CN116096912A - 借由细胞生产中性未岩藻糖化寡糖的混合物 - Google Patents

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Abstract

本发明处于合成生物学及代谢工程改造的技术领域。更特定言之，本发明处于代谢上经工程改造的细胞的培养或发酵的技术领域。本发明描述一种代谢上经工程改造以用于生产至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的细胞。此外，本发明提供一种用于借由细胞生产至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物以及自培养纯化所述寡糖中的至少一种的方法。

Description

借由细胞生产中性未岩藻糖化寡糖的混合物
本发明处于合成生物学及代谢工程改造的技术领域。更特定言之，本发明处于代谢上经工程改造的细胞的培养或发酵的技术领域。本发明描述一种代谢上经工程改造以用于生产至少四种不同中性未岩藻糖化(non-fucosylated)寡糖的混合物的细胞。此外，本发明提供一种用于借由细胞生产至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物以及自培养纯化所述寡糖中的至少一种的方法。
背景技术
常常以与蛋白质及脂质的糖结合形式存在的寡糖参与许多生命现象，诸如与受精、胚胎发生、发炎、癌转移及宿主病原体黏附的发生及进展相关的分化、发育及生物识别过程。寡糖亦可以未结合聚糖形式存在于体液及人乳中，其中寡糖亦调节重要的发育及免疫过程(Bode,Early Hum.Dev.1-4(2015)；Reily等人，Nat.Rev.Nephrol.15,346-366(2019)；Varki,Glycobiology 27,3-49(2017))。由于寡糖的广泛功能谱，对寡糖混合物存在巨大科学及商业关注。然而，寡糖混合物的可用性受到限制，因为生产依赖于化学或化学酶促合成或依赖于自天然来源诸如动物乳汁的纯化。化学合成方法为费力且耗时的，且由于所涉及的大量步骤，所述方法难以扩大规模。使用糖基转移酶(glycosyltransferase)的酶促途径提供优于化学合成的许多优势。糖基转移酶催化糖部分自活化核苷酸-糖供体转移至糖或非糖受体上(Coutinho等人，J.Mol.Biol.328(2003)307-317)。此等糖基转移酶为生物技术人员合成寡糖的来源且用于(化学)酶促途径以及基于细胞的生产系统中。然而，糖基转移酶的立体特异性及区位选择性仍为难对付的挑战。另外，化学酶促途径需要原位再生核苷酸-糖供体。寡糖的细胞生产需要严格控制足够水准的核苷酸-糖供体在互补糖基转移酶附近的时空可用性。由于此等困难，当前方法通常使得合成单一寡糖而非寡糖混合物。
本发明的一目标为提供工具及方法，借助于所述工具及方法，包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的寡糖混合物可以高效、时间效益及成本效益的方式且视需要以连续制程借由细胞、较佳单个细胞产生。
根据本发明，此目标及其他目标借由提供用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的寡糖混合物的细胞及方法来达成，其中该细胞经遗传修饰以用于生产所述寡糖。
发明内容
出人意料地，现已发现，有可能借由单个细胞生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的寡糖混合物。本发明提供一种代谢上经工程改造的细胞及一种用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的寡糖混合物的方法。该方法包含以下步骤：提供表现至少两种糖基转移酶且能够合成(a)作为用于所述糖基转移酶的供体的核苷酸-糖的细胞；在容许生产该寡糖混合物的条件下培养该细胞。本发明亦提供自中性未岩藻糖化寡糖混合物分离所述寡糖中的至少一种、较佳全部的方法。此外，本发明提供一种代谢上经工程改造以用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的寡糖混合物的细胞。
定义
用于本说明书中以描述本发明的字组及其各种具体实例应不仅以其通常所定义含义的意义来理解，而且应包括在通常所定义含义的范畴以外的在本说明书中特定定义的结构、材料或作用。因此，若元件在本说明书的上下文中可理解为包括多于一个含义，则其在申请专利范围中的使用必须理解为由本说明书及字组自身支援的一般至所有可能含义。
本文所揭示的本发明的各种具体实例及具体实例的态样应不仅以本说明书中特定描述的次序及情形来理解，而且包括任何次序及其任何组合。每当情形需要时，将认为以单数形式使用的所有字组包括复数形式，且反的亦然。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语一般具有与本发明所属技术领域中具有通常知识者通常所理解相同的含义。一般而言，本文所使用的命名法及本文所描述的细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合为所属领域中熟知且常用的命名法、细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合。使用标准技术进行核酸及肽合成。一般而言，纯化步骤是根据制造商说明书进行。
在本说明书中，已揭示本发明的具体实例，且尽管采用特定术语，但所述术语仅以描述性意义使用且并非出于限制本发明的范围的目的，本发明的范围阐述于以下申请专利范围中。必须理解，已仅出于示例的目的阐述所说明的具体实例，且不应视为限制本发明。熟习此项技术者将显而易见，改变、其他具体实例、改良、细节及用途可根据本文中本发明的文字及精神且在本发明的范围内进行，本发明的范围仅由权利要求书限制，根据包括等同原则的专利法予以解释。在以下申请专利范围中，仅为便于描述，提供用以指明申请专利范围步骤的参考字元，且所述参考字元并不意欲暗示用于执行所述步骤的任何特定次序。
在此文件及其申请专利范围中，动词「包含(to comprise)」及其词形变化形式以其非限制性意义使用，意谓包括该字组之后的项目，但不排除未具体提及的项目。在整个申请案中，动词「包含(to comprise)」可由「由……组成(to consist)」或「基本上由……组成(to consist essentially of)」替换，且反的亦然。另外，动词「由……组成」可由「基本上由……组成」替换，意谓如本文所定义的组成物可包含除具体鉴别的组分外的(多种)额外组分，所述额外组分不改变本发明的独特特征。另外，除非上下文明确要求存在一个元件且仅存在一个元件，否则借由不定冠词「一(a/an)」提及一元件并不排除存在多于一个元件的可能性。因此不定冠词「一」通常意谓「至少一个(at least one)」。在整个申请案中，除非另外明确陈述，否则冠词「一(a及an)」较佳由「至少两个(at least two)」置换，更佳由「至少三个(at least three)」置换，甚至更佳由「至少四个(at least four)」置换，甚至更佳由「至少五个(at least five)」置换，甚至更佳由「至少六个(at least six)」置换，最佳由「至少七个(at least seven)」置换。
除非另外指示，否则如本文中鉴别的各具体实例可组合在一起。本说明书中所提及的所有公开案、专利及专利申请案均以引用的方式并入本文中，其引用程度如同特定及个别地指示将各个别公开案、专利或专利申请案以引用的方式并入一般。优先权申请案，包括EP20190198、EP20190200、EP20190203、EP20190204及EP20190205的全部内容，亦以引用的方式并入本文中，其引用程度如同特定及个别地指示将所述优先权申请案以引用的方式并入一般。
根据本发明，术语「聚核苷酸(polynucleotide)」一般是指可为未修饰RNA或DNA或经修饰RNA或DNA的任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸。「聚核苷酸」包括(但不限于)单股及双股DNA；为单股及双股区或单股、双股及三股区的混合物的DNA；单股及双股RNA；及为单股及双股区的混合物的RNA；包含可为单股或更通常双股或三股区、或单股及双股区的混合物的DNA及RNA的杂合分子。另外，如本文所用，术语「聚核苷酸」系指包含RNA或DNA或RNA及DNA两者的三股区。此类区中的股可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包括所述分子中的一或多者的全部，但更通常仅涉及具有所述分子中的一些的区。三螺旋区的分子中的一个常为寡核苷酸。如本文所用，术语「聚核苷酸」亦包括含有一或多个经修饰碱基的如上文所描述的DNA或RNA。因此，具有出于稳定性或出于其他原因进行修饰的主链的DNA或RNA为根据本发明的「聚核苷酸」。此外，包含不常见碱基(诸如肌苷)或经修饰碱基(诸如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA应理解为由术语「聚核苷酸」覆盖。应了解，已对DNA及RNA进行多种修饰，此用于所属技术领域中具有通常知识者已知的许多适用目的。术语「聚核苷酸」在本文使用时涵盖此类经化学、酶促或代谢修饰的形式的聚核苷酸，以及病毒及细胞(包括(例如)简单及复杂细胞)所特有的DNA及RNA的化学形式。语「聚核苷酸」亦涵盖通常称为寡核苷酸的短聚核苷酸。
「多肽(polypeptide)」是指包含两个或更多个借由肽键或经修饰肽键彼此接合的氨基酸的任何肽或蛋白质。「多肽」是指短链(通常称为肽、寡肽及寡聚物)及长链(通常称为蛋白质)。多肽可含有除20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。「多肽」包括借由自然过程(诸如加工及其他转译后修饰)以及借由化学修饰技术修饰的多肽。此类修饰充分描述于基本文本及更详细的专论中以及大量研究文献中，且其为所属技术领域中具有通常知识者所熟知。相同类型的修饰可在既定多肽中若干位点处以相同或不同程度存在。此外，既定多肽可含有多种类型的修饰。修饰可出现在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链及胺基端或羧基端。修饰包括例如：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血基质部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酸肌醇的共价连接、交联、环化、双硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、焦麸氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、脂质连接、硫酸化、麸氨酸残基的γ-羧化、羟基化及ADP-核糖基化、硒化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(诸如精胺酰化)及泛素化。多肽可为分支链的或在存在或不存在分支情况下为环状的。环状、分支链及分支链环状多肽可由转译后自然过程产生，且亦可借由完全合成方法制备。
如本文所用，术语「编码多肽的聚核苷酸(polynucleotide encoding apolypeptide)」涵盖包括编码本发明多肽的序列的聚核苷酸。术语亦涵盖如下聚核苷酸，其包括编码多肽的单个连续区或非连续区(例如间杂有整合噬菌体或插入序列或编辑)以及亦可含有编码序列及/或非编码序列的其他区。
「经分离(isolated)」意谓自天然状态「人工(by the hand of man)」改变，亦即若其存在于自然界中，则其自其原始环境改变或移除或两者。举例而言，天然存在于活生物体中的聚核苷酸或多肽未「经分离」，但与其天然状态的共存物质分离的相同聚核苷酸或多肽「经分离」，如该术语在本文中所用。类似地，如本文所用的术语「合成(synthetic)」序列意谓已以合成方式产生且不直接自天然来源分离的任何序列。如本文所用的术语「合成」意谓任何合成产生的序列且不直接自天然来源分离。
如本文中提及细胞或宿主细胞所用，术语「重组(recombinant)」或「转基因(transgenic)」或「经遗传修饰(genetically modified)」可互换使用，且指示细胞复制异源核酸，或表现由异源核酸(亦即，「对该细胞外来(foreign to said cell)」的序列或「对该细胞中的该位置或环境外来(foreign to said location or environment in saidcell)」的序列)编码的肽或蛋白质。此类细胞描述为经至少一种异源或外源基因转形，或描述为借由引入至少一种异源或外源基因转形。代谢上经工程改造或重组或转基因细胞可含有在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因。重组细胞亦可含有天然形式的细胞中所发现的基因，其中基因借由人工手段修饰且再引入至细胞中。所述术语亦涵盖含有对于细胞而言内源的核酸的细胞，该核酸已经修饰或其表现或活性已经修饰而无需自该细胞移除该核酸；此类修饰包括借由基因置换、启动子置换；位点特异性突变；及相关技术获得的修饰。相应地，「重组多肽(recombinant polypeptide)」系借由重组细胞产生的多肽。如本文所用，「异源序列(heterologous sequence)」或「异源核酸(heterologous nucleic acid)」是源自对特定细胞而言外来的来源(例如来自不同物种)，或若来自相同来源则自其原始形式或基因体中的位置进行修饰的序列或核酸。因此，与启动子可操作地连接的异源核酸系来自与衍生启动子的来源不同的来源，或若来自相同来源，则自其原始形式或基因体中的位置进行修饰。异源序列可例如借由转染、转形、结合或转导稳定引入至宿主微生物细胞的基因体中，其中可视细胞及待引入的序列而定来应用技术。各种技术为所属领域中具有通常知识者所已知且例如揭示于Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中。如在本发明的上下文中所用的术语「突变(mutant)」细胞或微生物是指经遗传修饰的细胞或微生物。
在本发明的上下文内，术语「内源(endogenous)」是指任何作为细胞的天然部分且存在于其在细胞染色体中的天然位置处且与作用于其表现的天然控制机制相比，表现的控制尚未改变的聚核苷酸、多肽或蛋白质序列。术语「外源(exogenous)」是指任何来源于研究下的细胞的外部且不来源于细胞的天然部分或不存在于其在细胞染色体或质体中的天然位置处的聚核苷酸、多肽或蛋白质序列。
当提及聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶使用时，术语「异源」是指来自宿主生物体物种的外的源或源自宿主生物体物种的外的源的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相比之下，本文使用「同源」聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶指示源自宿主生物体物种的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。当提及用于维持或操纵基因序列的基因调节序列或辅助核酸序列(例如，启动子、5'非转译区、3'非转译区、聚A添加序列、内含子序列、剪接位点、核糖体结合位点、内部核糖体进入序列、基因体同源区、重组位点等)时，「异源」意谓调节序列或辅助序列不与该调节或辅助核酸序列在构筑体、基因体、染色体或游离基因体中与其并置的基因天然相关。因此，可操作地连接于在自然状态下(亦即以非基因工程改造生物体的基因体形式)不可与启动子操作连接的基因的启动子在本文中称为「异源启动子(heterologouspromoter)」，即使该启动子可源自与其连接的基因相同的物种(或在一些情况下，源自相同的生物体)。
术语蛋白质或酶的「经修饰活性(modified activity)」与蛋白质或酶的活性相比于该蛋白质或酶的野生型(亦即天然)活性的变化有关。该经修饰活性可为与蛋白质或酶的野生型活性相比，该蛋白质或酶的消除、减弱、降低或延迟的活性，但亦可为与蛋白质或酶的野生型活性相比，该蛋白质或酶的加速或增强的活性。蛋白质或酶的经修饰活性借由该蛋白质或酶的经修饰表现获得或借由蛋白质或酶的经修饰(亦即突变)形式的表现获得。酶的经修饰活性进一步关于酶的表观米氏常数(apparent Michaelis constant)Km及/或表观最大速度(Vmax)的修饰。
术语基因的「经修饰表现(modified expression)」是关于与在经编码蛋白质的生产过程的任何阶段中该基因的野生型表现相比的表现的变化。该经修饰表现相比于野生型为较低或较高表现，其中在内源基因的情况下，术语「较高表现(higher expression)」亦定义为该基因的「过度表现(overexpression)」，或在野生型菌株中不存在的异源基因的情况下，定义为「表现(expression)」。较低表现或减少的表现是借助于所属技术领域中具有通常知识者的常见熟知技术获得(诸如使用siRNA、CrispR、CrispRi、核糖开关、重组工程、同源重组、ssDNA突变诱发、RNAi、miRNA、asRNA、突变基因、剔除基因、转位子突变诱发、……)，所述技术用于以使得基因不太能够(亦即与功能性野生型基因相比统计上显著『不太能够』)或完全不能(诸如剔除基因)产生功能性最终产物的方式改变基因。如本文所用的术语「核糖开关(riboswitch)」定义为信使RNA的一部分，该信使RNA折叠成借由干扰转译而阻断表现的错综结构。效应分子的结合诱导构形变化，允许转录后的调节表现。随后以使得如上文所描述获得较低表现的方式改变所关注的基因，亦可借由改变转录单元、启动子、非转译区、核糖体结合位点、夏因达尔加诺(Shine Dalgarno)序列或转录终止子获得较低表现。较低表现或减少的表现可例如借由使启动子序列中的一或多个碱基对突变或将启动子序列完全改为具有与野生型相比更低的表现强度的持续性(constitutive)启动子或引起经调节的表现的可诱导型启动子或引起经调节的表现的可抑制型启动子来获得。过度表现或表现是借助于所属技术领域中具有通常知识者的常见熟知技术获得(诸如使用人工转录因子、重新设计启动子序列、核糖体工程改造、在真染色质处引入或再引入表现模组、使用高复本数的质体)，其中该基因为「表现卡匣(expression cassette)」的一部分，该表现卡匣是关于其中存在启动子序列、非转译区序列(含有核糖体结合序列、夏因达尔加诺(ShineDalgarno)或科札克(Kozak)序列)、编码序列及视需要的转译终止子且引起功能性活性蛋白质的表现的任何序列。该表现为持续性或调节性的。
术语「持续性表现(constitutive expression)」定义为在某些生长条件下不受除RNA聚合酶的亚单元以外的转录因子(例如，如σ70、σ54的细菌σ因子或相关σ因子；及与RNA聚合酶核心酶共缔合的酵母粒线体RNA聚合酶特异性因子MTF1)调节的表现。此类转录因子的非限制性实例为大肠杆菌中的CRP、LacI、ArcA、Cra、IclR，或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的Aft2p、Crz1p、Skn7，或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的DeoR、GntR、Fur。此等转录因子结合于特异性序列上且可阻断或增强在某些生长条件下的表现。RNA聚合酶为用于自DNA模板合成RNA的催化机构。RNA聚合酶结合特异性序列以例如经由原核宿主中的σ因子或经由酵母中的MTF1使转录起始。持续性表现在不需要诱导或抑制的情况下提供恒定表现量。
术语「借由天然诱导剂的表现(expression by a natural inducer)」定义为仅在宿主的某一天然条件(例如生物体在分娩中或在泌乳期间)下表现的基因的兼性或调节表现，作为对环境变化(例如包括(但不限于)激素、热、冷、光、氧化或渗透应激/信号传导)的反应，或取决于发育阶段的位置或该宿主细胞的细胞周期，包括(但不限于)细胞凋亡及自体吞噬。
术语「控制序列(control sequence)」是指借由细胞转录及转译系统识别的序列，允许聚核苷酸序列转录及转译成多肽。此类DNA序列因此为在特定细胞或生物体中表现可操作地连接的编码序列所必需的。此类控制序列可为(但不限于)启动子序列、核糖体结合序列、夏因达尔加诺序列、科札克序列、转录终止子序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、视需要的操纵序列及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号及强化子。若前序列或分泌性前导序列的DNA表现为参与多肽分泌的前蛋白，则其可与该多肽的DNA可操作地连接；若启动子或强化子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点经定位以便有助于转译，则其与编码序列可操作地连接。所述控制序列可另外经外部化学物质，诸如(但不限于)IPTG、阿拉伯糖(arabinose)、乳糖、别乳糖(allo-lactose)、鼠李糖或岩藻糖(fucose)经由诱导型启动子或经由诱导或抑制该聚核苷酸转录或转译成多肽的基因电路控制。
一般而言，「可操作地连接(operably linked)」意谓所连接的DNA序列为连续的且在分泌性前导序列的情况下，为连续的且处于阅读阶段(reading phase)。然而，强化子不必为连续的。
术语「野生型(wild type)」是指其在自然界中存在时通常已知的遗传或表型情况。
如本文所用的术语「蛋白质的经修饰表现(modified expression of aprotein)」是指与野生型(亦即天然)蛋白质相比，i)内源蛋白的较高表现或过度表现，ii)异源蛋白的表现或iii)具有较高活性的变异蛋白的表现及/或过度表现。
如本文所用，术语「乳腺细胞(mammary cell)」大体上是指乳腺上皮细胞、乳腺上皮管腔细胞或哺乳动物上皮肺泡细胞或其任何组合。如本文所用，术语「乳腺样细胞(mammary-like cell)」大体上是指具有类似于(或实质上类似于)天然乳腺细胞但衍生自非乳腺细胞来源的表型/基因型的细胞。此类乳腺样细胞可经工程改造以移除至少一个非所需遗传组件及/或包括乳腺细胞所特有的至少一个预定遗传构筑体。乳腺样细胞的非限制性实例可包括乳腺上皮样细胞、乳腺上皮管腔样细胞、呈现乳腺细胞谱系的细胞的一或多个特征的非乳腺细胞或其任何组合。乳腺样细胞的其他非限制性实例可包括具有与天然乳腺细胞类似(或实质上类似)的表型，或更特定言之与天然乳腺上皮细胞类似(或实质上类似)的表型的细胞。具有表型或展现至少一种与天然乳腺细胞或乳腺上皮细胞类似(或实质上与其类似)的特征的细胞可包含展现天然或已经工程改造以能够表现至少一种乳汁组分的细胞(例如衍生于乳腺细胞谱系或非乳腺细胞谱系)。
如本文所用，术语「非乳腺细胞(non-mammary cell)」一般可包括任何非乳腺谱系的细胞。在本发明的上下文中，非乳腺细胞可为能够经工程改造以表现至少一种乳汁组分的任何哺乳动物细胞。此类非乳腺细胞的非限制性实例包括肝细胞、血球、肾细胞、脐带血细胞、上皮细胞、表皮细胞、肌细胞、纤维母细胞、间叶细胞或其任何组合。在一些情况下，分子生物学及基因体编辑技术可经工程改造以同时消除、沉默或减弱无数基因。
在整个本申请案中，除非另外明确地陈述，否则表述「能够……<动词>(capableof…<verb>)」及「能够……<动词>(capable to…<verb>)」较佳地用该动词的主动语态替换，且反之亦然。举例而言，表述「能够表现(capable of expressing)」较佳地用「表现(express)」替换，且反之亦然，亦即「表现」较佳地用「能够表现」替换。
如本文所用，术语「变异体(variant)」为分别与参考聚核苷酸或多肽不同但保持基本特性的聚核苷酸或多肽。聚核苷酸的典型变异体与另一参考聚核苷酸在核苷酸序列方面不同。变异体的核苷酸序列的变化可能会或可能不会改变由参考聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所论述，核苷酸变化可能在参考序列编码的多肽中引起氨基酸取代、添加、缺失、融合及截断。多肽的典型变异体与另一参考多肽在氨基酸序列方面不同。通常，差异是有限的，以致参考多肽的序列与变异体的序列总体上十分相似且在许多区中一致。借由呈任何组合的一或多个取代、添加、缺失，变异体与参考多肽可在氨基酸序列方面不同。取代或插入的氨基酸残基可为或可不为由遗传密码编码的残基。聚核苷酸或多肽的变异体可为天然产生的，诸如对偶基因变异体，或其可为未已知为天然产生的变异体。聚核苷酸及多肽的非天然产生变异体可借由突变诱发技术、借由直接合成及借由所属领域中具有通常知识者已知的其他重组方法制得。
如本文所用，术语多肽的「衍生物(derivative)」是可在多肽的氨基酸序列内含有氨基酸残基的缺失、添加或取代，但引起沉默变化，由此产生功能上等效的多肽的多肽。氨基酸取代可基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性及/或两亲媒性性质的类似性进行。举例而言，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、白氨酸、异白氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；平面中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及麸酰胺酸；带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、离氨酸及组氨酸；且带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及麸氨酸。在本发明的上下文内，如本文所用的衍生物多肽是指能够展现与原始多肽在试管内及/或活体内活性方面实质上类似的多肽，如借由多种标准(包括(但不限于)酶活性)中的任一者所判定，且其可在转译期间或转译之后差异修饰。此外，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物以取代或添加形式引入至原始多肽序列中。
