、同向搬运蛋白及反向搬运蛋白的集合名称(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。其属于电化学电位驱动运输蛋白且亦称为次级载体型促进剂。膜运输蛋白在利用载体介导的过程时包括于此类别中，以当单个物种借由易化扩散或在膜电位依赖型过程(若溶质带电)中进行转运时，则催化单向搬运；当两个或更多个物种在紧耦合过程中以相反方向转运时，不耦合至除化学渗透能量之外的直接能量形式，则催化反向搬运；及/或当两个或更多个物种在紧耦合过程中以相同方向一起转运时，不耦合至除化学渗透能量之外的直接能量形式，则催化同向搬运，所述蛋白均属于次级载体(Forrest等人，Biochim.Biophys.Acta 1807(2011)167-188)。此等系统通常具有立体特异性。溶质：溶质反向运输为次级载体的典型特征。搬运蛋白及酶的动态缔合产生功能性膜转运代谢群组，其将典型地获自胞外隔室的基质直接地导入至其细胞代谢中(Moraes及Reithmeier，Biochim.Biophys.Acta 1818(2012)，2687-2706)。经由此搬运蛋白系统转运的溶质包括但不限于阳离子、有机阴离子、无机阴离子、核苷、氨基酸、多元醇、磷酸化糖分解中间物、渗透剂、螯铁蛋白。
若膜运输蛋白水解无机焦磷酸、ATP或另一核苷三磷酸的二磷酸键以驱动一种溶质或多种溶质的主动吸收及/或挤出，则膜运输蛋白包括于P-P-键水解驱动的运输蛋白的类别中(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。膜运输蛋白可或可不暂时磷酸化，但基质未磷酸化。经由P-P-键水解驱动的运输蛋白的类别转运的基质包括但不限于阳离子、重金属、β-葡聚糖、UDP-葡萄糖、脂多糖、磷壁酸。
β-桶状孔蛋白膜运输蛋白形成跨膜孔隙，其通常允许溶质以能量无关的方式穿过膜。此等蛋白质的跨膜部分仅仅由β股组成，形成β-桶状(Saier等人，Nucleic AcidsRes.44(2016)D372-D379)。此等孔蛋白型蛋白质发现于革兰氏阴性细菌(Gram-negativebacteria)、粒线体、质体及可能抗酸性(acid-fast)革兰氏阳性细菌的外膜中。经由此等β-桶状孔蛋白转运的溶质包括但不限于核苷、棉子糖、葡萄糖、β-葡萄糖苷、寡糖。
辅助运输蛋白定义为促进跨越一或多个生物膜转运但本身不直接参与转运的蛋白质。此等膜运输蛋白始终结合一或多种现有转运系统起作用，所述系统诸如(但不限于)外膜因子(outer membrane factor；OMF)、多糖(PST)搬运蛋白、ATP结合卡匣(ATP-bindingcassette；ABC)型运输蛋白。其可提供与能量耦合相关以进行转运的功能，在复合物形成中起结构作用，提供生源或稳定性功能或调节功能(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。辅助运输蛋白的实例包括但不限于参与多糖转运的多糖共聚合酶家族、参与细菌素及化学毒素转运的膜融合蛋白家族。
推定运输蛋白包含以下者的家族，当成员的转运功能确认时，所述家族将被分类为别处，或若所提出的转运功能被证明无效，则将自运输蛋白分类系统中消除。此等家族包括一或多个已针对其提出转运功能的成员，但此类功能的证据尚未令人信服(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。如在2019年6月17日发布的TCDB系统下归入此组的推定运输蛋白的实例包括但不限于铜运输蛋白。
磷酸转移驱动的基团移位蛋白亦称为细菌磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统(phosphotransferase system；PTS)的PEP依赖型磷氧基转移驱动的基团移位蛋白。衍生自胞外糖的反应产物为细胞质磷酸糖类。催化糖磷酸化的酶促成分在紧耦合过程中叠加于转运过程上。PTS系统涉及许多不同态样，包含调节及趋化性、生物膜形成及发病机制(Lengeler，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.25(2015)79-93；Saier，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.25(2015)73-78)。如在2019年6月17日发布的TCDB系统下归于磷酸转移驱动的基团移位蛋白内的膜运输蛋白家族包括与葡萄糖-葡萄糖苷、果糖-甘露糖醇、乳糖-N，N′-二乙酰基壳二糖-β-葡萄糖苷、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖-果糖-山梨糖及抗坏血酸盐的转运有关联的PTS系统。
主要易化子超家族(major facilitator superfamily；MFS)为膜运输蛋白的超家族，其催化单向搬运、溶质：阳离子(H+，但几乎不为Na+)同向搬运及/或溶质：H+或溶质：溶质反向搬运。大多数长度为400-600个氨基酰基残基且具有12、14或偶尔24个跨膜α-螺旋扳手(TMS)，如借由Saier Lab Bioinformatics Group(www.tcdb.org)运作的运输蛋白分类资料库所定义。
如本文所用的「SET」或「糖流出运输蛋白(Sugar Efflux Transporter)」是指SET家族的膜蛋白，其为具有InterPRO域IPR004750的蛋白质及/或为属于eggNOGv4.5家族ENOG410XTE9的蛋白质。InterPro域的鉴别可借由使用https：//www.ebi.ac.uk/interpro/上的线上工具或InterProScan(https：//www，ebi.ac.uk/interpro/download.html)的独立版本使用预设值进行。在eggNOGv4.5中鉴别直是同源家族可使用eggNOG-mappervl(http：//eggnogdb.embl.de/#/app/home)的在线版本或独立版本进行。
如本文所用的术语「螯铁蛋白(Siderophore)」是指各种微生物的次级代谢物，其主要为铁离子特异性螯合剂。此等分子已分类为儿茶酚盐(catecholate)、氧肟酸盐(hydroxamate)、羧酸盐及混合类型。螯铁蛋白一般借由非核糖体肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetase；NRPS)依赖性路径或NRPS非依赖性路径(NRPS independentpathway，NIS)合成。NRPS依赖性螯铁蛋白生物合成路径中最重要的前驱物为分支酸盐(chorismate)。2，3-DHBA可借由异分支酸合酶、异分支酸酶及2，3-二羟基苯甲酸酯-2，3-脱氢酶催化的三步骤反应自分支酸盐形成。螯铁蛋白亦可由水杨酸盐形成，该水杨酸盐借由异分支酸丙酮酸酯解离酶自异分支酸盐形成。当鸟氨酸用作螯铁蛋白的前驱物时，生物合成取决于由L-鸟氨酸N5-单加氧酶催化的鸟氨酸的羟基化。在NIS路径中，螯铁蛋白生物合成中的重要步骤是N(6)-羟基离氨酸合酶。
需要运输蛋白以将螯铁蛋白输出至细胞外。至此在此过程中鉴别出膜蛋白的四个超家族：主要易化子超家族(MFS)；多药/寡糖基脂质/多糖翻转酶超家族(Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide Flippase Superfamily；MOP)；抗性、结节性及细胞分裂超家族(resistance，nodulation and cell division superfamily；RND)；及ABC超家族。一般而言，参与螯铁蛋白输出的基因与螯铁蛋白生物合成基因簇聚在一起。如本文所用的术语「螯铁蛋白输出蛋白(siderophore exporter)」是指将螯铁蛋白输出至细胞外所需的此类运输蛋白。
ATP结合卡匣(ABC)超家族含有吸收及流出转运系统，且此等两组中的成员通常松散地簇聚在一起。无蛋白质磷酸化的ATP水解为转运供以能量。ABC超家族内存在数十个家族，且家族一般与基质特异性相关。成员根据如借由运输蛋白分类资料库所定义的类别3.A.1分类，该资料库借由经由www.tcdb.org可获得的Saier Lab Bioinformatics Group运作且提供膜运输蛋白的功能性及系统发生分类。
术语「致能流出(enabled efflux)」意谓在细胞质膜及/或细胞壁上引入溶质的转运活性。该转运可借由引入及/或增加如本发明中所描述的运输蛋白的表现来实现。术语「增强的流出(enhanced efflux)」意谓改善溶质在细胞质膜及/或细胞壁上的转运活性。溶质在细胞质膜及/或细胞壁上的转运可借由引入及/或增加如本发明所描述的膜运输蛋白的表现来增强。膜运输蛋白的「表现(Expression)」在基因为内源基因的情况下，被定义为编码该膜运输蛋白的该基因的「过度表现(overexpression)」；或在编码该膜运输蛋白的基因为不存在于野生型菌株或细胞中的异源基因的情况下，被定义为「表现(expression)」。
如本文所用的术语「前驱物(precursor)」是指借由细胞吸收或合成以特异性制造根据本发明的寡糖的物质。在此意义上，前驱物可为如本文所定义的受体，但亦可为另一物质、代谢物，其首先在细胞内经修饰作为寡糖的生物化学合成路径的一部分。此类前驱物的实例包含如本文所定义的受体及/或葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、岩藻糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、二羟基丙酮、葡萄糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基-甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺；磷酸化糖，如例如但不限于葡萄糖-1-磷酸盐、半乳糖-1-磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐、果糖-6-磷酸盐、果糖-1，6-二磷酸盐、甘油-3-磷酸盐、甘油醛-3-磷酸盐、二羟基丙酮-磷酸盐、葡萄糖胺-6-磷酸盐、N-乙酰基-葡萄糖胺-6-磷酸盐、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸盐、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸盐、甘露糖-6-磷酸盐、甘露糖-1-磷酸；及/或如本文所定义的核苷酸活化糖，如例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺、GDP-甘露糖、GDP-4-脱氢-6-去氧-α-D-甘露糖及/或GDP-岩藻糖。
视情况，细胞经转型以包含至少一种编码选自由以下者组成的群的蛋白质的核酸序列：乳糖运输蛋白；岩藻糖运输蛋白；用于核苷酸活化糖的运输蛋白，其中该运输蛋白将a内化至添加前驱物以用于寡糖合成的培养基中。
如本文所用的术语「受体(acceptor)」是指可借由糖基转移酶修饰的双糖或寡糖。此类受体的实例包含乳糖，乳-N-二糖(LNB)、乳-N-丙糖、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、N-乙酰基-乳糖胺(LacNAc)、乳-N-五糖(LNP)、乳-N-新五糖、对乳-N-五糖、对乳-N-新五糖、乳-N-新生五糖I(lacto-N-novopentaose I)、乳-N-六糖(lacto-N-hexaose；LNH)、乳-N-新六糖(lacto-N-neohexaose；LNnH)、对乳-N-新六糖(para lacto-N-neohexaose；pLNnH)、对乳-N-六糖(para lacto-N-hexaose；pLNH)、乳-N-七糖、乳-N-新七糖、对乳-N-新七糖、对乳-N-七糖、乳-N-八糖(lacto-N-octaose；LNO)、乳-N-新八糖、异乳-N-八糖、对乳-N-八糖、异乳-N-新八糖、新生乳-N-新八糖、对乳-N-新八糖、异乳-N-九糖、新生乳-N-九糖、乳-N-九糖、乳-N-十糖、异乳-N-十糖、新生乳-N-十糖、乳-N-新十糖；半乳糖基乳糖，经延伸具有1、2、3、4、5或多个N-乙酰基乳糖胺单位及/或1、2、3、4、5或多个乳-N-二糖单位的乳糖及含有1或多个N-乙酰基乳糖胺单位及或1或多个乳-N-二糖单位的寡糖，或其转为寡糖及岩藻糖基化形式的中间物。
在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「合成(synthesize)」、「合成(synthesized)」及「合成(synthesis)」可分别与特征「制造(produce)」、「制造(produced)」及「制造(production)」互换地使用。
发明详述
根据第一态样，本发明提供一种用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的经代谢工程改造的细胞，亦即，经代谢工程改造以用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的细胞。本文中，提供单个经代谢工程改造的细胞，其能够表现，较佳表现至少一种岩藻糖基转移酶及一种额外糖基转移酶，且能够合成GDP-岩藻糖及一或多种作为该额外糖基转移酶的供体的糖-核苷酸。在整个申请案中，除非另外明确说明，否则「经遗传修饰的细胞(genetically modified cell)」或「经代谢工程改造的细胞」较佳意谓分别经遗传修饰或经代谢工程改造以用于制造包含根据本发明的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的该混合物的细胞。在本发明的上下文中，如本文所揭示的该混合物的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖较佳地不出现在该经代谢工程改造的细胞的野生型先驱细胞中。
根据第二态样，本发明提供一种用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的方法。该方法包含以下步骤：
i)提供一种细胞，较佳单一细胞，其能够表现，较佳表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶及至少一种额外糖基转移酶，且能够合成GDP-岩藻糖及一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于该额外糖基转移酶的供体，及
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成所述核苷酸-糖的条件下培养该细胞，使得该细胞制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的该中性混合物，
iii)较佳地，自培养分离所述中性寡糖中的至少一者，更佳地，自该培养分离所有所述中性寡糖。
本发明中所用的岩藻糖基转移酶可为如本文所定义的岩藻糖基转移酶中的任一者。
在本发明的范围内，容许条件应理解为与物理或化学参数相关的条件，所述参数包括但不限于温度、pH、压力、渗透压及产物/前驱物/受体浓度。
在一特定实施方式中，容许条件可包括30+/-20摄氏度的温度范围、7+/-3的pH范围。
在本发明的上下文中，应理解，该细胞胞内制造根据本发明的不同寡糖的该混合物。所属技术领域中具有通常知识者应进一步理解，一部分或实质上所有所述所制造的寡糖保留在胞内及/或经由被动或主动运输排出到细胞外。
根据本发明，用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的该方法可利用非代谢经工程改造的细胞或可利用经代谢工程改造的细胞，亦即，经代谢工程改造以用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的该混合物的细胞。
根据本发明的方法及细胞的一较佳实施方式，经代谢工程改造的细胞经基因表现模组修饰，其中来自所述表现模组中的任一者的表现为持续型的或借由天然诱导物产生。
所述表现模组亦称为转录单元且包含用于表现重组基因的聚核苷酸，所述基因包括编码基因序列及可操作地连接于编码基因的适当转录及/或转译控制信号。所述控制信号包含启动子序列、非转译区、核糖体结合位点、终止子序列。所述表现模组可含有用于表现一个单一重组基因的元件，但亦可含有用于表现更多重组基因的元件或可组织于操纵子结构中以用于整合表现两个或更多个重组基因。所述聚核苷酸可借由重组DNA技术，使用所属技术领域中熟知的技术来产生。所属技术领域中具有通常知识者熟知的构筑表现模组的方法包括例如试管内重组DNA技术、合成技术及活体内基因重组。参见例如描述于以下者中的技术：Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，N.Y.(1989及每年更新)。
根据本发明的一较佳实施方式，细胞经一或多个表现模组修饰。表现模组可整合于该细胞的基因体中或可在载体上呈递至该细胞。该载体可以稳定转型/转染至该经代谢工程改造的细胞中的质体、黏质体、噬菌体、脂质体或病毒形式存在。其中，此类载体包括染色体、游离型及病毒衍生的载体，例如，来源于细菌质体、噬菌体、转位子、酵母游离基因体、插入元件、酵母染色体元件、病毒的载体及来源于其等的组合的载体，诸如来源于质体及噬菌体遗传元件(诸如黏质体及噬质体)的载体。此等载体可含有选择标记，诸如(但不限于)抗生素标记、营养缺陷型标记、毒素-抗毒素标记、RNA有义/反义标记。表现系统构筑体可含有调节以及产生表现的控制区。通常，就此而言，适合于在宿主中维持、扩增或表现聚核苷酸及/或表现多肽的任何系统或载体可用于表现。适当DNA序列可借由各种熟知及惯例技术、诸如(例如)阐述于Sambrook等人(参见上文)文献中的彼等技术中的任一者插入至表现系统中。对于重组制造，细胞可经基因工程改造以并入本发明的表现系统或其部分或聚核苷酸。向细胞中引入聚核苷酸可借由许多标准实验室手册，诸如Davis等人，Basic Methodsin Molecular Biology，(1986)及Sambrook等人，1989，前述文献中所描述的方法来实现。
如本文所用，表现模组包含用于表现至少一种重组基因的聚核苷酸。该重组基因参与在合成该寡糖混合物中起作用的多肽的表现；或该重组基因与该宿主细胞中的其他路径相关联，所述路径不参与三种或更多种寡糖的该混合物的合成。所述重组基因编码具有经修饰的表现或活性的内源蛋白，较佳所述内源蛋白过度表现；或所述重组基因编码异质引入且表现于该经修饰的细胞中，较佳过度表现的异源蛋白。内源蛋白可在亦表现异源蛋白的细胞中具有经修饰的表现。
根据本发明的一较佳实施方式，所述表现模组中的每一者的表现为持续型的或借由天然诱导物产生。如本文所用，持续型表现应理解为在生物体中连续转录的基因的表现。借由天然诱导物产生的表现应理解为仅在宿主的某一天然条件(例如生物体在分娩中或在泌乳期间)下表现的基因的兼性或调节表现，作为对环境变化(例如包括但不限于激素、热、冷、光、氧化或渗透应激/信号传导)的反应，或取决于发育阶段的位置或该宿主细胞的细胞周期，包括但不限于细胞凋亡及自体吞噬。
本发明提供不同类型的细胞以用于中性寡糖混合物的该制造，该寡糖混合物包含具有单个经代谢工程改造的细胞的四种或超过四种中性岩藻糖基化寡糖。举例而言，本发明提供一种细胞，其中该细胞表现一种岩藻糖基转移酶及一种额外不为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶，且该细胞合成GDP-岩藻糖及另一种不同于GDP-岩藻糖但为用于该额外糖基转移酶的供体的额外核苷酸-糖。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现两种或更多种岩藻糖基转移酶及作为所述岩藻糖基转移酶的核苷酸-糖供体的GDP-岩藻糖。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现两种不同岩藻糖基转移酶及一种不为岩藻糖基转移酶的额外糖基转移酶，且该细胞合成GDP-岩藻糖及另一种不同于GDP-岩藻糖但为用于该额外糖基转移酶的供体的额外核苷酸-糖。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现一种岩藻糖基转移酶及不为岩藻糖基转移酶的两种额外糖基转移酶，且该细胞合成GDP-岩藻糖及另一种不同于GDP-岩藻糖但为用于所述额外糖基转移酶的供体的额外核苷酸-糖。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现一种岩藻糖基转移酶及不为岩藻糖基转移酶的两种额外糖基转移酶，且所述细胞合成GDP-岩藻糖及不同于GDP-岩藻糖的两种额外核苷酸-糖，且其中第一种核苷酸-糖为用于第一种额外糖基转移酶的供体且第二种核苷酸-糖为用于第二种额外糖基转移酶的供体。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现两种或更多种岩藻糖基转移酶及不为岩藻糖基转移酶的一或多种额外糖基转移酶，且该细胞合成GDP-岩藻糖及不同于GDP-岩藻糖但为用于所述额外糖基转移酶中的任一者的供体的一或多种额外核苷酸-糖。
在本文所描述的方法及细胞中，细胞较佳包含编码一种蛋白质的同一编码DNA序列的多个复本。在本发明的上下文中，该蛋白可为糖基转移酶、膜蛋白或如本文所揭示的任何其他蛋白。在整个本申请案中，特征「多个(multiple)」意谓至少2个，较佳至少3个，更佳至少4个，甚至更佳至少5个。
在根据本发明的方法及/或细胞的一实施方式中，该混合物包含至少四种，较佳至少五种，更佳至少六种，甚至更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性岩藻糖基化寡糖。在整个申请案中，除非另外说明，否则特征「寡糖(oligosaccharide)」及「寡糖(oligosaccharides)」较佳分别经「一种MMO」及「多种MMO」替换，更佳地分别经「基于乳糖的MMO(lactose-based MMO)」及「多种基于乳糖的MMO(lactose-based MMOs)」替换，甚至更佳地分别经「一种HMO」及「多种HMO」替换。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，该中性混合物中的中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者为哺乳动物乳寡糖(MMO)，较佳乳糖类哺乳动物乳寡糖，更佳人乳寡糖(HMO)。在一实施方式中，细胞在该所制造的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物中产生一种哺乳动物乳寡糖。在一较佳实施方式中，细胞在该所制造的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物中产生超过一种哺乳动物乳寡糖。在一更佳实施方式中，所制造的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物中的所有所述寡糖皆为哺乳动物乳寡糖。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的所述中性混合物中的寡糖中的至少一者为人类ABO血型系统的抗原。在一实施方式中，细胞在该所制造的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物中产生人类ABO血型系统的一种抗原。在一较佳实施方式中，细胞在该所制造的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物中产生人类ABO血型系统的超过一种抗原。在一更佳实施方式中，细胞在该所制造的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物中产生人类ABO血型系统的三种抗原。
在本发明的上下文中，根据本发明的至少三种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物可包含其他寡糖，诸如如本文中所描述的中性非岩藻糖基化寡糖。此类寡糖可例如为如本文所述基于乳糖的寡糖、基于LNB的寡糖及/或基于LacNAc的寡糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的一个更佳实施方式中，该混合物包含人类ABO血型系统的至少三种不同抗原。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一更佳实施方式中，该中性混合物包含至少四种，较佳至少五种，更佳至少六种，甚至更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种中性岩藻糖基化哺乳动物乳寡糖(MMO)，较佳基于乳糖的哺乳动物乳寡糖，更佳人乳寡糖(HMO)。在整个申请案中，除非另外明确说明，否则特征「包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物(mixture comprising at least four different neutral fucosylatedoligosaccharides)」较佳用「包含至少四种不同中性岩藻糖基化MMO，较佳基于乳糖的MMO，更佳基于HMO的混合物(mixture comprising at least four different neutralfucosylated MMOs，preferably lactose-based MMOs，more preferably HMOs)」替换，同样，「包含至少五种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物(mixture comprising at leastfive different neutral fucosylated oligosaccharides)」较佳用「包含至少五种不同中性岩藻糖基化MMO，较佳基于乳糖的MMO，更佳HMO的混合物(mixture comprising atleast five different neutral fucosylated MMOs，preferably lactose-based MMOs，more preferably HMOs)」替换，等等。在本发明的上下文中，根据本发明的一较佳实施方式的至少四种不同中性岩藻糖基化哺乳动物乳寡糖的中性混合物可包含其他寡糖，诸如哺乳动物乳寡糖及/或非哺乳动物乳寡糖。此类寡糖可例如为如本文所述基于乳糖的寡糖、基于LNB的寡糖及/或基于LacNAc的寡糖。在根据本发明的方法及/或细胞的一个较佳实施方式中，该中性混合物包含至少四种如本文所揭示的不同中性岩藻糖基化MMO及视情况人类ABO血型系统的至少一种，较佳至少两种，更佳至少三种抗原。在根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式中，该中性混合物包含至少四种如本文所揭示的不同中性岩藻糖基化MMO及视情况至少一种，较佳至少两种，更佳至少三种，甚至更佳至少四种不同的基于LNB的寡糖及视情况至少一种，较佳至少两种，更佳至少三种，甚至更佳至少四种不同的基于LacNAc的寡糖。在根据本发明的方法及/或细胞的替代及/或额外较佳实施方式中，哺乳动物乳寡糖构成根据本发明的寡糖混合物的至少50％，较佳至少60％，更佳至少70％，甚至更佳至少80％，甚至更佳至少90％。在根据本发明的方法及/或细胞的一更佳实施方式中，该混合物中的所有寡糖为MMO，较佳基于乳糖的MMO，更佳HMO。如本文中已陈述，如本文所揭示的混合物较佳为如本文所描述对细胞进行代谢工程改造的直接结果。
在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「至少一种(at least one)」较佳用「一种(one)」替换，同样地，特征「至少两种(at least two)」较佳用「两种(two)」替换，等等。
在根据本发明的方法及/或细胞的一视情况选用的实施方式中，根据本发明的混合物进一步包含LacdiNAc(亦即GalNAc-b1，4-GlCNAc)及/或GalNAc-b1，4-葡萄糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代实施方式中，中性岩藻糖基化寡糖混合物包含至少三种在聚合度(degree of polymerization，DP)方面不同的不同中性岩藻糖基化寡糖。寡糖的聚合度是指寡糖结构中存在的单糖单元的数目。如本文所用，寡糖的聚合度为三(DP3)或更高，后者包含4(DP4)、5(DP5)、6(DP6)或更长中的任一者。如本文所描述的中性岩藻糖基化寡糖混合物较佳地包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖，其中存在于该混合物中的至少三种，较佳全部寡糖彼此具有不同的聚合度。举例而言，该中性岩藻糖基化寡糖混合物由四种寡糖组成，其中两种寡糖是聚合度为3(DP3)的三糖，第三种寡糖是聚合度为4(DP4)的四糖，且第四种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖。在另一实例中，该中性岩藻糖基化寡糖混合物由四种寡糖组成，其中第一种寡糖为聚合度为3(DP3)的三糖，第二种寡糖及第三种寡糖为聚合度为4(DP4)的四糖，且第四种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖。在另一实例中，该中性岩藻糖基化寡糖混合物由四种寡糖组成，其中第一种寡糖为聚合度为3(DP3)的三糖，第二种寡糖为聚合度为4(DP4)的四糖，且第三种及第四种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖。在另一实例中，该中性岩藻糖基化寡糖混合物由四种寡糖组成，其中所有所述四种寡糖具有不同聚合度，其中该第一种寡糖为聚合度为3(DP3)的三糖，其中该第二种寡糖为聚合度为4(DP4)的四糖，其中该第三种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖，且其中该第四种寡糖为具有聚合度6(DP6)的六糖。根据本发明的方法及/或细胞的一个实施方式，细胞制造包含五种不同中性岩藻糖基化寡糖或超过五种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物。在一个实施方式中，此类混合物包含至少五种不同中性岩藻糖基化寡糖，其中寡糖中的三者具有不同聚合度。在一个实施方式中，混合物中的所有所述寡糖具有如本文所描述的不同聚合度。
根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代实施方式，该混合物的所述岩藻糖基化寡糖中的至少一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖、及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
较佳地，中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物包含至少一种经由糖苷键彼此连接的3个或更多个单糖次单元的中性寡糖，其中所述单糖残基中的至少一者为N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)残基。该寡糖可含有超过一个GlcNAc残基，例如两个、三个或超过三个。GlcNAc可存在于寡糖的还原端处。该GlcNAc亦可存在于该寡糖的非还原端处。该GlcNAc亦可存在于寡糖结构内。GlcNAc可连接至包含半乳糖、岩藻糖的其他单糖次单元。
替代地或另外，中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物包含至少一种中性半乳糖基化寡糖且含有至少一个半乳糖单糖次单元。该半乳糖基化寡糖为包含至少三个经由糖苷键彼此连接的单糖次单元的糖结构，其中该单糖次单元中的至少一者为半乳糖。该中性半乳糖基化寡糖可含有超过一个半乳糖残基，例如两个、三个或超过三个。半乳糖可连接至包含葡萄糖、GlcNAc、岩藻糖的其他单糖次单元。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代较佳实施方式中，根据本发明的中性寡糖混合物包含在该混合物中相对丰度为至少50％，较佳至少60％，更佳至少70％，甚至更佳至少80％，甚至更佳至少90％，甚至更佳至少95％的岩藻糖基化寡糖，最佳地，在本发明的该中性寡糖混合物中的所有寡糖经岩藻糖基化。所属技术领域中具有通常知识者将进一步理解，若定义中性混合物中的岩藻糖基化寡糖的相对丰度，则混合物中的寡糖的剩余部分不可避免地为中性非岩藻糖基化寡糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，该中性寡糖混合物不包含非岩藻糖基化寡糖。在根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式中，该中性寡糖混合物包含至少四种岩藻糖基化寡糖及一或多种非岩藻糖基化寡糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代实施方式中，如本文所描述的混合物中各寡糖的相对丰度为至少5％，较佳至少10％。
在本发明的上下文中，如本文所揭示的该寡糖混合物较佳为如本文所描述的对细胞进行代谢工程改造的直接结果。此意谓，根据本发明的混合物中的寡糖中的较佳至少一种，更佳至少两种，甚至更佳至少三种，最佳全部不借由该经代谢工程改造的细胞的野生型先驱细胞产生。
如本文所描述的寡糖的名称是根据如借由Urashima等人(Trends inGlycoscience and Glycotechnology，2018，第30卷，编号72，第SE51-SE65页)及其中的参考文献所公开且如「Prebiotics and Probiotics in human milk.Origins andFunctions of Milk-Borne Oligosaccharides and Bacteria」，第2及3章，编M.McGuire，M.McGuire，L Bode，Elsevier，Academic Press，第506页)中所公开的寡糖名称及式。
在根据本发明的方法及/或细胞的一更佳实施方式中，混合物包含以下者、基本上由以下者组成或由以下者组成：至少四种，较佳至少五种，甚至更佳至少六种，甚至更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性岩藻糖基化寡糖，较佳选自以下各者：
-基于乳糖的中性岩藻糖基化寡糖，较佳以下者中的任一者：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-[Fuc-a1，3-[Gal-b1，4]-GlcNAc-b1，6]-Gal-b1，4-Glc、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、GalNAc-LNFP-I(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II；Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III；Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V；Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI；Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-新岩藻五糖I(LNnFPI；Fuc-a1，2-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-[Fuc-a1，4]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFHII；Fuc-a1，4-(Gal-b1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、单岩藻糖基乳-N-六糖III、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基-乳-N-新六糖、LNnDFH(Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、A-四糖(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，4-Glc)、Gal-LNFP-III、LNDFH III、F-LNH I、F-LNH II、F-LNH III、F-LNnH II、F-LNnH I、F-对-LNH I、F-对-LNH II、F-对-LNnH、DF-LNH II、DF-LNH I、DF-LNnH、DF-对-LNH、DF-对-LNHII、DF-对LNH III、DF-对-LNnH、TF-LNH I、TF-LNH II、TF-对-LNH I、TF-对-LNH II、TF-对-LNnH、F-LNO I、F-LNO II、F-LNO III、F-LNnO、F-LNnO II、F-异-LNO、F-异-LNnO I、F-新生-LNnO、F-对-LNO、DF-异-LNnO、DF-LNO I、DF-LNO II、DF-LNO III、DF-LNnO I、DF-LNnO II、DF-LNnO III、DF-异-LNO I、DF-异-LNO II、DF-异-LNO III、DF-异-LNO IV、DF-异-LNO V、DF-异-LNO VI、DF-异-LNO VII、DF-对-LNnO、TF-LNO I、TF-LNO II、TF-LNnO、TF-异-LNO I、TF-异-LNO II、TF-异-LNO III、TF-异-LNO IV、TF-异-LNnO、四-F-异-LNO、四-F-对-LNO、五-F-异-LNO、F-LND I、F-LND II、DF-LND I、DF-LND II、DF-LND III、DF-LND IV、DF-LNDV、DF-LND VI、TriF-LND I、TriF-LND II、TriF-LND III、TriF-LND IV、TriF-LND V、TriF-LND VI、TriF-LND VII、TetraF-LND I、TetraF-LND II、TetraF-LND III、F-LNnD I、F-LNnDII、DF-LNnD、DF-新生-LND、DF D Gal-LNnH(Gal-a1，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-a1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-GlcNAc-b1，3]-Ga l-b1，4-Glc)、3-F-异球三糖、B-四糖、B-五糖、B-六糖、B-七糖、DF DGal-LNnT(Gal-a1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-Glc)、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnH b、DFGal-对-LNnH，更佳以下者中的任一者：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-[Fuc-a1，3-[Gal-b1，4]-GlcNAc-b1，6]-Gal-b1，4-Glc、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、GalNAc-LNFP-I(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II；Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III：Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V；Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI；Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)，最佳以下者中的任一者：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)；及/或
-基于LNB的中性岩藻糖基化寡糖，较佳以下者中的任一者：2′FLNB、4-FLNB、Leb(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc)；及/或
-基于LacNAc的中性岩藻糖基化寡糖，较佳以下者中的任一者：2′FLacNAc、3-FLacNAc、Ley(Fuc-a1，2-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc)。