在一些具体实例中，本发明涵盖借由修饰如本发明中所用的酶的结构来制备功能变异体。变异体可借由氨基酸取代、缺失、添加或其组合产生。举例而言，可合理地预期，白氨酸用异白氨酸或缬氨酸的独立置换、天冬氨酸用麸氨酸的独立置换、苏氨酸用丝氨酸的独立置换或氨基酸用结构上相关的氨基酸的类似置换(例如保守突变)不会对所得分子的生物活性产生重大影响。保守置换为在侧链相关的氨基酸家族内发生的置换。本发明多肽的氨基酸序列变化是否产生功能同源物可容易地借由评定变异体多肽以类似于野生型多肽的方式在细胞中产生反应的能力来测定。
如本文所用的术语「功能同源物(functional homolog)」描述具有序列相似性(换言之，同源性)且亦共有至少一种功能性特征(诸如生物化学活性)的彼等分子(Altenhoff等人，PLoS Comput.Biol.8(2012)e1002514)。功能同源物典型地将产生类似但未必相同程度的相同特征。功能上同源的蛋白质产生相同特征，其中借由一种同源物产生的定量量测值为另一者的至少10％；更典型地，为由原始分子产生的定量量测值的至少20％，在约30％与约40％之间；例如在约50％与约60％之间；在约70％与约80％之间；或在约90％与约95％之间；在约98％与约100％之间，或大于100％。因此，在分子具有酶活性的情况下，功能同源物将具有与原始酶相比以上所列举的酶活性百分比。在分子为DNA结合分子(例如多肽)的情况下，与原始分子相比，如借由结合分子的重量所量测，同源物将具有结合亲和力的以上所列举百分比。
功能同源物及参考多肽可为天然存在的多肽，且序列相似性可归因于趋同或趋异进化事件。功能同源物有时被称为异种同源物，其中「异种同源物(ortholog)」是指作为另一物种中所参考的基因或蛋白质的功能等效物的同源基因或蛋白质。
异种同源基因为借由最后共同祖先的单一基因的垂直传递产生的不同物种中的同源基因，其中基因及其主要功能为保守性的。同源基因为由共同祖先在两个物种中遗传的基因。
当参考来自给定物种的氨基酸或核苷酸/核酸序列使用时，术语「异种同源物」是指来自不同物种的相同氨基酸或核苷酸/核酸序列。应理解，两个序列在其经由线性传递衍生自共同祖先序列时为彼此的异种同源物，及/或就其序列及其生物功能两者而言在其他方面为紧密相关的。异种同源物通常将具有高度序列一致性但可能不(且通常将不)共有100％序列一致性。
同种同源基因为借由基因复制事件产生的同源基因。同种同源基因通常属于相同物种，但此并非必需的。同种同源物可分裂成同种内同源物(in-paralog)(在物种形成事件之后出现的同种同源对)及同种外同源物(out-paralog)(在物种形成事件之前出现的同种同源对)。在物种之间，同种外同源物为由于在物种形成之前复制而存在于两个生物体之间的同种同源物对。在物种内，同种外同源物为存在于同一生物体中但其复制事件发生在物种形成之后的同种同源物对。同种同源物典型地具有相同或类似功能。
可借由分析核苷酸及多肽序列比对来鉴别功能同源物。举例而言，对核苷酸或多肽序列的数据库执行查询可鉴别所关注多肽的同源物，如例如生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸-活化糖合成的蛋白质或膜蛋白。序列分析可涉及分别使用生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸-活化糖合成的蛋白质或膜蛋白的氨基酸序列作为参考序列对非冗余数据库的BLAST、Reciprocal BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列是自核苷酸序列推导出。典型地，数据库中具有超过40％序列一致性的彼等多肽为进一步评估是否适合分别作为生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸-活化糖合成的蛋白质或膜转运蛋白的候选物。氨基酸序列相似性允许保守氨基酸取代，诸如一个疏水性残基经另一疏水性残基取代或一个极性残基经另一极性残基取代或一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代或一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代等。较佳地，借由保守取代，意指以下组合，诸如甘氨酸借由丙氨酸取代，且反之亦然；缬氨酸、异白氨酸及白氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；天冬氨酸借由麸氨酸取代，且反之亦然；天冬酰胺借由麸酰胺酸取代，且反之亦然；丝氨酸借由苏氨酸取代，且反之亦然；离氨酸借由精氨酸取代，且反之亦然；半胱氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；及苯丙氨酸及酪氨酸借由色氨酸取代，且反之亦然。视需要，可进行此类候选物的人工检验以便限制待进一步评估的候选物的数目。人工检验可借由选择似乎具有存在于生产力调节多肽中的域(例如保守功能域)的彼等候选物来进行。
就聚核苷酸而言，「片段(Fragment)」是指纯系(clone)或聚核苷酸分子的任何部分，尤其保留全长聚核苷酸分子的可用功能特征的聚核苷酸的一部分。有用片段包括可用于杂合或扩增技术或用于调节复制、转录或转译的寡核苷酸及聚核苷酸。「聚核苷酸片段(polynucleotide fragment)」是指聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的任何子序列，其典型地包含本文所提供的聚核苷酸序列中的任一者的至少约9、10、11、12个连续核苷酸或由其组成，例如至少约30个核苷酸或至少约50个核苷酸。例示性片段可另外或替代地包括包含编码多肽的保守性家族域的区、基本上由其组成或由其组成的片段。例示性片段可另外或替代地包括包含多肽的保守域的片段。因此，聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段较佳意谓包含该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)或由其组成的核苷酸序列，其中不超过200、150、100、50或25个连续核苷酸缺失，较佳不超过50个连续核苷酸缺失，且该核苷酸序列保留可借由所属技术领域中具有通常知识者经由常规实验评定的全长聚核苷酸分子的可用功能特征(例如活性)。或者，聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段较佳意谓一种核苷酸序列，其包含来自该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的一定量的连续核苷酸或由其组成，且其中该一定量的连续核苷酸为该聚核苷酸SEQ ID NO(或GenbankNO.)的全长的至少50.0％、60.0％、70.0％、80.0％、81.0％、82.0％、83.0％、84.0％、85.0％、86.0％、87.0％、88.0％、89.0％、90.0％、91.0％、92.0％、93.0％、94.0％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、100％，较佳至少80％、更佳至少87％、甚至更佳至少90％、甚至更佳至少95％、最佳至少97％且保留全长聚核苷酸分子的可用功能特征(例如活性)。因此，聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段较佳意谓包含该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)或由其组成的核苷酸序列，其中一定量的连续核苷酸缺失且其中该量不超过该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的全长的50.0％、40.0％、30.0％，较佳不超过该聚核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的全长的20.0％、15.0％、10.0％、9.0％、8.0％、7.0％、6.0％、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.0％、0.5％，更佳不超过15％、甚至更佳不超过10％、甚至更佳不超过5％、最佳不超过2.5％，且其中该片段保留可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的全长聚核苷酸分子的可用功能特征(例如活性)。
在整个申请案中，聚核苷酸序列可由SEQ ID NO或可替代地由GenBank NO表示。因此，除非另外明确陈述，否则术语「聚核苷酸SEQ ID NO(polynucleotide SEQ ID NO)」及「聚核苷酸GenBank NO.(polynucleotide GenBank NO.)」可互换使用。
片段可另外或可替代地包括多肽及蛋白质分子的子序列，或多肽的子序列。在一些情况下，片段或域为多肽的子序列，其按与完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似程度执行完整多肽的至少一种生物功能。如本文所定义的「多肽的子序列(subsequence of thepolypeptide)」是指衍生自多肽的连续氨基酸残基的序列。举例而言，多肽片段可包含可识别的结构模体或功能域，诸如结合于DNA启动子区、活化域或蛋白质-蛋白质交互作用域的DNA结合位点或域，且可引发转录。片段的尺寸可自少至3个氨基酸残基至完整多肽的全长变化，例如长度为至少约20个氨基酸残基，例如长度为至少约30个氨基酸残基。因此，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的片段较佳意谓一种多肽序列，其包含该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)或由其组成，其中不超过80、60、50、40、30、20或15个连续氨基酸残基缺失，较佳不超过40个连续氨基酸残基缺失，且其按与可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似或更大程度执行完整多肽的至少一种生物功能。或者，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的片段较佳意谓一种多肽序列，其包含来自该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或GenbankNO.)的一定量的连续氨基酸残基或由其组成，且其中该一定量的连续氨基酸残基为该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的全长的至少50.0％、60.0％、70.0％、80.0％、81.0％、82.0％、83.0％、84.0％、85.0％、86.0％、87.0％、88.0％、89.0％、90.0％、91.0％、92.0％、93.0％、94.0％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、100％，较佳至少80％、更佳至少87％、甚至更佳至少90％、甚至更佳至少95％、最佳至少97％，且其按与可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似或更大程度执行完整多肽的至少一种生物功能。因此，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的片段较佳意谓一种多肽序列，其包含该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)或由其组成，其中一定量的连续氨基酸残基缺失且其中该量不超过该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的全长的50.0％、40.0％、30.0％，较佳不超过该多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的全长的20.0％、15.0％、10.0％、9.0％、8.0％、7.0％、6.0％、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.0％、0.5％，更佳不超过15％、甚至更佳不超过10％、甚至更佳不超过5％、最佳不超过2.5％，且其按与可借由所属技术领域中具有通常知识者常规评定的完整多肽实质上相同的方式，较佳以类似或更大程度执行完整多肽的至少一种生物功能。
在整个申请案中，多肽序列可由SEQ ID NO或可替代地由UniProt ID或GenBankNO表示。因此，除非另外明确陈述，否则术语「多肽SEQ ID NO(polypeptide SEQ ID NO)」及「多肽UniProt ID(polypeptide UniProt ID)」及「多肽GenBank NO.(polypeptideGenBank NO.)」可互换使用。
较佳地，多肽的片段为衍生自多肽的较佳以类似或更大程度具有多肽的至少一种特性或活性的功能片段。功能片段可例如包括多肽的功能域或保守域。应理解，多肽或其片段可具有对多肽的活性实质上无作用的保守氨基酸取代。借由保守取代，意指一种疏水性氨基酸经另一种疏水性氨基酸取代或一种极性氨基酸经另一种极性氨基酸取代或一种酸性氨基酸经另一种酸性氨基酸取代或一种碱性氨基酸经另一种碱性氨基酸取代等。较佳地，借由保守取代，意指以下组合，诸如甘氨酸借由丙氨酸取代，且反之亦然；缬氨酸、异白氨酸及白氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；天冬氨酸借由麸氨酸取代，且反之亦然；天冬酰胺借由麸酰胺酸取代，且反之亦然；丝氨酸借由苏氨酸取代，且反之亦然；离氨酸借由精氨酸取代，且反之亦然；半胱氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；及苯丙氨酸及酪氨酸借由色氨酸取代，且反之亦然。域可例如借由Pfam(El-Gebali等人，Nucleic Acids Res.47(2019)D427-D432)或保守域数据库(Conserved Domain Database；CDD)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)(Lu等人，Nucleic Acids Res.48(2020)D265-D268)名称定性。各数据库的内容在每次发布时为固定的且不改变。当特定数据库的内容改变时，此特定数据库接收具有新发布日期的新发布版本。各数据库的所有发布版本及其对应发布日期及如在此等特定发布日期标注的特定内容均为可获得的且为本领域中熟习此项技术的人员已知。本文所用的PFAM数据库(https://pfam.xfam.org/)为在2020年6月11日发布的Pfam版本33.1。蛋白质序列资讯及功能资讯可由蛋白质序列及标注数据的全面资源提供，如例如通用蛋白质资源(UniProt)(www.uniprot.org)(Nucleic Acids Res.2021,49(D1),D480-D489)。UniProt包含称为UniProt知识库(UniProtKB)的专门及充分管理的蛋白质数据库，以及UniProt参考序列集(UniRef)及UniProt档案(UniParc)。UniProt标识符(UniProt ID)对于存在于数据库中的各蛋白质为特有的。如本文所用的UniProt ID为2021年5月05日的UniProt数据库版本中的UniProt ID。在本文中使用如存在于2021年5月05日的NIH基因序列数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)(Nucleic AcidsRes.2013,41(D1),D36-D42)版本中的各别Genbank寄存编号(GenBank NO.)提及不具有UniProt ID的蛋白质。
如本文所用的术语「糖基转移酶(glycosyltransferase)」是指能够催化糖部分自活化供体分子转移至特异性受体分子，从而形成糖苷键的酶。由此合成的寡糖可具有直链类型或分支链类型且可含有多个单糖建构嵌段。已描述使用核苷酸二磷酸-糖、核苷酸单磷酸-糖及磷酸糖及相关蛋白将糖基转移酶分类成不同的基于序列的家族(Campbell等人，Biochem.J.326,929-939(1997))且可在CAZy(碳水化合物活性酶)网站(www.cazy.org)上获得。
如本文所用，糖基转移酶可选自包含(但不限于)以下者的清单：半乳糖基转移酶(例如β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶、α-1,4-半乳糖基转移酶)、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(例如β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶)、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(例如α-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶)、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶(xylosyltransferase)、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转氨酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖胺基转移酶。
半乳糖基转移酶为将半乳糖苷基(Gal)自UDP-半乳糖(UDP-Gal)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。半乳糖基转移酶包含β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶及α-1,4-半乳糖基转移酶，其经由α-或β-糖苷键将Gal残基自UDP-Gal转移至聚糖受体上。半乳糖基转移酶可发现但不限于为GT2、GT6、GT8、GT25及GT92CAZy家族。葡萄糖基转移酶为将葡萄糖基(Glc)自UDP-葡萄糖(UDP-Glc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。葡萄糖基转移酶包含α-葡萄糖基转移酶、β-1,2-葡萄糖基转移酶、β-1,3-葡萄糖基转移酶及β-1,4-葡萄糖基转移酶，其经由α-或β-糖苷键将Glc残基自UDP-Glc转移至聚糖受体上。葡萄糖基转移酶可发现但不限于为GT1、GT4及GT25 CAZy家族。甘露糖基转移酶为将甘露糖基(Man)自GDP-甘露糖(GDP-Man)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。甘露糖基转移酶包含α-1,2-甘露糖基转移酶、α-1,3-甘露糖基转移酶及α-1,6-甘露糖基转移酶，其经由α-糖苷键将Man残基自GDP-Man转移至聚糖受体上。甘露糖基转移酶可发现但不限于为GT22、GT39、GT62及GT69 CAZy家族。N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶为将N-乙酰基葡萄糖胺基(GlcNAc)自UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶可发现但不限于为GT2及GT4 CAZy家族。
N-乙酰基半乳糖胺基转移酶为将N-乙酰基半乳糖胺基(GalNAc)自UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。N-乙酰基半乳糖胺基转移酶可发现但不限于为GT7、GT12及GT27 CAZy家族。N-乙酰基甘露糖胺基转移酶为将N-乙酰基甘露糖胺基(ManNAc)自UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。木糖基转移酶为将木糖残基(Xyl)自UDP-木糖(UDP-Xyl)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。木糖基转移酶可发现但不限于为GT61及GT77 CAZy家族。鼠李糖基转移酶为将鼠李糖残基自GDP-鼠李糖供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。鼠李糖基转移酶可发现但不限于为GT1、GT2及GT102 CAZy家族。N-乙酰基鼠李糖基转移酶为将N-乙酰基鼠李糖胺(rhamnosamine)残基自UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶为使用UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖(arabino)-4-己酮糖用于伪氨酸(pseudaminic acid)的生物合成的糖基转移酶，该伪氨酸为用于修饰鞭毛蛋白的唾液酸类糖。UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶(murA)为将烯醇丙酮酰基自磷酸烯醇丙酮酸盐(phosphoenolpyruvate；PEP)转移至UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDPAG)以形成UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酸盐的糖基转移酶。岩藻糖胺基转移酶为将N-乙酰基岩藻糖胺残基自dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺或UDP-N-乙酰基岩藻糖胺供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。
术语「核苷酸-糖(nucleotide-sugar)」、「核苷酸-活化糖(nucleotide-activatedsugar)」或「活化糖(activated sugar)」在本文中可互换使用且是指单糖的活化形式。活化单糖的实例包括(但不限于)UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-来苏糖(lyxo)-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(pneumosamine)(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸(acetylmuramic acid)、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖、GDP-鼠李糖或UDP-木糖。核苷酸-糖在糖基化反应中充当糖基供体。糖基化反应为借由糖基转移酶催化的反应。
如本文所用的术语且如目前先进技术中通常所理解，「寡糖(Oligosaccharide)」是指含有少量、典型地三至二十个简单糖(亦即单糖)的糖聚合物。如本文所用的单糖为还原糖。寡糖可为还原或非还原糖且具有还原及非还原端。还原糖为能够还原另一种化合物且本身经氧化的任何糖，亦即糖的羰基碳经氧化成羧基。如本发明中所用的寡糖可为直链结构或可包括分支。两个糖单元之间的键(例如糖苷键、半乳糖苷键、葡萄糖苷键等)可表示为例如1,4、1->4或(1-4)，在本文中可互换使用。举例而言，术语「Gal-b1,4-Glc」、「β-Gal-(1->4)-Glc」、「Galβ1-4-Glc」及「Gal-b(1-4)-Glc」具有相同含义，亦即半乳糖(Gal)的碳-1与葡萄糖(Glc)的碳-4的β-糖苷键键联。各单糖可呈环状形式(例如呋喃糖形式的哌喃糖)。个别单糖单元之间的键联可包括α1->2、α1->3、α1->4、α1->6、α2->1、α2->3、α2->4、α2->6、β1->2、β1->3、β1->4、β1->6、β2->1、β2->3、β2->4及β2->6。寡糖可含有α-糖苷键及β-糖苷键两者或可仅含有β-糖苷键。较佳地，如本文所描述的寡糖含有选自如本文下文所用的清单的单糖。寡糖的实例包括(但不限于)哺乳动物乳寡糖及人乳寡糖。如本文所用，「基于乳-N-二糖(LNB)的寡糖(LNB(lacto-N-biose)-based oligosaccharide)」是指如本文所定义的寡糖，其在其还原端处含有LNB。如本文所用，「基于N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)的寡糖(LacNAc(N-acetyllactosamine)-based oligosaccharide)」是指如本文所定义的寡糖，其在其还原端处含有LacNAc。