在本发明的此上下文中的较佳混合物包含至少四种中性岩藻糖基化寡糖的混合物，其中所述混合物包含以下者、基本上由以下者组成或由以下者组成：至少四种，较佳至少五种，甚至更佳至少六种，甚至更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种选自包含以下者的清单的不同中性岩藻糖基化寡糖：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-[Fuc-a1，3-[Gal-b1，4]-GlcNAc-b1，6]-Gal-b1，4-Glc、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、GalNAc-LNFP-I(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II；Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III；Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V；Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI；Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-新岩藻五糖I(LNnFP I；Fuc-a1，2-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-[Fuc-a1，4]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH II；Fuc-a1，4-(Gal-b1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、单岩藻糖基乳-N-六糖III、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基-乳-N-新六糖、LNnDFH(Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、A-四糖(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，4-Glc)、2′FLNB、4-FLNB、Leb(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc)、2′FLacNAc、3-FLacNAc、Ley(Fuc-a1，2-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc)、Gal-LNFP-III、LNDFH III、F-LNH I、F-LNH II、F-LNH III、F-LNnH II、F-LNnH I、F-对-LNH I、F-对-LNH II、F-对-LNnH、DF-LNH II、DF-LNHI、DF-LNnH、DF-对-LNH、DF-对-LNH II、DF-对LNH III、DF-对-LNnH、TF-LNH I、TF-LNH II、TF-对-LNH I、TF-对-LNH II、TF-对-LNnH、F-LNO I、F-LNO II、F-LNO III、F-LNnO、F-LNnOII、F-异-LNO、F-异-LNnO I、F-新生-LNnO、F-对-LNO、DF-异-LNnO、DF-LNO I、DF-LNO II、DF-LNO III、DF-LNnO I、DF-LNnO II、DF-LNnO III、DF-异-LNO I、DF-异-LNO II、DF-异-LNO III、DF-异-LNO IV、DF-异-LNO V、DF-异-LNO VI、DF-异-LNO VII、DF-对-LNnO、TF-LNOI、TF-LNO II、TF-LNnO、TF-异-LNO I、TF-异-LNO II、TF-异-LNO III、TF-异-LNO IV、TF-异-LNnO、四-F-异-LNO、四-F-对-LNO、五-F-异-LNO、F-LND I、F-LND II、DF-LND I、DF-LNDII、DF-LND III、DF-LND IV、DF-LND V、DF-LND VI、TriF-LND I、TriF-LND II、I riF-LNDIII、TriF-LND IV、TriF-LND V、TriF-LND VI、TriF-LND VII、TetraF-LND I、TetraF-LNDII、TetraF-LND III、F-LNnD I、F-LNnD II、DF-LNnD、DF-新生-LND、DF D Gal-LNnH(Gal-a1，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-a1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-GlcNAc-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、3-F-异球三糖、B-四糖、B-五糖、B-六糖、B-七糖、DF DGal-LNnT(Gal-a1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-Glc)、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnHb、DFGal-对-LNnH。
在本发明的此上下文中的更佳混合物包含至少四种中性岩藻糖基化寡糖的混合物，其中所述混合物包含以下者、基本上由以下者组成或由以下者组成：至少四种，较佳至少五种，甚至更佳至少六种，甚至更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种选自包含以下者的清单的不同中性岩藻糖基化寡糖：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-[Fuc-a1，3-[Gal-b1，4]-GlcNAc-b1，6]-Gal-b1，4-Glc、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、GalNAc-LNFP-I(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II；Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III；Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V；Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI；Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)。
所述较佳混合物的实例包含有包含以下者、由以下者组成或基本上由以下者组成的混合物：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)及乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)。所述较佳混合物的另一实例包含一种混合物，该混合物包含至少四种选自包含以下者的清单的寡糖、由其组成或基本上由其组成：3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III；Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI；Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-[Fuc-a1，4]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH II；Fuc-a1，4-(Gal-b1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)。所述较佳混合物的另一实例包含一种混合物，该混合物包含至少四种选自包含以下者的清单的寡糖、由其组成或基本上由其组成：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、2′FLNB、4-FLNB、Leb(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II：Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V；Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)。
例示性混合物在本发明的此上下文中描述于实施例部分中。
视情况，至少一种，较佳至少两种，更佳至少三种，甚至更佳至少四种，甚至更佳至少五种，甚至更佳至少六种，最佳至少七种不同中性非岩藻糖基化寡糖存在于根据本发明的混合物中。较佳地，所述中性非岩藻糖基化寡糖较佳选自：
-基于乳糖的中性非岩藻糖基化寡糖，较佳以下者中的任一者：乳-N-三糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1，3)半乳糖基-对-乳-N-新五糖、β-(1，4)半乳糖基-对-乳-N-五糖、Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(Gal-a1，4-乳糖)、β3′-半乳糖基乳糖、β6′-半乳糖基乳糖、Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、GalNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc(GalNAc-b1，3-乳糖)、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-乳糖、GalNAc-b1，3-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(球-N-四糖)、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、GalNAc-b1，3-LNT、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-LNT、新生-LNT(GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP I(Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3-Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP II(Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP III(Gal-b1，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、新生-LNO、GalNAc-b1，3-LNnT、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-LNnT、LNH、LNnH、异-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、异-LND、GalNAc-a1，3-Gal-b1，4-Glc、新生-LNP I、异-LNT、DGalLNnH、galili五糖，更佳以下者中的任一者：乳-N-三糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1，3)半乳糖基-对-乳-N-新五糖、β-(1，4)半乳糖基-对-乳-N-五糖、Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(Gal-a1，4-乳糖)、β3′-半乳糖基乳糖、β6′-半乳糖基乳糖、GalNAc-b1，3-乳糖、球-N-四糖，最佳以下者中的任一者：乳-N-三糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖；及/或
-基于LNB的中性非岩藻糖基化寡糖、及/或
-基于LacNAc的中性非岩藻糖基化寡糖，如例如LacDiNAc及poly-LacNAc。
在本发明的此上下文中的较佳混合物包含至少四种中性岩藻糖基化寡糖与至少一种，较佳至少两种，更佳至少三种，甚至更佳至少四种，甚至更佳至少五种，甚至更佳至少六种，最佳至少七种选自包含以下者的清单的不同中性非岩藻糖基化寡糖的混合物：乳-N-三糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1，3)半乳糖基-对-乳-N-新五糖、β-(1，4)半乳糖基-对-乳-N-五糖、Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(Gal-a1，4-乳糖)、β3′-半乳糖基乳糖、β6′-半乳糖基乳糖、Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、GalNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc(GalNAc-b1，3-乳糖)、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-乳糖、GalNAc-b1，3-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(球-N-四糖)、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、GalNAc-b1，3-LNT、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-LNT、新生-LNT(GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP I(Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3-Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP II(Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP III(Gal-b1，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、新生-LNO、GalNAc-b1，3-LNnT、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-LNnT、LacDiNAc、poly-LacNAc、LNH、LNnH、异-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、异-LND、GalNAc-a1，3-Gal-b1，4-Glc、新生-LNP I、异-LNT、DGalLNnH、galili五糖。
在本发明的此上下文中的更佳混合物包含至少四种中性岩藻糖基化寡糖与至少一种，较佳至少两种，更佳至少三种，甚至更佳至少四种，甚至更佳至少五种，甚至更佳至少六种，最佳至少七种选自包含以下者的清单的不同中性非岩藻糖基化寡糖的混合物：乳-N-三糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1，3)半乳糖基-对-乳-N-新五糖、β-(1，4)半乳糖基-对-乳-N-五糖、Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(Gal-a1，4-乳糖)、β3′-半乳糖基乳糖、β6′-半乳糖基乳糖、GalNAc-b1，3-乳糖及球-N-四糖。例示性混合物在本发明的此上下文中描述于实施例部分中。
在根据本发明的方法及/或细胞的甚至更佳实施方式中，根据本发明的混合物包含以下者、基本上由以下者组成或由以下者组成：至少四种，较佳至少五种，甚至更佳至少六种，甚至更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种选自包含以下者的清单的不同中性岩藻糖基化寡糖：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-[Fuc-a1，3-[Gal-b1，4]-GlcNAc-b1，6]-Gal-b1，4-Glc、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、GalNAc-LNFP-I(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II；Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III；Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V；Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI；Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-新岩藻五糖I(LNnFP I；Fuc-a1，2-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-[Fuc-a1，4]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH II；Fuc-a1，4-(Gal-b1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、单岩藻糖基乳-N-六糖III、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基-乳-N-新六糖、LNnDFH(Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、A-四糖(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，4-Glc)、2′FLNB、4-FLNB、Leb(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc)、2′FLacNAc、3-FLacNAc、Ley(Fuc-a1，2-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc)、Gal-LNFP-III、LNDFH III、F-LNH I、F-LNH II、F-LNH III、F-LNnH II、F-LNnH I、F-对-LNH I、F-对-LNH II、F-对-LNnH、DF-LNH II、DF-LNH I、DF-LNnH、DF-对-LNH、DF-对-LNH II、DF-对LNH III、DF-对-LNnH、TF-LNH I、TF-LNH II、TF-对-LNHI、TF-对-LNH II、TF-对-LNnH、F-LNO I、F-LNO II、F-LNO III、F-LNnO、F-LNnO II、F-异-LNO、F-异-LNnO I、F-新生-LNnO、F-对-LNO、DF-异-LNnO、DF-LNO I、DF-LNO II、DF-LNOIII、DF-LNnO I、DF-LNnO II、DF-LNnO III、DF-异-LNO I、DF-异-LNO II、DF-异-LNO III、DF-异-LNO IV、DF-异-LNO V、DF-异-LNO VI、DF-异-LNO VII、DF-对-LNnO、TF-LNO I、TF-LNO II、TF-LNnO、TF-异-LNO I、TF-异-LNO II、TF-异-LNO III、TF-异-LNO IV、TF-异-LNnO、四-F-异-LNO、四-F-对-LNO、五-F-异-LNO、F-LND I、F-LND II、DF-LND I、DF-LND II、DF-LND III、DF-LND IV、DF-LND V、DF-LND VI、TriF-LND I、TriF-LND II、TriF-LND III、TriF-LND IV、TriF-LND V、TriF-LND VI、TriF-LND VII、TetraF-LND I、TetraF-LND II、TetraF-LND III、F-LNnD I、F-LNnD II、DF-LNnD、DF-新生-LND、DF D Gal-LNnH(Gal-a1，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-a1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-GlcNAc-b1，3]-Ga l-b1，4-Glc)、3-F-异球三糖、B-四糖、B-五糖、B-六糖、B-七糖、DF DGal-LNnT(Gal-a1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-[Fuc-a1，3]-Glc)、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnHb、DFGal-对-LNnH，及至少一种，较佳至少两种，更佳至少三种，甚至更佳至少四种，甚至更佳至少五种，甚至更佳至少六种，最佳至少七种选自包含以下者的清单的不同中性非岩藻糖基化寡糖：乳-N-三糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1，3)半乳糖基-对-乳-N-新五糖、β-(1，4)半乳糖基-对-乳-N-五糖、Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(Gal-a1，4-乳糖)、β3′-半乳糖基乳糖、β6′-半乳糖基乳糖、Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Gal-b1，3-Galb1，3-Gal-b1，4-Glc、GalNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc(GalNAc-b1，3-乳糖)、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-乳糖、GalNAc-b1，3-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc(球-N-四糖)、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-Gal-a1，4-Gal-b1，4-Glc、GalNAc-b1，3-LNT、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-LNT、新生-LNT(GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP I(Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3-Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP II(Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、Gal-新生-LNP III(Gal-b1，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，6-[Gal-b1，3]-Gal-b1，4-Glc)、新生-LNO、GalNAc-b1，3-LNnT、Gal-b1，3-GalNAc-b1，3-LNnT、LacDiNAc、poly-LacNAc、LNH、LNnH、异-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、异-LND、GalNAc-a1，3-Gal-b1，4-Glc、新生-LNP I、异-LNT、DGalLNnH、galili五糖。
所述更佳混合物的实例包含有包含以下者、由以下者组成或基本上由以下者组成的混合物：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、LN3、LNT及乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)。
所述更佳混合物的另一实例包含一种混合物，该混合物包含至少四种选自包含以下者的清单的寡糖、由其组成或基本上由其组成：3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III；Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI；Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-[Fuc-a1，4]-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH II；Fuc-a1，4-(Gal-b1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)，其中该混合物的至少四种寡糖经岩藻糖基化。
所述更佳混合物的另一实例包含一种混合物，该混合物包含至少四种选自包含以下者的清单的寡糖、由其组成或基本上由其组成：2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL或LDFT)、2′FLNB、4-FLNB、Leb(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc)、LN3、LNT、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I；Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II；Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V；Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)其中该混合物的至少四种寡糖经岩藻糖基化。
例示性混合物在本发明的此上下文中描述于实施例部分中。
为了制造如本文及在根据本发明的方法及/或细胞的一实施方式中所描述的基于乳糖的寡糖，可添加乳糖至培养中使得该细胞可经由被动或主动运输将其吸收；或可借由细胞制造乳糖(例如在如所属技术领域中具有通常知识者已知用于此目的而对细胞进行代谢工程改造后)，较佳地胞内制造。乳糖可因此在合成哺乳动物乳寡糖或人乳寡糖(较佳所有基于乳糖的MMO或HMO)中用作受体，该乳糖较佳包含于如本文所描述的根据本发明的寡糖混合物中。产生乳糖的细胞可借由表现N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶获得。更佳地，细胞经修饰以用于增强乳糖产生。该修饰可为选自包含以下者的群的任一者或多者：N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶的过度表现、UDP-葡萄糖4-表异构酶的过度表现。替代地，在糖基化反应中使用乳糖作为受体的细胞较佳具有用于自培养中吸收乳糖的运输蛋白。更佳地，将细胞最佳化以用于乳糖吸收。该最佳化可为乳糖运输蛋白的过度表现，该乳糖运输蛋白如来自例如大肠杆菌或乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)的乳糖透过酶。较佳持续型地表现乳糖透过酶。乳糖可在培养开始时添加，或其可在培养的生长阶段期间已形成足够生物质时添加，亦即，MMO产生阶段(借由将乳糖添加至培养中开始)与生长阶段分离。在一较佳实施方式中，乳糖在培养开始时及/或期间添加，亦即生长阶段及产生阶段不分离。
在根据本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，当细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。在术语「乳糖杀灭(lactose killing)」的情况下，意指其中存在乳糖以及另一碳源的培养基中的细胞生长受阻。在一较佳实施方式中，细胞经遗传修饰以使得其保持至少50％的乳糖流入而不经受乳糖杀灭，甚至在高乳糖浓度下，如WO 2016/075243中所描述。该遗传修饰包含借由不产生乳糖杀灭表型的异源启动子表现及/或过度表现外源性及/或内源性乳糖运输蛋白基因，及/或修饰不产生乳糖杀灭表型的乳糖运输蛋白的密码子使用以产生该乳糖运输蛋白的改变的表现。在此方面WO2016/075243的内容以引用的方式并入。
为产生如本文及根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代实施方式中所描述的基于LNB的寡糖，可向培养中添加LNB(亦即乳-N-二糖，Gal-b1，3-GlcNAc)以使得该细胞可被动地或经由主动运输吸收；或LNB可借由细胞产生(例如出于如所属技术领域中具有通常知识者已知的此目的对细胞进行代谢工程改造后)，较佳在胞内产生。LNB可因此在合成基于LNB的寡糖(较佳所有基于LNB的寡糖)中用作受体，该LNB较佳包含于如本文所描述的根据本发明的寡糖混合物中。产生LNB的细胞可借由表现可修饰GlcNAc(在细胞中产生及/或被动地或经由主动运输吸收)以形成LNB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶获得。较佳地，产生LNB的细胞能够表现，较佳表现用于合成GlcNAc所需的酶，诸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶，较佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶及磷酸酶(较佳地，HAD类磷酸酶)。较佳地，细胞经代谢工程改造以用于产生LNB。更佳地，细胞经代谢工程改造以用于增强产生LNB。细胞较佳经修饰以表现及/或过度表现包含以下者的多肽中的任一者或多者：葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶。
在糖基化反应中使用LNB作为受体的细胞较佳地具有用于自培养中吸收LNB的运输蛋白。更佳地，将细胞最佳化以用于LNB吸收。该最佳化可为LNB运输蛋白的过度表现，该LNB运输蛋白如来自例如大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母菌或酪蛋白乳酸杆菌BL23的乳糖透过酶。较佳持续型地表现乳糖透过酶。LNB可在培养开始时添加，或其可在培养的生长阶段期间已形成足够生物质时添加，亦即，寡糖产生阶段(借由将LNB添加至培养中开始)与生长阶段分离。在一较佳实施方式中，LNB在培养开始时及/或期间添加，亦即生长阶段及产生阶段不分离。
为产生如本文及根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代实施方式中所描述的基于LacNAc的寡糖，可向培养中添加LacNAc(亦即N-乙酰基乳糖胺，Gal-b1，4-GlcNAc)以使得该细胞可被动地或经由主动运输吸收；或LacNAc可借由细胞产生(例如出于如所属技术领域中具有通常知识者已知的此目的对细胞进行代谢工程改造后)，较佳在胞内产生。LacNac可因此在合成基于LacNAc的寡糖(较佳所有基于LacNAc的寡糖)中用作受体，该LacNAc较佳包含于如本文所描述的根据本发明的寡糖混合物中。产生LacNAc的细胞可借由表现可修饰GlcNAc(在细胞中产生及/或被动地或经由主动运输吸收)以形成LacNAc的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶获得。较佳地，产生LacNAc的细胞能够表现，较佳表现用于合成GlcNAc所需的酶，诸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶，较佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶及磷酸酶(较佳地，HAD类磷酸酶)。较佳地，细胞经代谢工程改造以用于产生LacNAc。更佳地，细胞经代谢工程改造以用于增强产生LacNAc。细胞较佳经修饰以表现及/或过度表现包含以下者的多肽中的任一者或多者：葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶。
在糖基化反应中使用LacNAc作为受体的细胞较佳具有用于自培养中吸收LacNAc的运输蛋白。更佳地，将细胞最佳化以用于LacNAc吸收。该最佳化可为LNB运输蛋白的过度表现，该LNB运输蛋白如来自例如大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母菌或酪蛋白乳酸杆菌BL23的乳糖透过酶。较佳持续型地表现乳糖透过酶。LacNAc可在培养开始时添加，或其可在培养的生长阶段期间已形成足够生物质时添加，亦即，寡糖产生阶段(借由将LacNAc添加至培养中开始)与生长阶段分离。在一较佳实施方式中，LacNAc在培养开始时及/或期间添加，亦即生长阶段及产生阶段不分离。
在根据本发明的方法及/或细胞的一实施方式中，该细胞(i)能够表现，较佳表现岩藻糖基转移酶，较佳选自α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3/1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，及(ii)能够表现，较佳表现至少一种，较佳至少两种，较佳至少三种，更佳至少四种，甚至更佳至少五种，甚至更佳至少六种，最佳至少七种额外糖基转移酶，较佳选自包含以下者的清单：如本文描述的岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶。
在一较佳实施方式中，该岩藻糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶。在另一较佳实施方式中，该半乳糖基转移酶是选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶。在另一较佳实施方式中，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶。在另一较佳实施方式中，该甘露糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶。在另一较佳实施方式中，该N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶。在另一较佳实施方式中，该N-乙酰基半乳糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，细胞在所述糖基转移酶中的至少一者，较佳至少两者，更佳所有的表现或活性方面经修饰。在一较佳实施方式中，该糖基转移酶为经修饰表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源性糖基转移酶过度表现；替代地该糖基转移酶为异质引入且表现于该细胞中，较佳过度表现的异源蛋白。该内源性糖基转移酶可在亦表现异源性糖基转移酶的细胞中具有经修饰的表现。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，所述糖基转移酶中的至少一者，较佳至少两者为岩藻糖基转移酶且该细胞能够合成GDP-Fuc。GDP-岩藻糖可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。产生GDP-岩藻糖的此类细胞可表现将例如添加至细胞中的岩藻糖转化为GDP-岩藻糖的酶。此酶可为例如双功能性岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，如来自脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)的Fkp，或一种各别岩藻糖激酶连同一种各别岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的组合，如已知其来自若干物种，包括智人、野猪(Sus scrofa)及褐鼠(Rattus norvegicus)。在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，该细胞能够表现选自以下者中的至少一种，较佳至少两种岩藻糖基转移酶：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3/1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶。较佳地，所述岩藻糖基转移酶是选自以下者的生物体：如例如螺旋杆菌属(Helicobacter)物种，如例如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、鼬鼠螺旋杆菌(Helicobacter mustelae)；阿克曼氏菌属(Akkermansia)物种，如例如嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)；类杆菌属(Bacteroides)物种，如例如脆弱类杆菌、普通类杆菌(Bacteroides vulgatus)、卵形类杆菌(Bacteroides ovatus)；大肠杆菌物种，如例如大肠杆菌O126、大肠杆菌O55：H7；毛螺菌科(Lachnospiraceae)物种；坦纳菌属(Tannerella)物种；梭菌属(Clostridium)物种；沙门氏菌属(Salmonella)物种，如例如肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、黑蒿产甲烷微菌(Methanosphaerula palustries)；丁酸弧菌属(Butyrivibrio)物种；普氏菌属(Prevotella)物种；吡咯单胞菌属(Porphyromonas)物种，如例如卡托氏吡咯单胞菌(Porphyromonas catoniae)；阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)；智人；小家鼠(Musmusculus)。在本发明的方法及/或细胞的一更佳实施方式中，所述岩藻糖基转移酶是选自包含α-1，2-岩藻糖基转移酶及α-1，3/1，4-岩藻糖基转移酶的清单。
较佳地，细胞经修饰以产生GDP-岩藻糖。更佳地，细胞经修饰以用于增强GDP-岩藻糖产生。该修饰可为选自包含以下者的群的任一者或多者：UDP-葡萄糖：十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶编码基因的基因剔除、GDP-L-岩藻糖合酶编码基因的过度表现、GDP-甘露糖4，6-脱水酶编码基因的过度表现、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶编码基因的过度表现、磷酸甘露糖变位酶编码基因的过度表现及甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因的过度表现。在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「经增强(enhanced)」及/或「经最佳化(optimized)」制造较佳意谓如本文所描述引入细胞中的修饰及/或代谢工程改造与该经修饰细胞或经代谢工程改造的细胞的野生型先驱细胞相比产生更高的产量。举例而言，「经增强的GDP-岩藻糖制造」较佳意谓与不含有此等特定修饰的野生型先驱细胞相比，经修饰细胞中的GDP-岩藻糖的胞内制造较高。
较佳地，细胞在此上下文中包含如本文所描述的岩藻糖基化路径。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，所述额外糖基转移酶中的至少一者，较佳至少两者为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶且该细胞能够合成UDP-GlcNAc。UDP-GlcNAc可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。产生UDP-GlcNAc的此类细胞可表现将例如添加至细胞中的GlcNAc转化为UDP-GlcNAc的酶。此等酶可为来自包括智人、大肠杆菌的若干物种的N-乙酰基-D-葡萄糖胺激酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、磷酸葡萄糖胺变位酶及N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶。替代地，细胞可(较佳经代谢工程改造以)表现用于合成GlcNAc所需的酶，诸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、糖基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶，较佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶及磷酸酶(较佳地，HAD类磷酸酶)。在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，该细胞能够表现选自β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶的至少一种，较佳至少两种N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶。较佳地，所述N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶是选自以下者的生物体：如例如奈瑟氏菌属(Neisseria)物种，如例如脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、乳酸奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、多糖奈瑟氏菌(Neisseriapolysaccharea)、长奈瑟氏菌(Neisseria elongata)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、微黄奈瑟氏菌(Neisseria subflava)；巴氏杆菌物种，如例如达可马巴氏杆菌；新根瘤菌属(Neorhizobium)物种，如例如山羊豆根瘤菌(Neorhizobium galegae)；嗜血杆菌属物种，如例如副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌；智人；小家鼠。
较佳地，细胞经修饰以产生UDP-GlcNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-GlcNAc产生。该修饰可为选自包含以下者的群的任一者或多者：N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶的基因剔除、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶的过度表现、磷酸葡萄糖胺变位酶的过度表现以及N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的过度表现。
较佳地，细胞在此上下文中包含如本文所描述的N-乙酰基葡萄糖胺碳水化合物路径。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，所述额外糖基转移酶中的至少一者，较佳至少两者为半乳糖基转移酶且该细胞能够合成UDP-Gal。UDP-Gal可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。产生UDP-Gal的此类细胞可表现将例如UDP-葡萄糖转化为UDP-Gal的酶。此酶可例如为如自包括智人、大肠杆菌及褐鼠的若干物种已知的UDP-葡萄糖-4-表异构酶GalE。在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，该细胞能够表现选自β-1，3-半乳糖基转移酶及β-1，4-半乳糖基转移酶的至少一种，较佳至少两种半乳糖基转移酶，及/或该细胞能够表现选自α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶的至少一种，较佳至少两种半乳糖基转移酶。较佳地，所述半乳糖基转移酶是选自以下者的生物体，如例如大肠杆菌物种，如例如大肠杆菌O55：H7、大肠杆菌DEClB、大肠杆菌DEClD；奈瑟氏菌属物种，如例如脑膜炎奈瑟氏菌、乳酸奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌、长奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、微黄奈瑟氏菌；金氏菌属物种，如例如脱氮金氏菌(Kingella denitrificans)；布氏杆菌属(Brucella)物种，如例如犬布氏杆菌(Brucella canis)、猪布氏杆菌(Brucellasuis)；沙门氏菌属物种，如例如肠沙门氏菌、氧化亚铁假高炳根氏菌(Pseudogulbenkianaferrooxidan)、麸氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；链球菌属物种；阿拉伯芥；智人；小家鼠。
较佳地，细胞经修饰以产生UDP-Gal。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-Gal产生。该修饰可为选自包含以下者的群的任一者或多者：双功能性5′-核苷酸酶/UDP-糖水解酶编码基因的基因剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶编码基因的基因剔除及UDP-葡萄糖-4-表异构酶编码基因的过度表现。
较佳地，细胞在此上下文中包含如本文所描述的半乳糖基化路径。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，所述糖基转移酶中的至少一者，较佳至少两者为N-乙酰基半乳糖氨基转移酶且该细胞能够合成UDP-GalNAc。UDP-GalNAc可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。产生UDP-GalNAc的此类细胞可表现将例如UDP-葡萄糖转化为UDP-Gal的酶。此酶可例如为如自包括智人、大肠杆菌及褐鼠的若干物种已知的UDP-葡萄糖-4-表异构酶GalE。在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，该细胞能够表现选自α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶的至少一种，较佳至少两种N-乙酰基半乳糖氨基转移酶。较佳地，所述N-乙酰基半乳糖氨基转移酶是选自以下者的生物体，如例如螺旋杆菌属物种，如例如鼬鼠螺旋杆菌；嗜血杆菌属物种，如例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；奈瑟氏菌属物种，如例如脑膜炎奈瑟氏菌、乳糖奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌、长奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、微黄奈瑟氏菌；立克次体属(Rickettsia)物种，如例如贝氏立克次体(Rickettsia bellii)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、日本立克次体(Rickettsia japonica)、康氏立克次体(Rickettsia conorii)、猫立克次体(Rickettsia felis)、马赛立克次体(Rickettsiamassiliae)；智人；小家鼠。
较佳地，细胞经修饰以产生UDP-GalNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-GalNAc产生。该修饰可为选自包含以下者的群的任一者或多者：双功能性5′-核苷酸酶/UDP-糖水解酶编码基因的基因剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶编码基因的基因剔除及UDP-葡萄糖-4-表异构酶编码基因的过度表现。
较佳地，细胞在此上下文中包含如本文所描述的N-乙酰基半乳糖氨基化路径。
在整个本申请案中，每当例如借由提及SEQ ID NO亦即独特资料库编号(例如UNIPROT编号)或借由提及来源的特定生物体揭示蛋白质时，该蛋白质实施方式可较佳经以下实施方式中的任一者，较佳全部置换(且因此认为该蛋白质根据所有以下实施方式揭示)：
-蛋白质(例如借由提及SEQ ID NO亦即独特资料库编号(例如UNIPROT编号)或借由提及来源的特定生物体)，
-与该蛋白质的全长具有至少80％整体序列一致性的该蛋白质的功能同源物、变异体或衍生物，
-该蛋白质的功能片段且具有相同活性，或
-包含多肽，该多肽包含与该蛋白质的全长氨基酸序列具有至少80％序列一致性且具有相同活性的氨基酸序列或由其组成。
举例而言，当揭示「具有SEQ ID NO：05的幽门螺旋杆菌(H.pylori)α-1，3-岩藻糖基转移酶(H.pylori alpha-1，3-fucosyltransferase with SEQ ID NO：05)」时，该实施方式较佳经以下实施方式中的任一者，较佳全部置换：
-具有SEQ ID NO：05的幽门螺旋杆菌α-1，3-岩藻糖基转移酶，
-包含根据SEQ ID NO：05的多肽序列的α-1，3-岩藻糖基转移酶，
-与SEQ ID NO：05的全长具有至少80％整体序列一致性且具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的SEQ ID NO：05的功能同源物、变异体或衍生物，
-SEQ ID NO：05的功能片段且具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性，或
-包含多肽，该多肽包含与该SEQ ID NO：05的全长氨基酸序列具有至少80％序列一致性且具有α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，细胞能够合成选自包含以下者的清单的所述核苷酸-糖中的任一者：GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。在一较佳实施方式中，细胞能够合成两种核苷酸-糖。在一更佳实施方式中，细胞能够合成至少三种核苷酸活化糖。在一甚至更佳实施方式中，细胞能够合成至少四种核苷酸活化糖。在一最佳实施方式中，细胞能够合成至少五种核苷酸活化糖。在另一较佳实施方式中，该细胞经代谢工程改造以用于产生核苷酸-糖。在另一较佳实施方式中，细胞经修饰及/或经工程改造以用于核苷酸-糖的最佳化产生，亦即如本文所描述的核苷酸-糖的增强产生。在一更佳实施方式中，该细胞经代谢工程改造以用于产生两种核苷酸-糖。在一甚至更佳实施方式中，该细胞经代谢工程改造以用于产生三个或更多种核苷酸活化糖。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，细胞表现一或多种多肽，该一或多种多肽选自包含以下者的清单：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶。
在根据本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，根据本发明的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物可借由提供一种用于制造基于乳糖的中性岩藻糖基化寡糖的细胞来产生，该细胞1)能够如本文所描述自培养吸收乳糖或能够在借由如本文所描述的b-1，4-半乳糖基转移酶的作用吸收葡萄糖之后产生乳糖；及2)能够表现至少一种，较佳至少两种选自包含以下者的清单的如本文所描述的岩藻糖基转移酶：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶；3)视情况能够表现如本文所描述的N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，较佳半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶；4)视情况能够表现至少一种，较佳至少两种选自包含以下者的清单的如本文所描述的半乳糖基转移酶：N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶、α-1，4-半乳糖基转移酶；5)视情况能够表现选自包含以下者的清单的至少一种，较佳至少两种如本文所描述的N-乙酰基半乳糖氨基转移酶：α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶；6)能够合成GDP-岩藻糖，较佳该细胞具有如本文所定义的岩藻糖基化路径，及7)能够合成该糖基转移酶(若存在)中的每一者的核苷酸-糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳实施方式中，根据本发明的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物可借由提供一种用于制造基于乳糖的中性非岩藻糖基化寡糖的细胞来产生，该细胞1)能够自如本文所描述的培养中吸收乳糖或能够在借由如本文所描述的b-1，4-半乳糖基转移酶的作用吸收葡萄糖之后产生乳糖；及2)能够表现如本文所描述的N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，较佳半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶；3)视情况能够表现至少一种，较佳至少两种如本文所描述的半乳糖基转移酶，所述半乳糖基转移酶选自包含以下者的清单：N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶、α-1，4-半乳糖基转移酶；及4)视情况能够表现至少一种，较佳至少两种如本文所描述的N-乙酰基半乳糖氨基转移酶，所述N-乙酰基半乳糖氨基转移酶选自包含α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶的清单及5)能够合成所述糖基转移酶(若存在)中的每一者的核苷酸-糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳实施方式中，根据本发明的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物可借由提供一种用于制造基于LNB的中性岩藻糖基化寡糖的细胞来产生，该细胞1)能够自如本文所描述的培养中吸收LNB或能够产生如本文所描述的LNB；及2)能够表现至少一种，较佳至少两种如本文所描述的岩藻糖基转移酶，所述岩藻糖基转移酶选自包含α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶的清单；3)能够合成GDP-岩藻糖，较佳该细胞具有如本文所定义的岩藻糖基化路径，及4)视情况能够产生UDP-半乳糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳实施方式中，根据本发明的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物可借由提供一种用于制造基于LNB的中性非岩藻糖基化寡糖的细胞来产生，该细胞能够如本文所描述产生LNB或能够如本文所描述自培养吸收LNB；且能够合成UDP-Gal。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳实施方式中，根据本发明的至少三种不同寡糖的混合物可借由提供一种用于产生基于LacNAc的中性岩藻糖基化寡糖的细胞来产生，该细胞1)能够自如本文所描述的培养中吸收LacNAc或能够产生如本文所描述的LacNAc；及2)能够表现至少一种，较佳至少两种如本文所描述的岩藻糖基转移酶，所述岩藻糖基转移酶选自包含α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶的清单；3)能够合成GDP-岩藻糖，较佳该细胞具有如本文所定义的岩藻糖基化路径，及4)视情况能够产生UDP-半乳糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳实施方式中，根据本发明的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物可借由提供一种用于制造基于LacNAc的中性非岩藻糖基化寡糖的细胞来产生，该细胞能够如本文所描述产生LacNAc或能够如本文所描述自培养吸收LacNAc；且能够合成UDP-Gal。
在根据本发明的方法及/或细胞的一更佳实施方式中，包含中性岩藻糖基化基于乳糖的寡糖(如例如岩藻基乳糖及岩藻糖基化LNT及/或LNnT结构，如例如LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V)的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物可借由提供一种细胞来产生，该细胞：1)能够如本文所描述自培养吸收乳糖或能够在借由如本文所描述的b-1，4-半乳糖基转移酶的作用吸收葡萄糖之后产生乳糖；及2)能够表现至少一种，较佳至少两种选自包含以下者的清单的如本文所描述的岩藻糖基转移酶：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶；3)能够合成GDP-岩藻糖，较佳地，该细胞具有如本文所定义的岩藻糖基化路径；4)能够表现如本文所描述的N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，较佳半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶；5)能够表现至少一种，较佳至少两种选自包含以下者的清单的如本文所描述的半乳糖基转移酶：N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶、α-1，4-半乳糖基转移酶；6)能够合成UDP-GlcNAc，较佳该细胞具有如本文所定义的N-乙酰基葡萄糖氨基化路径；7)能够合成UDP-Gal，较佳该细胞具有如本文所定义的半乳糖基化路径。
根据本发明的例示性方法及细胞描述于实施例部分中。强调此等实施例显示产生特定混合物的至少一种方式。所属技术领域中具有通常知识者应了解，若所表现酶中的任一者具有相同催化活性，较佳在类似程度上，该活性可经由常规实验容易地评定，则所述所表现酶中的任一者可经另一种酶置换，其中酶的活性与如本文所揭示的参考酶(例如基质的试管内转化)的活性相比。
较佳地，除四种中性岩藻糖基化寡糖以外，寡糖混合物亦包含至少一种如本文所定义的中性非岩藻糖基化寡糖。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，所述中性寡糖中的任一者，更佳所述寡糖中的全部，借由被动运输亦即无需借助于主动运输系统消耗来自该细胞的能量而移位至细胞外。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，细胞使用至少一种前驱物用于制造所述寡糖中的任一者或多者。如本文所揭示的定义中所解释，应了解术语「前驱物(precursor)」。在一更佳实施方式中，细胞使用两种或更多种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物。
在本发明方法的一较佳实施方式中，向培养中馈入前驱物及/或受体以用于合成该混合物中的所述寡糖中的任一者。如本文所揭示的定义中所解释，应了解术语「受体(acceptor)」。在该方法的另一较佳实施方式中，向培养中馈入至少两种前驱物及/或受体以用于合成混合物中的所述寡糖中的任一者或多者，较佳全部。若使用同一分类的两个或更多个糖基转移酶(例如2-岩藻糖基转移酶)，其具有不同亲和力(例如一个对乳糖具有亲和力的岩藻糖基转移酶及另一个对乳果糖具有亲和力的岩藻糖基转移酶)用于产生根据本发明的寡糖的混合物，则此可为适用的。
在如本文所描述的方法及/或细胞的另一实施方式中，细胞产生用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物。在一较佳实施方式中，该细胞产生一或多种用于合成该寡糖混合物的前驱物。在一更佳实施方式中，该细胞经修饰以用于所述前驱物中的任一者的最佳化产生，以用于合成所述寡糖中的任一者。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物完全转化为所述寡糖中的任一者。在一更佳实施方式中，细胞将所述前驱物中的任一者完全转化为所述寡糖中的任一者。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式中，细胞经进一步代谢工程改造以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与该细胞外的所述中性寡糖中的任一者的分泌。该细胞可表现参与所述中性寡糖中的任一者自该细胞至该细胞外的分泌的所述膜蛋白中的一者。该细胞亦可表现所述膜蛋白中的超过一者。所述膜蛋白中的任一者可使所述中性寡糖中的一或多者移位至该细胞外。该细胞可使所述中性寡糖中的任一者移位，所述寡糖包含被动扩散体(passive diffusion)、通道膜蛋白、膜运输蛋白、膜载体蛋白。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式中，细胞经进一步代谢工程改造以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成所述中性寡糖中的任一者的前驱物及/或受体。在一实施方式中，细胞可表现参与用于合成所述中性寡糖中的任一者的任何类型前驱物及/或受体的吸收的所述膜蛋白中的一者。在另一及/或额外实施方式中，细胞亦可表现所述膜蛋白的超过一者，所述膜蛋白参与吸收所述前驱物及/或受体中的至少一者。在另一及/或额外实施方式中，细胞可经修饰以用于吸收超过一种用于合成所述中性寡糖中的任一者的前驱物及/或受体。在一较佳实施方式中，细胞经修饰以用于吸收所有所需前驱物。在另一较佳实施方式中，细胞经修饰以用于吸收所有受体。
在本发明的方法及/或细胞的一更佳实施方式中，膜蛋白是选自包含以下者的清单：搬运蛋白、P-P-键水解驱动的运输蛋白、β-桶状孔蛋白、辅助运输蛋白、推定运输蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白。在本发明的方法及/或细胞的甚至更佳实施方式中，搬运蛋白包含MFS运输蛋白、糖流出运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳实施方式中，P-P-键水解驱动的运输蛋白包含ABC运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式中，膜蛋白提供所述寡糖中的任一者，较佳所述寡糖中的全部的经改善制造。在本发明的方法及/或细胞的替代及/或额外较佳实施方式中，膜蛋白使所述寡糖中的任一者，较佳所述寡糖中的全部能够流出。在本发明的方法及/或细胞的替代及/或额外较佳实施方式中，膜蛋白提供所述寡糖中的任一者，较佳所述寡糖中的全部的经增强流出。
在本发明的方法及/或细胞的一更佳实施方式中，细胞表现属于MFS运输蛋白家族的膜蛋白，所述运输蛋白如例如来自包含大肠杆菌(UniProt ID P0AEY8)、莫金斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)(UniProt ID D4BC23)及雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)(UniProtID G9Z5F4)的物种的多药运输蛋白MdfA家族的MdfA多肽。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳实施方式中，细胞表现属于糖流出运输蛋白家族的膜蛋白，所述运输蛋白如例如来自包含大肠杆菌(UniProt ID P31675)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)(UniProtID A0A078LMl6)及肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)(UniProt IDA0A0C4MGS7)的物种的SetA家族的SetA多肽。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳实施方式中，细胞表现属于螯铁蛋白输出蛋白家族的膜蛋白，所述输出蛋白如例如大肠杆菌entS(UniProt ID P24077)及大肠杆菌iceT(UniProt ID A0A024L207)。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳实施方式中，细胞表现属于ABC运输蛋白家族的膜蛋白，所述运输蛋白如例如来自大肠杆菌的oppF(UniProt ID P77737)、来自乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰基乳酸变种(Lactococcus lactis subsp.lactis by.diacetylactis)的lmrA(UniProt IDA0A1V0NEL4)及来自长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的Bion_2475(UniProt ID B7GPD4)。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，细胞赋予增强的噬菌体抗性。噬菌体抗性的该增强可源自内源膜蛋白的降低的表现及/或内源膜蛋白编码基因的突变。术语「噬菌体不敏感性(phage insensitive)」或「抗噬菌体(phage resistant)」或「噬菌体抗性(phage resistance)」或「抗噬菌体概况(phage resistant profile)」应理解为意指对借由噬菌体及/或生长抑制的感染及/或杀灭较不敏感且较佳不敏感的细菌菌株。如本文所用，术语「抗噬菌体活性(anti-phage activity)」或「对借由至少一种噬菌体的感染具抗性(resistant to infection bv at least one phage)」是指表现功能性噬菌体抗性系统的细菌细胞相比于不表现功能性噬菌体抗性系统的相同发育阶段(例如培养状态)下的相同物种的细菌细胞对借由至少一种噬菌体家族的感染的抗性增加，如可借由例如细菌活力、噬菌体溶原性、噬菌体基因体复制及噬菌体基因体降解所确定。噬菌体可为裂解噬菌体或温和(溶原性)噬菌体。涉及细胞的噬菌体抗性的膜蛋白包含OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、BtuB、TolC、LamB、FhuA、TonB、FadL、Tsx、FepA、YncD、PhoE及NfrA及其同源物。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，细胞赋予降低的黏度。细胞黏度降低可借由经修饰的细胞壁生物合成获得。细胞壁生物合成可经修饰，包含例如聚-N-乙酰基-葡萄糖胺、肠内菌共同抗原、纤维素、可拉酸(colanic acid)、核寡糖、渗透调节周质葡聚糖及甘油葡萄糖苷、聚糖及茧蜜糖的合成减少或消除。
根据本发明的方法及/或细胞的另一实施方式，细胞能够制造磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)。在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，与未经修饰的先驱细胞相比，细胞经修饰以用于PEP的经增强产生及/或供应。
在一较佳实施方式中且作为用于PEP的经增强产生及/或供应的手段，一或多种PEP依赖型、糖运输磷酸转移酶系统被破坏，诸如(但不限于)：1)N-乙酰基-D-葡萄糖胺Npi-磷酸转移酶(EC 2.7.1.193)，其举例而言由大肠杆菌或芽孢杆菌物种中的nagE基因(或簇nagABCD)编码，2)ManXYZ，其编码输入外源性己糖(甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺、果糖、2-去氧葡萄糖、甘露糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺等)及释放磷酸至细胞细胞质中的酶ll Man复合物(甘露糖PTS透过酶、蛋白质-Npi-磷酸组氨酸-D-甘露糖磷酸转移酶)，3)葡萄糖特异性PTS运输蛋白(举例而言由PtsG/Crr编码)，其在细胞质中吸收葡萄糖且形成葡萄糖-6-磷酸盐，4)蔗糖特异性PTS运输蛋白，其在细胞质中吸收蔗糖且形成蔗糖-6-磷酸盐，5)果糖特异性PTS运输蛋白(举例而言由基因fruA及fruB编码及激酶fruK编码，该激酶fruK在第一步骤中吸收果糖且形成果糖-1-磷酸盐且在第二步骤中形成果糖1，6二磷酸盐，6)乳糖PTS运输蛋白(举例而言由干酪乳球菌(Lactococcus casei)中的lacE编码)，其吸收乳糖且形成乳糖-6-磷酸盐，7)半乳糖醇特异性PTS酶，其吸收半乳糖醇及/或山梨醇且分别形成半乳糖醇-1-磷酸盐或山梨醇-6-磷酸盐，8)甘露糖醇特异性PTS酶，其吸收甘露糖醇及/或山梨醇且分别形成甘露糖醇-1-磷酸盐或山梨醇-6-磷酸盐，及9)茧蜜糖特异性PTS酶，其吸收茧蜜糖且形成茧蜜糖-6-磷酸盐。
在另一及/或额外较佳实施方式中且作为用于PEP的经增强产生及/或供应的手段，完整PTS系统借由破坏PtsIH/Crr基因簇而破坏。PtsI(酶I)为充当大肠杆菌K-12的磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统(PTS糖)的闸道的细胞质蛋白。PtsI为PTS糖的两个(PtsI及PtsH)糖非特异性蛋白成分中的一者，其与糖特异性内膜透过酶一起影响引起多种碳水化合物基质的耦合磷酸化及运输的磷酸转移级联。HPr(含有组氨酸的蛋白质)为PTS糖的两种糖非特异性蛋白质成分中的一者。其接受来自磷酸化酶I(PtsI-P)的磷氧基且接着将其转移至PTS糖的许多糖特异性酶(统称为酶II)中的任一者的EIIA域。在需要PtsH及PtsI的反应中，Crr或EIIAGlc由PEP磷酸化。
在另一及/或额外较佳实施方式中，细胞经进一步修饰以借由对应的透过酶的引入及/或过度表现来补偿碳源的PTS系统的缺失。此等为例如透过酶或ABC运输蛋白，其包含但不限于特异性地输入乳糖的运输蛋白，诸如由来自大肠杆菌的LacY基因编码的运输蛋白；输入蔗糖的运输蛋白，诸如由来自大肠杆菌的cscB基因编码的运输蛋白；输入葡萄糖的运输蛋白，诸如由来自大肠杆菌的galP基因编码的运输蛋白；输入果糖的运输蛋白，诸如由来自变形链球菌(Streptococcus mutans)的fruI基因编码的运输蛋白；或为山梨醇/甘露糖醇ABC运输蛋白，诸如由类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的簇SmoEFGK编码的运输蛋白；茧蜜糖/蔗糖/麦芽糖运输蛋白，诸如由苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的基因簇ThuEFGK编码的运输蛋白；及N-乙酰基葡萄糖胺/半乳糖/葡萄糖运输蛋白，诸如由奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)的NagP编码的运输蛋白。PTS缺失与替代运输蛋白的过度表现的组合的实例为：1)葡萄糖PTS系统(例如ptsG基因)的缺失与葡萄糖透过酶(例如glcP的galP)的引入及/或过度表现组合，2)果糖PTS系统(例如fruB、fruA、fruK基因中的一或多者)的缺失与果糖透过酶(例如fruI)的引入及/或过度表现组合，3)乳糖PTS系统的缺失与乳糖透过酶(例如LacY)的引入及/或过度表现组合，及/或4)蔗糖PTS系统的缺失与蔗糖透过酶(例如cscB)的引入及/或过度表现组合。
在另一较佳实施方式中，细胞经修饰以借由引入碳水化合物激酶，诸如葡萄糖激酶(EC 2.7.1.1、EC 2.7.1.2、EC 2.7.1.63)、半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)及/或果糖激酶(EC2.7.1.3、EC 2.7.1.4)来补偿碳源的PTS系统缺失。PTS缺失与替代运输蛋白及激酶的过度表现的组合的实例为：1)葡萄糖PTS系统(例如ptsG基因)的缺失，与葡萄糖透过酶(例如glcP的galP)的引入及/或过度表现组合，与葡萄糖激酶(例如glk)的引入及/或过度表现组合，及/或2)果糖PTS系统(例如fruB、fruA、fruK基因中的一或多者)的缺失，与果糖透过酶(例如fruI)的引入及/或过度表现组合，与果糖激酶(例如frk或mak)的引入及/或过度表现组合。
在另一及/或额外较佳实施方式中且作为用于PEP的经增强产生及/或供应的手段，细胞借由引入包含以下者的清单中的任一者或多者或在包含以下者的清单中的任一者或多者方面进行修饰来修饰：磷酸烯醇丙酮酸合酶活性(EC：2.7.9.2，举例而言在大肠杆菌中借由ppsA编码)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性(EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49，举例而言分别在麸氨酸棒状杆菌中借由PCK编码或在大肠杆菌中借由pckA编码)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性(EC 4.1.1.31，举例而言在大肠杆菌中借由ppc编码)；草酰乙酸脱羧酶活性(EC4.1.1.112，举例而言在大肠杆菌中借由eda编码)；丙酮酸激酶活性(EC 2.7.1.40，举例而言在大肠杆菌中借由pykA及pykF编码)；丙酮酸羧化酶活性(EC 6.4.1.1，举例而言在枯草芽孢杆菌中借由pyc编码)；及苹果酸脱氢酶活性(EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.40，举例而言在大肠杆菌中分别借由maeA或maeB编码)。
在一更佳实施方式中，细胞经修饰以过度表现所述多肽中的任一者或多者，所述多肽包含来自大肠杆菌的ppsA(UniProt ID P23538)、来自麸氨酸棒状杆菌的PCK(UniProtID Q6F5A5)、来自大肠杆菌的pcka(UniProt ID P22259)、来自大肠杆菌的eda(UniProt IDP0A955)、来自大肠杆菌的maeA(UniProt ID P26616)及来自大肠杆菌的maeB(UniProt IDP76558)。
在另一及/或额外较佳实施方式中，细胞经修饰以表现具有磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、草酰乙酸脱羧酶活性或苹果酸脱氢酶活性的任一或多种多肽。
在另一及/或额外较佳实施方式中且作为用于PEP的经增强产生及/或供应的手段，细胞借由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶活性的降低活性，较佳缺失编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶的基因加以修饰。
在一例示性实施方式中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、苹果酸脱氢酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、苹果酸脱氢酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合及/或苹果酸脱氢酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性实施方式中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合，磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合及/或磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合。
在另一例示性实施方式中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合。
在另一例示性实施方式中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性实施方式中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性实施方式中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性实施方式中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式，与未经修饰的先驱细胞相比，细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。该修饰可为选自包含以下者的群的任一者或多者：乙酰基-辅酶A合成酶的过度表现、完全或部分基因剔除或显现较少功能性丙酮酸脱氢酶及完全或部分基因剔除或显现较少功能性乳酸脱氢酶。
在本发明的方法及/或细胞的另一实施方式中，细胞在至少一种乙酰基-辅酶A合成酶的表现或活性方面经修饰，所述合成酶如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人、小家鼠的acs。在一较佳实施方式中，该乙酰基-辅酶A合成酶为具有修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源性乙酰基-辅酶A合成酶经过度表现；替代地，该乙酰基-辅酶A合成酶是异质引入且表现于该细胞中，较佳过度表现的异源蛋白。该内源性乙酰基-辅酶A合成酶可在亦表现异源性乙酰基-辅酶A合成酶的细胞中具有经修饰的表现。在一更佳实施方式中，细胞在来自大肠杆菌的乙酰基-辅酶A合成酶acs(UniProt ID P27550)的表现或活性方面经修饰。在另一及/或额外较佳实施方式中，细胞在来自大肠杆菌的acs(UniProt IDP27550)的功能同源物、变异体或衍生物的表现或活性方面经修饰，该功能同源物、变异体或衍生物与来自大肠杆菌的该多肽(UniProt ID P27550)的全长具有至少80％整体序列一致性且具有乙酰基-辅酶A合成酶活性。
在本发明的方法及/或细胞的替代性及/或额外其他实施方式中，细胞在至少一种如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人及褐鼠的丙酮酸脱氢酶的表现或活性方面经修饰。在一较佳实施方式中，细胞已经修饰以借由所属领域中具有通常知识者通常已知的方式具有至少一种部分或完全基因剔除或突变的丙酮酸脱氢酶编码基因，从而产生至少一种功能较小或丙酮酸脱氢酶活性失能的蛋白质。在一更佳实施方式中，细胞在poxB编码基因方面具有完全基因剔除，从而导致细胞缺乏丙酮酸脱氢酶活性。
在本发明的方法及/或细胞的替代性及/或额外其他实施方式中，细胞在至少一种如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人及褐鼠的乳酸脱氢酶的表现或活性方面经修饰。在一较佳实施方式中，细胞已经修饰以借由所属领域中具有通常知识者通常已知的方式具有至少一种部分或完全基因剔除或突变的乳酸脱氢酶编码基因，从而产生至少一种功能较小或乳酸脱氢酶活性失能的蛋白质。在一更佳实施方式中，细胞在ldhA编码基因方面具有完全基因剔除，从而导致细胞缺乏乳酸脱氢酶活性。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式，与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下者的蛋白质中的任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶(fuculokinase)、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷氧基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳实施方式，细胞包含用于所选单糖、双糖或寡糖的分解代谢路径，该分解代谢路径至少部分不活化，所述单糖、双糖或寡糖参与来自该混合物的所述寡糖中的任一者的制造及/或为该制造所需的。
本发明的另一实施方式提供一种方法及一种细胞，其中包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物是在如本文所描述的真菌、酵母菌、细菌、昆虫、动物、植物及原虫细胞中及/或借由其产生。细胞是选自包含细菌、酵母菌、原虫或真菌的清单，或是指植物或动物细胞。后一细菌较佳属于变形菌(Proteobacteria)门或厚壁菌(Firmicutes)门或蓝菌(Cyanobacteria)门或异常球菌-栖热菌(Deinococcus-Thermus)门。属于变形菌门的后一细菌较佳属于肠细菌科，较佳属于大肠杆菌种。后一细菌较佳是关于属于大肠杆菌种的任何菌株，诸如(但不限于)大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌W、大肠杆菌K12、大肠杆菌尼塞尔(Nissle)。更特定言之，后一术语是关于指定为大肠杆菌K12菌株的经培养大肠杆菌菌株-其良好适应于实验室环境，且不同于野生型菌株，所述经培养大肠杆菌菌株已丧失其在肠中生长的能力。大肠杆菌K12菌株的熟知实例为K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111及AA200。因此，本发明特定地是关于如上文所指示的经突变及/或经转型的大肠杆菌细胞或菌株，其中该大肠杆菌菌株为K12菌株。大肠杆菌K12菌株更佳为大肠杆菌MG1655。属于厚壁菌门的后一细菌较佳属于杆菌纲(Bacilli)，较佳具有诸如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的成员的乳杆菌目(Lactobacilliales)，或具有诸如来自芽孢杆菌(Bacillus)属的成员，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的芽孢杆菌目(Bacillales)。属于放线菌(Actinobacteria)门的后一细菌较佳属于具有成员麸氨酸棒状杆菌或非发酵棒状杆菌(C.afermentans)的棒状杆菌(Corynebacteriaceae)科，或属于具有成员灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或费氏链霉菌(S.fradiae)的链霉菌(Streptomycetaceae)科。后一酵母菌较佳属于子囊菌(Ascomycota)门或担子菌(Basidiomycota)门或半知菌(Deuteromycota)门或接合菌(Zygomycetes)门。后一酵母菌较佳属于酵母菌(Saccharomyces)属(具有如例如酿酒酵母、贝酵母(S.bayanus)、布拉酵母(S.boulardii)的成员)、毕赤酵母(Pichia)属(具有如例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、异常毕赤酵母(P.anomala)、克鲁维毕赤酵母(P.kluyveri)的成员)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(具有如例如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)、乳酒念珠菌(K.marxianus)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)的成员)、德巴利酵母属(Debaromyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)(如例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))或斯塔莫酵母属(Starmerella)(如例如熊蜂生斯塔莫酵母(Starmerella bombicola))。后一酵母菌较佳选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolitica)、酿酒酵母及乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。后一真菌较佳属于根霉菌属(Rhizopus)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)。
植物细胞包括开花及非开花植物的细胞，以及藻类细胞，例如单胞藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorella)等。较佳地，该植物为烟草、苜蓿、稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物。后一动物细胞较佳衍生自非人类哺乳动物(例如牛、水牛、猪、绵羊、小鼠、大鼠)、鸟类(例如鸡、鸭、鸵鸟、火鸡、野鸡)、鱼类(例如剑鱼、鲑鱼、鲔鱼、海鲈、鳟鱼、鲶鱼)、无脊椎动物(例如龙虾、蟹、虾、蚌蛤、牡蛎、贻贝、海胆)、爬行动物(例如蛇、鳄鱼、龟)、两栖动物(例如蛙)或昆虫(例如蝇、线虫)或为衍生自排除胚胎干细胞的人类细胞的经遗传修饰的细胞系。人类及非人类哺乳动物细胞两者较佳选自包含以下者的清单：上皮细胞如例如乳腺上皮细胞、胚胎肾细胞(例如HEK293或HEK 293T细胞)、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞如例如N20、SP2/0或YB2/0细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，诸如WO21067641中所描述。后一昆虫细胞较佳衍生自：斜纹夜盗虫(Spodopterafrugiperda)如例如Sf9或Sf21细胞、家蚕(Bombyx mori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)如例如BTI-TN-5B1-4细胞或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)如例如果蝇属S2细胞。后一原虫细胞较佳为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳实施方式中，与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞为存活的革兰氏阴性细菌，该细菌包含减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG)、肠内菌共同抗原(Enterobacterial CommonAntigen；ECA)、纤维素、可拉酸、核寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OsmoregulatedPeriplasmic Glucan；OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或茧蜜糖。