如本文所用的术语「单糖(monosaccharide)」是指借由水解不可分解为更简单的糖，经醛糖或酮糖分类，且每分子含有一或多个羟基的糖。单糖为含有仅一个简单糖的糖。单糖的实例包含己糖(Hexose)、D-葡萄哌喃糖、D-半乳呋喃糖、D-半乳哌喃糖、L-半乳哌喃糖、D-哌喃甘露糖、D-别哌喃糖(Allopyranose)、L-阿卓哌喃糖(Altropyranose)、D-古洛哌喃糖(Gulopyranose)、L-艾杜哌喃糖(Idopyranose)、D-塔罗哌喃糖(Talopyranose)、D-呋喃核糖、D-哌喃核糖、D-阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)、D-阿拉伯哌喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯哌喃糖、D-木哌喃糖、D-来苏哌喃糖、D-赤呋喃糖(Erythrofuranose)、D-苏糖呋喃糖(Threofuranose)、庚糖、L-甘油-D-甘露-庚哌喃糖(LDmanHep)、D-甘油-D-甘露-庚哌喃糖、(DDmanHep)、6-去氧-L-阿卓哌喃糖、6-去氧-D-古洛哌喃糖、6-去氧-D-塔罗哌喃糖、6-去氧-D-半乳哌喃糖、6-去氧-L-半乳哌喃糖、6-去氧-D-甘露哌喃糖、6-去氧-L-甘露哌喃糖、6-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-去氧-D-阿拉伯糖-己糖、2-去氧-D-赤藻-戊糖、2,6-二去氧-D-阿拉伯糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-D-阿拉伯糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-L-阿拉伯糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-D-木糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-D-核糖-己哌喃糖、2,6-二去氧-D-核糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-L-木糖-己哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-别哌喃糖、2-胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-塔罗哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-D-别哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-乙酰胺基-2-去氧-D-塔罗哌喃糖、2-乙酰胺基-2,6-二去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-半乳哌喃糖、2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-甘露哌喃糖、2-乙酰胺基-2,6-二去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙酰胺基-2,6-二去氧-D-塔罗哌喃糖、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、D-核糖-己-2-酮哌喃糖、D-阿拉伯糖-己-2-酮呋喃糖(D-呋喃果糖)、D-阿拉伯糖-己-2-酮哌喃糖、L-木糖-己-2-酮哌喃糖、D-来苏糖-己-2-酮哌喃糖、D-苏糖-戊-2-酮哌喃糖、D-阿卓-庚-2-酮哌喃糖、3-C-(羟甲基)-D-赤呋喃糖、2,4,6-三去氧-2,4-二胺基-D-葡萄哌喃糖、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖、2,6-二去氧-3-甲基-D-核糖-己糖、2-胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰胺基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-羟乙酰基酰胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰基葡萄糖胺、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、N-乙酰基甘露糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖胺、鼠李糖、果糖及多元醇。
术语多元醇意指含有多个羟基的醇。举例而言，甘油、山梨糖醇或甘露糖醇。
如本文所用，术语「双糖(disaccharide)」是指由两个单糖单元构成的糖。双糖的实例包含乳糖(Gal-b1,4-Glc)、乳-N-二糖(Gal-b1,3-GlcNAc)、N-乙酰基乳糖胺(Gal-b1,4-GlcNAc)、LacDiNAc(GalNAc-b1,4-GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺基葡萄糖(GalNAc-b1,4-Glc)。
如本文所用，「哺乳动物乳寡糖(mammalian milk oligosaccharide)或MMO是指诸如(但不限于)以下的中性未岩藻糖化哺乳动物乳寡糖：乳-N-丙糖(triose)II、乳-N-四糖(tetraose)、乳-N-新四糖(neotetraose)、乳-N-六糖(hexaose)、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖及/或半乳糖基化聚葡萄胺糖。
哺乳动物乳寡糖包含在泌乳期间的任何阶段中发现的乳汁中所存在的寡糖，该乳汁包括来自人类及哺乳动物的初乳，所述哺乳动物包括(但不限于)牛(欧洲牛(BosTaurus))、绵羊(绵羊(Ovis aries))、山羊(家畜山羊(Capra aegagrus hircus))、双峰骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus))、马(欧洲野马(Equus ferus caballus))、猪(野猪(Susscropha))、犬(家犬亚种(Canis lupus familiaris))、虾夷棕熊(ezo brown bear)(日本棕熊(Ursus arctos yesoensis))、北极熊(海熊(Ursus maritimus))、日本黑熊(亚洲黑熊(Ursus thibetanus japonicus))、条纹臭鼬(条纹臭鼬(Mephitis mephitis))、冠海豹(冠海豹(Cystophora cristata))、亚洲大象(亚洲象(Elephas maximus))、非洲大象(非洲象(Loxodonta africana))、巨食蚁兽(大食蚁兽(Myrmecophaga tridactyla))、真瓶鼻海豚(瓶鼻海豚(Tursiops truncates))、北极小须鲸(小须鲸(Balaenopteraacutorostrata))、尤金袋鼠(尤金袋鼠(Macropus eugenii))、红袋鼠(红袋鼠(Macropusrufus))、普通袋狐(帚尾袋貂(Trichosurus Vulpecula))、无尾熊(考拉(Phascolarctoscinereus))、东袋鼬(细脚袋鼩(Dasyurus viverrinus))、鸭嘴兽(鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus))。人乳寡糖(Human milk oligosaccharide；HMO)亦称为人类一致乳寡糖，其在化学上与人类母乳中发现的人乳寡糖一致，但为生物技术生产的(例如使用不含细胞的系统或细胞及包含细菌、真菌、酵母、植物、动物或原虫细胞的生物体，较佳经基因工程改造的细胞及生物体)。人类一致乳寡糖以名称HiMO出售。
如本文所用，「基于乳糖的哺乳动物乳寡糖(lactose-based mammalian milkoligosaccharide)(MMO)」是指如本文中所定义的MMO，其在其还原端含有乳糖。
如本文所用且如目前先进技术中通常所理解，『岩藻糖化寡糖(fucosylatedoligosaccharide)』为带有岩藻糖残基的寡糖。此类岩藻糖化寡糖为包含经由糖苷键彼此连接的至少三个单糖次单元的糖结构，其中该单糖次单元中的至少一者为岩藻糖。岩藻糖化寡糖可含有超过一个岩藻糖残基，例如两个、三个或更多个岩藻糖残基。岩藻糖化寡糖可为中性寡糖或带电寡糖，例如亦包含唾液酸结构。岩藻糖可经由α-糖苷键连接至包含葡萄糖、半乳糖、GlcNAc的其他单糖次单元，所述α-糖苷键包含α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6键。
实例包含2'-岩藻基乳糖(2'FL)、3-岩藻基乳糖(3FL)、4-岩藻基乳糖(4FL)、6-岩藻基乳糖(6FL)、二岩藻基乳糖(diFL)、乳糖二岩藻四糖(lactodifucotetraose；LDFT)、乳-N-岩藻五糖(fucopentaose)I(LNFP I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP V)、乳-N-岩藻五糖VI(LNFP VI)、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I)、乳-N-二岩藻六糖II(LDFH II)、单岩藻基乳-N-六糖III(MFLNH III)、二岩藻基乳-N-六糖(DFLNHa)、二岩藻基-乳-N-新六糖、3'-唾液酸基-3-岩藻基乳糖、二唾液酸单岩藻基乳-N-新六糖、单岩藻基单唾液酸基乳-N-八糖(唾液酸基Lea)、唾液酸基乳-N-岩藻六糖II、二唾液酸基乳-N-岩藻五糖II、单岩藻基二唾液酸基乳-N-四糖。
如本文所用且如目前先进技术中通常所理解，『中性寡糖(neutraloligosaccharide)』为不具有源自羧酸基的负电荷的寡糖。此类中性寡糖的实例包含2'-岩藻基乳糖(2'FL)、3-岩藻基乳糖(3FL)、2',3-二岩藻基乳糖(diFL)、乳-N-丙糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖、二岩藻基-乳-N-六糖及二岩藻基-乳-N-新六糖。
如本文所用且如目前先进技术中通常所理解，『中性未岩藻糖化寡糖(neutralnon-fucosylated oligosaccharide)』为不具有源自羧酸基的负电荷且不含有岩藻糖残基的寡糖。此类中性未岩藻糖化寡糖的实例包含乳-N-丙糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖及对-乳-N-新六糖。
如本发明中所用的术语「LNT II」、「LNT-II」、「LN3」、「乳-N-丙糖II(lacto-N-triose II)」、「乳-N-丙糖II(lacto-N-triose II)」、「乳-N-丙糖(lacto-N-triose)」、「乳-N-丙糖(lacto-N-triose)」或「GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LNT」、「乳-N-四糖(lacto-N-tetraose)」、「乳-N-四糖(lacto-N-tetraose)」或「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LNnT」、「乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)」、「乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)」、「新-LNT(neo-LNT)」或「Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
术语「LNB」及「乳-N-二糖(Lacto-N-biose)」可互换使用且是指双糖Gal-b1,3-GlcNAc。
术语「LacNAc」及「N-乙酰基乳糖胺(N-acetyllactosamine)」可互换使用且是指双糖Gal-b1,4-GlcNAc。
如本文所用的『半乳糖基化途径(galactosylation pathway)』为由以下组成的生化途径：酶及其各别基因，半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶及/或葡萄糖磷酸变位酶，以及产生寡糖的2、3、4及/或6羟基上的α或β结合半乳糖的半乳糖基转移酶。
如本文所用的『N-乙酰基葡萄糖胺碳水化合物途径(N-acetylglucosaminecarbohydrate pathway)』为由以下组成的生化途径：酶及其各别基因，L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶及/或葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，以及产生寡糖的3、4及/或6羟基上的α或β结合N-乙酰基葡萄糖胺的糖基转移酶。
如本文所用的『N-乙酰基半乳糖胺基化途径(N-acetylgalactosaminylationpathway)』为包含酶及其各别基因中的至少一者的生化途径，所述酶及其各别基因选自包含以下者的清单：L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及/或UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶，以及产生GalNAc修饰的化合物的糖基转移酶，该化合物包含在单-、二-或寡糖上具有α或β结合N-乙酰基半乳糖胺的该单-、二-或寡糖。
如本文所用的『甘露糖基化途径(mannosylation pathway)』为包含酶及其各别基因中的至少一者的生化途径，所述酶及其各别基因选自包含以下者的清单：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase)及/或甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(guanylyltransferase)，以及产生甘露糖基化化合物的糖基转移酶，该化合物包含在单-、二-或寡糖上具有α或β结合甘露糖的该单-、二-或寡糖。
如本文所用的『N-乙酰基甘露糖胺基化途径(N-acetylmannosaminylationpathway)』为包含酶及其各别基因中的至少一者的生化途径，所述酶及其各别基因选自包含以下者的清单：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶及/或ManNAc激酶，以及产生ManNAc修饰的化合物的糖基转移酶，该化合物包含在单-、二-或寡糖上具有α或β结合N-乙酰甘露糖胺的该单-、二-或寡糖。
术语「L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶(L-glutamine-D-fructose-6-phosphate aminotransferase)」、「麸酰胺酸---果糖-6-磷酸转胺酶(异构化)(glutamine---fructose-6-phosphate transaminase(isomerizing))」、「磷酸己糖胺基转移酶(hexosephosphate aminotransferase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸异构酶(形成麸酰胺酸)(glucosamine-6-phosphate isomerase(glutamine-forming)」、「麸酰胺酸-果糖-6-磷酸转胺酶(异构化)(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase(isomerizing))」、「D-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(D-fructose-6-phosphate amidotransferase)」、「果糖-6-磷酸胺基转移酶(fructose-6-phosphate aminotransferase)」、「磷酸葡萄糖胺异构酶(glucosaminephosphate isomerase)」、「葡萄糖胺6-磷酸合酶(glucosamine 6-phosphatesynthase)」、「GlcN6P合酶(GlcN6P synthase)」、「GFA」、「glms」、「glmS」及「glmS*54」可互换使用且是指催化使用L-麸酰胺酸将D-果糖-6-磷酸盐转化为D-葡萄糖胺-6-磷酸盐的酶。
术语「葡萄糖胺-6-P脱胺酶(glucosamine-6-P deaminase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶(glucosamine-6-phosphate deaminase)」、「GlcN6P脱胺酶(GlcN6P deaminase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸异构酶(glucosamine-6-phosphate isomerase)」、「glmD」及「nagB」可互换使用且是指催化葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P)的可逆异构化-脱胺作用以形成果糖-6-磷酸及铵离子的酶。
术语「磷酸葡萄糖胺变位酶(phosphoglucosamine mutase)」及「glmM」可互换使用且是指催化葡萄糖胺-6-磷酸转化成葡萄糖胺-1-磷酸的酶。磷酸葡萄糖胺变位酶亦可催化自葡萄糖-1-P形成葡萄糖-6-P，尽管速率要低1400倍。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺-6-P去乙酰基酶(N-acetylglucosamine-6-Pdeacetylase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶(N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase)」及「nagA」可互换使用且是指催化N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcNAc-6-P)的N-乙酰基的水解以产生葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcN6P)及乙酸盐的酶。
N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-酰基-D-葡萄糖胺＝N-酰基-D-甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶、GlcNAc 2-表异构酶、N-酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶及N-乙酰基葡萄糖胺表异构酶。
UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含UDP-N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-GlcNAc-2-表异构酶及UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶。
N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺6-磷酸盐＝N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸盐的酶。
双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶为催化反应UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基-D-甘露糖胺及反应N-乙酰基-D-甘露糖胺+ATP＝ADP+N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸盐的双官能酶。
葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶为催化乙酰基自乙酰基-CoA转移至D-葡萄糖胺-6-磷酸盐从而产生游离CoA及N-乙酰基-D-葡萄糖胺6-磷酸盐的酶。替代名称包含胺基去氧葡萄糖磷酸乙酰基转移酶、D-葡萄糖胺-6-P N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺6-磷酸乙酰基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺-磷酸N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸乙酰基酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡萄糖胺乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺N-乙酰基酶磷酸葡萄糖胺N-乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺转乙酰基酶、GNA及GNA1。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶(N-acetylglucosamine-6-phosphatephosphatase)」是指使N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcNAc-6-P)去磷酸化由此合成N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)的酶。
术语「N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶(N-acetylmannosamine-6-phosphatephosphatase)」是指使N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸盐(ManNAc-6P)去磷酸化成N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)的酶。
术语「N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶(N-acetylmannosamine-6-phosphate 2-epimerase)」、「ManNAc-6-P异构酶(ManNAc-6-P isomerase)」、「ManNAc-6-P2-表异构酶(ManNAc-6-P 2-epimerase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-6P 2-表异构酶(N-acetylglucosamine-6P 2-epimerase)」及「nanE」可互换使用且是指将ManNAc-6-P转化为N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸盐(GlcNAc-6-P)的酶。
术语「磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase)」、「乙酰基葡萄糖胺磷酸变位酶(acetylglucosamine phosphomutase)」、「乙酰基胺基去氧葡萄糖磷酸变位酶(acetylaminodeoxyglucose phosphomutase)」、「二氧磷基-N-乙酰基葡萄糖胺变位酶(phospho-N-acetylglucosamine mutase)」及「N-乙酰基-D-葡萄糖胺1,6-磷酸变位酶(N-acetyl-D-glucosamine 1,6-phosphomutase)」可互换使用且是指催化将N-乙酰基-葡萄糖胺1-磷酸盐转化成N-乙酰基葡萄糖胺6-磷酸盐的酶。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase)」、「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺二磷酸酶(UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase)」、「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(uridine diphosphoacetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「UTP:2-乙酰胺基-2-去氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UTP:2-acetamido-2-deoxy-alpha-D-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(UDP-GlcNAcpyrophosphorylase)」、「GlmU尿苷酰基转移酶(GlmU uridylyltransferase)」、「乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(Acetylglucosamine 1-phosphateuridylyltransferase)」、「UDP-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(UDP-acetylglucosaminepyrophosphorylase)」、「二磷酸尿苷-N-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(uridinediphosphate-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺磷酸化酶(uridine diphosphoacetylglucosamine phosphorylase)」及「乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase)」可互换使用且是指催化借由转移尿苷5-单磷酸盐(自尿苷5-三磷酸盐(uridine 5-triphosphate；UTP)转移)将N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸盐(GlcNAc-1-P)转化为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的酶。
术语葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶是指催化乙酰基自乙酰基辅酶A转移至葡萄糖胺-1-磷酸盐(GlcN-1-P)以产生N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸盐(GlcNAc-1-P)的酶。