在方法及/或细胞的一更佳实施方式中，该减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸、核寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或茧蜜糖是借由参与该聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸、核寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或茧蜜糖中的任一者的合成中的任一或多种糖基转移酶的突变提供，其中该突变提供所述糖基转移酶中的任一者的缺失或更低表现。所述糖基转移酶包含编码聚-N-乙酰基-D-葡萄糖胺合酶次单元的糖基转移酶基因、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺-十一异戊烯基-磷酸N-乙酰基葡萄糖胺磷酸转移酶、Fuc4NAc(4-乙酰氨基-4，6-二去氧-D-半乳糖)转移酶、UDP-N-乙酰基-D-甘露糖醛酸转移酶、编码纤维素合酶催化次单元的糖基转移酶基因、纤维素生物合成蛋白、可拉酸生物合成葡萄糖醛酸基转移酶、可拉酸生物合成半乳糖基转移酶、可拉酸生物合成岩藻糖基转移酶、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、推定可拉生物合成糖基转移酶、UDP-葡萄糖醛酸：LPS(HepIII)糖基转移酶、ADP-庚糖-LPS庚糖基转移酶2、ADP-庚糖：LPS庚糖基转移酶1、推定ADP-庚糖：LPS庚糖基转移酶4、脂多糖核心生物合成蛋白、UDP-葡萄糖：(葡萄糖基)LPSα-1，2-葡萄糖基转移酶、UDP-D-葡萄糖：(葡萄糖基)LPSα-1，3-葡萄糖基转移酶、UDP-D-半乳糖：(葡萄糖基)脂多糖-1，6-D-半乳糖基转移酶、脂多糖葡萄糖基转移酶I、脂多糖核心庚糖基转移酶3，β-1，6-半乳糖呋喃酮基转移酶、十一异戊烯基-磷酸4-去氧-4-甲酰氨基-L-阿拉伯糖转移酶、脂质IVA 4-氨基-4-去氧-L-阿拉伯糖基转移酶、细菌萜醇葡萄糖基转移酶、推定家族2糖基转移酶、渗透调节周质葡聚糖(OPG)生物合成蛋白G、OPG生物合成蛋白质H、葡萄糖基甘油酸酯磷酸化酶、肝糖合酶、1，4-α-葡聚糖分支酶、4-α-葡聚糖转移酶及茧蜜糖-6-磷酸合酶。在一例示性实施方式中，该细胞在所述糖基转移酶中的任一者或多者方面经突变，所述糖基转移酶包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaz、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP，其中该突变提供所述糖基转移酶中的任一者的缺失或更低表现。
在方法及/或细胞的替代及/或额外较佳实施方式中，聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)的该减少或消除合成借由碳储存调节子编码基因的过度表现、Na+/H+反向搬运蛋白调节子编码基因的缺失及/或感测器组氨酸激酶编码基因的缺失提供。
如本文所用的微生物或细胞能够在单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油；包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨、酵母萃取物的复合培养基或其混合物(如例如混合原料，较佳混合单糖原料，如例如水解蔗糖)作为主要碳源上生长。术语「复合培养基(complexmedium)」意指其中精确构成并未确定的培养基。术语主要意指相关生物产物、生物质形成、二氧化碳及/或副产物形成(诸如酸及/或醇，诸如乙酸盐、乳酸盐及/或乙醇)的最重要碳源，亦即所有所需碳的20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％均衍生自以上所指示碳源。在本发明的一个实施方式中，该碳源为该生物体的唯一碳源，亦即所有所需碳的100％衍生自以上所指示碳源。常见主要碳源包含(但不限于)葡萄糖、甘油、果糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽-寡糖、麦芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、茧蜜糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖浆、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐及丙酮酸盐。术语复合培养基意指其中精确构成并未确定的培养基。实例为糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物。
在另一较佳实施方式中，本文所描述的微生物或细胞使用具有如WO2012/007481中所描述的制造路径及生物质路径的分裂代谢，该文献以引用的方式并入本文中。该生物体可例如经遗传修饰以借由改变选自磷酸葡萄糖异构酶基因、磷酸果糖激酶基因、果糖-6-磷酸醛缩酶基因、果糖异构酶基因及/或果糖：PEP磷酸转移酶基因的基因来积聚果糖-6-磷酸盐。
根据本发明的方法的另一实施方式，容许产生混合物中的所述寡糖的条件包含使用培养基来培养本发明的细胞以产生该寡糖混合物，其中该培养基缺乏用于制造所述寡糖中的任一者的任何前驱物及/或受体，且与将至少一种前驱物及/或受体进料进一步添加至该培养基进行组合以用于制造所述寡糖中的任一者，较佳地用于制造该混合物中的所述寡糖中的全部。
在一较佳实施方式中，用于产生如本文所描述的寡糖混合物的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含至少一种前驱物及/或受体的培养基；
ii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍：
iii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍，且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L，较佳至少75g/L，更佳至少90g/L，更佳至少100g/L，更佳至少125g/L，更佳至少150g/L，更佳至少175g/L，更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
在另一及/或额外较佳实施方式中，用于产生如本文所描述的寡糖混合物的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)以一个脉冲或以不连续(经脉冲)方式向培养基添加至少一种前驱物及/或受体，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料脉冲之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍；
iii)以一个脉冲或以不连续(经脉冲)方式在反应器中向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料脉冲之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于2倍，且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料脉冲的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料脉冲的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、10小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以不连续(经脉冲)方式将至少一种前驱物及/或受体进料添加至培养基中；
v)历经5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、10小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以不连续(经脉冲)方式向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L，较佳至少75g/L，更佳至少90g/L，更佳至少100g/L，更佳至少125g/L，更佳至少150g/L，更佳至少175g/L，更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
在另一更佳实施方式中，用于产生如本文所描述的寡糖混合物的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)向该培养基添加包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的乳糖进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于2倍；
iii)向该培养基添加包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于2倍，且其中较佳地，该乳糖进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该乳糖进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L，较佳75g/L，更佳100g/L，更佳125g/L，更佳150g/L，更佳175g/L，更佳200g/L，更佳225g/L，更佳250g/L，更佳275g/L，更佳300g/L，更佳325g/L，更佳350g/L，更佳375g/L，更佳400g/L，更佳450g/L，更佳500g/L，甚至更佳550g/L，最佳600g/L；且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L，较佳至少75g/L，更佳至少90g/L，更佳至少100g/L，更佳至少125g/L，更佳至少150g/L，更佳至少175g/L，更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
较佳地，该乳糖进料是借由自该培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以＞300mM的浓度添加乳糖来实现。
在另一实施方式中，乳糖进料是借由以一浓度向培养基添加乳糖来实现，该浓度使得在该培养的整个制造阶段中获得至少5mM，较佳10mM或30mM的乳糖浓度。
在本文所描述的方法的另一实施方式中，培养宿主细胞至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
在一较佳实施方式中，在培养基中提供碳源，较佳蔗糖，持续3天或更多天，较佳至多7天；及/或在培养基中以连续方式提供每公升初始培养物体积至少100、有利至少105、更有利至少110、甚至更有利至少120公克蔗糖，使得培养基的最终体积不超过培养之前的培养基的体积的三倍、有利不超过两倍、更有利小于两倍。
较佳地，当进行如本文所描述的方法时，指数式细胞生长的第一阶段是借由在将该前驱物，较佳乳糖在第二阶段中添加至培养中之前将碳源，较佳葡萄糖或蔗糖添加至培养基中来提供。
在本发明的方法的另一较佳实施方式中，指数式细胞生长的第一阶段是借由将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驱物，较佳乳糖的该培养基中来提供，之后为其中仅将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至培养中的第二阶段。
在本发明的方法的另一较佳实施方式中，指数式细胞生长的第一阶段是借由将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驱物，较佳乳糖的该培养基中来提供，之后为其中将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖，及前驱物，较佳乳糖添加至培养中的第二阶段。
在替代较佳实施方式中，在如本文所描述的方法中，已在指数式生长的第一阶段中将前驱物与碳基基质一起添加。
在方法的另一较佳实施方式中，培养基含有至少一种选自包含以下者的群的前驱物：乳糖、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(LNB)及N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
根据本发明，如本文所描述的方法较佳地包含自该培养分离所述中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者，更佳地自该培养分离所有所述中性岩藻糖基化寡糖，甚至更佳地自该培养分离存在于根据本发明的混合物中的所有寡糖的步骤。
术语「自该培养分离(separating from said cultivation)」意谓自细胞及/或其生长的培养基中收获、收集或撷取所述寡糖中的任一者，较佳所述寡糖中的全部。
所述寡糖中的任一者可以习知方式自水性培养基分离，细胞在该水性培养基中生长。在该寡糖仍存在于制造寡糖混合物的细胞中的情况下，可使用用以自细胞中释放或萃取该寡糖的习知方式，诸如使用以下者进行细胞破坏：高pH、热冲击、音波处理、法式压滤(French press)、均质化、酶促水解、化学水解、溶剂水解、洗涤剂、水解……培养基及/或细胞萃取物一起且分别可接着进一步用于分离该寡糖。此较佳涉及澄清该含有寡糖的混合物以移除悬浮粒子及污染物，尤其细胞、细胞组分、不可溶代谢物及由培养经遗传修饰的细胞产生的碎片。在此步骤中，可以习知方式澄清该含有寡糖的混合物。较佳地，该含有寡糖的混合物借由离心、絮凝、倾析及/或过滤澄清。将该寡糖与该含有寡糖的混合物分离的另一步骤较佳涉及将实质上所有蛋白质以及肽、氨基酸、RNA及DNA以及可能干扰后续分离步骤的任何内毒素及糖脂自该含有寡糖的混合物移除，较佳在已使其澄清之后。在此步骤中，蛋白质及相关杂质可以习知方式自该含有寡糖的混合物移除。较佳地，蛋白质、盐、副产物、染料、内毒素及其他相关杂质自该含有寡糖的混合物借由超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、切向流高效能过滤、用非离子界面活性剂处理、酶消化、超过滤、电泳(例如使用平板(slab)-聚丙烯酰胺或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE))、亲和层析(使用亲和配位体，包括例如DEAE-琼脂糖凝胶、聚-L-离氨酸及多黏菌素-B、内毒素-选择性吸附剂基质)、离子交换层析(诸如(但不限于)阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换、由内而外配位体连接)、疏水性相互作用层析及/或凝胶过滤(亦即粒径排阻层析)，特定言之借由层析，更特定言之借由离子交换层析或疏水性相互作用层析或配位体交换层析移除。除粒径排阻层析之外，借由层析介质或所选膜保留蛋白质及相关杂质，该寡糖保持在该含有寡糖的混合物中。
在另一较佳实施方式中，如本文所描述的方法亦提供进一步纯化来自寡糖混合物的所述寡糖中的任一者或多者。所述寡糖的进一步纯化可例如借由使用(活性)木炭或碳、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换以移除任何残留DNA、蛋白质、LPS、内毒素或其他杂质来实现。亦可使用醇(诸如乙醇)及水醇混合物。另一纯化步骤借由产物的结晶、蒸发或沉淀实现。另一纯化步骤为对所制造的寡糖进行干燥，例如喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(band dry)、带式干燥(belt dry)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
在一例示性实施方式中，可在一制程中进行所产生寡糖中的至少一者，较佳全部的分离及纯化，该制程包含以下按任何次序的步骤：
a)使培养物或其澄清形式与具有截留分子量(molecular weight cut-off；MWCO)为600-3500Da的纳米过滤膜接触，确保保留所制造的寡糖且使蛋白质、盐、副产物、染料及其他相关杂质中的至少一部分通过，
b)使用该膜，用无机电解质的水溶液对来自步骤a)的保留物进行透滤制程，继而视情况用纯水进行透滤以移除过量电解质，
c)及收集来自该电解质的阳离子的呈盐形式的所述寡糖富集的保留物。
在一替代性例示性实施方式中，可在一制程中进行所产生寡糖中的至少一种，较佳全部的分离及纯化，该制程包含以下按任何次序的步骤：使用不同膜使培养物或其澄清形式经受两种膜过滤步骤，其中
-一个膜具有约300至约500道尔顿(Dalton)之间的截留分子量，及
-另一膜，其截留分子量在约600至约800道尔顿之间。
在一替代性例示性实施方式中，可在一制程中进行所产生寡糖中的至少一者，较佳全部的分离及纯化，该制程包含以下按任何次序的步骤，所述步骤包含用呈H+形式的强阳离子交换树脂及呈自由碱形式的弱阴离子交换树脂处理培养物或其澄清形式的步骤。
在一替代性例示性实施方式中，以以下方式进行所产生寡糖中的至少一者，较佳全部的分离及纯化。将包含所制造的寡糖、生物质、培养基组分及污染物的培养物施用于以下纯化步骤：
i)自培养物分离生物质，
ii)进行阳离子交换剂处理以用于移除带正电物质，
iii)进行阴离子交换剂处理以用于移除带负电物质，
iv)进行纳米过滤步骤及/或电渗析步骤，
其中提供一种包含所制造的寡糖的纯化溶液，其纯度大于或等于80％。视情况，纯化溶液借由选自包含以下者的清单的任一或多个干燥步骤进行干燥：喷雾干燥，冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥、带式干燥、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥及真空滚筒干燥。
在一替代性例示性实施方式中，可在一制程中进行所产生寡糖中的至少一种，较佳全部的分离，该制程包含以下按任何次序的步骤：对培养物进行酶处理；自培养物移除生物质；超过滤；纳米过滤；及进行管柱层析步骤。较佳地，此类管柱层析为单个管柱或多个管柱。更佳地，管柱层析步骤为模拟移动床层析。此类模拟移动床层析较佳包含i)至少4个管柱，其中至少一个管柱包含弱或强阳离子交换树脂；及/或ii)具有不同流速的四个区域I、II、III及IV；及/或iii)包含水的溶离剂；及/或iv)15至60摄氏度的操作温度。
在一特定实施方式中，本发明提供所制造的寡糖或寡糖混合物，其借由选自包含以下者的清单的任一或多个干燥步骤干燥成粉末：喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥、带式干燥、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥及真空滚筒干燥，其中干粉含有＜15-wt.％的水，较佳＜10-wt.％的水，更佳＜7-wt.％的水，最佳＜5-wt.％的水。
在第三态样中，本发明提供如本文所描述的经代谢工程改造的细胞的用途，其用于制造包含至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物。
为鉴别包含如本文所描述的细胞中产生的至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物中的寡糖，单体建构嵌段(例如单糖或聚糖单元组成物)、侧链的变旋异构组态、取代基的存在及位置、聚合度/分子量及键联模式可借由所属技术领域中已知的标准方法鉴别，所述标准方法诸如例如甲基化分析、还原裂解、水解、气相层析-质谱法(gaschromatography-mass spectrometry；GC-MS)、基质辅助雷射脱附/离子化-质谱法(Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry；MALDI-MS)、电洒离子化-质谱法(Electrospray ionization-mass spectrometry；ESI-MS)、具有紫外线或折射率侦测的高效液相层析(HPLC)、具有脉冲安培侦测的高效能阴离子交换层析(High-Performance Anion-Exchange chromatography with Pulsed Amperometric Detection；HPAEC-PAD)、毛细管电泳(capillary electrophoresis；CE)、红外线(infrared；IR)/拉曼光谱法及核磁共掁(Nuclear magnetic resonance；NMR)光谱技术。可使用例如固态NMR、傅立叶变换红外(Fourier transform infrared；FT-IR)光谱法及广角X射线散射(wide-angle X-ray scattering；WAXS)来求解晶体结构。聚合度(degree of polymerization；DP)、DP分布及多分散性可借由例如黏度测定法及SEC(SEC-HPLC，高效粒径排阻层析)测定。为鉴别糖的单体组分，可使用方法诸如例如酸催化的水解、高效液相层析(highperformance liquid chromatography；HPLC)或气-液相层析(gas-liquidchromatography；GLC)(在转化成醛醇乙酸盐之后)。为确定糖苷键，在DMSO中用碘甲烷及强碱使糖甲基化，进行水解，实现部分甲基化糖醇的还原，进行甲基化醛醇乙酸盐的乙酰化，且借由GLC/MS(与质谱法结合的气-液相层析)进行分析。为测定寡糖序列，使用酸或酶进行部分解聚合以测定结构。为鉴别变旋异构组态，对寡糖进行酶分析，例如使其与对特定类型的键联，例如β-半乳糖苷酶或α-葡萄糖苷酶等具有特异性的酶接触，且NMR可用于分析产物。
包含寡糖混合物的产物
在一些实施方式中，将如本文所描述产生的寡糖混合物并入至食品(例如人类食品或进食(feed))、膳食补充剂、医药成分、化妆品成分或药品中。在一些实施方式中，寡糖混合物与一或多种适用于食品、进食、膳食补充剂、医药成份、化妆品成分或药品的成分混合。
在一些实施方式中，膳食补充剂包含至少一种益菌助生质成分及/或至少一种益生菌成分。
「益菌助生质(prebiotic)」为促进对宿主有益的微生物，尤其胃肠道中的微生物生长的物质。在一些实施方式中，膳食补充剂提供多种益菌助生质，包括借由本说明书中所揭示的制程制造及/或纯化的寡糖混合物，以促进一或多种有益微生物的生长。膳食补充剂的益菌助生质成分的实例包括其他益菌助生质分子(诸如HMO)及植物多糖(诸如菊糖、果胶、b-葡聚糖及木质寡糖)。「益生菌(probiotic)」产品典型地含有置换或添加至胃肠道微生物群以便接受体受益的活微生物。此类微生物的实例包括乳杆菌属物种(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)及保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus))、双岐杆菌属物种(例如，动物双岐杆菌(B.animalis)、长双岐杆菌(B.longum)及婴儿双岐杆菌(B.infantis)(例如Bi-26))及布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。在一些实施方式中，由此说明书的制程制造及/或纯化的寡糖混合物与此类微生物组合经口投予。
膳食补充剂的其他成分的实例包括双糖(诸如乳糖)、单糖(诸如葡萄糖及半乳糖)、增稠剂(诸如阿拉伯胶)、酸性调节剂(诸如柠檬酸三钠)、水、脱脂乳及调味剂。
在一些实施方式中，寡糖混合物并入至人类婴儿食品(例如婴儿配方食品)中。婴儿配方食品通常为用于作为人类母乳的完整或部分替代物向婴儿喂养的制造食品。在一些实施方式中，婴儿配方食品以粉末形式出售，且借由与水混合制备以用于向婴儿瓶喂或杯喂。婴儿配方食品的组成物典型地经设计以大致模拟人类母乳。在一些实施方式中，在本说明书中借由制程产生及/或纯化的寡糖混合物包括于婴儿配方食品中以提供与由人类母乳中的寡糖提供的营养益处类似的营养益处。在一些实施方式中，将寡糖混合物与婴儿配方食品的一或多种成分混合。婴儿配方食品成分的实例包括脱脂乳、碳水化合物来源(例如乳糖)、蛋白质来源(例如乳清蛋白浓缩物及酪蛋白)、脂肪来源(例如植物油，诸如棕榈油、高油酸红花油、菜籽油、椰子油及/或葵花籽油；及鱼油)、维生素(诸如维生素A、Bb、Bi2、C及D)、矿物质(诸如柠檬酸钾、柠檬酸钙、氯化镁、氯化钠、柠檬酸钠及磷酸钙)及可能的人乳寡糖(HMO)。此类HMO可包括例如DiFL、乳-N-丙糖II、LNT、LNnT、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6′-半乳糖基乳糖、3′-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖及乳-N-新六糖。
在一些实施方式中，一或多种婴儿配方食品成分包含脱脂乳、碳水化合物来源、蛋白质来源、脂肪来源及/或维生素及矿物质。
在一些实施方式中，一或多种婴儿配方食品成分包含乳糖、乳清蛋白浓缩物及/或高油酸红花油。
在一些实施方式中，婴儿配方食品中的寡糖混合物的浓度与通常存在于人类母乳中的寡糖的浓度为大致相同浓度。在一些实施方式中，婴儿配方食品中的寡糖的混合物中的各单一寡糖的浓度与通常存在于人类母乳中的寡糖的浓度为大致相同浓度。
在一些实施方式中，寡糖混合物并入至进料制剂中，其中该进料是选自包含宠物食品、动物代乳品、兽医产品、断奶后进料或蠕变进料的清单。
除非另外明确陈述，否则在本发明的一态样的上下文中揭示的各实施方式亦揭示于本发明的所有其他态样的上下文中。
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语一般具有与本发明所属技术领域中具有通常知识者通常所理解相同的含义。一般而言，本文所用的命名法及上文及下文所描述的细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合为所属领域中熟知且常用的命名法、细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合。使用标准技术进行核酸及肽合成。一般而言，纯化步骤是根据制造商说明书进行。
其他优势遵循特定实施方式及实例。不言而喻，以上提及的特征及仍有待下文阐述的特征，在不脱离本发明的范围的情况下，不仅可以分别指定的组合使用而且可以其他组合或独立地使用。
本发明是关于以下特定实施方式：
1.一种经代谢工程改造的细胞，其制造至少三种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物，其中该细胞
-表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶，及
-能够合成核苷酸-糖GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)，及
-表现至少一种额外糖基转移酶，及
-能够合成至少一种或多种核苷酸-糖，其中该至少一种或多种核苷酸-糖为用于该额外糖基转移酶的供体。
2.如实施方式1的细胞，其中该细胞经基因表现模组修饰，其中来自所述表现模组中的任一者的表现为持续型的或借由天然诱导物产生。
3.如实施方式1至2中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同寡糖。
4.如实施方式1至3中任一项的细胞，其中该细胞制造四种或更多种不同中性岩藻糖基化寡糖。
5.如实施方式1至4中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者是选自包含以下者的清单：岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶。
6.如实施方式1至5中任一项的细胞，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
7.如实施方式1至6中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为岩藻糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)。
8.如实施方式1至7中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
9.如实施方式1至8中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
10.如实施方式1至9中任一项的细胞，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下者的清单：GDP-Fuc、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖。
11.如实施方式1至10中任一项的细胞，其中所述中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露聚糖。
12.如实施方式1至11中任一项的细胞，其中除所述三种中性岩藻糖基化寡糖以外，该寡糖混合物亦包含至少一种中性非岩藻糖基化寡糖。
13.如实施方式1至12中任一项的细胞，其中该中性寡糖混合物包含至少一种寡糖，该至少一种寡糖经岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
14.如实施方式1至13中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与该细胞外的该混合物的所述中性寡糖中的任一者的分泌。
15.如实施方式1至14中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成所述中性寡糖中的任一者的前驱物。
16.如实施方式1至15中任一项的细胞，其中该细胞制造用于合成所述中性寡糖中的任一者的前驱物。
17.如实施方式1至16中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
18.如实施方式1至17中任一项的细胞，其中所有所述中性寡糖为哺乳动物乳寡糖。
19.如实施方式1至16中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的任一者为人类ABO血型系统的抗原。
20.如实施方式1至16及19中任一项的细胞，其中所有所述中性寡糖为人类ABO血型系统的抗原。
21.一种借由细胞制造至少三种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供一种细胞，该细胞(a)表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶，且能够合成该核苷酸-糖GDP-岩藻糖，及(b)表现至少一种额外糖基转移酶，及(c)能够合成至少一种或多种核苷酸-糖，其中所述核苷酸-糖为用于所述额外糖基转移酶的供体，及
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成所述核苷酸-糖的条件下培养该细胞，及
iii)较佳地，自该培养分离所述中性寡糖中的至少一者。
22.如实施方式21的方法，其中该细胞为如实施方式1至20中任一项的经代谢工程改造的细胞。
23.如实施方式21至22中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同寡糖。
24.如实施方式21至23中任一项的方法，其中该细胞制造四种或更多种不同中性岩藻糖基化寡糖。
25.如实施方式21至24中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者是选自包含以下者的清单：岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶。
26.如实施方式21至25中任一项的方法，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
27.如实施方式21至26中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为岩藻糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)。
28.如实施方式21至27中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
29.如实施方式21至28中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
30.如实施方式21至29中任一项的方法，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下者的清单：GDP-Fuc、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖。
31.如实施方式21至30中任一项的方法，其中所述中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
32.如实施方式21至31中任一项的方法，其中除所述三种中性岩藻糖基化寡糖以外，该寡糖混合物亦包含至少一种中性非岩藻糖基化寡糖。
33.如实施方式21至32中任一项的方法，其中该中性寡糖混合物包含至少一种寡糖，该至少一种寡糖经岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
34.如实施方式21至33中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于合成所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于合成所述寡糖中的任一者或多者的前驱物。
35.如实施方式21至34中任一项的方法，其中该细胞制造用于合成所述中性寡糖中的任一者的前驱物。
36.如实施方式21至35中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
37.如实施方式21至36中任一项的方法，其中所有所述中性寡糖为哺乳动物乳寡糖。
38.如实施方式21至35中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的任一者为人类ABO血型系统的抗原。
39.如实施方式21至35及38中任一项的方法，其中所有所述中性寡糖为人类ABO血型系统的抗原。
40.如实施方式21至39中任一项的方法，其中用于合成所述中性寡糖中的任一者的该前驱物完全转化为所述中性寡糖中的任一者。
41.如实施方式21至40中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一者：澄清、超过滤、纳米过滤、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、切向流高效能过滤、切向流超过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
42.如实施方式21至41中任一项的方法，其进一步包含自该细胞纯化所述中性寡糖中的任一者。
43.如实施方式21至42中任一项的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、纳米过滤、超过滤或离子交换、使用醇、使用含水醇混合物、结晶、蒸发、沉淀、干燥、喷雾干燥或冻干。
44.如实施方式1至20中任一项的细胞或如实施方式21至43中任一项的方法，其中该细胞是选自由微生物、植物或动物细胞组成的群，较佳该微生物为细菌、真菌或酵母菌，较佳该植物为稻、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，较佳该动物为昆虫、鱼类、鸟或非人类哺乳动物，较佳该动物细胞为哺乳动物细胞系。
45.如实施方式1至20及44中任一项的细胞或如实施方式21至44中任一项的方法，其中该细胞为以下者的细胞：细菌，较佳大肠杆菌菌株，更佳为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳为大肠杆菌MG1655的大肠杆菌K12菌株。
46.如实施方式1至20及44中任一项的细胞或如实施方式21至44中任一项的方法，其中该细胞为酵母细胞。
47.一种如实施方式1至20、44至46中任一项的细胞或如实施方式21至46中任一项的方法的用途，其用于制造至少三种不同中性岩藻糖基化寡糖的混合物。
此外，本发明是关于以下较佳特定实施方式：
1.一种经代谢工程改造的细胞，其制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物，其中该细胞
-经代谢工程改造以用于制造该混合物，及
-表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶，及
-能够合成核苷酸-糖GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)，及
-表现至少一种额外糖基转移酶，及
-能够合成至少一种或多种核苷酸-糖，其中该至少一种或多种核苷酸-糖为用于该额外糖基转移酶的供体。
2.如较佳实施方式1的细胞，其中该细胞经基因表现模组修饰，其中来自所述表现模组中的任一者的表现为持续型的或借由天然诱导物产生。
3.如较佳实施方式1或2中任一项的细胞，其中该细胞包含编码一种蛋白质的相同编码DNA序列的多个复本。
4.如较佳实施方式1至3中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同寡糖。
5.如较佳实施方式1至4中任一项的细胞，其中该细胞制造至少五种，较佳至少六种，更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性岩藻糖基化寡糖。
6.如较佳实施方式1至5中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者是选自包含以下者的清单：岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶，
-较佳地，该岩藻糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，
-较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，
-较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，
-较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基半乳糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶。
7.如较佳实施方式1至6中任一项的细胞，其中该细胞能够表现，较佳表现所述额外糖基转移酶中的至少两者，更佳至少三者，甚至更佳至少四者，最佳至少五者。
8.如较佳实施方式1至7中任一项的细胞，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
9.如较佳实施方式1至8中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为岩藻糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)。
10.如较佳实施方式1至9中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
11.如较佳实施方式1至10中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
12.如较佳实施方式1至11中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基半乳糖氨基转移酶，且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
13.如较佳实施方式1至12中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基甘露糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
14.如较佳实施方式1至13中任一项的细胞，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下者的清单：GDP-Fuc、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
15.如较佳实施方式1至14中任一项的细胞，其中该细胞表现一或多种选自包含以下者的清单的多肽：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶，较佳其中该细胞在所述多肽中的任一者的表现或活性方面经修饰。
16.如较佳实施方式1至15中任一项的细胞，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
17.如较佳实施方式1至16中任一项的细胞，其中所述中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
18.如较佳实施方式1至17中任一项的细胞，其中除所述四种中性岩藻糖基化寡糖以外，该寡糖混合物亦包含至少一种中性非岩藻糖基化寡糖。
19.如较佳实施方式1至18中任一项的细胞，其中该中性寡糖混合物包含至少一种寡糖，该至少一种寡糖经岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
20.如较佳实施方式1至19中任一项的细胞，其中该细胞使用至少一种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，所述前驱物自培养基馈至该细胞。
21.如较佳实施方式1至20中任一项的细胞，其中该细胞制造至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物。
22.如较佳实施方式1至21中任一项的细胞，其中该至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物完全转化为所述寡糖中的任一者。
23.如较佳实施方式1至22中任一项的细胞，其中该细胞胞内制造所述寡糖，且其中所述所制造的寡糖的一部分或实质上全部保留在胞内，及/或经由被动或主动运输排出到该细胞外。
24.如较佳实施方式1至23中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外分泌来自该混合物的所述中性寡糖中的任一者，较佳地其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所有所述中性寡糖。
25.如较佳实施方式1至24中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性寡糖中的任一者的前驱物及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所需前驱物，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
26.如较佳实施方式24或25中任一项的细胞，其中该膜蛋白是选自包含以下者的清单：搬运蛋白(porter)、P-P-键水解驱动的运输蛋白(transporter)、β-桶状孔蛋白、辅助运输蛋白(transport protein)、推定运输蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，