术语「glmU」是指具有N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶及葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性两者且催化UDP-GlcNAc的从头生物合成途径中的两个依序反应的双官能酶。C端域催化乙酰基自乙酰基辅酶A转移至GlcN-1-P以产生GlcNAc-1-P，其借由尿苷5-单磷酸盐的转移而转化成UDP-GlcNAc，此是由N端域催化的反应。
术语「半乳糖-1-表异构酶(galactose-1-epimerase)」、「醛糖1-表异构酶(aldose1-epimerase)」、「变旋酶(mutarotase)」、「醛糖变旋酶(aldose mutarotase)」、「半乳糖变旋酶(galactose mutarotase)」、「半乳糖1-表异构酶(galactose 1-epimerase)」及「D-半乳糖1-表异构酶(D-galactose 1-epimerase)」可互换使用且是指催化β-D-半乳糖转化为α-D-半乳糖的酶。
术语「半乳糖激酶(galactokinase)」、「半乳糖激酶(磷酸化)(galactokinase(phosphorylating))」及「ATP:D-半乳糖-1-磷酸转移酶(ATP:D-galactose-1-phosphotransferase)」可互换使用且是指催化使用ATP将α-D-半乳糖转化成α-D-半乳糖1-磷酸盐的酶。
术语葡萄糖激酶及「葡萄糖激酶(磷酸化)(glucokinase(phosphorylating))」可互换使用且是指催化使用ATP将D-葡萄糖转化成D-葡萄糖6-磷酸盐的酶。
术语「半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(galactose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「Gal-1-P尿苷酰基转移酶(Gal-1-P uridylyltransferase)」、「UDP-葡萄糖---己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UDP-glucose---hexose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「尿苷酰基转移酶(uridyl transferas)」、「己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(hexose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「尿苷酰基转移酶(uridyltransferase)」、「己糖1-磷酸尿苷酰基转移酶(hexose 1-phosphateuridyltransferase)」、「UDP-葡萄糖:α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UDP-glucose:alpha-D-galactose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「galB」及「galT」可互换使用且是指催化反应D-半乳糖1-磷酸盐+UDP-D-葡萄糖＝D-葡萄糖1-磷酸盐+UDP-D-半乳糖的酶。
术语「UDP-葡萄糖4-表异构酶(UDP-glucose 4-epimerase)」、「UDP-半乳糖4-表异构酶(UDP-galactose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖表异构酶(uridinediphosphoglucose epimerase)」、「半乳糖瓦尔登转化酶(galactowaldenase)」、「UDPG-4-表异构酶(UDPG-4-epimerase)」、「尿苷二磷酸半乳糖4-表异构酶(uridine diphosphategalactose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸-半乳糖-4-表异构酶(uridine diphospho-galactose-4-epimerase)」、「UDP-葡萄糖表异构酶(UDP-glucose epimerase)」、「4-表异构酶(4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶(uridine diphosphoglucose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶(uridine diphosphate glucose 4-epimerase)」及「UDP-D-半乳糖4-表异构酶(UDP-D-galactose 4-epimerase)」可互换使用且是指催化UDP-D-葡萄糖转化为UDP-半乳糖的酶。
术语「葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(glucose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「UTP---葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UTP---glucose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UDP glucosepyrophosphorylase)」、「UDPG磷酸化酶(UDPG phosphorylase)」、「UDPG焦磷酸化酶(UDPGpyrophosphorylase)」、「尿苷5'-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine 5'-diphosphoglucose pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphoglucose pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸-D-葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate-D-glucose pyrophosphorylase)」、「尿苷-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine-diphosphate glucose pyrophosphorylase)」及「galU」可互换使用且是指催化使用UTP将D-葡萄糖-1-磷酸盐转化为UDP-葡萄糖的酶。
术语「磷酸葡萄糖变位酶(α-D-葡萄糖-1,6-二磷酸依赖型)(phosphoglucomutase(alpha-D-glucose-1,6-bisphosphate-dependent))」、「葡萄糖磷酸变位酶(不明确)(glucose phosphomutase(ambiguous))」及「磷酸葡萄糖变位酶(不明确)(phosphoglucosemutase(ambiguous))」可互换使用且是指催化D-葡萄糖1-磷酸盐转化为D-葡萄糖6-磷酸盐的酶。
术语「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶(UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase)」、「UDP乙酰基葡萄糖胺表异构酶(UDP acetylglucosamine epimerase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺表异构酶(uridine diphosphoacetylglucosamineepimerase)」、「尿苷二磷酸N-乙酰基葡萄糖胺-4-表异构酶(uridine diphosphate N-acetylglucosamine-4-epimerase)」、「尿苷5'-二磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺-4-表异构酶(uridine 5'-diphospho-N-acetylglucosamine-4-epimerase)」及「UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺4-表异构酶(UDP-N-acetyl-D-glucosamine 4-epimerase)」可互换使用且是指催化UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)差向异构化为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)的酶。
术语「N-乙酰基半乳糖胺激酶(N-acetylgalactosamine kinase)」、「GALK2」、「GK2」、「GalNAc激酶(GalNAc kinase)」、「N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)-1-磷酸激酶(N-acetylgalactosamine(GalNAc)-1-phosphate kinase)」及「ATP:N-乙酰基-D-半乳糖胺1-磷酸转移酶(ATP:N-acetyl-D-galactosamine 1-phosphotransferase)」可互换使用且是指催化使用ATP自N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)合成N-乙酰基半乳糖胺1-磷酸盐(GalNAc-1-P)的酶。
术语「UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylgalactosaminepyrophosphorylase)」及「UDP-GalNAc焦磷酸化酶(UDP-GalNAc pyrophosphorylase)」可互换使用且是指使用UTP催化N-乙酰基半乳糖胺1-磷酸盐(GalNAc-1-P)转化为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)的酶。
术语「N-乙酰基神经氨酸激酶(N-acetylneuraminate kinase)」、「ManNAc激酶(ManNAc kinase)」、「N-乙酰基-D-甘露糖胺激酶(N-acetyl-D-mannosamine kinase)」及「nanK」可互换使用且是指使ManNAc磷酸化以合成N-乙酰基甘露糖胺-磷酸盐(ManNAc-6-P)的酶。
术语「乙酰基-辅酶A合成酶(acetyl-coenzyme A synthetase)」、「acs」、「乙酰基-CoA合成酶(acetyl-CoA synthetase)」、「AcCoA合成酶(AcCoA synthetase)」、「乙酸盐--CoA接合酶(acetate--CoA ligase)」、「酰基活化酶(acyl-activating enzyme)」及「yfaC」可互换使用且是指在ATP依赖性反应中催化乙酸盐转化为乙酰基-辅酶A(AcCoA)的酶。
术语「丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)」、「丙酮酸氧化酶(pyruvateoxidase)」、「POX」、「poxB」及「丙酮酸盐:泛醌-8氧化还原酶(pyruvate:ubiquinone-8oxidoreductase)」可互换使用且是指催化丙酮酸盐的氧化去羧以产生乙酸盐及CO2的酶。
术语「乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、「D-乳酸脱氢酶(D-lactatedehydrogenase)」、「ldhA」、「hslI」、「htpH」、「D-LDH」、「发酵性乳酸脱氢酶(fermentativelactate dehydrogenase)」及「D-特异性2-羟基酸脱氢酶(D-specific 2-hydroxyaciddehydrogenase)」可互换使用且是指催化乳酸盐转化成丙酮酸盐由此生成NADH的酶。
如本文所用，术语「细胞生产力指数(cell productivity index；CPI)」是指借由细胞产生的产物的质量除以培养物中产生的细胞的质量。
术语「纯化(purified)」是指实质上或基本上不含干扰生物分子活性的组分的物质。对于细胞、糖类、核酸及多肽，术语「纯化」是指实质上或基本上不含通常伴随如天然状态下所发现的物质的组分的物质。典型地，本发明的经纯化糖、寡糖、蛋白质或核酸为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％纯，通常至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯，如借由基于银染凝胶的条带强度或用于测定纯度的其他方法所量测。纯度或均质性可借由所属技术领域中熟知的多种方式指示，所述方式诸如蛋白质或核酸样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后在染色后进行观测。出于某些目的，将需要高解析度及采用HPLC或用于纯化的类似方式。对于寡糖，纯度可使用诸如(但不限于)薄层层析、气相层析、NMR、HPLC、毛细管电泳或质谱分析的方法测定。
如使用序列比较算法或借由目视检查所量测，在针对最大对应性比较且比对时，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语「一致(identical)」或「一致性百分比(percent identity)」或「一致性％(％identity)」是指两个或更多个相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的序列或子序列。对于序列比较，一个序列充当参考序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列及参考序列输入至电脑中，必要时指定子序列座标，且指定序列算法程序参数。接着，序列比较算法根据所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。可在参考序列的全长序列内全局计算一致性百分比，产生整体一致性百分比评分。或者，可在参考序列的部分序列内计算一致性百分比，产生局部一致性百分比评分。在局部序列比对中使用参考序列的全长产生测试与参考序列之间的整体一致性百分比评分。一致性百分比可使用不同算法如例如BLAST及PSI-BLAST(Altschul等人，1990,J Mol Biol 215:3,403-410；Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res 25:17,3389-402)、Clustal Omega方法(Sievers等人，2011,Mol.Syst.Biol.7:539)、MatGAT方法(Campanella等人，2003,BMC Bioinformatics,4:29)或EMBOSS Needle测定。
比对的基本局部比对搜寻工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST))方法为由国家生物技术资讯中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)提供以使用预设参数比较序列的算法。该程序比较核苷酸或蛋白质序列与序列数据库且计算统计显著性。位置特异性叠代基本局部比对搜寻工具(Position-SpecificIterative Basic Local Alignment Search Tool；PSI-BLAST)使用蛋白质-蛋白质BLAST(BLASTp)自超过给定分数临限值侦测的序列的多个序列比对导出位置特异性评分矩阵(position-specific scoring matrix；PSSM)或分布概况。BLAST方法可用于成对或多序列比对。成对序列比对用于鉴别具有相似性的区，其可以指示两个生物序列(蛋白质或核酸)之间的功能、结构及/或进化关系。BLAST的网页界面可在以下获得：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
Clustal Omega(Clustal W)为使用接种的引导树及HMM分布-分布技术(HMMprofile-profile technique)以在三个或更多个序列之间产生比对的多序列比对程序。其产生发散序列的生物学上有意义的多序列比对。ClustalΩ的网页介面可在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/下获得。使用ClustalΩ方法进行多序列比对及蛋白质序列一致性百分比计算的预设参数为：启用输入序列的去比对：FALSE；启用mbed类集群引导树：TRUE；启用mbed类集群叠代：TRUE；(组合引导树/HMM)叠代的数目：预设(0)；最大引导树叠代：预设[-1]；最大HMM叠代：预设[-1]；命令：比对。
矩阵全局比对工具(MatGAT)是在不需要资料的预比对的情况下产生DNA或蛋白质序列的相似性/一致性矩阵的电脑应用。程序使用Myers及Miller全局比对算法进行一系列成对比对，计算相似性及一致性，且接着将结果置于距离矩阵中。使用者可以指定采用何种类型的比对矩阵(例如BLOSUM50、BLOSUM62及PAM250)进行其蛋白质序列检查。
当考虑到两个序列的整个长度时，EMBOSS Needle(https://galaxy-iuc.github.io/emboss-5.0-docs/needle.html)使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)全局比对算法寻找两个序列的最佳比对(包括空位)。借由动态程序化方法借由探究所有可能的比对且选择最佳比对来确保最佳比对。德曼-翁施算法为一类算法的成员，其可按mn步骤的次序计算最佳评分及比对(其中『n』及『m』为两个序列的长度)。空位开放罚分(预设10.0)为当产生空位时所扣除的分数。预设值假设您将EBLOSUM62矩阵用于蛋白质序列。空位延伸(预设0.5)罚分被添加至空位中的每一碱基或残基的标准空位罚分。此为惩罚长空位的方式。
如本文所用，具有与参考多肽序列的全长序列至少80％序列一致性的氨基酸序列的多肽应理解为与参考多肽序列的氨基酸序列全长具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91.50％、92.00％、92.50％、93.00％、93.50％、94.00％、94.50％、95.00％、95.50％、96.00％、96.50％、97.00％、97.50％、98.00％、98.50％、99.00％、99.50％、99.60％、99.70％、99.80％、99.90％、100％序列一致性的序列。在整个申请案中，除非另外明确指定，否则包含/组成/具有与参考多肽(或核苷酸序列)的全长氨基酸序列(或核苷酸序列)具有至少80％序列一致性的氨基酸序列(或核苷酸序列)的多肽(或DNA序列)，通常用SEQ ID NO或UniProt ID或Genbank No.指示，与全长参考序列较佳具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，更佳具有至少85％，甚至更佳具有至少90％，最佳具有至少95％的序列一致性。
出于本发明的目的，一致性百分比是使用MatGAT2.01(Campanella等人，2003,BMCBioinformatics 4:29)来测定。采用针对蛋白质的以下预设参数：(1)空位成本存在：12及延伸：2；(2)所用矩阵为BLOSUM65。在较佳具体实例中，序列一致性是基于指定SEQ ID NO，亦即参考序列的全长序列或其一部分计算。其部分较佳意谓完整参考序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
术语「培养(cultivation)」是指培养或发酵细胞的培养基、细胞本身及由细胞在全培养液中产生的寡糖，亦即在细胞的内部(胞内)以及外部(胞外)产生。
术语「膜转运蛋白(membrane transporter protein)」或「膜蛋白(membraneprotein)」可互换使用且是指作为细胞膜的一部分或与细胞膜交互作用且控制分子流动及跨越细胞的资讯的蛋白质。因此，膜蛋白参与转运，不论其输入至细胞中或自细胞输出。
此类膜转运蛋白可为如由转运蛋白分类数据库(Transporter ClassificationDatabase)所定义的运输蛋白(porter)、P-P-键水解驱动的转运蛋白、β-桶状孔蛋白(β-Barrel Porin)、辅助转运蛋白、推定转运蛋白(putative transport protein)及磷酸转移驱动的基团移位蛋白(translocator)，该数据库经由www.tcdb.org获得由Saier LabBioinformatics Group运作及管理且提供膜转运蛋白的功能性及系统发生分类。此转运蛋白分类数据库详述膜转运蛋白的IUBMB核准的综合分类系统，称为转运蛋白分类(Transporter Classification；TC)系统。如此处所描述的TCDB分类搜寻系基于如2019年6月17日发布的TCDB.org而定义。
运输蛋白为利用载体介导的过程的单向运输蛋白、同向运输蛋白及反向运输蛋白的集合名称(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。其属于电化学电位驱动转运蛋白且亦称为次级载体型促进剂。膜转运蛋白在利用载体介导的过程时包括于此类别中，以当单个物种借由易化扩散或在膜电位依赖型过程(若溶质带电)中进行转运时，则催化单向运输蛋白；当两个或更多个物种在紧耦合过程中以相反方向转运时，不耦合至除化学渗透能量的外的直接能量形式，则催化反向运输蛋白；及/或当两个或更多个物种在紧耦合过程中以相同方向一起转运时，不耦合至除化学渗透能量的外的直接能量形式，则催化同向运输蛋白，所述蛋白均属于次级载体(Forrest等人，Biochim.Biophys.Acta 1807(2011)167-188)。此等系统通常具有立体特异性。溶质:溶质反向运输为次级载体的典型特征。运输蛋白及酶的动态缔合产生功能性膜转运代谢群组，其将典型地获自胞外隔室的基质直接地导入至其细胞代谢中(Moraes及Reithmeier,Biochim.Biophys.Acta 1818(2012),2687-2706)。经由此运输蛋白系统转运的溶质包括(但不限于)阳离子、有机阴离子、无机阴离子、核苷、氨基酸、多元醇、磷酸化糖分解中间物、渗透剂、螯铁蛋白。
若膜转运蛋白水解无机焦磷酸、ATP或另一核苷三磷酸的二磷酸键以驱动一种溶质或多种溶质的主动吸收及/或挤出，则膜转运蛋白包括于P-P-键水解驱动的转运蛋白的类别中(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。膜转运蛋白可或可不暂时磷酸化，但基质未磷酸化。经由P-P-键水解驱动的转运蛋白的类别转运的基质包括(但不限于)阳离子、重金属、β-葡聚糖、UDP-葡萄糖、脂多糖、磷壁酸。
β-桶状孔蛋白膜转运蛋白形成跨膜孔隙，其通常允许溶质以能量无关的方式穿过膜。此等蛋白质的跨膜部分仅仅由β股组成，形成β-桶状(Saier等人，Nucleic AcidsRes.44(2016)D372-D379)。此等孔蛋白型蛋白质发现于革兰氏阴性细菌(Gram-negativebacteria)、粒线体、质体及可能抗酸性(acid-fast)革兰氏阳性细菌的外膜中。经由此等β-桶状孔蛋白转运的溶质包括(但不限于)核苷、棉子糖、葡萄糖、β-葡糖苷、寡糖。
辅助转运蛋白定义为促进跨越一或多个生物膜转运但本身不直接参与转运的蛋白质。此等膜转运蛋白始终结合一或多种现有转运系统起作用，所述系统诸如(但不限于)外膜因子(outer membrane factor；OMF)、多糖(PST)运输蛋白、ATP结合卡匣(ATP-bindingcassette；ABC)型转运蛋白。其可提供与能量耦合相关以进行转运的功能，在复合物形成中起结构作用，提供生源或稳定性功能或调节功能(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。辅助转运蛋白的实例包括(但不限于)参与多糖转运的多糖共聚合酶家族、参与细菌素及化学毒素转运的膜融合蛋白家族。
推定转运蛋白包含以下的家族，当成员的转运功能确认时，所述家族将被分类为别处，或若所提出的转运功能被证明无效，则将自转运蛋白分类系统中消除。此等家族包括一或多个已针对其提出转运功能的成员，但此类功能的证据尚未令人信服(Saier等人，Nucleic Acids Res.44(2016)D372-D379)。如在2019年6月17日发布的TCDB系统下归入此组的推定转运蛋白的实例包括(但不限于)铜转运蛋白。
磷酸转移驱动的基团移位蛋白亦称为细菌磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统(phosphotransferase system；PTS)的PEP依赖型磷酰基转移驱动的基团移位蛋白。衍生自胞外糖的反应产物为细胞质磷酸糖类。催化糖磷酸化的酶促成分在紧耦合过程中叠加于转运过程上。PTS系统涉及许多不同态样，包含调节及趋化性、生物膜形成及发病机制(Lengeler,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.25(2015)79-93；Saier,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.25(2015)73-78)。如在2019年6月17日发布的TCDB系统下归于磷酸转移驱动的基团移位蛋白内的膜转运蛋白家族包括与葡萄糖-葡糖苷、果糖-甘露糖醇、乳糖-N,N'-二乙酰基壳二糖-β-葡糖苷、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖-果糖-山梨糖及抗坏血酸盐的转运有关联的PTS系统。
主要易化子超家族(major facilitator superfamily；MFS)为膜转运蛋白的超家族，其催化单向运输蛋白、溶质:阳离子(H+，但几乎不为Na+)同向运输蛋白及/或溶质:H+或溶质:溶质反向运输蛋白。大多数长度为400-600个胺基酰基残基且具有12、14或偶尔24个跨膜α-螺旋扳手(TMS)，如借由Saier Lab Bioinformatics Group(www.tcdb.org)运作的转运蛋白分类数据库所定义。
如本文所用的「SET」或「糖流出转运蛋白(Sugar Efflux Transporter)」是指SET家族的膜蛋白，其为具有InterPRO域IPR004750的蛋白质及/或为属于eggNOGv4.5家族ENOG410XTE9的蛋白质。InterPro域的鉴别可借由使用https://www.ebi.ac.uk/interpro/上的线上工具或InterProScan(https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html)的独立版本使用预设值进行。在eggNOGv4.5中鉴别直系同源家族可使用eggNOG-mapperv1(http://eggnogdb.embl.de/#/app/home)的在线版本或独立版本进行。
如本文所用的术语「螯铁蛋白(Siderophore)」是指各种微生物的次级代谢物，其主要为铁离子特异性螯合剂。此等分子已分类为儿茶酚盐(catecholate)、氧肟酸盐(hydroxamate)、羧酸盐及混合类型。螯铁蛋白一般借由非核糖体肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetase；NRPS)依赖性途径或NRPS非依赖性途径(NRPS independentpathway；NIS)合成。NRPS依赖性螯铁蛋白生物合成途径中最重要之前驱体为分支酸盐(chorismate)。2,3-DHBA可借由异分支酸合酶、异分支酸酶及2,3-二羟基苯甲酸酯-2,3-脱氢酶催化的三步骤反应自分支酸盐形成。螯铁蛋白亦可由水杨酸盐形成，该水杨酸盐借由异分支酸丙酮酸酯解离酶自异分支酸盐形成。当鸟氨酸用作螯铁蛋白之前驱体时，生物合成取决于由L-鸟氨酸N5-单加氧酶催化的鸟氨酸的羟基化。在NIS途径中，螯铁蛋白生物合成中的重要步骤是N(6)-羟基离氨酸合酶。
需要转运蛋白以将螯铁蛋白输出至细胞外部。至此在此过程中鉴别出膜蛋白的四个超家族：主要易化子超家族(MFS)；多药/寡糖基脂质/多糖翻转酶超家族(Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide Flippase Superfamily；MOP)；抗性、结节性及细胞分裂超家族(resistance,nodulation and cell division superfamily；RND)；及ABC超家族。一般而言，参与螯铁蛋白输出的基因与螯铁蛋白生物合成基因簇聚在一起。如本文所用的术语「螯铁蛋白输出蛋白(siderophore exporter)」是指将螯铁蛋白输出至细胞外部所需的此类转运蛋白。
ATP结合卡匣(ABC)超家族含有吸收及流出转运系统，且此等两组中的成员通常松散地簇聚在一起。无蛋白质磷酸化的ATP水解为转运供以能量。ABC超家族内存在数十个家族，且家族一般与基质特异性相关。成员根据如借由转运蛋白分类数据库所定义的类别3.A.1分类，该数据库借由经由www.tcdb.org可获得的Saier Lab Bioinformatics Group运作且提供膜转运蛋白的功能性及系统发生分类。
术语「致能流出(enabled efflux)」意谓在细胞质膜及/或细胞壁上引入溶质的转运的活动。该转运可借由引入及/或增加如本发明中所描述的转运蛋白的表现来实现。术语「增强的流出(enhanced efflux)」意谓改善溶质在细胞质膜及/或细胞壁上的转运的活动。可借由引入及/或增加如本发明所描述的膜转运蛋白的表现来增强溶质在细胞质膜及/或细胞壁上的转运。膜转运蛋白的「表现(Expression)」在基因为内源基因的情况下，被定义为编码该膜转运蛋白的该基因的「过度表现(overexpression)」；或在编码该膜转运蛋白的基因为不存在于野生型菌株或细胞中的异源基因的情况下，被定义为「表现(expression)」。
如本文所用的术语「前驱体(precursor)」是指借由细胞吸收或合成以特异性生产根据本发明的中性未岩藻糖化寡糖的物质。在此意义上，前驱体可为如本文所定义的受体，但亦可为另一物质、代谢物，其首先在细胞内作为寡糖的生物化学合成途径的一部分经修饰。此类前驱体的实例包含如本文所定义的受体及/或葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、二羟基丙酮、葡萄糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、N-乙酰基-甘露糖胺，磷酸化糖类如例如(但不限于)葡萄糖-1-磷酸盐、半乳糖-1-磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐、果糖-6-磷酸盐、果糖-1,6-二磷酸盐、甘油-3-磷酸盐、甘油醛-3-磷酸盐、二羟基丙酮-磷酸盐、葡萄糖胺-6-磷酸盐、N-乙酰基-葡萄糖胺-6-磷酸盐、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸盐、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸盐、甘露糖-6-磷酸盐、甘露糖-1-磷酸盐及/或如本文所定义的核苷酸活化糖类如例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺、GDP-甘露糖及/或GDP-4-脱氢-6-去氧-α-D-甘露糖。
视情况，细胞经转形以包含至少一种编码选自由以下组成的群的蛋白质的核酸序列：乳糖转运蛋白；用于核苷酸活化糖的转运蛋白，其中该转运蛋白内化至添加前驱体以用于中性未岩藻糖化寡糖合成的培养基中。
如本文所用的术语「受体(acceptor)」是指可借由糖基转移酶修饰的双糖或寡糖。此类受体的实例包含乳糖，乳-N-二糖(LNB)、乳-N-丙糖、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、N-乙酰基-乳糖胺(LacNAc)、乳-N-五糖(LNP)、乳-N-新五糖、对乳-N-五糖、对乳-N-新五糖、乳-N-新生五糖I(lacto-N-novopentaose I)、乳-N-六糖(lacto-N-hexaose；LNH)、乳-N-新六糖(lacto-N-neohexaose；LNnH)、对乳-N-新六糖(para lacto-N-neohexaose；pLNnH)、对乳-N-六糖(para lacto-N-hexaose；pLNH)、乳-N-七糖(heptaose)、乳-N-新七糖、对乳-N-新七糖、对乳-N-七糖、乳-N-八糖(lacto-N-octaose；LNO)、乳-N-新八糖、异乳-N-八糖、对乳-N-八糖、异乳-N-新八糖、新生乳-N-新八糖、对乳-N-新八糖、异乳-N-九糖(nonaose)、新生乳-N-九糖、乳-N-九糖、乳-N-十糖(decaose)、异乳-N-十糖、新生乳-N-十糖、乳-N-新十糖；半乳糖基乳糖，经延伸具有1、2、3、4、5或多个N-乙酰基乳糖胺单位及/或1、2、3、4、5或多个乳-N-二糖单位的乳糖及含有1或多个N-乙酰基乳糖胺单位及或1或多个乳-N-二糖单位的寡糖，或其转为寡糖形式的中间物。
在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「合成(synthesize)」、「合成(synthesized)」及「合成(synthesis)」可分别与特征「生产(produce)」、「生产(produced)」及「产生(production)」互换地使用。
发明详述
根据第一态样，本发明提供一种用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的代谢上经工程改造的细胞，亦即，代谢上经工程改造以用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的细胞。本文中提供单个代谢上经工程改造的细胞，其能够表现、较佳表现至少两种糖基转移酶且能够合成一或多个作为用于所述糖基转移酶的一或多种供体的糖-核苷酸。在整个申请案中，除非另外明确说明，否则「经遗传修饰的细胞(genetically modified cell)」或「代谢上经工程改造的细胞」较佳意谓分别经遗传修饰或代谢上经工程改造以用于生产包含至少四种根据本发明的不同中性未岩藻糖化寡糖的该混合物的细胞。在本发明的上下文中，如本文所揭示的该混合物的至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖较佳地不出现在该代谢上经工程改造的细胞的野生型先驱细胞(progenitor)中。
根据第二态样，本发明提供一种用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的方法。该方法包含以下步骤：
i)提供细胞、较佳单个细胞，其能够表现、较佳表现至少两种糖基转移酶且能够合成一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于所述糖基转移酶的一或多种供体，及
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成该一或多种核苷酸-糖的条件下培养该细胞，
iii)较佳地，自该培养分离所述中性未岩藻糖化寡糖中的至少一者，更佳地，自该培养分离所述寡糖中的全部。
在本发明的范围内，容许条件应理解为与物理或化学参数相关的条件，所述参数包括(但不限于)温度、pH、压力、渗透压及产物/前驱体/受体浓度。
在一特定具体实例中，容许条件可包括30+/-20摄氏度的温度范围、7+/-3的pH范围。
在本发明的上下文中，应理解，该细胞胞内产生所述寡糖。所属技术领域中具有通常知识者应进一步理解，一部分或实质上所有所述所产生的寡糖保持在胞内及/或经由被动或主动输送在细胞外部排出。
根据本发明，用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的该方法可利用非代谢上经工程改造的细胞或可利用代谢上经工程改造的细胞，亦即，代谢上经工程改造以用于生产包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的该混合物的细胞。
根据本发明的方法及细胞的一较佳具体实例，代谢上经工程改造的细胞经基因表现模组修饰，其中来自所述表现模组中的任一者的表现为持续性的或借由天然诱导剂产生。
所述表现模组亦称为转录单元且包含用于表现重组基因的聚核苷酸，所述基因包括编码基因序列及可操作地连接于编码基因的适当转录及/或转译控制信号。所述控制信号包含启动子序列、非转译区、核糖体结合位点、终止子序列。所述表现模组可含有用于表现一个单一重组基因的元件，但亦可含有用于表现更多重组基因的元件或可组织于操纵子结构中以用于整合表现两个或更多个重组基因。所述聚核苷酸可借由重组DNA技术，使用所属技术领域中熟知的技术来产生。所属技术领域中具有通常知识者熟知的构筑表现模组的方法包括例如试管内重组DNA技术、合成技术及活体内基因重组。参见例如描述于以下中的技术：Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:a laboratory manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,CSH,New York或Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,N.Y.(1989且每年更新)。
根据本发明的一较佳具体实例，细胞经一或多个表现模组修饰。表现模组可整合于该细胞的基因体中或可在载体上呈递至该细胞。该载体可以稳定转形/转染至该代谢上经工程改造的细胞中的质体、黏质体、噬菌体、脂质体或病毒形式存在。其中，此类载体包括染色体、游离型及病毒衍生的载体，例如，来源于细菌质体、噬菌体、转位子、酵母游离基因体、插入元件、酵母染色体元件、病毒的载体及来源于其组合的载体，诸如来源于质体及噬菌体遗传元件(诸如黏质体及噬质体)的载体。此等载体可含有选择标记，诸如(但不限于)抗生素标记、营养缺陷型标记、毒素-抗毒素标记、RNA有义/反义标记。表现系统构筑体可含有调节以及产生表现的控制区。通常，就此而言，适合于在宿主中维持、扩增或表现聚核苷酸及/或表现多肽的任何系统或载体可用于表现。适当DNA序列可借由各种熟知及惯例技术、诸如(例如)阐述于Sambrook等人(参见上文)文献中的彼等技术中的任一者插入至表现系统中。对于重组生产，细胞可经基因工程改造以并入本发明的表现系统或其部分或聚核苷酸。向细胞中引入聚核苷酸可借由许多标准实验室手册，诸如Davis等人，Basic Methodsin Molecular Biology,(1986)及Sambrook等人，1989,前述文献中所描述的方法来实现。
如本文所用，表现模组包含用于表现至少一种重组基因的聚核苷酸。该重组基因参与在该中性未岩藻糖化寡糖混合物的合成中起作用的多肽的表现；或该重组基因与该宿主细胞中不参与三种或更多种中性未岩藻糖化寡糖的该混合物的合成的其他途径相关联。所述重组基因编码具有经修饰的表现或活性的内源蛋白，较佳所述内源蛋白过度表现；或所述重组基因编码异质引入且表现于该经修饰的细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。内源蛋白可在亦表现异源蛋白的细胞中具有经修饰的表现。
根据本发明的一较佳具体实例，所述表现模组中的每一者的表现为持续性的或借由天然诱导剂产生。如本文所用，持续性表现应理解为在生物体中连续转录的基因的表现。借由天然诱导剂产生的表现应理解为仅在宿主的某一天然条件(例如生物体在分娩中或在泌乳期间)下表现的基因的兼性或调节表现，作为对环境变化(例如包括(但不限于)激素、热、冷、光、氧化或渗透应激/信号传导)的反应，或取决于发育阶段的位置或该宿主细胞的细胞周期，包括(但不限于)细胞凋亡及自体吞噬。
本发明提供不同类型的细胞以用于使用单个代谢上经工程改造的细胞以供包含四种或更多种中性未岩藻糖化寡糖的寡糖混合物的该生产。例而言，本发明提供一种细胞，其中该细胞表现两种不同糖基转移酶且该细胞合成一种单一核苷酸-糖，其为用于所述所表现的糖基转移酶两者的供体。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现三种不同糖基转移酶且该细胞合成一种单一核苷酸-糖，其为所有所述三种所表现的糖基转移酶的供体。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现两种不同糖基转移酶且该细胞合成两种不同核苷酸-糖，其中第一核苷酸-糖为用于第一糖基转移酶的供体且第二核苷酸-糖为用于第二糖基转移酶的供体。本发明亦提供一种细胞，其中该细胞表现三种或更多种糖基转移酶且该细胞合成一或多个不同核苷酸-糖，其为所有所述所表现的糖基转移酶的供体。
在本文所描述的方法及细胞中，细胞较佳包含编码一种蛋白质的同一编码DNA序列的多个复本。在本发明的上下文中，该蛋白可为糖基转移酶、膜蛋白或如本文所揭示的任何其他蛋白。在整个本申请案中，特征「多个(multiple)」意谓至少2个、较佳至少3个、更佳至少4个、甚至更佳至少5个。
在根据本发明的方法及/或细胞的一具体实例中，该混合物包含至少四种、较佳至少五种、更佳至少六种、甚至更佳至少七种、最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性未岩藻糖化寡糖。中性寡糖为不含有带负电单糖次单元的寡糖结构，该带负电单糖次单元包括通常称为唾液酸的N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)、葡萄糖醛酸盐及半乳糖醛酸盐。中性寡糖亦称为非酸性寡糖。唾液酸属于神经氨酸(5-胺基-3,5-二去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸)的衍生物家族。Neu5Gc为唾液酸的衍生物，其系借由Neu5Ac的C5处的N-乙酰基的羟基化形成。中性寡糖为非唾液酸化(non-sialylated)寡糖，且因此不含有酸性单糖次单元。中性未岩藻糖化寡糖为缺乏任何岩藻糖次单元的非带电未岩藻糖化寡糖。在整个申请案中，除非另外说明，否则特征「寡糖(oligosaccharide)」及「寡糖(oligosaccharides)」较佳分别经「一种MMO」及「多种MMO」替换，更佳地分别经「基于乳糖的MMO(lactose-based MMO)」及「多种基于乳糖的MMO(lactose-based MMOs)」替换，甚至更佳地分别经「一种HMO」及「多种HMO」替换。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，该混合物中的中性未岩藻糖化寡糖中的至少一者为哺乳动物乳寡糖(MMO)，较佳基于乳糖的哺乳动物乳寡糖，更佳人乳寡糖(HMO)。在一具体实例中，细胞在该所产生的至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物中产生一种哺乳动物乳寡糖。在一较佳具体实例中，细胞在该所产生的至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物中产生超过一种哺乳动物乳寡糖。在更佳具体实例中，所产生的至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物中的所有所述寡糖为哺乳动物乳寡糖。
在本发明的上下文中，根据本发明的至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物可包含如本文所描述的基于乳糖的中性未岩藻糖化寡糖、基于LNB的中性未岩藻糖化寡糖及/或基于LacNAc的中性未岩藻糖化寡糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一更佳具体实例中，该混合物包含至少四种、较佳至少五种、更佳至少六种、甚至更佳至少七种、最佳至少八种、至少九种、至少十种中性未岩藻糖化哺乳动物乳寡糖(MMO)、较佳基于乳糖的哺乳动物乳寡糖、更佳人乳寡糖(HMO)。在整个申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物(mixture comprising at least four different neutral non-fucosylatedoligosaccharides)」较佳用「包含至少四种不同中性未岩藻糖化MMO、较佳基于乳糖的MMO、更佳HMO的混合物(mixture comprising at least four different neutral non-fucosylated MMOs,preferably lactose-based MMOs,more preferably HMOs)」替换，同样，「包含至少五种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物(mixture comprising at leastfive different neutral non-fucosylated oligosaccharides)」较佳用「包含至少五种不同未中性岩藻糖化MMO、较佳基于乳糖的MMO、更佳HMO的混合物(mixture comprising atleast five different neutral non-fucosylated MMOs,preferably lactose-basedMMOs,more preferably HMOs)」替换，等等。在本发明的上下文中，根据本发明的一较佳具体实例的至少四种不同中性未岩藻糖化哺乳动物乳寡糖的混合物可包含其他寡糖，诸如哺乳动物乳寡糖及/或非哺乳动物乳寡糖。此类寡糖可例如为如本文所描述的基于乳糖的寡糖、基于LNB的寡糖及/或基于LacNAc的寡糖。在根据本发明的方法及/或细胞的替代及/或额外较佳具体实例中，哺乳动物乳寡糖构成根据本发明的寡糖混合物的至少50％、较佳至少60％、更佳至少70％、甚至更佳至少80％、甚至更佳至少90％。在根据本发明的方法及/或细胞的一更佳具体实例中，该混合物中的所有寡糖为MMO，较佳基于乳糖的MMO，更佳HMO。如本文中已陈述，如本文所揭示的混合物较佳为如本文所描述对细胞进行代谢工程改造的直接结果。
在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「至少一种」较佳用「一种」替换，同样地，特征「至少两种」较佳用「两种」替换，等等。
在根据本发明的方法及/或细胞的一视需要的具体实例中，根据本发明的混合物进一步包含LacDiNAc(亦即GalNAc-b1,4-GlcNAc)及/或GalNAc-b1,4-葡萄糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代具体实例中，寡糖混合物包含至少三种在聚合度(degree of polymerization；DP)方面不同的不同中性未岩藻糖化寡糖。寡糖的聚合度是指寡糖结构中存在的单糖单元的数目。如本文所用，寡糖的聚合度为三(DP3)或更高，后者包含4(DP4)、5(DP5)、6(DP6)或更长中的任一者。如本文所描述的寡糖混合物较佳地包含至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖，其中存在于该混合物中的至少三种、较佳全部寡糖彼此具有不同的聚合度。举例而言，该寡糖混合物是由四种中性未岩藻糖化寡糖组成，其中两种寡糖系聚合度为3(DP3)的三糖(trisaccharide)，第三种寡糖是聚合度为4(DP4)的四糖(tetrasaccharide)，且第四种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖(pentasaccharide)。在另一实例中，该寡糖混合物是由四种中性未岩藻糖化寡糖组成，其中第一种寡糖为聚合度为3(DP3)的三糖，第二种寡糖及第三种寡糖为聚合度为4(DP4)的四糖，且第四种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖。在另一实例中，该寡糖混合物是由四种中性未岩藻糖化寡糖组成，其中第一种寡糖为聚合度为3(DP3)的三糖，第二种寡糖为聚合度为4(DP4)的四糖，且第三种及第四种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖。在另一实例中，该寡糖混合物是由四种中性未岩藻糖化寡糖组成，其中所有所述四种寡糖具有不同聚合度，其中该第一种寡糖为聚合度为3(DP3)的三糖，其中该第二种寡糖为聚合度为4(DP4)的四糖，其中该第三种寡糖为聚合度为5(DP5)的五糖，且其中该第四种寡糖为聚合度为6(DP6)的六糖(hexasaccharide)。根据本发明的方法及/或细胞的一个具体实例，细胞生产包含五种不同中性未岩藻糖化寡糖或超过五种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物。在一个具体实例中，此类混合物包含至少五种不同寡糖，其中寡糖中的三者具有不同聚合度。在一个具体实例中，混合物中的所有所述寡糖具有如本文所描述的不同聚合度。
根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代具体实例，该混合物的所述中性未岩藻糖化寡糖中的至少一者经半乳糖化、糖基化、木糖基化、甘露糖基化，含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
较佳地，中性未岩藻糖化寡糖的混合物包含至少一种具有经由糖苷键彼此连接的三个或更多个单糖次单元的寡糖，其中所述单糖残基中的至少一者为GlcNAc残基。该寡糖可含有多于一个GlcNAc残基，例如两个、三个或更多个。GlcNAc可存在于寡糖的还原端处。该GlcNAc亦可存在于该寡糖的非还原端处。该GlcNAc亦可存在于寡糖结构内。GlcNAc可连接至其他单糖次单元，如例如半乳糖。
可替换地或附加地，中性未岩藻糖化寡糖混合物包含至少一种半乳糖化寡糖且含有至少一个半乳糖单糖次单元。该半乳糖化寡糖为包含至少三个经由糖苷键彼此连接的单糖次单元的糖结构，其中该单糖次单元中的至少一者为半乳糖。该半乳糖化寡糖可含有多于一个半乳糖残基，例如两个、三个或更多个。半乳糖可连接至包含葡萄糖及GlcNAc的其他单糖次单元。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代具体实例中，如本文所描述的混合物中各寡糖的相对丰度为至少5％、较佳至少10％。
在本发明的上下文中，如本文所揭示的该寡糖混合物较佳为如本文所描述的对细胞进行代谢工程改造的直接结果。此意谓，根据本发明的混合物中的寡糖中的较佳至少一种、更佳至少两种、甚至更佳至少三种、最佳全部不借由该代谢上经工程改造的细胞的野生型先驱细胞产生。
如本文所描述的寡糖的名称是根据如借由Urashima等人(Trends inGlycoscience and Glycotechnology,2018,第30卷,第72期,第SE51-SE65页)及其中的参考文献所公开且如「Prebiotics and Probiotics in human milk.Origins andFunctions of Milk-Borne Oligosaccharides and Bacteria」,第2及3章,编M.McGuire,M.McGuire,L.Bode,Elsevier,Academic Press,第506页)中所公开的寡糖名称及式。