较佳地，所述搬运蛋白包含MFS运输蛋白、糖流出运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白，
较佳地，所述P-p-键水解驱动的运输蛋白包含ABC运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
27.如较佳实施方式24至26中任一项的细胞，其中该膜蛋白提供改良的所述寡糖中的任一者的制造及/或能够实现及/或增强的所述寡糖中的任一者的流出。
28.如较佳实施方式1至27中任一项的细胞，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。
29.如较佳实施方式1至28中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
30.如较佳实施方式29的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下者的蛋白质中的任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶(phosphotransferase；PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷氧基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
31.如较佳实施方式1至30中任一项的细胞，其中该细胞能够制造磷酸烯醇丙酮酸盐(phosphoenolpyruvate；PEP)。
32.如较佳实施方式1至31中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰以用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的制造及/或供应。
33.如较佳实施方式1至32中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
34.如较佳实施方式1至33中任一项的细胞，其中所有所述中性寡糖为哺乳动物乳寡糖。
35.如较佳实施方式1至34中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的任一者为人类ABO血型系统的抗原。
36.如较佳实施方式1至33及35中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的三者为人类ABO血型系统的抗原。
37.一种借由细胞，较佳单一细胞制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供一种细胞，该细胞(a)能够表现，较佳表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶，且能够合成该核苷酸-糖GDP-岩藻糖，及(b)表现至少一种额外糖基转移酶，及(c)能够合成至少一种或多种核苷酸-糖，其中所述核苷酸-糖为用于所述额外糖基转移酶的供体，及
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成所述核苷酸-糖的条件下培养该细胞，使得该细胞制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的该中性混合物，及
iii)较佳地，自该培养分离所述中性寡糖中的至少一者，更佳地，自该培养分离所有所述中性寡糖。
38.如较佳实施方式37的方法，其中该细胞为如较佳实施方式1至36中任一项的经代谢工程改造的细胞。
39.如较佳实施方式38的方法，其中该细胞经基因表现模组修饰，其中来自所述表现模组中的任一者的表现为持续型的或借由天然诱导物产生。
40.如较佳实施方式38或39中任一项的方法，其中该细胞包含编码一种蛋白质的相同编码DNA序列的多个复本。
41.如较佳实施方式37至40中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同寡糖。
42.如较佳实施方式37至41中任一项的方法，其中该细胞制造至少五种，较佳至少六种，更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性岩藻糖基化寡糖。
43.如较佳实施方式37至42中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者是选自包含以下者的清单：岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶，
-较佳地，该岩藻糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，
-较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，
-较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，
-较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基半乳糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶。
44.如较佳实施方式37至43中任一项的方法，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
45.如较佳实施方式37至44中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为岩藻糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)。
46.如较佳实施方式37至45中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
47.如较佳实施方式37至46中任一项的方法，其中该额外糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
48.如较佳实施方式37至47中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基半乳糖氨基转移酶，且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
49.如较佳实施方式37至48中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基甘露糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
50.如较佳实施方式37至49中任一项的方法，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下者的清单：GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-阿拉伯糖4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
51.如较佳实施方式37至50中任一项的方法，其中该细胞表现一或多种选自包含以下者的清单的多肽：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶，较佳其中该细胞在所述多肽中的任一者的表现或活性方面经修饰。
52.如较佳实施方式37至51中任一项的方法，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
53.如较佳实施方式37至52中任一项的方法，其中所述中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
54.如较佳实施方式37至53中任一项的方法，其中除所述四种中性岩藻糖基化寡糖以外，该寡糖混合物亦包含至少一种中性非岩藻糖基化寡糖。
55.如较佳实施方式37至54中任一项的方法，其中该中性寡糖混合物包含至少一种寡糖，该至少一种寡糖经岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
56.如较佳实施方式37至55中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，所述前驱物自培养基馈至该细胞。
57.如较佳实施方式37至56中任一项的方法，其中该细胞制造至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物。
58.如较佳实施方式37至57中任一项的方法，其中该至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物完全转化为所述寡糖中的任一者。
59.如较佳实施方式37至58中任一项的方法，其中该细胞胞内制造所述寡糖，且其中所述所制造的寡糖的一部分或实质上全部保留在胞内，及/或经由被动或主动运输排出到该细胞外。
60.如较佳实施方式37至59中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外分泌来自该混合物的所述中性寡糖中的任一者，较佳地其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所有所述中性寡糖。
61.如较佳实施方式37至60中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性寡糖中的任一者的前驱物及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所需前驱物，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
62.如较佳实施方式60或61中任一项的方法，其中该膜蛋白是选自包含以下者的清单：搬运蛋白、P-P-键水解驱动的运输蛋白、β-桶状孔蛋白、辅助运输蛋白、推定运输蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，
较佳地，所述搬运蛋白包含MFS运输蛋白、糖流出运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白，
较佳地，所述P-P-键水解驱动的运输蛋白包含ABC运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
63.如较佳实施方式60至62中任一项的方法，其中该膜蛋白提供改良的所述寡糖中的任一者的制造及/或能够实现及/或增强的所述寡糖中的任一者的流出。
64.如较佳实施方式37至63中任一项的方法，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。
65.如较佳实施方式37至64中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
66.如较佳实施方式65的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下者的蛋白质中的任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷氧基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
67.如较佳实施方式37至66中任一项的方法，其中该细胞能够制造磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)。
68.如较佳实施方式37至67中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰以用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的制造及/或供应。
69.如较佳实施方式37至68中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
70.如较佳实施方式37至69中任一项的方法，其中所有所述中性寡糖为哺乳动物乳寡糖。
71.如较佳实施方式37至69中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的任一者为人类ABO血型系统的抗原。
72.如较佳实施方式37至69及71中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的三者为人类ABO血型系统的抗原。
73.如较佳实施方式37至72中任一项的方法，其中所述条件包含：
-使用包含至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物及/或受体的培养基，及/或
-向该培养基添加至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物及/或受体进料。
74.如较佳实施方式37至73中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含至少一种前驱物及/或受体的培养基；
ii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍；
iii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍；且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L，较佳至少75g/L，更佳至少90g/L，更佳至少100g/L，更佳至少125g/L，更佳至少150g/L，更佳至少175g/L，更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
75.如较佳实施方式37至73中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)向该培养基添加包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍；
iii)向该培养基添加包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍，且其中较佳地，该乳糖进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该乳糖进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L，较佳75g/L，更佳100g/L，更佳125g/L，更佳150g/L，更佳175g/L，更佳200g/L，更佳225g/L，更佳250g/L，更佳275g/L，更佳300g/L，更佳325g/L，更佳350g/L，更佳375g/L，更佳400g/L，更佳450g/L，更佳500g/L，甚至更佳550g/L，最佳600g/L，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L，较佳至少75g/L，更佳至少90g/L，更佳至少100g/L，更佳至少125g/L，更佳至少150g/L，更佳至少175g/L，更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
76.如较佳实施方式75的方法，其中该乳糖进料是借由自该培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以＞300mM的浓度添加乳糖来实现。
77.如较佳实施方式75或76中任一项的方法，其中该乳糖进料是借由以一浓度向该培养中添加乳糖来实现，该浓度使得在该培养的整个制造阶段中获得至少5mM，较佳10mM或30mM的乳糖浓度。
78.如较佳实施方式37至77中任一项的方法，其中宿主细胞经培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
79.如较佳实施方式37至78中任一项的方法，其中该细胞培养于包含碳源的培养基中，该碳源包含单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油、包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物的复合培养基中；较佳地，其中该碳源是选自包含以下者的清单：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽-寡糖、麦芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、茧蜜糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖浆、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐及丙酮酸盐。
80.如较佳实施方式37至79中任一项的方法，其中该培养基含有至少一种选自包含以下者的群的前驱物：乳糖、半乳糖、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(lacto-N-biose；LNB)、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
81.如较佳实施方式37至80中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由在将该前驱物，较佳乳糖在第二阶段中添加至该培养基之前将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至该培养基中来提供。
82.如较佳实施方式37至81中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驱物，较佳乳糖的该培养基中来提供，之后为其中仅将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至该培养基的第二阶段。
83.如较佳实施方式37至82中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驱物，较佳乳糖的该培养基中来提供，之后为其中将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖，及前驱物，较佳乳糖添加至该培养基的第二阶段。
84.如较佳实施方式37至83中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一者：澄清、超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效能过滤、切向流超过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
85.如较佳实施方式37至84中任一项的方法，其进一步包含自该细胞纯化所述中性寡糖中的任一者。
86.如较佳实施方式85的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一者：使用活性炭或碳；使用木炭、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换；使用醇；使用水醇混合物；结晶；蒸发；沉淀；干燥，喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(banddrying)、带式干燥(belt drying)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
87.如较佳实施方式1至36中任一项的细胞或如较佳实施方式37至86中任一项的方法，其中该细胞为细菌、真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞或原虫细胞，
-较佳地，该细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，更佳为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655，
-较佳地，该真菌属于选自包含以下者的群的属：根霉菌属(Rhizopua)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)，
-较佳地，该酵母菌属于选自包含以下者的群的属：酵母菌属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉森酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、斯塔莫酵母属(Starmerella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，
-较佳地，该植物细胞为藻类细胞或衍生自烟草、苜蓿、稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，
-较佳地，该动物细胞衍生自非人类哺乳动物、鸟类、鱼类、无脊椎动物、爬行动物、两栖动物或昆虫，或为衍生自不包括胚胎干细胞的人类细胞的经遗传修饰的细胞系，更佳地该人类及非人类哺乳动物细胞为上皮细胞、胚胎肾细胞、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，更佳地该昆虫细胞衍生自斜纹夜盗虫(Spodoptera frugiperda)、家蚕(Bombyx mori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，
-较佳地，该原虫细胞为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
88.如较佳实施方式87的细胞或如较佳实施方式87的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞为存活的革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacterium)，该细菌包含减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG)、肠内菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen；ECA)、纤维素、可拉酸、核寡糖、渗透调节周质葡聚糖(Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或茧蜜糖。
89.一种如较佳实施方式1至36、87、88中任一项的细胞或如较佳实施方式37至88中任一项的方法的用途，其用于制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物。
本发明将在实施例中更详细地描述。
以下实施例将充当本发明的进一步说明及阐明，且并不意欲为限制性的。
实施例
实施例1.大肠杆菌的物质及方法
培养基
鲁利亚培养液(Luria Broth；LB)培养基是由1％胰胨(Difco，比利时埃伦博德海姆(Erembodegem，Belgium))、0.5％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，比利时鲁汶(Leuven，Belgium))组成。培养实验中使用的96孔盘中或摇瓶中的基本培养基含有2.00g/LNH4Cl、5.00g/L(NH4)2SO4、2.993g/L KH2PO4、7.315g/L K2HPO4、8.372g/L MOPS、0.5g/LNaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1ml/L维生素溶液、100μl/L钼酸盐溶液及1mL/L硒溶液。如各别实施例中所指定，将20g/L乳糖、20g/L LacNAc及/或20g/L LNB作为前驱物另外添加至培养基中。使用1M KOH将基本培养基设定为pH 7。维生素溶液是由3.6g/L FeCl2.4H2O、5g/L CaCl2.2H2O、1.3g/L MnCl2.2H2O、0.38g/L CuCl2.2H2O、0.5g/LCoCl2.6H2O、0.94g/L ZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/L Na2EDTA.2H2O及1.01g/L硫胺.HCl组成。钼酸盐溶液含有0.967g/L NaMoO4.2H2O。硒溶液含有42g/L Seo2。
用于发酵的基本培养基含有6.75g/L NH4Cl、1.25g/L(NH4)2SO4、2.93g/L KH2PO4及7.31g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1mL/L维生素溶液、100μL/L钼酸盐溶液及1mL/L硒溶液，具有与如上文所描述的相同组成。如各别实施例中所指定，将20g/L乳糖、20g/L LacNAc及/或20g/L LNB另外添加至培养基中。
借由高压处理(121℃，21分钟)对复合培养基进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加以下抗生素使培养基具有选择性：例如氯霉素(20mg/L)、卡本西林(carbenicillin)(100mg/L)、观霉素(40mg/L)及/或康霉素(50mg/L)。
质体
pKD46(红色辅助质体，安比西林(Ampicillin)抗性)、pKD3(含有FRT侧接氯霉素抗性(cat)基因)、pKD4(含有FRT侧接康霉素抗性(kan)基因)及pCP20(表现FLP重组酶活性)质体是获自教授R.Cunin(Vrije Universiteit Brussel，比利时，于2007)。将质体保持在购自Invitrogen的宿主大肠杆菌DH5α(F-、phi80dlacZΔM15、Δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-，mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA1)中。
菌株及突变
大肠杆菌K12 MG1655[λ-、F-、rph-1]是于2007年3月获自大肠杆菌基因储备中心(美国)，CGSC菌株编号：7740。基因破坏、基因引入及基因置换是使用Datsenko及Wanner(PNAS 97(2000)，6640-6645)公开的技术进行。此技术是基于借由λ红重组酶进行同源重组之后的抗生素选择。翻转酶重组酶的后续催化确保在最终产生菌株中移除抗生素选择卡匣。携有红色辅助质体pKD46的转型体在30℃下在10mL具有安比西林(100mg/L)及L-阿拉伯糖(10mM)的LB培养基中生长至OD600nm为0.6。借由第一次用50mL冰冷水且第二次用1mL冰冷水洗涤细胞使其为电感受态。接着，将细胞再悬浮于50μL冰冷水中。用50μL细胞及10-100ng线性双股DNA产物，借由使用Gene PulserTM(BioRad)(600Ω，25μFD及250伏)进行电穿孔。在电穿孔之后，将细胞添加至1mL的在37℃下培育1h的LB培养基中，且最后扩散至含有25mg/L氯霉素或50mg/L康霉素的LB琼脂上以选择抗生素抗性转型体。借由PCR用在经修饰区上游及下游的引子验证所选突变体，且在42℃下使其生长于LB琼脂中以使辅助质体损失。测试突变体的安比西林敏感性。借由PCR使用pKD3、pKD4及其衍生物作为模板获得线性ds-DNA扩增子。所用引子具有与模板互补的序列的一部分且与染色体DNA上必须发生重组的侧互补的另一部分。对于基因体基因剔除，同源区经设计在相关基因的起始及终止密码子上游50-nt及下游50-nt。对于基因体基因嵌入，必须考虑转录起始点(+1)。PCR产物经PCR纯化，经Dpnl消化，自琼脂糖凝胶再纯化，且悬浮于溶离缓冲液(5mM Tris，pH 8.0)中。用pCP20质体转型所选突变体，该质体为安比西林及氯霉素抗性质体，显示FLP合成的温度敏感性复制及热诱导。在30℃下选择安比西林抗性转型体，其后在42℃下在LB中纯化少数菌落，且接着测试所有抗生素抗性及FLP辅助质体的损失。用对照引子检查基因剔除及基因嵌入。
在GDP-岩藻糖产生的一实施方式中，突变菌株衍生自大肠杆菌K12MG1655，该大肠杆菌包含大肠杆菌wcaJ及thyA基因的基因剔除及持续型转录单元的基因体基因嵌入，所述持续型转录单元含有如例如具有SEQ ID NO 01的大肠杆菌W的CscB的蔗糖运输蛋白、如例如源自具有SEQ ID NO 02的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的Frk的果糖激酶及如例如源自具有SEQ ID NO 03的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的BaSP的蔗糖磷酸化酶。对于岩藻糖基化寡糖的产生，突变GDP-岩藻糖产生菌株另外经表现质体修饰，所述表现质体包含α-1，2-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元，如例如具有SEQ ID NO04的幽门螺旋杆菌(H.pylori)的HpFutC；及/或α-1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元，如例如具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的HpFucT，且经用于选择性标记的持续型转录单元，如例如具有SEQ ID NO 07的大肠杆菌thyA修饰。岩藻糖基转移酶基因的持续型转录单元亦可经由基因体基因嵌入存在于突变大肠杆菌菌株中。如WO2016075243及WO2012007481中所描述，GDP-岩藻糖产生可进一步借由包含glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、pgi及lon的大肠杆菌基因的基因体基因剔除在突变大肠杆菌菌株中最佳化。GDP-岩藻糖产生可另外经最佳化，包含甘露糖-6-磷酸异构酶(如例如具有SEQ ID NO 08的大肠杆菌的manA)、磷酸甘露糖变位酶(如例如具有SEQ ID NO 09的大肠杆菌的marB)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(如例如具有SEQ ID NO 10的大肠杆菌的manC)、GDP-甘露糖4，6-脱水酶(如例如具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的gmd)及GDP-L-岩藻糖合酶(如例如具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fcl)的持续型转录单元的基因体基因嵌入。GDP-岩藻糖产生亦可借由大肠杆菌fucK及fucI基因的基因体基因剔除及持续型转录单元的基因体基因嵌入获得，所述持续型转录单元含有岩藻糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 13的大肠杆菌的fucP，及双功能性岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，如例如来自具有SEQ NO ID 14的脆弱类杆菌的fkp。若产生GDP-岩藻糖的突变菌株意欲制备岩藻糖基化乳糖结构，则菌株另外经大肠杆菌LacZ、LacY及LacA基因的基因体基因剔除及经乳糖透过酶(如例如具有SEQ ID NO 15的大肠杆菌LacY)的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰。
替代地，及/或另外，产生GDP-岩藻糖及/或岩藻糖基化结构可在具有持续型转录单元的基因体基因嵌入的突变大肠杆菌菌株中进一步经最佳化，该持续型转录单元包含膜运输蛋白，如例如来自莫金斯克罗诺杆菌的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、来自杨氏柠檬酸杆菌的MdfA(UniProt ID D4BC23)、来自大肠杆菌的MdfA(UniProt ID P0AEY8)、来自雷金斯堡约克氏菌的MdfA(UniProt ID G9Z5F4)、来自大肠杆菌的iceT(UniProt IDA0A024L207)或来自杨氏柠檬酸杆菌的iceT(UniProt ID D4B8A6)。
在产生LN3(GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及源自其的包含乳-N-四糖(LNT)及乳-N-新四糖(LNnT)的寡糖的一实施方式中，突变菌株衍生自大肠杆菌K12 MG1655且经大肠杆菌LacZ及nagB基因的基因剔除修饰，且经如例如具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰。对于LNT或LNnT产生，突变菌株进一步经可经由基因体基因嵌入或自表现质体递送至菌株的以下者的持续型转录单元分别修饰：如例如具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖苷基转移酶或具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶。视情况，半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶及/或N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶基因的多个复本可添加至突变大肠杆菌菌株中。此外，LNT及/或LNnT产生可借由用如例如具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的glmS*54的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶的持续型转录单元的一或多个基因体基因嵌入修饰菌株来改善UDP-GlcNAc产生进行增强。另外，菌株可视情况经修饰以借由大肠杆菌ushA、galT、ldhA及agp基因的基因体基因剔除增强UDP-半乳糖产生。突变大肠杆菌菌株亦可视情况经调适具有以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入：如例如具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE的UDP-葡萄糖-4-表异构酶、如例如具有SEQ ID NO 26的大肠杆菌的glmM的磷酸葡萄糖胺变位酶及如例如具有SEQ ID NO 27的大肠杆菌的glmU的N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶。突变菌株亦可视情况适用于经由以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入在蔗糖上生长，所述持续型转录单元含有如例如具有SEQ ID NO 01的大肠杆菌W的CscB的蔗糖运输蛋白、如例如源自具有SEQ ID NO 02的运动发酵单胞菌的Frk的果糖激酶及如例如源自具有SEQ ID NO 03的青春双歧杆菌的BaSP的蔗糖磷酸化酶。
替代地及/或另外，产生LN3、LNT、LNnT及其衍生的寡糖可进一步经持续型转录单元的基因体基因嵌入在突变大肠杆菌菌株中经最佳化，该持续型转录单元包含膜运输蛋白，如例如来自莫金斯克罗诺杆菌的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、来自杨氏柠檬酸杆菌的MdfA(UniProt ID D4BC23)、来自大肠杆菌的MdfA(UniProt ID P0AEY8)、来自雷金斯堡约克氏菌的MdfA(UniProt ID G9Z5F4)、来自大肠杆菌的iceT(UniProt ID A0A024L207)或来自杨氏柠檬酸杆菌的iceT(UniProt ID D4B8A6)。
较佳但未必，糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质及/或膜运输蛋白经N端及/或C端融合至如例如以下者的可溶性强化子标签：SUMO标签、MBP标签、His、FLAG、Strep-II、Halo-标签、NusA、硫氧还原蛋白、GST及/或Fh8标签以增强其可溶性(Cost等人，Front.Microbiol.2014，https：//doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063；Fox等人，ProteinSci.2001，10(3)，622-630；Jia及Jeaon，Open Biol.2016，6：160196)。
视情况，突变大肠杆菌菌株经编码伴随蛋白，如例如DnaK、DnaJ、GrpE或GroEL/ES伴随蛋白系统的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰(Baneyx F.、Palumbo J.L.(2003)Improving Heterologous Protein Folding via Molecular Chaperone and FoldaseCo-Expression.In：Vaillancourt P.E.(编)E.coliGene Expression Protocols.Methodsin Molecular BiologyTM，第205卷.Humana Press)。
视情况，突变大肠杆菌菌株经修饰以产生糖基最小化的大肠杆菌菌株，其包含非必需糖基转移酶基因中的任一者或多者的基因体基因剔除，所述非必需糖基转移酶基因包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、wazZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、amT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP。
所有持续型启动子、UTR及终止子序列源自由Mutalik等人(Nat.Methods2013，第10期，354-360)及Cambray等人(Nucleic Acids Res.2013，41(9)，5139-5148)描述的库。所有基因在Twist Bioscience(twistbioscience.com)或IDT(eu.idtdna.com)上以合成方式定序，且使用供应商的工具调适密码子使用。本发明中所描述的SEQ ID NO概述于表1中。
所有菌株在-80℃下储存于冷冻小瓶中(隔夜LB培养物以1∶1比率与70％甘油混合)。
表1：本发明中所描述的SEQ ID NO的概述
Figure BPA0000334656630001471
Figure BPA0000334656630001481
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶，于150μL LB中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，用400μL基本培养基借由稀释400倍。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72小时或更短或更长。为量测培养实验结束时的糖浓度，借由使培养液在60℃下沸腾15分钟，之后使细胞短暂离心而自各孔获取全培养液样品(＝胞内及胞外糖浓度的平均值)。
生物反应器的预培养始于具有某一菌株的整个1mL冷冻小瓶，在1L或2.5L摇瓶中在250mL或500mL基本培养基中接种且在37℃下在定轨振荡器上以200rpm培育24h。接着接种5L生物反应器(250mL接种物于2L批料培养基中)；该过程由MFCS控制软体(SartoriusStedim Biotech，Melsungen，Germany)控制。培养条件设定为37℃及最大搅拌；压力气体流速视菌株及生物反应器而定。使用0.5M H2S04及20％NH4OH将pH控制在6.8。冷却废气。当发酵期间起泡升高时，添加10％聚硅氧消泡剂溶液。
光学密度
培养物的细胞密度通常借由量测600nm下的光学密度(Implen NanophotometerNP80，Westburg，Belgium，或用Spark 10M微量盘读取器，Tecan，Switzerland)来监测。
解析型分析
标准品，诸如(但不限于)蔗糖、乳糖、LacNAc、乳-N-二糖(LNB)、岩藻糖基化LacNAc(2′FLacNAc、3-FLacNAc)、岩藻糖基化LNB(2′FLNB、4′FLNB)、乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新-四糖(LNnT)、LNFP-I、LNFP-H、LNFP-III及LNFP-V是购自Carbosynth(英国)、Elicityl(法国(France))及IsoSep(瑞典(Sweden))。用内部制造的标准品分析其他化合物。
在Waters Acquity H级UPLC上在蒸发光散射侦测器(Evaporative LightScattering Detector；ELSD)或折射率(Refractive Index；RI)侦测下分析寡糖。在WatersAcquity UPLC BEH Amide管柱(2.1×100mm；
Figure BPA0000334656630001491
1.7μm)管柱及Acquity UPLC BEHAmide VanGuard管柱(/>
Figure BPA0000334656630001492
2.1×5mm)上注射0.7μL体积的样品。管柱温度为50℃。移动相由其中添加0.2％三乙胺的1/4水及3/4乙腈溶液组成。该方法以0.130mL/min的流速等度。ELS侦测器具有50℃的偏移管温度，且N2气体压力为50psi，增益200及资料传输率10pps。RI侦测器的温度设定为35℃。
对于在质谱仪上的分析，在450℃的去溶剂化温度、650L/h的氮气去溶剂化气体流速及20V的锥体电压下使用具有电子喷雾电离(Electron Spray Ionisation；ESI)的Waters Xevo TQ-MS。对于所有寡糖，MS在选定离子监测(selected ion monitoring；SIM)中在负模式下操作。在具有Thermo Hypercarb管柱(2.1×100mm；3μm)的Waters AcquityUPLC上在35℃下进行分离。使用一定梯度，其中溶离剂A为超纯水及0.1％甲酸且其中溶离剂B为乙腈及0.1％甲酸。寡糖在55分钟内使用以下梯度分离：在21分钟内自2％至12％溶离剂B初始增加，在11分钟内自12％至40％溶离剂B第二次增加，且在5分钟内自40％至100％溶离剂B第三次增加。作为洗涤步骤，使用100％溶离剂B持续5分钟。对于管柱平衡，在1分钟内恢复2％溶离剂B的初始条件且维持12分钟。