在根据本发明的方法及/或细胞的一更佳具体实例中，混合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少四种、较佳至少五种、甚至更佳至少六种、甚至更佳至少七种、最佳至少八种、至少九种、至少十种不同中性未岩藻糖化寡糖，较佳选自以下：
基于乳糖的中性未岩藻糖化寡糖，较佳以下中的任一者：乳-N-丙糖(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖((LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖苷-对-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖苷-对-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(Gal-a1,4-乳糖)、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc(GalNAc-b1,3-乳糖)、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(球-N-四糖(globo-N-tetraose))、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、新生-LNT(GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc)、Gal-新生-LNP I(Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3-Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc)、Gal-新生-LNP II(Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、Gal-新生-LNP III(Gal-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc)、新生-LNO、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、LNH、LNnH、异-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、异-LND、GalNAc-a1,3-Gal-b1,4-Glc、新生-LNP I、异-LNT、DGalLNnH、galili五糖(galilipentasaccharide)，更佳以下中的任一者：乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖苷-对-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖苷-对-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(Gal-a1,4-乳糖)、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、GalNAc-b1,3-乳糖、球-N-四糖，最佳以下中的任一者：乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖；及/或
基于LNB的中性未岩藻糖化寡糖；及/或
基于LacNAc的中性未岩藻糖化寡糖，如例如LacDiNAc及聚-LacNAc。
在本发明的此上下文中的较佳混合物包含混合物，所述混合物包含至少四种、较佳至少五种、甚至更佳至少六种、甚至更佳至少七种、最佳至少八种、至少九种、至少十种选自包含以下者的清单的不同中性未岩藻糖化寡糖、由其组成或基本上由其组成：乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖苷-对-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖苷-对-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(Gal-a1,4-乳糖)、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc(GalNAc-b1,3-乳糖)、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(球-N-四糖)、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、新生-LNT(GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc)、Gal-新生-LNP I(Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3-Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc)、Gal-新生-LNP II(Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、Gal-新生-LNP III(Gal-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc)、新生-LNO、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、LNH、LNnH、异-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、异-LND、GalNAc-a1,3-Gal-b1,4-Glc、新生-LNP I、异-LNT、DGalLNnH、galili五糖、LacDiNAc及聚-LacNAc。
在本发明的此上下文中的更佳混合物包含混合物，所述混合物包含至少四种、较佳至少五种、甚至更佳至少六种、甚至更佳至少七种、最佳至少八种、至少九种、至少十种选自包含以下者的清单的不同中性未岩藻糖化寡糖、由其组成或基本上由其组成：乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖苷-对-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖苷-对-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(Gal-a1,4-乳糖)、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、GalNAc-b1,3-乳糖、球-N-四糖、LacDiNAc及聚-LacNAc。
在本发明的此上下文中的最佳混合物包含混合物，所述混合物包含至少四种、较佳至少五种、甚至更佳至少六种、甚至更佳至少七种、最佳至少八种、至少九种、至少十种选自包含以下者的清单的不同中性未岩藻糖化寡糖、由其组成或基本上由其组成：乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖及聚-LacNAc。
例示性混合物在本发明的此上下文中描述于实施例部分中。
为了生产如本文及在根据本发明的方法及/或细胞的一具体实例中所描述的基于乳糖的寡糖，可添加乳糖至培养中使得该细胞可经由被动或主动输送将其吸收；或可借由细胞生产乳糖(例如出于如所属技术领域中具有通常知识者已知的此目的对细胞进行代谢工程改造后)，较佳在胞内产生。乳糖可因此在合成哺乳动物乳寡糖或人乳寡糖(较佳所有基于乳糖的MMO或HMO)中用作受体，该乳糖较佳包含于如本文所描述的根据本发明的寡糖混合物中。产生乳糖的细胞可借由表现N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶获得。更佳地，细胞经修饰以用于增强乳糖产生。该修饰可为选自包含以下者的群组的任一或多者：N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶的过度表现、UDP-葡萄糖4-表异构酶的过度表现。或者，在糖基化反应中使用乳糖作为受体的细胞较佳具有用于自培养中吸收乳糖的转运蛋白。更佳地，将细胞最佳化以用于乳糖吸收。该最佳化可为乳糖转运蛋白的过度表现，该乳糖转运蛋白如来自例如大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)或酪蛋白乳酸杆菌(Lactobacillus casei)BL23的乳糖透过酶(permase)。较佳持续性地表现乳糖透过酶。乳糖可在培养开始时添加，或其可在培养的生长阶段期间已形成足够生物质时添加，亦即，MMO产生阶段(借由将乳糖添加至培养中开始)与生长阶段分离。在一较佳具体实例中，乳糖在培养开始时及/或期间添加，亦即生长阶段及产生阶段不分离。
在根据本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，当细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。在术语「乳糖杀灭(lactose killing)」的情况下，意指其中存在乳糖以及另一碳源的培养基中的细胞生长受阻。在一较佳具体实例中，细胞经遗传修饰以使得其保持至少50％的乳糖流入而不经受乳糖杀灭，甚至在高乳糖浓度下，如WO 2016/075243中所描述。该遗传修饰包含借由不产生乳糖杀灭表型的异源启动子表现及/或过度表现外源性及/或内源性乳糖转运蛋白基因，及/或修饰不产生乳糖杀灭表型的乳糖转运蛋白的密码子使用以产生该乳糖转运蛋白的改变的表现。在此方面WO2016/075243的内容以引用的方式并入。
为产生如本文及根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代具体实例中所描述的基于LNB的寡糖，可向培养中添加LNB(亦即乳-N-二糖，Gal-b1,3-GlcNAc)以使得该细胞可被动地或经由主动输送吸收；或LNB可借由细胞产生(例如出于如所属技术领域中具有通常知识者已知的此目的对细胞进行代谢工程改造后)，较佳在胞内产生。LNB可因此在合成基于LNB的寡糖(较佳所有基于LNB的寡糖)中用作受体，该LNB较佳包含于如本文所描述的根据本发明的寡糖混合物中。产生LNB的细胞可借由表现可修饰GlcNAc(在细胞中产生及/或被动地或经由主动输送吸收)以形成LNB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶获得。较佳地，产生LNB的细胞能够表现、较佳表现用于合成GlcNAc所需的酶，诸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶，较佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶及磷酸酶(较佳地，HAD类磷酸酶)，如例如以下中的任一者：大肠杆菌基因，包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU；或来自恋臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的ScDOG1及来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的BsAraL，如WO18122225中所描述。较佳地，细胞代谢上经工程改造以用于产生LNB。更佳地，细胞代谢上经工程改造以用于增强产生LNB。细胞较佳经修饰以表现及/或过度表现包含以下的多肽中的任一或多者：葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶。
在糖基化反应中使用LNB作为受体的细胞较佳地具有用于自培养中吸收LNB的转运蛋白。更佳地，将细胞最佳化以用于LNB吸收。该最佳化可为LNB转运蛋白的过度表现，该LNB转运蛋白如来自例如大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母菌或酪蛋白乳酸杆菌BL23的乳糖透过酶。较佳持续性地表现乳糖透过酶。LNB可在培养开始时添加，或其可在培养的生长阶段期间已形成足够生物质时添加，亦即，寡糖产生阶段(借由将LNB添加至培养中开始)与生长阶段分离。在一较佳具体实例中，LNB在培养开始时及/或期间添加，亦即生长阶段及产生阶段不分离。
为产生如本文及根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代具体实例中所描述的基于LacNAc的寡糖，可向培养中添加LacNAc(亦即N-乙酰基乳糖胺，Gal-b1,4-GlcNAc)以使得该细胞可被动地或经由主动输送吸收；或LacNAc可借由细胞产生(例如出于如所属技术领域中具有通常知识者已知的此目的对细胞进行代谢工程改造后)，较佳在胞内产生。LacNac可因此在合成基于LacNAc的寡糖(较佳所有基于LacNAc的寡糖)中用作受体，该LacNAc较佳包含于如本文所描述的根据本发明的寡糖混合物中。产生LacNAc的细胞可借由表现可修饰GlcNAc(在细胞中产生及/或被动地或经由主动输送吸收)以形成LacNAc的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶获得。较佳地，产生LacNAc的细胞能够表现、较佳表现用于合成GlcNAc所需的酶，诸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶，较佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶及磷酸酶(较佳地，如本文所描述的HAD类磷酸酶)。较佳地，细胞代谢上经工程改造以用于产生LacNAc。更佳地，细胞代谢上经工程改造以用于增强产生LacNAc。细胞较佳经修饰以表现及/或过度表现包含以下的多肽中的任一或多者：葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶。
在糖基化反应中使用LacNAc作为受体的细胞较佳具有用于自培养中吸收LacNAc的转运蛋白。更佳地，将细胞最佳化以用于LacNAc吸收。该最佳化可为LNB转运蛋白的过度表现，该LNB转运蛋白如来自大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母菌或酪蛋白乳酸杆菌BL23的乳糖透过酶。较佳持续性地表现乳糖透过酶。LacNAc可在培养开始时添加，或其可在培养的生长阶段期间已形成足够生物质时添加，亦即，寡糖产生阶段(借由将LacNAc添加至培养中开始)与生长阶段分离。在一较佳具体实例中，LacNAc在培养开始时及/或期间添加，亦即生长阶段及产生阶段不分离。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代较佳具体实例中，该细胞能够表现、较佳表现如本文所描述的至少两种、较佳至少三种、更佳至少四种、甚至更佳至少五种、甚至更佳至少六种、最佳至少七种糖基转移酶。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代较佳具体实例中，所述糖基转移酶中的至少一者、较佳至少两者、更佳全部参与包含至少四种不同寡糖的该混合物的产生。
在根据本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代较佳具体实例中，所述糖基转移酶中的任一者较佳选自包含以下者的清单：半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖胺基转移酶、鼠李糖基转移酶、木糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖胺基转移酶，如本文所定义。
在一较佳具体实例中，该半乳糖基转移酶是选自包含以下的清单：β-1,3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶及α-1,4-半乳糖基转移酶。在另一较佳具体实例中，该葡萄糖基转移酶系选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1,2-葡萄糖基转移酶、β-1,3-葡萄糖基转移酶及β-1,4-葡萄糖基转移酶。在另一较佳具体实例中，该甘露糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1,2-甘露糖基转移酶、α-1,3-甘露糖基转移酶及α-1,6-甘露糖基转移酶。在另一较佳具体实例中，该N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶是选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶及β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶。在另一较佳具体实例中，该N-乙酰基半乳糖胺基转移酶系选自包含以下者的清单：α-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶及β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，细胞在所述糖基转移酶中的至少一者、较佳至少两者、更佳所有的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，该糖基转移酶为具有修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源性糖基转移酶经过度表现；或者，该糖基转移酶是异质引入且表现于该细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。该内源性糖基转移酶可在亦表现异源性糖基转移酶的细胞中具有经修饰的表现。
在本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，所述糖基转移酶中的至少一者、较佳至少两者为N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶且该细胞能够合成UDP-GlcNAc。UDP-GlcNAc可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。产生UDP-GlcNAc的此类细胞可表现将例如添加至细胞中的GlcNAc转化为UDP-GlcNAc的酶。此等酶可为来自包括智人、大肠杆菌的若干物种的N-乙酰基-D-葡萄糖胺激酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺变位酶及N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶。或者，细胞可(较佳代谢上经工程改造以)表现用于合成GlcNAc所需的酶，诸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、磷酸酶、糖基转移酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶及UDP-葡萄糖4-表异构酶，较佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶及磷酸酶(较佳地，HAD类磷酸酶，如本文所描述)。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，该细胞能够表现选自β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶及β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶的至少一种、较佳至少两种N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶。较佳地，所述N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶是选自以下的生物体：如例如奈瑟氏菌属(Neisseria)物种，如例如脑膜炎奈瑟氏菌、乳酸奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、多糖奈瑟氏菌(Neisseria polysaccharea)、长奈瑟氏菌(Neisseria elongata)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、微黄奈瑟氏菌(Neisseria subflava)；巴氏杆菌物种，如例如达可马巴氏杆菌；新根瘤菌属(Neorhizobium)物种，如例如山羊豆根瘤菌(Neorhizobium galegae)；嗜血杆菌属物种，如例如副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌；智人；小家鼠。
较佳地，细胞经修饰以产生UDP-GlcNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-GlcNAc产生。该修饰可为选自包含以下者的群组的任一或多者：N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶的基因剔除、L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶的过度表现、磷酸葡萄糖胺变位酶的过度表现以及N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的过度表现。在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「经增强(enhanced)」及/或『最佳化(optimized)』生产较佳意谓如本文所描述在细胞中引入的修饰及/或代谢工程改造与该经修饰的细胞或代谢上经工程改造的细胞的野生型先驱细胞相比引起更高的生产产量。举例而言，「经增强的UDP-GlcNAc生产(an enhanced UDP-GlcNAcproduction)」较佳意谓与不含有此等特定修饰的野生型先驱细胞相比，经修饰细胞中的UDP-GlcNAc的胞内生产较高。
较佳地，细胞在此上下文中包含如本文所描述的N-乙酰基葡萄糖胺碳水化合物途径。
在本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，所述糖基转移酶中的至少一者、较佳至少两者为半乳糖基转移酶且该细胞能够合成UDP-Gal。UDP-Gal可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。产生UDP-Gal的此类细胞可表现将例如UDP-葡萄糖转化为UDP-Gal的酶。此酶可例如为如自包括智人、大肠杆菌及褐鼠的若干物种已知的UDP-葡萄糖-4-表异构酶GalE。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，该细胞能够表现选自β-1,3-半乳糖基转移酶及β-1,4-半乳糖基转移酶的至少一种、较佳至少两种半乳糖基转移酶，及/或该细胞能够表现选自α-1,3-半乳糖基转移酶及α-1,4-半乳糖基转移酶的至少一种、较佳至少两种半乳糖基转移酶。较佳地，所述半乳糖基转移酶是选自以下的生物体，如例如大肠杆菌物种，如例如大肠杆菌O55:H7、大肠杆菌DEC1B、大肠杆菌DEC1D；奈瑟氏菌属物种，如例如脑膜炎奈瑟氏菌、乳酸奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌、长奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、微黄奈瑟氏菌；金氏菌属物种，如例如脱氮金氏菌(Kingella denitrificans)；布氏杆菌属(Brucella)物种，如例如犬布氏杆菌(Brucella canis)、猪布氏杆菌(Brucella suis)；沙门氏菌属物种，如例如肠沙门氏菌、氧化亚铁假高炳根氏菌(Pseudogulbenkiana ferrooxidan)、麸氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；链球菌属物种；阿拉伯芥；智人；小家鼠。
较佳地，细胞经修饰以产生UDP-Gal。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-Gal产生。该修饰可为选自包含以下的群组的任一或多者：双功能性5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶编码基因的基因剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶编码基因的基因剔除及UDP-葡萄糖-4-表异构酶编码基因的过度表现。
较佳地，细胞在此上下文中包含如本文所描述的半乳糖基化途径。
在本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，所述糖基转移酶中的至少一者、较佳至少两者为N-乙酰基半乳糖胺基转移酶且该细胞能够合成UDP-GalNAc。UDP-GalNAc可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。产生UDP-GalNAc的此类细胞可表现将例如UDP-葡萄糖转化为UDP-Gal的酶。此酶可例如为如自包括智人、大肠杆菌及褐鼠的若干物种已知的UDP-葡萄糖-4-表异构酶GalE。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，该细胞能够表现选自α-1,3--N-乙酰基半乳糖胺基转移酶及β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶的至少一种、较佳至少两种N-乙酰基半乳糖胺基转移酶。较佳地，所述N-乙酰基半乳糖胺基转移酶系选自以下的生物体，如例如螺旋杆菌属物种，如例如鼬鼠螺旋杆菌；嗜血杆菌属物种，如例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；奈瑟氏菌属物种，如例如脑膜炎奈瑟氏菌、乳糖奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌、长奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、微黄奈瑟氏菌；立克次体属(Rickettsia)物种，如例如贝氏立克次体(Rickettsia bellii)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、日本立克次体(Rickettsia japonica)、康氏立克次体(Rickettsia conorii)、猫立克次体(Rickettsia felis)、马赛立克次体(Rickettsiamassiliae)；智人；小家鼠。较佳地，细胞经修饰以产生UDP-GalNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-GalNAc产生。该修饰可为选自包含以下者之的群组的任一或多者：双功能性5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶编码基因的基因剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶编码基因的基因剔除及UDP-葡萄糖-4-表异构酶编码基因的过度表现。
较佳地，细胞在此上下文中包含如本文所描述的N-乙酰基半乳糖胺基化途径。
在整个本申请案中，每当例如借由提及SEQ ID NO亦即独特数据库编号(例如UNIPROT编号)或借由提及来源的特定生物体揭示蛋白质时，该蛋白质具体实例可较佳经以下具体实例中的任一个、较佳全部置换(且因此认为该蛋白质根据所有以下具体实例揭示)：
蛋白质(例如借由提及SEQ ID NO亦即独特数据库编号(例如UNIPROT编号)或借由提及来源的特定生物体)，
与该蛋白质的全长具有至少80％整体序列一致性的该蛋白质的功能同源物、变异体或衍生物，
该蛋白质的功能片段且具有相同活性，或
包含多肽，该多肽包含与该蛋白质的全长氨基酸序列具有至少80％序列一致性且具有相同活性的氨基酸序列或由其组成。
举例而言，当揭示「来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)(galactoside beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase(LgtA)from N.meningitidis(UniProt ID Q9JXQ6))」时，该具体实例较佳经以下具体实例中的任一者、较佳全部置换：
来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)，
包含根据UniProt ID Q9JXQ6的多肽序列的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶，
UniProt ID Q9JXQ6的功能同源物、变异体或衍生物，其与具有半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶活性的UniProt ID Q9JXQ6的全长具有至少80％整体序列一致性，
UniProt ID Q9JXQ6且具有半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶活性的功能片段，或
包含多肽，该多肽包含与该UniProt ID Q9JXQ6的全长氨基酸序列具有至少80％序列一致性且具有半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶活性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，该细胞能够合成所述核苷酸-糖中的任一者，所述核苷酸-糖选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。在一较佳具体实例中，细胞能够合成两种核苷酸-糖。在更佳具体实例中，细胞能够合成至少三种核苷酸活化糖。在一甚至更佳具体实例中，细胞能够合成至少四种核苷酸活化糖。在一最佳具体实例中，细胞能够合成至少五种核苷酸活化糖。在另一较佳具体实例中，该细胞代谢上经工程改造以用于产生核苷酸-糖。在另一较佳具体实例中，细胞经修饰及/或经工程改造以用于核苷酸-糖的最佳化产生，亦即如本文所描述的核苷酸-糖的增强产生。在更佳具体实例中，该细胞代谢上经工程改造以用于产生两种核苷酸-糖。在一甚至更佳具体实例中，该细胞代谢上经工程改造以用于产生三种或更多种核苷酸活化糖。
在本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，细胞表现一或多种多肽，该一或多种多肽选自包含以下者的清单：L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶。
在根据本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，根据本发明的至少四种不同寡糖的混合物可借由提供一种用于产生基于乳糖的中性未岩藻糖化寡糖的细胞来产生，该细胞1)能够自如本文所描述的培养中吸收乳糖或能够在借由如本文所描述的b-1,4-半乳糖基转移酶的作用吸收葡萄糖后产生乳糖；及2)能够表现如本文所描述的N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶，较佳半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶；3)视情况能够表现至少一种、较佳至少两种如本文所描述的半乳糖基转移酶，所述半乳糖基转移酶选自包含以下者的清单：N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶、α-1,4-半乳糖基转移酶；及4)视情况能够表现至少一种、较佳至少两种如本文所描述的N-乙酰基半乳糖胺基转移酶，所述N-乙酰基半乳糖胺基转移酶选自包含α-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶及β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶的清单及5)能够合成所述糖基转移酶(若存在)中的每一者的核苷酸-糖。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，根据本发明的至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物可借由提供一种用于产生基于LNB的中性未岩藻糖化寡糖的细胞来产生，该细胞能够产生如本文所描述的LNB或能够自培养吸收LNB；且能够合成UDP-Gal。
在根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，根据本发明的至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物可借由提供一种用于产生基于LacNAc的中性未岩藻糖化寡糖的细胞来产生，该细胞能够产生如本文所描述的LacNAc或能够自培养吸收LacNAc；且能够合成UDP-Gal。
根据本发明的例示性方法及细胞描述于实施例部分中。强调此等实施例显示产生特定混合物的至少一种方式。所属技术领域中具有通常知识者应了解，若所表现酶中的任一者具有相同催化活性，较佳在类似程度上，该活性可经由常规实验容易地评估，则所述所表现酶中的任一者可经另一种酶置换，其中酶的活性与如本文所揭示的参考酶(例如基质的试管内转化)的活性相比。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者，更佳所述寡糖中的全部，借由被动运输亦即无需借助于主动输送系统消耗来自该细胞的能量而易位至细胞外部。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞使用至少一种前驱体用于产生所述寡糖中的任一或多者。如本文所揭示的定义中所解释，应了解术语「前驱体(precursor)」。在更佳具体实例中，细胞使用两种或更多种用于产生所述寡糖中的任一或多者的前驱体。
在本发明方法的一较佳具体实例中，向培养中馈入前驱体及/或受体以用于合成该混合物中的所述寡糖中的任一者。如本文所揭示的定义中所解释，应了解术语「受体(acceptor)」。在该方法的另一较佳具体实例中，向培养中馈入至少两种前驱体及/或受体以用于合成混合物中的所述寡糖中的任一或多者、较佳全部。若使用同一分类的两种或更多种糖基转移酶，其具有不同亲和力(例如一种对乳糖具有亲和力的糖基转移酶及另一种对乳-N-二糖具有亲和力的糖基转移酶)用于产生根据本发明的寡糖的混合物，则此可为适用的。
在如本文所描述的方法及/或细胞的另一具体实例中，细胞产生用于产生所述寡糖中的任一者的前驱体。在一较佳具体实例中，该细胞产生一或多种用于合成该寡糖混合物的前驱体。在更佳具体实例中，该细胞经修饰以用于所述前驱体中的任一者的最佳化产生，以用于合成所述寡糖中的任一者。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，至少一种用于产生所述寡糖中的任一者的前驱体完全转化为所述寡糖中的任一者。在更佳具体实例中，细胞将所述前驱体中的任一者完全转化为所述寡糖中的任一者。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，细胞经进一步代谢工程改造以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外部分泌所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者。该细胞可表现所述膜蛋白中的一者，所述膜蛋白参与将所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者自该细胞分泌至该细胞外部。该细胞亦可表现所述膜蛋白中的多于一者。所述膜蛋白中的任一者可将所述中性未岩藻糖化寡糖中的一或多者易位至该细胞外部。产生至少四种中性未岩藻糖化寡糖的混合物的该细胞可使所述寡糖中的任一者易位，所述寡糖包含被动扩散体(passive diffusion)、通道膜蛋白、膜转运蛋白、膜载体蛋白。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，细胞经进一步代谢工程改造以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一个的前驱体及/或受体。该细胞可表现所述膜蛋白中的一者，其参与吸收用于合成所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者的任何类型的前驱体及/或受体。该细胞亦可表现所述膜蛋白中的多于一者，所述膜蛋白参与吸收所述前驱体及/或受体中的至少一者。该细胞可经修饰以用于吸收多于一种用于合成所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一个的前驱体及/或受体。
在本发明的方法及/或细胞的一更佳具体实例中，膜蛋白是选自包含以下者的清单：运输蛋白、P-P-键水解驱动的转运蛋白、β-桶状孔蛋白、辅助转运蛋白、推定转运蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白。在本发明的方法及/或细胞的甚至更佳具体实例中，运输蛋白包含MFS转运蛋白、糖流出转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳具体实例中，P-P-键水解驱动的转运蛋白包含ABC转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，膜蛋白提供所述寡糖中的任一者、较佳所述寡糖中的全部的经改善生产。在本发明的方法及/或细胞的替代及/或额外较佳具体实例中，膜蛋白使所述寡糖中的任一者、较佳所述寡糖中的全部能够流出。在本发明的方法及/或细胞的替代及/或额外较佳具体实例中，膜蛋白提供所述寡糖中的任一者、较佳所述寡糖中的全部的经增强流出。
在本发明的方法及/或细胞的一更佳具体实例中，细胞表现属于MFS转运蛋白家族的膜蛋白，所述转运蛋白如例如来自包含大肠杆菌(UniProt ID P0AEY8)、莫金斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)(UniProt ID D4BC23)及雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)(UniProtID G9Z5F4)的物种的多药转运蛋白MdfA家族的MdfA多肽。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳具体实例中，细胞表现属于糖流出转运蛋白家族的膜蛋白，所述转运蛋白如例如来自包含大肠杆菌(UniProt ID P31675)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)(UniProtID A0A078LM16)及肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)(UniProt IDA0A0C4MGS7)的物种的SetA家族的SetA多肽。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳具体实例中，细胞表现属于螯铁蛋白输出蛋白家族的膜蛋白，所述输出蛋白如例如大肠杆菌entS(UniProt ID P24077)及大肠杆菌iceT(UniProt ID A0A024L207)。在本发明的方法及/或细胞的另一更佳具体实例中，细胞表现属于ABC转运蛋白家族的膜蛋白，所述转运蛋白如例如来自大肠杆菌的oppF(UniProt ID P77737)、来自乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰基乳酸变种(Lactococcus lactis subsp.lactis bv.diacetylactis)的lmrA(UniProt IDA0A1V0NEL4)及来自长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的Blon_2475(UniProt ID B7GPD4)。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞赋予增强的噬菌体抗性。噬菌体抗性的该增强可源自内源膜蛋白的降低的表现及/或内源膜蛋白编码基因的突变。术语「噬菌体不敏感性(phage insensitive)」或「抗噬菌体(phage resistant)」或「噬菌体抗性(phage resistance)」或「抗噬菌体概况(phage resistant profile)」应理解为意指对借由噬菌体及/或生长抑制的感染及/或杀灭较不敏感且较佳不敏感的细菌菌株。如本文所用，术语「抗噬菌体活性(anti-phage activity)」或「对借由至少一种噬菌体的感染具抗性(resistant to infection by at least one phage)」是指表现功能性噬菌体抗性系统的细菌细胞相比于不表现功能性噬菌体抗性系统的相同发育阶段(例如培养状态)下的相同物种的细菌细胞对借由至少一种噬菌体家族的感染的抗性增加，如可借由例如细菌活力、噬菌体溶原性、噬菌体基因体复制及噬菌体基因体降解所确定。噬菌体可为裂解噬菌体或温和(溶原性(lysogenic))噬菌体。涉及细胞的噬菌体抗性的膜蛋白包含OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、BtuB、TolC、LamB、FhuA、TonB、FadL、Tsx、FepA、YncD、PhoE及NfrA及其同源物。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞赋予降低的黏度。细胞黏度降低可借由经修饰的细胞壁生物合成获得。细胞壁生物合成可经修饰，包含例如聚-N-乙酰基-葡萄糖胺、肠内菌共同抗原、纤维素、可拉酸(colanic acid)、核心寡糖(coreoligosaccharide)、渗透调节周质葡聚糖及甘油葡萄糖苷(glucosylglycerol)、聚糖及海藻糖(trehalose)的合成减少或消除。
根据本发明的方法及/或细胞的另一具体实例，细胞能够产生磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，与未经修饰的先驱细胞相比，细胞经修饰以用于PEP的经增强产生及/或供应。
在一较佳具体实例中且作为用于PEP的经增强产生及/或供应的手段，一或多种PEP依赖型、糖输送磷酸转移酶系统被破坏，诸如(但不限于)：1)N-乙酰基-D-葡萄糖胺Npi-磷酸转移酶(EC 2.7.1.193)，其举例而言由大肠杆菌或芽孢杆菌物种中的nagE基因(或簇nagABCD)编码，2)ManXYZ，其编码输入外源性己糖(甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺、果糖、2-去氧葡萄糖、甘露糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺等)及释放磷酸至细胞细胞质中的酶ll Man复合物(甘露糖PTS透过酶、蛋白质-Npi-磷酸组氨酸-D-甘露糖磷酸转移酶)，3)葡萄糖特异性PTS转运蛋白(举例而言由PtsG/Crr编码)，其在细胞质中吸收葡萄糖且形成葡萄糖-6-磷酸盐，4)蔗糖特异性PTS转运蛋白，其在细胞质中吸收蔗糖且形成蔗糖-6-磷酸盐，5)果糖特异性PTS转运蛋白(举例而言由基因fruA及fruB编码及激酶fruK编码，该激酶fruK在第一步骤中吸收果糖且形成果糖-1-磷酸盐且在第二步骤中形成果糖1,6二磷酸盐，6)乳糖PTS转运蛋白(举例而言由干酪乳球菌(Lactococcus casei)中的lacE编码)，其吸收乳糖且形成乳糖-6-磷酸盐，7)半乳糖醇特异性PTS酶，其吸收半乳糖醇及/或山梨醇且分别形成半乳糖醇-1-磷酸盐或山梨醇-6-磷酸盐，8)甘露糖醇特异性PTS酶，其吸收甘露糖醇及/或山梨醇且分别形成甘露糖醇-1-磷酸盐或山梨醇-6-磷酸盐，及9)海藻糖特异性PTS酶，其吸收海藻糖且形成海藻糖-6-磷酸盐。
在另一及/或额外较佳具体实例中及作为用于PEP的经增强生产及/或供应的手段，借由破坏PtsIH/Crr基因簇来破坏完整PTS系统。PtsI(酶I)为充当大肠杆菌K-12的磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸转移酶系统(PTS糖)的闸道的细胞质蛋白。PtsI为PTS糖的两个(PtsI及PtsH)糖非特异性蛋白成分中的一者，其与糖特异性内膜透过酶一起影响引起多种碳水化合物基质的耦合磷酸化及输送的磷酸转移级联。HPr(含有组氨酸的蛋白质)为PTS糖的两种糖非特异性蛋白质成分中的一种。其接受来自磷酸化酶I(PtsI-P)的磷酰基且接着将其转移至PTS糖的许多糖特异性酶(统称为酶II)中的任一者的EIIA域。在需要PtsH及PtsI的反应中，Crr或EIIAGlc由PEP磷酸化。
在另一及/或额外较佳具体实例中，细胞进一步修饰以借由对应透过酶的引入及/或过度表现来补偿碳源的PTS系统的缺失。此等为例如透过酶或ABC转运蛋白，其包含但不限于特异性地输入乳糖的转运蛋白，诸如由来自大肠杆菌的LacY基因编码的转运蛋白；输入蔗糖的转运蛋白，诸如由来自大肠杆菌的cscB基因编码的转运蛋白；输入葡萄糖的转运蛋白，诸如由来自大肠杆菌的galP基因编码的转运蛋白；输入果糖的转运蛋白，诸如由来自变形链球菌(Streptococcus mutans)的fruI基因编码的转运蛋白；或为山梨醇/甘露糖醇ABC转运蛋白，诸如由类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的簇SmoEFGK编码的转运蛋白；海藻糖/蔗糖/麦芽糖转运蛋白，诸如由苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的基因簇ThuEFGK编码的转运蛋白；及N-乙酰基葡萄糖胺/半乳糖/葡萄糖转运蛋白，诸如由奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)的NagP编码的转运蛋白。PTS缺失与替代转运蛋白的过度表现的组合的实例为：1)葡萄糖PTS系统(例如ptsG基因)的缺失与葡萄糖透过酶(例如glcP的galP)的引入及/或过度表现组合，2)果糖PTS系统(例如fruB、fruA、fruK基因中的一或多者)的缺失与果糖透过酶(例如fruI)的引入及/或过度表现组合，3)乳糖PTS系统的缺失与乳糖透过酶(例如LacY)的引入及/或过度表现组合，及/或4)蔗糖PTS系统的缺失与蔗糖透过酶(例如cscB)的引入及/或过度表现组合。
在另一较佳具体实例中，细胞经修饰以借由引入碳水化合物激酶，诸如葡萄糖激酶(EC 2.7.1.1、EC 2.7.1.2、EC 2.7.1.63)、半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)及/或果糖激酶(EC2.7.1.3、EC 2.7.1.4)来补偿碳源的PTS系统的缺失。PTS缺失与替代转运蛋白及激酶的过度表现的组合的实例为：1)葡萄糖PTS系统(例如ptsG基因)的缺失，与葡萄糖透过酶(例如glcP的galP)的引入及/或过度表现组合，与葡萄糖激酶(例如glk)的引入及/或过度表现组合，及/或2)果糖PTS系统(例如fruB、fruA、fruK基因中的一或多者)的缺失，与果糖透过酶(例如fruI)的引入及/或过度表现组合，与果糖激酶(例如frk或mak)的引入及/或过度表现组合。
在另一及/或额外较佳具体实例中且作为用于PEP的经增强产生及/或供应的手段，细胞借由引入包含以下者的清单中的任一或多者或在包含以下者的清单中的任一或多者方面进行修饰来修饰：磷酸烯醇丙酮酸合酶活性(EC:2.7.9.2，举例而言在大肠杆菌中借由ppsA编码)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性(EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49，举例而言分别在麸氨酸棒状杆菌中借由PCK编码或在大肠杆菌中借由pckA编码)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性(EC 4.1.1.31，举例而言在大肠杆菌中借由ppc编码)；草酰乙酸脱羧酶活性(EC4.1.1.112，举例而言在大肠杆菌中借由eda编码)；丙酮酸激酶活性(EC 2.7.1.40，举例而言在大肠杆菌中借由pykA及pykF编码)；丙酮酸羧化酶活性(EC 6.4.1.1，举例而言在枯草芽孢杆菌中借由pyc编码)；及苹果酸脱氢酶活性(EC 1.1.1.38或EC1.1.1.40，举例而言在大肠杆菌中分别借由maeA或maeB编码)。
在更佳具体实例中，细胞经修饰以过度表现所述多肽中的任一或多者，所述多肽包含来自大肠杆菌的ppsA(UniProt ID P23538)、来自麸氨酸棒状杆菌的PCK(UniProt IDQ6F5A5)、来自大肠杆菌的pcka(UniProt ID P22259)、来自大肠杆菌的eda(UniProt IDP0A955)、来自大肠杆菌的maeA(UniProt ID P26616)及来自大肠杆菌的maeB(UniProt IDP76558)。
在另一及/或额外较佳具体实例中，细胞经修饰以表现具有磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、草酰乙酸脱羧酶活性或苹果酸脱氢酶活性的任一或多种多肽。
在另一及/或额外较佳具体实例中且作为用于PEP的经增强产生及/或供应的手段，细胞借由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶活性的降低活性，较佳缺失编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶的基因加以修饰。
在例示性具体实例中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、苹果酸脱氢酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、苹果酸脱氢酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合及/或苹果酸脱氢酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合，磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合及/或磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经遗传修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例，与未经修饰的先驱细胞相比，细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。该修饰可为选自包含以下的群组的任何一或多个：乙酰基-辅酶A合成酶的过度表现、完全或部分剔除丙酮酸脱氢酶或致使其功能较弱及完全或部分剔除乳酸脱氢酶或致使其功能较弱。