在Dionex HPAEC系统上用脉冲型电流侦测(pulsed amperometric detection；PAD)分析低浓度(低于50mg/L)下的糖。在Dionex CarboPac PA200管柱4×250mm及DionexCarboPac PA200保护管柱4×50mm上注射5μL体积的样品。管柱温度设定成30℃。使用一定梯度，其中溶离剂A为去离子水，其中溶离剂B为200mM氢氧化钠且其中溶离剂C为500mM乙酸钠。寡糖在60分钟内分离，同时使用以下梯度维持25％的溶离剂B的恒定比率：75％溶离剂A的初始等度步骤维持10分钟，0％至4％溶离剂C在8分钟内的初始增加，71％溶离剂A及4％溶离剂C的第二等度步骤维持6分钟，4％至12％溶离剂C在2.6分钟内的第二增加，63％溶离剂A及12％溶离剂C的第三等度步骤维持3.4分钟，及12％至48％溶离剂C在5分钟内的第三增加。作为洗涤步骤，使用48％溶离剂C持续3分钟。对于管柱平衡，在1分钟内恢复75％溶离剂A及0％溶离剂C的初始条件且维持11分钟。应用的流速为0.5mL/min。
实施例2.酿酒酵母的物质及方法
培养基
在具有完整补充混合物(SD CSM)或CSM省却(drop-out)(SD CSM-Ura，SD CSM-Trp，SD CSM-His)的合成限定酵母培养基上生长菌株，该培养基含有6.7g/L的不含氨基酸的酵母氮源基础(不含AA的YNB，Difco)、20g/L琼脂(Difco)(固体培养物)、22g/L葡萄糖单水合物或20g/L乳糖及0.79g/L CSM或0.77g/L CSM-Ura、0.77g/L CSM-Trp或0.77g/L CSM-His(MP Biomedicals)。
菌株
使用由Brachmann等人(Yeast(1998)14：115-32)产生的酿酒酵母BY4742，可获自Euroscarf培养物收集。所有突变菌株借由使用Gietz方法(Yeast 11：355-360，1995)的同源重组或质体转型产生。
质体
在产生GDP-岩藻糖的一实施方式中，酵母表现质体p2a_2μ_Fuc(Chan 2013，Plasmid 70，2-17)用于酿酒酵母中的外来基因的表现。此质体含有安比西林抗性基因及细菌复制起点以允许在大肠杆菌中进行选择及维持，以及用于在酵母中进行选择及维持的2μ酵母ori及Ura3选择标记。此质体另外含有用于以下者的持续型转录单元：如例如具有SEQID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12的乳糖透过酶、如例如具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的gmd的GDP-甘露糖4，6-脱水酶及如例如具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fcl的GDP-L-岩藻糖合酶。在另一实施方式中，酵母表现质体p2a_2μ_Fuc2可用作p2a_2μ_Fuc质体的替代表现质体，该质体包含紧接于安比西林抗性基因、细菌ori、2μ酵母ori及Ura3选择标记的用于以下者的持续型转录单元：如例如具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12的乳糖渗透酶、如例如具有SEQ ID NO 13的大肠杆菌的fucP的岩藻糖透过酶及如例如来自具有SEQNO ID 14的脆弱类杆菌的fkp的双功能性岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶。为进一步产生岩藻糖基化寡糖，p2a_2μ_Fuc及其变异体p2a_μ_Fuc2另外含有用于以下者的持续型转录单元，如例如具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的HpFutC的α-1，2-岩藻糖基转移酶，及/或如例如具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的HpFucT的α-1，3-岩藻糖基转移酶。
在产生UDP-半乳糖的一实施方式中，酵母表现质体衍生自pRS420-质体系列(Christianson等人，1992，Gene 110：119-122)，其含有HIS3选择标记及用于如例如具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE的UDP-葡萄糖-4-表异构酶的持续型转录单元。为产生LN3，此质体进一步经用于以下者的持续型转录单元修饰：如例如具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12的乳糖渗透酶及如例如具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶。为产生如LNT或LNnT的LN3衍生的寡糖，质体进一步分别经用于以下者的持续型转录单元修饰：如例如具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶或及如例如具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶。
较佳但未必，糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质及/或膜运输蛋白中的任一者或多者经N端及/或C端融合至SUMOstar标签(例如获自pYSUMOstar，Life Sensors，Malvem，PA)以增强其可溶性。
视情况，突变酵母菌菌株用编码伴随蛋白的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰，该伴随蛋白如例如Hsp31、Hsp32、Hsp33、Sno4、Kar2、Ssb1、Sse1、Sse2、Ssa1、Ssa2、Ssa3、Ssa4、Ssb2、Ecm10、Ssc1、Ssq1、Ssz1、Lhs1、Hsp82、Hsc82、Hsp78、Hsp104、Tcp1、Cct4、Cct8、Cct2、Cct3、Cct5、Cct6或Cct7(Gong等人，2009，Mol.Syst.Biol.5：275)。
将质体保持在购自Invitrogen的宿主大肠杆菌DH5α(F-、phi80dlacZδM15、δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-、mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA1)中。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、IDT或Twist Bioscience。可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
一般而言，酵母菌株最初在SD CSM盘上生长以获得单一菌落。使此等盘在30℃下生长2-3天。始于单一菌落，使预培养物在30℃下在5mL下生长隔夜，在200rpm下振荡。后续的125mL摇瓶实验在25mL培养基中以此预培养物的2％接种。在30℃下在200rpm的定轨振荡下培育此等摇瓶。
基因表现启动子
使用合成持续型启动子表现基因，如借由Blazeck所描述(Biotechnology andBioengineering，第109卷，第11号，2012)。
实施例3.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLacNAc、3-FLacNAc及二-FLacNAc的寡糖混合物
如实施例1中所描述的经修饰以用于制造GDP-岩藻糖的大肠杆菌菌株进一步用具有两种持续型转录单元的表现质体转型，所述单元表现具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌α-1，3-岩藻糖基转移酶。由于乳糖及N-乙酰基乳糖胺(LacNAc，Gal-b1，4-GlcNAc)为幽门螺旋杆菌岩藻糖基转移酶两者的适合受体，因此在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件，针对在全培养液样品中产生包含2′FL、3-FL及岩藻糖基化LacNAc(亦即2′FLacNAc及3-FLacNAc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LacNAc作为前驱物。因为具有SEQ ID NO04的酶亦显示2′FL上的岩藻糖基转移酶活性且具有SEQ ID NO 05的酶亦显示2′FLacNAc上的岩藻糖基转移酶活性，因此亦针对产生该寡糖混合物中的DiFL及二-FLacNAc评估新颖菌株。
实施例4.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLacNAc、3-FLacNAc及二-FLacNAc的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于产生GDP-岩藻糖的大肠杆菌菌株进一步经调适以用于借由以下者进行胞内乳糖合成：lacZ、glk及galETKM操纵子的基因体基因剔除以及用于具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB及具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的UDP-葡萄糖4-表异构酶(galE)的持续型转录单元的基因体基因嵌入。在下一步骤中，突变大肠杆菌菌株经具有两种持续型转录单元的表现质体转型，所述持续型转录单元用以表现具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌α-1，3-岩藻糖基转移酶。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、二-FL及岩藻糖基化N-乙酰基乳糖胺(亦即2′FLacNAc、3-FLacNAc及二-FLacNAc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且LNB作为前驱物。
实施例5.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLacNAc、3-FLacNAc及二-FLacNAc的寡糖混合物
如实施例1中所描述经最佳化以用于GDP-岩藻糖产生的大肠杆菌K-12MG1655菌株用大肠杆菌N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶(nagA)基因及大肠杆菌葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶(nagB)基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入进一步修饰以用于制造GlcNAc及LacNAc：具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β1，4-半乳糖基转移酶(lgtB)、具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变体L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)及具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)。在下一步骤中，新颖菌株另外用两种相容表现质体转型，其中第一质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌α-1，2-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元，且第二相容质体含有具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌α-1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。替代地，新颖菌株可用一种含有具有SEQ DD NO 04及05的幽门螺旋杆菌岩藻糖基转移酶两者的持续型转录单元的表现质体转型。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-岩藻糖基化LacNAc(2′FLacNAc)、3-岩藻糖基化LacNAc(3-FLacNAc)及二-岩藻糖基化LacNAc(二-FLacNAc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例6.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB、4-FLNB及二-FLNB的寡糖混合物
如实施例1中所描述的经修饰以用于制造GDP-岩藻糖的大肠杆菌菌株进一步用具有两种持续型转录单元的表现质体转型，所述单元表现具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌α-1，3-岩藻糖基转移酶。由于乳糖及乳-N-二糖(LNB，Gal-b1，3-GlcNAc)为幽门螺旋杆菌岩藻糖基转移酶两者的适合受体，因此在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL及岩藻糖基化LNB(亦即2′FLNB、4-FLNB及二-岩藻糖基化LNB(-FLNB))的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LNB作为前驱物。
实施例7.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB、4-FLNB及二-FLNB的寡糖混合物
在另一生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、二-FL及岩藻糖基化LNB(亦即2′FLNB、4-FLNB及二-岩藻糖基化LNB(二-FLNB))的寡糖混合物评估经修饰以用于制造如实施例4中所述的2′FL、3-FL及DiFL的大肠杆菌菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且LNB作为前驱物。
实施例8.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB、4-FLNB及二-FLNB的寡糖混合物
如实施例1中所述经最佳化以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌K-12MG1655菌株进一步用大肠杆菌N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶(nagA)基因及大肠杆菌葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶(nagB)基因的基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰以用于制造GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的N-乙酰基葡萄糖胺β1，3-半乳糖基转移酶(WbgO)、具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54及具有SEQ ID NO16的酿酒酵母的GNA1。在下一步骤中，新颖菌株另外用两种相容表现质体转型，其中第一质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌α-1，2-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元，且第二相容质体含有具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌α-1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。替代地，新颖菌株可用一种含有具有SEQ ID NO 04及05的幽门螺旋杆菌岩藻糖基转移酶两者的持续型转录单元的表现质体转型。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB、4-FLNB及二-FLNB的寡糖混合物评估所有新颖菌株，其中培养含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例9.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB、4-FLNB及二-FLNB的寡糖混合物
如实施例4中所描述经修饰以用于制造2′FL、3-FL及DiFL的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰以用于制造GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO、具有SEQ IDNO 17的大肠杆菌的突变glmS*54及具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB、4-FLNB及二-FLNB的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养含有蔗糖作为碳源且无前驱物。
实施例10.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、2′FLNB及Gal-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物
如实施例1中所描述的经修饰以用于制造GDP-岩藻糖的大肠杆菌菌株用具有以下者的持续型转录单元的表现质体转型：具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 23的大肠杆菌的α-1，3-半乳糖基转移酶WbnI。由于乳糖及LNB为幽门螺旋杆菌α-1，2-岩藻糖基转移酶的适合受体且2′FLNB作为大肠杆菌α-1，3-半乳糖基转移酶的受体，因此在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件，针对制造包含2′FL、DiFL、2′-岩藻糖基化LNB(2′FLNB)及Gal-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LNB作为前驱物。
实施例11.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、2′FLNB及Gal-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于制造GDP-岩藻糖的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰以用于制造GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO、具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54及具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1。在下一步骤中，新颖菌株经含有以下者的持续型转录单元的表现质体转型：具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 23的大肠杆菌的α-1，3-半乳糖基转移酶WbnI。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对制造包含2′FL、DiFL、2′-岩藻糖基化LNB及Gal-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例12用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、2′FLNB及GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖产生的大肠杆菌菌株用具有以下者的持续型转录单元的表现质体转型：具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 24的鼬鼠螺旋杆菌的α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶BgtA。由于乳糖及LNB为幽门螺旋杆菌α-1，2-岩藻糖基转移酶的适合受体且2′FLNB为鼬鼠螺旋杆菌α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶的受体，因此在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、DiFL、2′-岩藻糖基化LNB(2′FLNB)及GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LNB作为前驱物。
实施例13.使用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、2′FLNB及GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖产生的大肠杆菌菌株进一步经大肠杆菌nagA及nagB基因的基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰以用于产生GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO、具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54及具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 24的鼬鼠螺旋杆菌的α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶BgtA的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对产生包含2′FL、DiFL、2′-岩藻糖基化LNB及GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例14.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I2及Gal-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO18的脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)及具有SEQ IDNO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株进一步用含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元的表现质体与含有具有SEQID NO 23的大肠杆菌的α-1，3-半乳糖基转移酶WbnI的持续型转录单元的第二相容表现质体转型。如实施例23中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造及用于LNFP-I制造的大肠杆菌菌株进一步经转型。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及Gal-a1，3-LNFP-I(Gal-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例15.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO18的脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)及具有SEQ IDNO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株进一步用含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元的表现质体与含有具有SEQID NO 24的鼬鼠螺旋杆菌的α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶BgtA的持续型转录单元的第二相容表现质体转型。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中产生包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及GalNAc-a1，3-LNFP-I(GalNAc-a1，3-(Fuc-a1，2)-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例16.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO18的脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)及具有SEQ IDNO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株进一步用含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元的表现质体与含有具有SEQID NO 05的幽门螺旋杆菌的a-1，3-岩藻糖基转移酶(HpFucT)的持续型转录单元的第二相容表现质体转型。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LN3、LNT及LNFP-I(Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例17用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-II的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的glmS*54、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，为制造乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)，突变菌株进一步用含有以下者的持续型转录单元的表现质体转型：具有SEQ ID NO 25的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的突变a1，3/4岩藻糖苷酶及具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶(HpFutC)。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例18.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及LNFP-II的寡糖混合物
如实施例17中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造及用于LNFP-II制造的大肠杆菌菌株进一步经含有持续型转录单元的相容表现质体转型，该持续型转录单元针对具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的a-1，3-岩藻糖基转移酶(HpFucT)。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例19.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及LNFP-V的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V，Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例20.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNn T、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNnT制造：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a-1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III，Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI，Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3-)Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例21.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
在另一生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物评估如实施例16中所描述的大肠杆菌菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LNB驱体。
实施例22.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
在另一生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、-FLacNAc、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物评估如实施例16中所描述的大肠杆菌菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LacNAc作为前驱物。
实施例23.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
在另一生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、2′-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物评估如实施例16中所描述的大肠杆菌菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖、LacNAc及LNB作为前驱物。
实施例24.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GFP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例25.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GFP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、2′-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LacNAc作为前驱物。
实施例26.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
在另一生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物评估如实施例20中所描述的大肠杆菌菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LNB作为前驱物。
实施例27.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
在另一生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物评估如实施例20中所描述的大肠杆菌菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LacNAc作为前驱物。
实施例28.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
在另一生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、Di-FLacNAc、2′-FLNB、4-FLNB、Di-FLNB、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物评估如实施例20中所描述的大肠杆菌菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖、LacNAc及LNB作为前驱物。
实施例29.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GFP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA及nagB基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适：具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO o5的幽门螺旋杆菌的a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例30.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GFP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例31.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GFP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、2′-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖及LacNAc作为前驱物。
实施例32.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡糖结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GFP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 16的酿酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例33.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-II的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ IDNO 17的大肠杆菌的glmS*54、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ IDNO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，为制造乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)，突变菌株进一步用表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 25的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的突变a1，3/4岩藻糖苷酶的持续型转录单元。在最终步骤中，使突变菌株用相容表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶(HpFutC)的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例34.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-V的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ IDNO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V，Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例35.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNnT制造：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ IDNO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a-1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III，Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI，Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3-)Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例36用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-II的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌fucK、fucI、nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 13的大肠杆菌的fucP、具有SEQ ID NO 14的脆弱类杆菌的fkp、具有SEQ IDNO 17的大肠杆菌的glmS*54、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ IDNO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，为制造乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)，突变菌株进一步用表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 25的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的突变a1，3/4岩藻糖苷酶的持续型转录单元。在最终步骤中，使突变菌株用相容表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶(HpFutC)的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例37.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-V的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌fucK、fucI、nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNT制造：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 13的大肠杆菌的fucP、具有SEQ ID NO 14的脆弱类杆菌的fkp、具有SEQ IDNO 17的大肠杆菌的glmS*54、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ IDNO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V，Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例38.用经修饰的大肠杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以用于GDP-岩藻糖制造的大肠杆菌菌株进一步用大肠杆菌fucK、fucI、nagA、nagB、ushA及galT基因的基因体基因剔除以及以下者的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适以用于LN3及LNnT制造：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 13的大肠杆菌的fucP、具有SEQ ID NO 14的脆弱类杆菌的fkp、具有SEQ IDNO 17的大肠杆菌的突变glmS*54、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB。在下一步骤中，新颖菌株经一表现质体转型，该表现质体含有具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a-1，3-岩藻糖基转移酶的持续型转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III，Gal-b1，4-(Fuc-a1，3)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI，Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3-)Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖作为碳源且乳糖作为前驱物。
实施例39.用经修饰的酿酒酵母宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB及4-FLNB的寡糖混合物
如实施例2中所描述用酵母表现质体(p2a_2μ_Fuc的变异体)调适酿酒酵母菌株以用于GDP-岩藻糖制造及岩藻糖基转移酶表现，该表现质体包含用于以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的乳糖透过酶(LAC12)、具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的GDP-甘露糖4，6-脱水酶(gmd)、具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的GDP-L-岩藻糖合酶(fcl)、具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 05的幽门螺旋杆菌的α-1，3-岩藻糖基转移酶。在生长实验中根据实施例2中所描述的培养条件，使用包含乳糖及LNB作为前驱物的SD CSM-Ura省却培养基，针对制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLNB及4-FLNB的寡糖混合物评估突变酵母菌株。
实施例40.用经修饰的酿酒酵母宿主制造包含2′FL、DiFL、2′FLacNAc、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物
如实施例2中所描述用第一酵母表现质体及第二酵母表现质体调适酿酒酵母菌株以用于制造GDP-岩藻糖及LNT及用于表现a-1，2-岩藻糖基转移酶，该第一酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12、具有SEQ IDNO 11的大肠杆菌的gmd、具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fcl及具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶；及该第二酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。在生长实验中根据实施例2所描述中的培养条件使用包含乳糖及LacNAc作为前驱物的SD CSM-Ura-His省却培养基，针对产生包含2′FL、DiFL、LN3、LNT、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I，Fuc-a1，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)及2′FLacNAc的寡糖混合物评估突变酵母菌株。
实施例41.用经修饰的酿酒酵母宿主制造包含2′FL、DiFL、LNB、2′FLNB、LN3、LNT及LNFP-II的寡糖混合物
如实施例2中所描述用第一酵母表现质体及第二酵母表现质体调适酿酒酵母菌株以用于制造GDP-岩藻糖及LNT及用于表现a1，3/4-岩藻糖苷酶及a-1，2-岩藻糖基转移酶，该第一酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12、具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的gmd、具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fc1、具有SEQID NO 25的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的突变a1，3/4岩藻糖苷酶及具有SEQ ID NO04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶；及该第二酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。当在生长实验中根据实施例2中所描述的培养条件评估时，使用包含乳糖及N-乙酰基葡萄糖胺作为前驱物的SD CSM-Ura-His省却培养基，针对产生包含2′FL、DiFL、LNB、2′FLNB、LN3、LNT及乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II，Gal-b1，3-(Fuc-a1，4)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物评估突变酵母菌株。
实施例42.用经修饰的酿酒酵母宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-V的寡糖混合物
如实施例2中所描述用第一酵母表现质体及第二酵母表现质体调适酿酒酵母菌株以用于制造GDP-岩藻糖及LNT及用于表现a-1，2-岩藻糖基转移酶及a-1，3-岩藻糖基转移酶，该第一酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12、具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的gmd、具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fcl、具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a1，3-岩藻糖基转移酶；及该第二酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。当在生长实验中根据实施例2中所描述的培养条件评估时，使用包含乳糖作为前驱物的SD CSM-Ura-His省却培养基，针对制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及LNFP-V的寡糖混合物评估突变酵母菌株。
实施例43.用经修饰的酿酒酵母宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物
如实施例2中所描述用第一酵母表现质体及第二酵母表现质体调适酿酒酵母菌株以用于制造GDP-岩藻糖及LNnT及用于表现a-1，2-岩藻糖基转移酶及a-1，3-岩藻糖基转移酶，该第一酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12、具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的gmd、具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fcl、具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶及具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a1，3-岩藻糖基转移酶；及该第二酵母表现质体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB。当在生长实验中根据实施例2中所描述的培养条件评估时，使用包含乳糖作为前驱物的SD CSM-Ura-His省却培养基，针对制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、LNFP-III及乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI，Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3-)Glc)及乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI，Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3-)Glc)的寡糖混合物评估突变酵母菌株。
实施例44.用经修饰的酿酒酵母宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-V的寡糖混合物
如实施例2中所描述用酵母人工染色体(yeast artificial chromosome；YAC)调适酿酒酵母菌株以用于制造GDP-岩藻糖及LNT及用于表现a-1，2-岩藻糖基转移酶及a-1，3-岩藻糖基转移酶，该酵母人工染色体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LAC12、具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的gmd、具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fcl、具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶、具有SEQ ID NO06的幽门螺旋杆菌的截短a1，3-岩藻糖基转移酶、具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 19的大肠杆菌O55：H7的WbgO。当在生长实验中根据实施例2中所描述的培养条件评估时，使用包含乳糖作为前驱物的SDCSM-Ura-His省却培养基，针对制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及LNFP-V的寡糖混合物评估突变酵母菌株。
实施例45.用经修饰的酿酒酵母宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LNFP-III及LNFP-VI的寡糖混合物
如实施例2中所描述用酵母人工染色体(YAC)调适酿酒酵母菌株以用于制造GDP-岩藻糖及LNnT及用于表现a-1，2-岩藻糖基转移酶及a-1，3-岩藻糖基转移酶，该酵母人工染色体包含以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 22的乳酸克鲁维酵母的LACl2、具有SEQ ID NO 11的大肠杆菌的gmd、具有SEQ ID NO 12的大肠杆菌的fcl、具有SEQ ID NO 04的幽门螺旋杆菌的a-1，2-岩藻糖基转移酶、具有SEQ ID NO 06的幽门螺旋杆菌的截短a1，3-岩藻糖基转移酶、具有SEQ ID NO 21的大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA及具有SEQ ID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB。当在生长实验中根据实施例2中所描述的培养条件评估时，使用包含乳糖作为前驱物的SD CSM-Ura-His省却培养基，针对制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、LNFP-III及乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI，Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3-)Glc)及乳-N-岩藻五糖VI(LNFP-VI，Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-(Fuc-a1，3-)Glc)的寡糖混合物评估突变酵母菌株。
实施例46.枯草芽孢杆菌的物质及方法
培养基
使用两种不同培养基，亦即富集的鲁利亚培养液(LB)及摇瓶用基本培养基(minimal medium for shake flask；MMsf)。基本培养基使用痕量元素混合物。
痕量元素混合物是由0.735g/L CaCl2.2H2O、0.1g/L MnCl2.2H2O、0.033g/LCuCl2.2H2O、0.06g/L CoCl2.6H2O、0.17g/L ZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/LNa2EDTA.2H2O及0.06g/L Na2MoO4组成。柠檬酸铁溶液含有0.135g/L FeCl3.6H2O、1g/L柠檬酸钠(Hoch 1973 PMC1212887)。
鲁利亚培养液(Luria Broth；LB)培养基是由1％胰胨(Difco，比利时埃伦博德海姆(Erembodegem，Belgium))、0.5％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，比利时鲁汶(Leuven，Belgium))组成。鲁利亚培养液琼脂(Luria Broth agar；LBA)盘是由LB培养基组成，其中添加12g/L琼脂(Difco，比利时埃伦博德海姆(Erembodegem，Belgium))。
摇瓶用基本培养基(MMsf)实验含有2.00g/L(NH4)2SO4、7.5g/L KH2PO4、17.5g/LK2HPO4、1.25g/L柠檬酸钠、0.25g/L MgSO4.7H2O、0.05g/L色氨酸、10多至30g/L葡萄糖或另一碳源(包括但不限于实施例中指定的果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油及麦芽三糖)、10ml/L痕量元素混合物及10ml/L柠檬酸铁溶液。用1M KOH将培养基设定为pH 7。视实验而定，可添加乳糖、LNB或LacNAc。
借由高压处理(121℃，21′)对复合培养基(例如LB)进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素(例如吉欧霉素(zeocin)(20mg/L))使培养基具有选择性。
菌株、质体及突变
枯草芽孢杆菌168，可获自于芽孢杆菌基因储备中心(美国俄亥俄州(Ohio，USA))。
经由Cre/lox的基因缺失的质体如由Yan等人(Appl.&Environm.Microbial.，2008年9月，第5556-5562页)所描述进行构筑。基因破坏是经由与线性DNA同源重组及经由电穿孔转型来进行，如Xue等人(J.Microb.Meth.34(1999)183-191)所描述。基因剔除的方法由Liu等人(Metab.Engine.24(2014)61-69)描述。此方法使用目标基因的上游及下游的1000bp同源性。
如由Popp等人(Sci.Rep.，2017，7，15158)所描述的整合载体用作表现载体且必要时可进一步用于基因体整合。用于表现的适合启动子可源自部件储存库(iGem)：序列id：Bba_K143012、Bba_K823000、Bba_K823002或Bba_K823003。选殖可使用吉布森组装、金门组装、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。
在制造基于乳糖的寡糖的一实施方式中，产生枯草芽孢杆菌突变菌株以含有编码乳糖输入体(importer)(诸如具有SEQ ID NO 15的大肠杆菌lacY)的基因。在2′FL、3FL及/或diFL制造的一实施方式中，将α-1，2-及/或α-1，3-岩藻糖基转移酶表现构筑体另外添加至菌株。在LN3制造的一实施方式中，将包含半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(SEQ ID NO 18))的持续型转录单元另外添加至菌株。在LNT制造的一实施方式中，制造LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(如例如来自大肠杆菌O55：H7的WbgO(SEQ ID NO 19))的持续型转录单元修饰。在LNnT制造的一实施方式中，产生LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(SEQ ID NO 20))的持续型转录单元修饰。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶或始于LB盘的单一菌落，于150μL LB中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，用400μL MMsf培养基借由稀释400倍。使各菌株在96孔盘的多个孔中生长作为生物复制物。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72小时或更短或更长。在培养实验结束时，自各孔获取样品以量测上清液浓度(胞外糖浓度，在短暂离心细胞5分钟后)，或在短暂离心细胞前借由使培养液在90℃下沸腾15分钟或在60℃下沸腾60分钟量测(＝全培养液浓度，胞内及胞外糖浓度，如本文所定义)。
此外，对培养物进行稀释以量测600nm下的光学密度。借由寡糖浓度除以生物质(以与参考菌株相比的相对百分比)来确定细胞效能指数或CPI。凭经验确定生物质在600nm下量测的光学密度的大致1/3。
实施例47.用经修饰的枯草芽孢杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLacNAc及3-FLacNAc的寡糖混合物
枯草芽孢杆菌菌株如实施例46中所描述借由持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰，所述持续型转录单元针对具有SEQ ID NO 15的大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)及具有SEQ ID NO 04的α-1，2-岩藻糖基转移酶HpFutC及具有SEQ ID NO 05的α-1，3-岩藻糖基转移酶HpFucT。在生长实验中在包含乳糖及LacNAc的MMsf培养基上根据实施例46中所提供的培养条件，针对制造包含2′FL、3-FL、DiFL、2′FLacNAc及3-FLacNAc的寡糖混合物评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例48.用经修饰的枯草芽孢杆菌宿主制造包含2′FL、DiFL、LNFP-I、LNFP-II、LNT及LN3
枯草芽孢杆菌菌株首先借由nagB、glmS及gamA基因的基因体基因剔除及包含基因的持续型转录单元的基因体基因嵌入经修饰以用于LN3制造及在蔗糖上的生长，所述基因编码来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)(SEQ ID NO 15)、天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProt ID P0CI73)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶LgtA(SEQ ID NO 18)、来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)(SEQ ID NO 01)、来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)(SEQ ID NO 02)及来自青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(SEQ ID NO 03)。在下一步骤中，突变菌株进一步经包含来自大肠杆菌O55：H7的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶WbgO(SEQ ID NO 19)的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰以制造LNT。在后续步骤中，产生LNT的菌株用表现质体转型，该表现质体包含用于来自幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶HpFutC(SEQ ID NO 04)及具有SEQ ID NO 25的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的突变a1，3/4岩藻糖苷酶的持续型转录单元。在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的MMsf培养基上根据实施例46中所提供的培养条件，针对产生包含LN3、LNT、LNFP-I、LNFP-II、2′FL及DiFL的寡糖混合物评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例49.麸氨酸棒状杆菌物质及方法
培养基
使用两种不同培养基，亦即富集的胰胨-酵母萃取物(tryptone-yeast；TY)培养基及摇瓶用基本培养基(minimal medium for shake flask；MMsf)。基本培养基使用1000x储备痕量元素混合物。
痕量元素混合物是由10g/L CaCl2、10g/L FeSO4.7H2O、10g/L MnSO4.H2O、1g/LZnSO4.7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2.6H2O、0.2g/L生物素(pH 7.0)及0.03g/L原儿茶酸组成。
摇瓶用基本培养基(MMsf)实验含有20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素、1g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4、0.25g/L MgSO4.7H2O、42g/L MOPS、10多至30g/L葡萄糖或另一碳源(包括但不限于实施例中指定的果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油及麦芽三糖)及1ml/L痕量元素混合物。视实验而定，可将乳糖、LNB及/或LacNAc添加至培养基中。
TY培养基是由1.6％胰胨(Difco，比利时埃伦博德海姆)、1％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，比利时鲁汶)组成。TY琼脂(TYA)盘是由TY培养基组成，其中添加12g/L琼脂(Difco，比利时埃伦博德海姆)。
借由高压处理(121℃，21′)对复合培养基(例如TY)进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素(例如康霉素(kanamycin)、安比西林(ampicillin))使培养基具有选择性。
菌株及突变
麸氨酸棒状杆菌ATCC 13032可获自于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)。
如借由Suzuki等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，2005年4月，67(2)：225-33)所描述基于Cre/loxP技术的整合质体载体及如借由Okibe等人(Journal ofMicrobiological Methods 85，2011，155-163)所描述的热敏穿梭载体经构筑用于基因缺失、突变及插入。用于(异源)基因表现的适合启动子可源自Yim等人(Biotechnol.Bioeng.，2013年11月，110(11)：2959-69)。选殖可使用吉布森组装、金门组装、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。
在制造基于乳糖的寡糖的一实施方式中，产生麸氨酸棒状杆菌突变菌株以含有编码乳糖输入体(importer)(诸如例如具有SEQ ID NO 15的大肠杆菌lacY)的基因。在2′FL、3FL及/或diFL制造的一实施方式中，将α-1，2-及/或α-1，3-岩藻糖基转移酶表现构筑体另外添加至菌株。
在LN3制造的一实施方式中，将包含半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(SEQ ID NO 18))的持续型转录单元另外添加至菌株。在LNT制造的一实施方式中，制造LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(如例如来自大肠杆菌O55：H7的WbgO(SEQ ID NO 19))的持续型转录单元修饰。在LNnT制造的一实施方式中，产生LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(SEQ ID NO 20))的持续型转录单元修饰。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶或始于TY盘的单一菌落，于150μL TY中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，用400μL MMsf培养基借由稀释400倍。使各菌株在96孔盘的多个孔中生长作为生物复制物。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72小时或更短或更长。在培养实验结束时，自各孔获取样品以量测上清液浓度(胞外糖浓度，在短暂离心细胞5分钟后)，或在短暂离心细胞前借由使培养液在60℃下沸腾15分钟量测(＝全培养液浓度，胞内及胞外糖浓度，如本文所定义)。
此外，对培养物进行稀释以量测600nm下的光学密度。借由完全培养液中量测的寡糖浓度除以生物质(以与参考菌株相比的相对百分比)来确定细胞效能指数或CPI。凭经验确定生物质在600nm下量测的光学密度的大致1/3。
实施例50.用经修饰的麸氨酸棒状杆菌宿主制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、LNFP-III及乳-N-新六糖的寡糖混合物
麸氨酸棒状杆菌菌株借由nagB、glmS及gamA基因的基因体基因剔除及包含基因的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰以用于LN3制造及在蔗糖上的生长，所述基因编码来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)(SEQ ID NO 15)、天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProtID Q8NND3)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶LgtA(SEQID NO 18)、来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)(SEQ ID NO 01)、来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)(SEQ ID NO 02)及来自青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(SEQ IDNO03)。在下一步骤中，突变菌株进一步经包含来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶LgtB(SEQ ID NO 20)的持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰以制造LNnT。在后续步骤中，产生LNnT的菌株用包含持续型转录单元的表现质体转型，该持续型转录单元针对来自幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶HpFutC(SEQ ID NO 04)及来自幽门螺旋杆菌的α-1，3-岩藻糖基转移酶HpFucT(SEQ ID NO 05)。在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的MMsf培养基上根据实施例49中所提供的培养条件，针对产生包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、LNFP-III及乳-N-新六糖的寡糖混合物评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例51.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的物质及方法
培养基
将莱茵衣藻细胞在三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐-磷酸盐(Tris-acetate-phosphate；TAP)培养基(pH 7.0)中培养。TAP培养基使用1000x储备Hutner氏痕量元素混合物。Hutner氏痕量元素混合物是由50g/L Na2EDTA.H2O(Titriplex III)、22g/LZnSO4.7H2O、11.4g/L H3BO3、5g/L MnCl2.4H2O、5g/L FeSO4.7H2O、1.6g/L CoCl2.6H2O、1.6g/L CuSO4.5H2O及1.1g/L(NH4)6MoO3组成。
TAP培养基含有2.42g/L三羟甲基氨基甲烷(参(羟甲基)氨基甲烷)、25mg/L盐储备溶液、0.108g/L K2HPO4、0.054g/L KH2PO4及1.0mL/L冰乙酸。盐储备溶液是由15g/LNH4CL、4g/L MgSO4.7H2O及2g/L CaCl2.2H2O组成。作为用于糖合成的前驱物及/或受体，可添加化合物，例如半乳糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖、乳糖、LacNAc、LNB。借由高压处理(121℃，21′)来对培养基进行灭菌。对于斜面琼脂上的储备培养物，使用含有1％琼脂(具有经纯化高强度，1000g/cm2)的TAP培养基。
菌株、质体及突变
莱茵衣藻野生型菌株21gr(CC-1690，野生型，mt+)、6145C(CC-1691，野生型，mt-)、CC-125(137c，野生型，mt+)、CC-124(137c，野生型，mt-)可购自美国明尼苏达大学(University of分钟nesota，U.S.A.)的衣藻属资源中心(Chlamydomonas ResourceCenter)(https：//www.chlamycollection.org)。
表现质体源自pSIl03，如可购自衣藻属资源中心。选殖可使用吉布森组装、金门组装、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。用于(异源)基因表现的适合启动子可衍生自例如Scranton等人(Algal Res.2016，15：135-142)。靶向遗传修饰(如基因剔除或基因置换)可使用如例如借由Jiang等人(Eukaryotic Cell 2014，13(11)：1465-1469)所描述的Crispr-Cas技术进行。
经由电穿孔的转型是如借由Wang等人(Biosci.Rep.2019，39：BSR2018210)所描述进行。在恒定通气及光强度为8000Lx的连续光照下，使细胞在液体TAP培养基中生长，直至细胞密度达到1.0-2.0×107个细胞/毫升。接着，将细胞以1.0×106个细胞/毫升的浓度接种至新制液体TAP培养基中且在连续光照下生长18-20h，直至细胞密度达到4.0×106个细胞/毫升。接下来，将细胞借由在室温下以1250g离心5分钟收集，洗涤且用含有60mM山梨醇的预冷却液体TAP培养基(Sigma，美国)再悬浮且冰冻10分钟。接着，将250μL细胞悬浮液(对应于5.0×l07个细胞)置放于具有100ng质体DNA的预冷却0.4cm电穿孔比色管(400ng/mL)中。使用BTX ECM830电穿孔装置(1575Ω，50μFD)，用6个各具有4ms的脉冲长度及100ms的脉冲间隔时间的500V脉冲进行电穿孔。在电穿孔之后，立即将比色管置放于冰上持续10分钟。最后，将细胞悬浮液转移至含有10mL具有60mM山梨醇的新制液体TAP培养基的50ml圆锥形离心管中，借由缓慢振荡使其在暗光下恢复隔夜。在隔夜恢复之后，再收集细胞且用淀粉包埋方法接种至选择性1.5％(w/v)琼脂-TAP盘上，该盘含有安比西林(100mg/L)或氯霉素(100mg/L)。接着在23+-0.5℃下在光强度为8000Lx的连续照明下培育盘。5-7天后分析细胞。
在制造UDP-半乳糖的一实施方式中，莱茵衣藻细胞经包含基因的转录单元修饰，所述基因编码如例如阿拉伯芥的半乳糖激酶(KIN，UniProt ID Q9SEE5)及如例如来自阿拉伯芥(A.thaliana)的USP的UDP-糖焦磷酸化酶(UniProt ID Q9C5I1)。
在LN3制造的一实施方式中，将包含半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(SEQ ID NO 18))的持续型转录单元另外添加至菌株。在LNT制造的一实施方式中，制造LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(如例如来自大肠杆菌O55：H7的WbgO(SEQ ID NO 19))的持续型转录单元修饰。在LNnT制造的一实施方式中，产生LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(SEQ ID NO 20))的持续型转录单元修饰。
在制造GDP-岩藻糖的一实施方式中，莱茵衣藻细胞经用于如例如来自阿拉伯芥的GDP-岩藻糖合酶(GER1，UniProt ID O49213)的转录单元修饰。
在岩藻糖基化的一实施方式中，莱茵衣藻细胞可经包含以下者的持续型转录单元的表现质体修饰：如例如来自幽门螺旋杆菌的HpFutC的α-1，2-岩藻糖基转移酶(SEQ ID NO04)及/或如例如来自幽门螺旋杆菌的HpFucT的α-1，3-岩藻糖基转移酶(SEQ ID NO 05)。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
在23+/-0.5℃下，在14/10h光/暗循环下以8000Lx的光强度，在选择性TAP-琼脂盘中培养莱茵衣藻细胞。在培养5至7天之后分析细胞。
关于高密度培养物，细胞可在如借由Chen等人(Bioresour.Technol.2011，102：71-81)及Johnson等人(Biotechnol.Prog.2018，34：811-827)所描述的封闭系统，如例如竖直或水平管光生物反应器、搅拌槽光生物反应器或平板光生物反应器中培养。
实施例52.在突变莱茵衣藻细胞中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LacNAc、2′FLacNAc及3-FLacNAc的寡糖混合物
莱茵衣藻细胞如实施例51中所描述经持续型转录单元的基因体基因嵌入进行工程改造以用于制造UDP-Gal，所述持续型转录单元包含编码半乳糖激酶(KIN，UniProt IDQ9SEE5)及UDP-糖焦磷酸化酶(USP)(UniProt ID Q9C5I1)的阿拉伯芥基因。在下一步骤中，细胞经持续型转录单元的基因体基因嵌入修饰，所述持续型转录单元包含来自脑膜炎奈瑟氏菌的b1，4-半乳糖基转移酶lgtB(SEQ ID NO 20)、来自阿拉伯芥的GDP-岩藻糖合酶(GER1，UniProt ID O49213)、来自幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶HpFutC(SEQ IDNO 04)及来自幽门螺旋杆菌的α-1，3-岩藻糖基转移酶HpFucT(SEQ ID NO 05)。在培养实验中在包含半乳糖及N-乙酰基葡萄糖胺作为前驱物的TAP琼脂盘上根据实施例51中所提供的培养条件，针对产生包含2′FL、3-FL、DiFL、LacNAc、2′FLacNAc及3-FLacNAc的寡糖混合物评估新颖菌株。培育5天之后，收集细胞，且在UPLC上分析糖产生。
实施例53.在突变莱茵衣藻细胞中制造包含2′FL、3-FL、DiFL、LacNAc、2′FLacNAc、3-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及二岩藻糖基-乳-N-新六糖的寡糖混合物
如实施例52中所描述的突变莱茵衣藻细胞进一步经用于具有SEQ ID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(lgtA)的持续型转录单元的基因体基因嵌入调适。在培养实验中在包含半乳糖及N-乙酰基葡萄糖胺作为前驱物的TAP琼脂盘上根据实施例51中提供的培养条件，针对产生包含2′FL、3-FL、DiFL、LacNAc、2′FLacNAc、3-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及二岩藻糖基-乳-N-新六糖的寡糖混合物评估新颖菌株。培育5天之后，收集细胞，且在UPLC上分析糖产生。
实施例54.动物细胞的物质及方法
自不同哺乳动物的脂肪组织分离间叶干细胞
新鲜脂肪组织是获自屠宰场(例如，牛、猪、绵羊、鸡、鸭、鲶鱼、蛇、蛙)或抽脂手术(例如，在人类的情况下，在签署知情同意书之后)且保持在补充有抗生素的磷酸盐缓冲盐水中。进行脂肪组织的酶消化，之后进行离心以分离间叶干细胞。将经分离之间叶干细胞转移至细胞培养烧瓶中且在标准生长条件(例如，37℃、5％CO2)下生长。初始培养基包括DMEM-F12、RPMI及α-MEM培养基(补充有15％胎牛血清)及1％抗生素。随后在第一次通过之后，培养基用补充有10％FBS(胎牛血清)的培养基置换。举例而言，Ahmad及Shakoori(2013，Stem Cell Regen Med.9(2)：29-36)，出于所有目的将其以全文引用的方式并入本文中，描述此实施例中所描述的方法的某些变化形式。
自乳汁分离间叶干细胞
此实施例说明自在无菌条件下自人类或任何其他哺乳动物(诸如本文所描述)收集的乳汁分离间叶干细胞。将相等体积的磷酸盐缓冲盐水添加至经稀释乳汁中，之后离心20分钟。将细胞集结粒用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，且在标准培养条件下在DMEM-F12、RPMI及补充有10％胎牛血清及1％抗生素的a-MEM培养基中在细胞培养烧瓶中接种细胞。举例而言，Hassiotou等人(2012，Stem Cells.30(10)：2164-2174)，出于所有目的将其以全文引用的方式并入本文中，描述此实施例中所描述的方法的某些变化形式。
使用2D及3D培养系统分化干细胞
经分离之间叶细胞可在2D及3D培养系统中分化成乳腺样上皮细胞及腔细胞。参见例如Huynh等人.1991.Exp Cell Res.197(2)：191-199；Gibson等人.1991，In Vitro CellDev Biol Anim.27(7)：585-594；Blatchford等人.1999；Animal Cell Technology′：Basic&Applied Aspects，Springer，Dordrecht.141-145；Williams等人.2009，BreastCancer Res 11(3)：26-43；及Arevalo等人.2015，Am J Physiol Cell Physiol.310(5)：C348-C356；其中的各者出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
对于2D培养，将经分离的细胞在培养盘中在补充有10ng/ml上皮生长因子及5pg/ml胰岛素的生长培养基中初始地接种。在汇合时，将细胞用补充有2％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素)及5pg/ml胰岛素的生长培养基喂饲48h。为诱发分化，将细胞用含有5pg/ml胰岛素、1pg/ml皮质醇、0.65ng/ml三碘甲状腺素、100nM地塞米松及1pg/ml促乳素的完整生长培养基喂饲。24小时后，自完全诱导培养基移除血清。
对于3D培养，将经分离的细胞胰蛋白酶化且在基质胶、玻尿酸或超低附着表面培养盘中培养六天，且借由添加补充有10ng/ml上皮生长因子及5pg/ml胰岛素的生长培养基来经诱导分化及乳酸化。在汇合时，将细胞用补充有2％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素)及5pg/ml胰岛素的生长培养基喂饲48h。为诱发分化，将细胞用含有5pg/ml胰岛素、1pg/ml皮质醇、0.65ng/ml三碘甲状腺素、100nM地塞米松及1pg/ml促乳素的完整生长培养基喂饲。24小时后，自完全诱导培养基移除血清。
制造乳腺样细胞的方法
哺乳动物细胞借由用编码Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的病毒载体再程式化来诱导多能性。接着在Mammocult培养基(获自Stem Cell Technologies)或乳腺细胞富集培养基(DMEM，3％FBS、雌激素、孕酮、肝素、氢皮质酮、胰岛素、EGF)中培养所得经再程式化的细胞以使其变为乳腺样细胞，自其中可诱导所选乳汁组分的表现。替代地，表观遗传重塑是使用诸如CRISPR/Cas9的重塑系统执行，以活化相关的选择基因，诸如酪蛋白、待持续型a-乳白蛋白，以允许其各自蛋白质的表现，及/或下调及/或基因剔除所选内源性基因，如例如WO21067641中所描述，出于所有目的将该文献以全文引用的方式并入本文中。
培养
完整生长培养基包括高葡萄糖DMEM/F12、10％FBS、1％NEAA、1％pen/strep、1％ITS-X、1％F-Glu、10ng/ml EGF及5pg/ml氢皮质酮。完整泌乳培养基包括高葡萄糖DMEM/F12、1％NEAA、1％pen/strep、1％ITS-X、1％F-Glu、10ng/ml EGF、5pg/ml氢皮质酮及1pg/ml促乳素(在Hyunh 1991中为5ug/ml)。细胞以20,000个细胞/平方公分的密度接种于完整生长培养基中的经胶原蛋白涂布的培养瓶上，且在完整生长培养基中静置以黏附及扩增48小时，其后将该培养基换为完整泌乳培养基。在暴露于泌乳培养基后，细胞开始分化且停止生长。在约一周内，细胞开始分泌泌乳产物，诸如乳脂质、乳糖、酪蛋白及乳清至培养基中。可借由浓缩或借由超滤进行稀释来实现所需浓度的泌乳培养基。可借由透析实现泌乳培养基的所需盐平衡，例如以自培养基移除非所需代谢产物。所使用激素及其他生长因子可借由树脂纯化，例如使用镍树脂来移除His标记的生长因子来选择性地萃取，以进一步降低乳酸化产物中污染物的水准。
实施例55.在非乳腺成体干细胞中制成包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物
如实施例54中所描述的经分离间叶细胞及经再程式化成乳腺样细胞经由CRISPR-CAS修饰以过度表现来自智人的GlcN6P合酶(UniProt ID Q06210)、来自智人的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(UniProt ID Q96EK6)、来自智人的磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶(UniProt ID O95394)、UDP-N-乙酰基己糖胺焦磷酸化酶(UniProt ID Q16222)、具有SEQID NO 18的脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶LgtA、具有SEQID NO 20的脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖苷基转移酶LgtB、来自智人的GDP-岩藻糖合酶GFUS(UniProt ID Q13630)、来自幽门螺旋杆菌的α-1，2-岩藻糖基转移酶HpFutC(SEQ ID NO 04)及来自幽门螺旋杆菌的α-1，3-岩藻糖基转移酶HpFucT(SEQ IDNO 05)。对于宿主细胞，使引入的所有基因经密码子最佳化。细胞以20,000个细胞/平方公分的密度接种于完整生长培养基中的经胶原蛋白涂布的培养瓶上，且在完整生长培养基中静置以黏附及扩增48小时，其后将该培养基换为完整泌乳培养基，持续约7天。如实施例54中所描述培养之后，细胞经受UPLC以分析包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT及LNFP-I的寡糖混合物的制造。
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Claims (89)

1.一种经代谢工程改造的细胞，其制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物，其中该细胞
-经代谢工程改造以用于制造该混合物，及
-表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶，及
-能够合成核苷酸-糖GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)，及
-表现至少一种额外糖基转移酶，及
-能够合成至少一种或多种核苷酸-糖，其中该至少一种或多种核苷酸-糖为用于该额外糖基转移酶的供体。
2.如权利要求1的细胞，其中该细胞经基因表现模组修饰，其中来自所述表现模组中的任一者的表现为持续型的或借由天然诱导物产生。
3.如权利要求1或2中任一项的细胞，其中该细胞包含编码一种蛋白质的相同编码DNA序列的多个复本。
4.如权利要求1至3中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同寡糖。
5.如权利要求1至4中任一项的细胞，其中该细胞制造至少五种，较佳至少六种，更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性岩藻糖基化寡糖。
6.如权利要求1至5中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者是选自包含以下者的清单：岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺(altrosamine)转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基(enolpyruvyl)转移酶及岩藻糖氨基转移酶，
-较佳地，该岩藻糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，
-较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，
-较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，
-较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基半乳糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶。
7.如权利要求1至6中任一项的细胞，其中该细胞能够表现，较佳表现所述额外糖基转移酶中的至少两者，更佳至少三者，甚至更佳至少四者，最佳至少五者。
8.如权利要求1至7中任一项的细胞，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
9.如权利要求1至8中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为岩藻糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)。
10.如权利要求1至9中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
11.如权利要求1至10中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
12.如权利要求1至11中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基半乳糖氨基转移酶，且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
13.如权利要求1至12中任一项的细胞，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基甘露糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
14.如权利要求1至13中任一项的细胞，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下者的清单：GDP-Fuc、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-阿拉伯糖(arabino)-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-来苏糖(lyxo)-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(pneumosamine)(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
15.如权利要求1至14中任一项的细胞，其中该细胞表现一或多种选自包含以下者的清单的多肽：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶，较佳其中该细胞在所述多肽中的任一者的表现或活性方面经修饰。
16.如权利要求1至15中任一项的细胞，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
17.如权利要求1至16中任一项的细胞，其中所述中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
18.如权利要求1至17中任一项的细胞，其中除所述四种中性岩藻糖基化寡糖以外，该寡糖混合物亦包含至少一种中性非岩藻糖基化寡糖。
19.如权利要求1至18中任一项的细胞，其中该中性寡糖混合物包含至少一种寡糖，该至少一种寡糖经岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
20.如权利要求1至19中任一项的细胞，其中该细胞使用至少一种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，所述前驱物自培养基馈至该细胞。
21.如权利要求1至20中任一项的细胞，其中该细胞制造至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物。
22.如权利要求1至21中任一项的细胞，其中该至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物完全转化为所述寡糖中的任一者。
23.如权利要求1至22中任一项的细胞，其中该细胞胞内制造所述寡糖，且其中所述所制造的寡糖的一部分或实质上全部保留在胞内，及/或经由被动或主动运输排出到该细胞外。
24.如权利要求1至23中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外分泌来自该混合物的所述中性寡糖中的任一者，较佳地其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所有所述中性寡糖。
25.如权利要求1至24中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性寡糖中的任一者的前驱物及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所需前驱物，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
26.如权利要求24或25中任一项的细胞，其中该膜蛋白是选自包含以下者的清单：搬运蛋白(porter)、P-P-键水解驱动的运输蛋白(transporter)、β-桶状孔蛋白、辅助运输蛋白(transport protein)、推定运输蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，
较佳地，所述搬运蛋白包含MFS运输蛋白、糖流出运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白，
较佳地，所述P-P-键水解驱动的运输蛋白包含ABC运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
27.如权利要求24至26中任一项的细胞，其中该膜蛋白提供改良的所述寡糖中的任一者的制造及/或能够实现及/或增强的所述寡糖中的任一者的流出。
28.如权利要求1至27中任一项的细胞，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。
29.如权利要求1至28中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
30.如权利要求29的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下者的蛋白质中的任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶(fuculokinase)、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶(phosphotransferase；PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷氧基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶(phosphoacyltransferase)、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
31.如权利要求1至30中任一项的细胞，其中该细胞能够制造磷酸烯醇丙酮酸盐(phosphoenolpyruvate；PEP)。
32.如权利要求1至31中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰以用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的制造及/或供应。
33.如权利要求1至32中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
34.如权利要求1至33中任一项的细胞，其中所有所述中性寡糖为哺乳动物乳寡糖。
35.如权利要求1至34中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的任一者为人类ABO血型系统的抗原。
36.如权利要求1至33及35中任一项的细胞，其中所述中性寡糖中的三者为人类ABO血型系统的抗原。
37.一种借由细胞且较佳为单一细胞制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供一种细胞，该细胞(a)能够表现，较佳表现为岩藻糖基转移酶的糖基转移酶，且能够合成该核苷酸-糖GDP-岩藻糖，及(b)表现至少一种额外糖基转移酶，及(c)能够合成至少一种或多种核苷酸-糖，其中所述核苷酸-糖为用于所述额外糖基转移酶的供体，及
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成所述核苷酸-糖的条件下培养该细胞，使得该细胞制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的该中性混合物，及
iii)较佳地，自该培养分离所述中性寡糖中的至少一者，更佳地，自该培养分离所有所述中性寡糖。
38.如权利要求37的方法，其中该细胞为如权利要求1至36中任一项的经代谢工程改造的细胞。
39.如权利要求38的方法，其中该细胞经基因表现模组修饰，其中来自所述表现模组中的任一者的表现为持续型的或借由天然诱导物产生。
40.如权利要求38或39中任一项的方法，其中该细胞包含编码一种蛋白质的相同编码DNA序列的多个复本。
41.如权利要求37至40中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同寡糖。
42.如权利要求37至41中任一项的方法，其中该细胞制造至少五种，较佳至少六种，更佳至少七种，最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性岩藻糖基化寡糖。
43.如权利要求37至42中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者是选自包含以下者的清单：岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶，
-较佳地，该岩藻糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，
-较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，
-较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，
-较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基半乳糖氨基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶及β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶。
44.如权利要求37至43中任一项的方法，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
45.如权利要求37至44中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为岩藻糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)。
46.如权利要求37至45中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
47.如权利要求37至46中任一项的方法，其中该额外糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
48.如权利要求37至47中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基半乳糖氨基转移酶，且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
49.如权利要求37至48中任一项的方法，其中所述额外糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基甘露糖氨基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的一者为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
50.如权利要求37至49中任一项的方法，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下者的清单：GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
51.如权利要求37至50中任一项的方法，其中该细胞表现一或多种选自包含以下者的清单的多肽：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶，较佳其中该细胞在所述多肽中的任一者的表现或活性方面经修饰。
52.如权利要求37至51中任一项的方法，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
53.如权利要求37至52中任一项的方法，其中所述中性岩藻糖基化寡糖中的至少一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
54.如权利要求37至53中任一项的方法，其中除所述四种中性岩藻糖基化寡糖以外，该寡糖混合物亦包含至少一种中性非岩藻糖基化寡糖。
55.如权利要求37至54中任一项的方法，其中该中性寡糖混合物包含至少一种寡糖，该至少一种寡糖经岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
56.如权利要求37至55中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于制造所述寡糖中的任一者或多者的前驱物，所述前驱物自培养基馈至该细胞。
57.如权利要求37至56中任一项的方法，其中该细胞制造至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物。
58.如权利要求37至57中任一项的方法，其中该至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物完全转化为所述寡糖中的任一者。
59.如权利要求37至58中任一项的方法，其中该细胞胞内制造所述寡糖，且其中所述所制造的寡糖的一部分或实质上全部保留在胞内，及/或经由被动或主动运输排出到该细胞外。
60.如权利要求37至59中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外分泌来自该混合物的所述中性寡糖中的任一者，较佳地其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所有所述中性寡糖。
61.如权利要求37至60中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源性膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源性膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性寡糖中的任一者的前驱物及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所需前驱物，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
62.如权利要求60或61中任一项的方法，其中该膜蛋白是选自包含以下者的清单：搬运蛋白、P-P-键水解驱动的运输蛋白、β-桶状孔蛋白、辅助运输蛋白、推定运输蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，
较佳地，所述搬运蛋白包含MFS运输蛋白、糖流出运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白，
较佳地，所述P-P-键水解驱动的运输蛋白包含ABC运输蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
63.如权利要求60至62中任一项的方法，其中该膜蛋白提供改良的所述寡糖中的任一者的制造及/或能够实现及/或增强的所述寡糖中的任一者的流出。
64.如权利要求37至63中任一项的方法，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。
65.如权利要求37至64中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
66.如权利要求65的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下者的蛋白质中的任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性移位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷氧基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
67.如权利要求37至66中任一项的方法，其中该细胞能够制造磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)。
68.如权利要求37至67中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰以用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的制造及/或供应。
69.如权利要求37至68中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
70.如权利要求37至69中任一项的方法，其中所有所述中性寡糖为哺乳动物乳寡糖。
71.如权利要求37至69中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的任一者为人类ABO血型系统的抗原。
72.如权利要求37至69及71中任一项的方法，其中所述中性寡糖中的三者为人类ABO血型系统的抗原。
73.如权利要求37至72中任一项的方法，其中所述条件包含：
-使用包含至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物及/或受体的培养基，及/或
-向该培养基添加至少一种用于制造所述寡糖中的任一者的前驱物及/或受体进料。
74.如权利要求37至73中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含至少一种前驱物及/或受体的培养基；
ii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍；
iii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍；且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱物及/或受体进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L，较佳至少75g/L，更佳至少90g/L，更佳至少100g/L，更佳至少125g/L，更佳至少150g/L，更佳至少175g/L，更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
75.如权利要求37至73中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)向该培养基添加包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍；
iii)向该培养基添加包含每公升初始反应器体积至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍，较佳不超过两倍，更佳小于两倍，且其中较佳地，该乳糖进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该乳糖进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L，较佳75g/L，更佳100g/L，更佳125g/L，更佳150g/L，更佳175g/L，更佳200g/L，更佳225g/L，更佳250g/L，更佳275g/L，更佳300g/L，更佳325g/L，更佳350g/L，更佳375g/L，更佳400g/L，更佳450g/L，更佳500g/L，甚至更佳550g/L，最佳600g/L，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L，较佳至少75g/L，更佳至少90g/L，更佳至少100g/L，更佳至少125g/L，更佳至少150g/L，更佳至少175g/L，更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
76.如权利要求75的方法，其中该乳糖进料是借由自该培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以＞300mM的浓度添加乳糖来实现。
77.如权利要求75或76中任一项的方法，其中该乳糖进料是借由以一浓度向该培养中添加乳糖来实现，该浓度使得在该培养的整个制造阶段中获得至少5mM，较佳10mM或30mM的乳糖浓度。
78.如权利要求37至77中任一项的方法，其中宿主细胞经培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
79.如权利要求37至78中任一项的方法，其中该细胞培养于包含碳源的培养基中，该碳源包含单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油、包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物的复合培养基中；较佳地，其中该碳源是选自包含以下者的清单：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽-寡糖、麦芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、茧蜜糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖浆、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐及丙酮酸盐。
80.如权利要求37至79中任一项的方法，其中该培养基含有至少一种选自包含以下者的群的前驱物：乳糖、半乳糖、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(lacto-N-biose；LNB)、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
81.如权利要求37至80中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由在将该前驱物，较佳乳糖在第二阶段中添加至该培养基之前将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至该培养基中来提供。
82.如权利要求37至81中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驱物，较佳乳糖的该培养基中来提供，之后为其中仅将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至该培养基的第二阶段。
83.如权利要求37至82中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驱物，较佳乳糖的该培养基中来提供，之后为其中将碳基基质，较佳葡萄糖或蔗糖，及前驱物，较佳乳糖添加至该培养基的第二阶段。
84.如权利要求37至83中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一者：澄清、超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效能过滤、切向流超过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
85.如权利要求37至84中任一项的方法，其进一步包含自该细胞纯化所述中性寡糖中的任一者。
86.如权利要求85的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换、使用醇、使用水醇混合物、结晶、蒸发、沉淀、干燥，喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(band drying)、带式干燥(belt drying)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
87.如权利要求1至36中任一项的细胞或如权利要求37至86中任一项的方法，其中该细胞为细菌、真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞或原虫细胞，
-较佳地，该细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，更佳为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655，
-较佳地，该真菌属于选自包含以下者的群的属：根霉菌属(Rhizopus)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)，
-较佳地，该酵母菌属于选自包含以下者的群的属：酵母菌属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉森酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、斯塔莫酵母属(Starmerella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，
-较佳地，该植物细胞为藻类细胞或衍生自烟草、苜蓿、稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，
-较佳地，该动物细胞衍生自非人类哺乳动物、鸟类、鱼类、无脊椎动物、爬行动物、两栖动物或昆虫，或为衍生自不包括胚胎干细胞的人类细胞的经遗传修饰的细胞系，更佳地该人类及非人类哺乳动物细胞为上皮细胞、胚胎肾细胞、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，更佳地该昆虫细胞衍生自斜纹夜盗虫(Spodoptera frugiperda)、家蚕(Bombyxmori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，
-较佳地，该原虫细胞为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
88.如权利要求87的细胞或如权利要求87的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞为存活的革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacterium)，该细菌包含减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG)、肠内菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen；ECA)、纤维素、可拉酸(colanic acid)、核寡糖、渗透调节周质葡聚糖(Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或茧蜜糖。
89.一种如权利要求1至36、87、88中任一项的细胞或如权利要求37至88中任一项的方法的用途，其用于制造至少四种不同中性岩藻糖基化寡糖的中性混合物。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113652385B (zh) * 2021-08-06 2023-10-03 江南大学 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
WO2023168441A1 (en) * 2022-03-04 2023-09-07 The Regents Of The University Of California Production of milk oligosaccharides in plants
WO2023182527A1 (ja) * 2022-03-25 2023-09-28 キリンホールディングス株式会社 ラクトジフコテトラオース（ｌｄｆｔ）の製造法
WO2023209098A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Dsm Ip Assets B.V. Hmo producing microorganism with increased robustness towards glucose gradients
DK202200561A1 (en) * 2022-06-13 2024-02-14 Dsm Ip Assets Bv Sigma factor modifications for biosynthetic production
DK202200588A1 (en) 2022-06-20 2024-02-23 Dsm Ip Assets Bv Mixture of fucosylated HMOs
WO2024003223A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Inbiose N.V. Fucosylated saccharide for use in the prevention or treatment of parasitic disease
WO2024003222A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Inbiose N.V. Fucosylated saccharide for use in the prevention or treatment of bacterial disease
WO2024017987A1 (en) 2022-07-20 2024-01-25 Inbiose N.V. Production of oligosaccharides in host cells
WO2024047096A1 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Inbiose N.V. Process for purification of an oligosaccharide
WO2024089131A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Inbiose N.V. Saccharide importers for lacto-n-triose

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991016449A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
AU675209B2 (en) * 1991-10-15 1997-01-30 Scripps Research Institute, The Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of GDP-fucose
AU773845B2 (en) * 1998-11-18 2004-06-10 Neose Technologies, Inc. Low cost manufacture of oligosaccharides
FR2796082B1 (fr) * 1999-07-07 2003-06-27 Centre Nat Rech Scient Procede de production d'oligosaccharides
MXPA04012978A (es) 2002-07-01 2005-09-12 Arkion Life Sciences Llc D B A Proceso y material para la produccion de glucosamina y n-acetilglucosamina.
JP4264742B2 (ja) 2004-06-03 2009-05-20 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 ラクトｎビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体
US20080145899A1 (en) * 2004-09-17 2008-06-19 Neose Technologies Inc Production of Oligosaccharides By Microorganisms
EP1991690B1 (en) 2006-03-09 2014-01-15 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Method of producing sialylated oligosaccharides
US8361756B2 (en) 2006-09-15 2013-01-29 The Regents Of The University Of California Bifidobacterial gene sequences and their use
JP4915917B2 (ja) 2006-12-22 2012-04-11 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 ラクト−ｎ−ビオースｉ及びガラクト−ｎ−ビオースの製造方法
CN113736721A (zh) 2010-07-12 2021-12-03 因比奥斯公司 用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物
AU2012257395A1 (en) * 2011-05-13 2013-12-12 Glycom A/S Method for generating human milk oligosaccharides (HMOs) or precursors thereof
WO2012168495A1 (es) * 2011-06-07 2012-12-13 Hero Ag Obtención de oligosacaridos mediante un procedimiento biotecnológico
JP5800741B2 (ja) 2012-03-27 2015-10-28 森永乳業株式会社 ラクト−ｎ−ビオースｉの製造方法
US9029136B2 (en) 2012-07-25 2015-05-12 Glycosyn LLC Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides
DK3467100T3 (da) * 2013-03-14 2022-11-14 Glycosyn LLC Mikroorganismer og fremgangsmåder til fremstilling af sialylerede og n-acetylglucosamin-holdige oligosaccharider
US20140273103A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Glycobia, Inc. Polysialic acid, blood group antigens and glycoprotein expression in prokaryotes
EP2927316B1 (en) * 2014-03-31 2018-11-07 Jennewein Biotechnologie GmbH Total fermentation of oligosaccharides
WO2015175801A1 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 Glycosyn LLC Alpha (1,2) fucosyltransferase syngenes for use in the production of fucosylated oligosaccharides
WO2015197082A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Glycom A/S Oligosaccharide production
WO2016063262A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Glycom A/S MIXTURES OF HMOs
CA2958786A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Universiteit Gent Mutant microorganisms resistant to lactose killing
US10829508B2 (en) * 2015-12-18 2020-11-10 Glycom A/S Fermentative production of oligosaccharides
JP6771756B2 (ja) 2016-04-26 2020-10-21 国立大学法人 和歌山大学 β−ガラクトシダーゼ
EP3315610B1 (en) * 2016-10-29 2020-12-16 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for the production of fucosylated oligosaccharides
RU2019117393A (ru) 2016-12-27 2020-12-07 Инбиоз Н.В. Синтез сиалированных соединений in vivo
EP3425052A1 (en) * 2017-07-07 2019-01-09 Jennewein Biotechnologie GmbH Fucosyltransferases and their use in producing fucosylated oligosaccharides
EP3658678A1 (en) * 2017-07-26 2020-06-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Sialyltransferases and their use in producing sialylated oligosaccharides
EP3569713A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-20 Jennewein Biotechnologie GmbH Use of glycosidases in the production of oligosaccharides
EP3702468A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-02 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentative production of carbohydrates by microbial cells utilizing a mixed feedstock
EP3751003A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-16 Jennewein Biotechnologie GmbH Production of fucosylated oligosaccharides in bacillus
EP4038178A4 (en) 2019-10-03 2023-11-01 TurtleTree Labs Pte. Ltd. NUTRIENT COMPOSITIONS AND METHODS, KITS AND CELLULAR COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION THEREOF
CN110527704B (zh) 2019-10-31 2020-03-13 烟台华康荣赞生物科技有限公司 一种合成乳-n-二糖的方法

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