在本发明的方法及/或细胞的另一具体实例中，细胞在至少一种乙酰基-辅酶A合成酶的表现或活性方面经修饰，所述合成酶如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人、小家鼠的acs。在一较佳具体实例中，该乙酰基-辅酶A合成酶为具有修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源性乙酰基-辅酶A合成酶经过度表现；或者，该乙酰基-辅酶A合成酶系异质引入且表现于该细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。该内源性乙酰基-辅酶A合成酶可在亦表现异源性乙酰基-辅酶A合成酶的细胞中具有经修饰的表现。在更佳具体实例中，细胞在来自大肠杆菌的乙酰基-辅酶A合成酶acs(UniProt ID P27550)的表现或活性方面经修饰。在另一及/或额外较佳具体实例中，细胞在来自大肠杆菌的acs(UniProt ID P27550)的功能同源物、变异体或衍生物的表现或活性方面经修饰，该功能同源物、变异体或衍生物与来自大肠杆菌的该多肽(UniProt ID P27550)的全长具有至少80％整体序列一致性且具有乙酰基-辅酶A合酶活性。
在本发明的方法及/或细胞的替代性及/或额外其他具体实例中，细胞在至少一种如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人及褐鼠的丙酮酸脱氢酶的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，细胞已经修饰以借由所属领域中具有通常知识者通常已知的方式具有至少一种部分或完全剔除或突变的丙酮酸脱氢酶编码基因，从而产生至少一种功能较小或丙酮酸脱氢酶活性失能的蛋白质。在更佳具体实例中，细胞在poxB编码基因方面具有完全剔除，从而导致细胞缺乏丙酮酸脱氢酶活性。
在本发明的方法及/或细胞的替代性及/或额外其他具体实例中，细胞在至少一种如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人及褐鼠的乳酸脱氢酶的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，细胞已经修饰以借由所属领域中具有通常知识者通常已知的方式具有至少一种部分或完全剔除或突变的乳酸脱氢酶编码基因，从而产生至少一种功能较小或乳酸脱氢酶活性失能的蛋白质。在更佳具体实例中，细胞在ldhA编码基因方面具有完全剔除，从而导致细胞缺乏乳酸脱氢酶活性。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例，与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下的蛋白质中的任一或多种：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶(phosphoacyltransferase)、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例，细胞包含对于所选单糖、双糖或寡糖的分解代谢途径，该分解代谢途径至少部分不活化，所述单糖、双糖或寡糖参与来自该混合物的所述寡糖中的任一种的生产及/或为该生产所需的。
本发明的另一具体实例提供一种方法及一种细胞，其中包含至少三种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物在如本文所描述的真菌、酵母菌、细菌、昆虫、动物、植物及原虫细胞中及/或借由其产生。细胞是选自包含细菌、酵母菌、原虫或真菌的清单，或是指植物或动物细胞。后者的细菌较佳属于变形菌(Proteobacteria)门或厚壁菌(Firmicutes)门或蓝菌(Cyanobacteria)门或异常球菌-栖热菌(Deinococcus-Thermus)门。属于变形菌门之后者的细菌较佳属于肠细菌科，较佳属于大肠杆菌种。后者的细菌较佳是关于属于大肠杆菌种的任何菌株，诸如但不限于大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌W、大肠杆菌K12、大肠杆菌Nissle。更特定言之，后者的术语是关于经培养的大肠杆菌菌株(命名为大肠杆菌K12菌株)，其良好适于实验室环境，且不同于野生型菌株，已损失其在肠中茁壮成长的能力。大肠杆菌K12菌株的熟知实例为K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111及AA200。因此，本发明特定关于如上文所指示的突变及/或转形的大肠杆菌细胞或菌株，其中该大肠杆菌菌株为K12菌株。更佳地，大肠杆菌K12菌株为大肠杆菌MG1655。属于厚壁菌门之后者的细菌较佳属于杆菌纲(Bacilli)，较佳具有诸如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的成员的乳杆菌目(Lactobacilliales)，或具有诸如来自芽孢杆菌(Bacillus)属的成员，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的芽孢杆菌目(Bacillales)。属于放线菌(Actinobacteria)门的后者的细菌较佳属于具有成员麸氨酸棒状杆菌或非发酵棒状杆菌(C.afermentans)的棒状杆菌(Corynebacteriaceae)科，或属于具有成员灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或费氏链霉菌(S.fradiae)的链霉菌(Streptomycetaceae)科。后者的酵母菌较佳属于子囊菌(Ascomycota)门或担子菌(Basidiomycota)门或半知菌(Deuteromycota)门或接合菌(Zygomycetes)门。后者的酵母菌较佳属于酵母菌(Saccharomyces)属(具有如例如酿酒酵母、贝酵母(S.bayanus)、布拉酵母(S.boulardii)的成员)、毕赤酵母(Pichia)属(具有如例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、异常毕赤酵母(P.anomala)、克鲁维毕赤酵母(P.kluyveri)的成员)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(具有如例如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)、乳酒念珠菌(K.marxianus)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)的成员)、德巴利酵母属(Debaromyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)(如例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))或球拟假丝酵母属(Starmerella)(如例如熊蜂生球拟假丝酵母(Starmerella bombicola))。后者的酵母菌较佳选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)、酿酒酵母及乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。后者的真菌较佳属于根霉菌属(Rhizopus)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)。
植物细胞包括开花及非开花植物的细胞，以及藻类细胞，例如单胞藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorella)等。较佳地，该植物为烟草、苜蓿、稻谷、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物。后者的动物细胞较佳衍生自非人类哺乳动物(例如牛、水牛、猪、绵羊、小鼠、大鼠)、鸟类(例如鸡、鸭、鸵鸟、火鸡、野鸡)、鱼类(例如剑鱼、鲑鱼、鲔鱼、海鲈、鳟鱼、鲶鱼)、无脊椎动物(例如龙虾、蟹、虾、蚌蛤、牡蛎、贻贝、海胆)、爬虫类(例如蛇、鳄鱼、龟)、两栖动物(例如蛙)或昆虫(例如蝇、线虫)或为衍生自排除胚胎干细胞的人类细胞的经遗传修饰的细胞系。人类及非人类哺乳动物细胞两者较佳选自包含以下的清单：上皮细胞如例如乳腺上皮细胞、胚胎肾细胞(例如HEK293或HEK 293T细胞)、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞如例如N20、SP2/0或YB2/0细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，诸如WO21067641中所描述。后者的昆虫细胞较佳衍生自：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)如例如Sf9或Sf21细胞、家蚕(Bombyx mori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)如例如BTI-TN-5B1-4细胞或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)如例如果蝇属S2细胞。后者的原虫细胞较佳为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞为存活的革兰氏阴性细菌，该细菌包含减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG)、肠内菌共同抗原(Enterobacterial CommonAntigen；ECA)、纤维素、可拉酸、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OsmoregulatedPeriplasmic Glucan；OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖。
在方法及/或细胞的一更佳具体实例中，该减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖是借由参与该聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖中的任一者的合成中的任一或多种糖基转移酶的突变提供，其中该突变提供所述糖基转移酶中的任一者的缺失或更低表现。所述糖基转移酶包含编码聚-N-乙酰基-D-葡萄糖胺合酶次单元的糖基转移酶基因、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺-十一异戊烯基-磷酸N-乙酰基葡萄糖胺磷酸转移酶、Fuc4NAc(4-乙酰胺基-4,6-二去氧-D-半乳糖)转移酶、UDP-N-乙酰基-D-甘露糖醛酸转移酶、编码纤维素合酶催化次单元的糖基转移酶基因、纤维素生物合成蛋白、可拉酸生物合成葡萄糖醛酸基转移酶、可拉酸生物合成半乳糖基转移酶、可拉酸生物合成岩藻糖基转移酶、UDP-葡萄糖:十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、推定可拉生物合成糖基转移酶、UDP-葡萄糖醛酸:LPS(HepIII)糖基转移酶、ADP-庚糖-LPS庚糖基转移酶2、ADP-庚糖:LPS庚糖基转移酶1、推定ADP-庚糖:LPS庚糖基转移酶4、脂多糖核心生物合成蛋白、UDP-葡萄糖:(葡萄糖基)LPSα-1,2-葡萄糖基转移酶、UDP-D-葡萄糖:(葡萄糖基)LPSα-1,3-葡萄糖基转移酶、UDP-D-半乳糖:(葡萄糖基)脂多糖-1,6-D-半乳糖基转移酶、脂多糖葡萄糖基转移酶I、脂多糖核心庚糖基转移酶3,β-1,6-半乳糖呋喃酮基转移酶、十一异戊烯基-磷酸4-去氧-4-甲酰胺基-L-阿拉伯糖转移酶、脂质IVA 4-胺基-4-去氧-L-阿拉伯糖基转移酶、细菌萜醇葡萄糖基转移酶、推定家族2糖基转移酶、渗透调节周质葡聚糖(OPG)生物合成蛋白G、OPG生物合成蛋白质H、葡萄糖基甘油酸酯磷酸化酶、肝糖合酶、1,4-α-葡聚糖分支酶、4-α-葡聚糖转移酶及海藻糖-6-磷酸合酶。在例示性具体实例中，该细胞在所述糖基转移酶中的任一或多者方面经突变，所述糖基转移酶包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP，其中该突变提供所述糖基转移酶中的任一者的缺失或更低表现。
在方法及/或细胞的替代及/或额外较佳具体实例中，聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)的该减少或消除合成借由碳储存调节器编码基因的过度表现、Na+/H+反向转运蛋白调节器编码基因的缺失及/或感测器组氨酸激酶编码基因的缺失提供。
如本文所用的微生物或细胞能够在单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油；包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨、酵母萃取物的复合培养基或其混合物(如例如混合原料，较佳混合单糖原料，如例如水解蔗糖)作为主要碳源上生长。术语「复合培养基(complexmedium)」意指其中精确构成并未确定的培养基。术语主要意指所关注生物产物、生物质形成、二氧化碳及/或副产物形成(诸如酸及/或醇，诸如乙酸盐、乳酸盐及/或乙醇)的最重要碳源，亦即所有所需碳的20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％均衍生自以上所指示碳源。在本发明的一个具体实例中，该碳源为该生物体的唯一碳源，亦即所有所需碳的100％衍生自以上所指示碳源。常见主要碳源包含(但不限于)葡萄糖、甘油、果糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽-寡糖、麦芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖浆、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐及丙酮酸盐。术语复合培养基意指其中精确构成并未确定的培养基。实例为糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物。
在另一较佳具体实例中，本文所描述的微生物或细胞使用具有如WO2012/007481中所描述的生产途径及生物质途径的分裂代谢，该文献以引用的方式并入本文中。该生物体可例如经遗传修饰以借由改变选自磷酸葡萄糖异构酶基因、磷酸果糖激酶基因、果糖-6-磷酸醛缩酶基因、果糖异构酶基因及/或果糖:PEP磷酸转移酶基因的基因来积聚果糖-6-磷酸盐。
根据本发明的方法的另一具体实例，容许产生混合物中的所述寡糖的条件包含使用培养基来培养本发明的细胞以产生该寡糖混合物，其中该培养基缺乏用于产生所述寡糖中的任一种的任何前驱体及/或受体，且与将至少一种前驱体及/或受体进料(acceptorfeed)进一步添加至该培养基进行组合以用于产生所述寡糖中的任一者，较佳地用于产生该混合物中的所述寡糖中的全部。
在一较佳具体实例中，用于产生如本文所描述的寡糖混合物的方法包含以下步骤中的至少一种：
i)使用包含至少一种前驱体及/或受体的培养基；
ii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍；
iii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，其中该总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的该时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
在另一及/或额外较佳具体实例中，用于产生如本文所描述的寡糖混合物的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)以一个脉冲或以不连续(经脉冲)方式向培养基中添加至少一种前驱体及/或受体，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料脉冲之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍；
iii)以一个脉冲或以不连续(经脉冲)方式在反应器中向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，其中该总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料脉冲之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料脉冲的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料脉冲的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、10小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以不连续(经脉冲)方式将至少一种前驱体及/或受体进料添加至培养基中；
v)历经5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、10小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以不连续(经脉冲)方式向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
在另一更佳具体实例中，用于产生如本文所描述的寡糖混合物的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每公升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)向该培养基添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中该总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
iii)向该培养基添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍，且其中较佳地，该乳糖进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该乳糖进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的该时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L、较佳75g/L、更佳100g/L、更佳125g/L、更佳150g/L、更佳175g/L、更佳200g/L、更佳225g/L、更佳250g/L、更佳275g/L、更佳300g/L、更佳325g/L、更佳350g/L、更佳375g/L、更佳400g/L、更佳450g/L、更佳500g/L、甚至更佳550g/L、最佳600g/L；且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一种。
较佳地，该乳糖进料是借由自该培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以>300mM的浓度添加乳糖来实现。
在另一具体实例中，乳糖进料是借由以一定浓度向培养基中添加乳糖，使得在该培养的整个生产阶段中获得至少5mM、较佳10mM或30mM的乳糖浓度来实现。
在本文所描述的方法的另一具体实例中，宿主细胞培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
在一较佳具体实例中，在培养基中提供碳源，较佳蔗糖，持续3天或更多天，较佳至多7天；及/或在培养基中以连续方式提供每升初始培养物体积至少100、有利至少105、更有利至少110、甚至更有利至少120克蔗糖，使得培养基的最终体积不超过培养之前的培养基的体积的三倍、有利不超过两倍、更有利小于两倍。
较佳地，当进行如本文所描述的方法时，指数式细胞生长的第一阶段是借由在将该较佳为乳糖的前驱体在第二阶段中添加至培养中之前将碳源、较佳葡萄糖或蔗糖添加至培养基中来提供。
在本发明的方法的另一较佳具体实例中，指数式细胞生长的第一阶段是借由将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至包含较佳为乳糖的前驱体的该培养基中来提供，之后为其中仅将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至培养中的第二阶段。
在本发明的方法的另一较佳具体实例中，指数式细胞生长的第一阶段是借由将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至包含较佳为乳糖的前驱体的该培养基中来提供，之后为其中将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质，及较佳为乳糖的前驱体添加至培养中的第二阶段。
在替代性较佳具体实例中，在如本文所描述的方法中，已在指数式生长的第一阶段中将前驱体与以碳为基础的基质一起添加。
在该方法的另一较佳具体实例中，培养基含有至少一种选自包含以下者的群组的前驱体：乳糖、半乳糖、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(LNB)及N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
根据本发明，如本文所描述的方法较佳包含自该培养分离所述寡糖中的任一或多者、较佳所述寡糖中的全部的步骤。
术语「自该培养分离(separating from said cultivation)」意谓自细胞及/或其生长的培养基中收获、收集或撷取所述寡糖中的任一者、较佳所述寡糖中的全部。
所述寡糖中的任一者可以习知方式自水性培养基分离，细胞在该水性培养基中生长。在该寡糖仍存在于生产寡糖混合物的细胞中的情况下，可使用用以自细胞中释放或萃取该寡糖的习知方式，诸如使用以下进行细胞破坏：高pH、热冲击、音波处理、法式压滤(French press)、均质化、酶促水解、化学水解、溶剂水解、洗涤剂、水解……培养基及/或细胞萃取物一起且分别可接着进一步用于分离该寡糖。此较佳涉及澄清该含有寡糖的混合物以移除悬浮粒子及污染物，尤其细胞、细胞组分、不可溶代谢物及由培养经遗传修饰的细胞产生的碎片。在此步骤中，可以习知方式澄清该含有寡糖的混合物。较佳地，该含有寡糖的混合物借由离心、絮凝、倾析及/或过滤澄清。将该寡糖与该含有寡糖的混合物分离的另一步骤较佳涉及将实质上所有蛋白质以及肽、氨基酸、RNA及DNA以及可能干扰后续分离步骤的任何内毒素及糖脂自该含有寡糖的混合物移除，较佳在已使其澄清之后。在此步骤中，蛋白质及相关杂质可以习知方式自该含有寡糖的混合物移除。较佳地，蛋白质、盐、副产物、染料、内毒素及其他相关杂质自该含有寡糖的混合物借由超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效能过滤、切向流超过滤、电泳(例如使用平板(slab)-聚丙烯酰胺或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE))、亲和层析(使用亲和配位体，包括例如DEAE-琼脂糖凝胶、聚-L-离氨酸及多黏菌素-B、内毒素-选择性吸附剂基质)、离子交换层析(诸如(但不限于)阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换、由内而外配位体连接)、疏水性交互作用层析及/或凝胶过滤(亦即粒径排阻层析)，特定言之借由层析，更特定言之借由离子交换层析或疏水性交互作用层析或配位体交换层析移除。除粒径排阻层析的外，借由层析介质或所选膜保留蛋白质及相关杂质，该寡糖保持在该含有寡糖的混合物中。
在另一较佳具体实例中，如本文所描述的方法亦提供进一步纯化来自寡糖混合物的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一或多者。所述寡糖的进一步纯化可例如借由使用(活性)木炭或碳、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换以移除任何残留DNA、蛋白质、LPS、内毒素或其他杂质来实现。亦可使用醇(诸如乙醇)及水醇(aqueous alcohol)混合物。另一纯化步骤借由产物的结晶、蒸发或沉淀实现。另一纯化步骤为对所生产的寡糖、较佳所生产的中性未岩藻糖化寡糖进行干燥，例如喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(band dry)、带式干燥(belt dry)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒(drum)干燥、滚筒(roller)干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
在例示性具体实例中，所产生的中性未岩藻糖化寡糖中的至少一者、较佳全部的分离及纯化是在一制程中进行，该制程包含以下按任何次序的步骤：
a)使培养物或其澄清形式与截留分子量(molecular weight cut-off；MWCO)为600-3500Da的纳米过滤膜接触，确保保留所产生的寡糖且使蛋白质、盐、副产物、染料及其他相关杂质中的至少一部分通过，
b)使用该膜，用无机电解质的水溶液对来自步骤a)的保留物进行透滤制程，继而视情况用纯水进行透滤以移除过量电解质，
c)及收集来自该电解质的阳离子的呈盐形式的所述寡糖富集的保留物。
在一替代性例示性具体实例中，在一制程中进行所产生的中性未岩藻糖化寡糖中的至少一种、较佳全部的分离及纯化，该制程包含以下按任何次序的步骤：使用不同膜使培养物或其澄清形式经受两种膜过滤步骤，其中
一个膜具有约300至约500道尔顿(Dalton)之间的截留分子量，及
另一膜，其截留分子量在约600至约800道尔顿之间。
在一替代性例示性具体实例中，在一制程中进行所产生的中性未岩藻糖化寡糖中的至少一者、较佳全部的分离及纯化，该制程包含以下按任何次序的步骤，所述步骤包含用呈H+形式的强阳离子交换树脂及呈自由碱形式的弱阴离子交换树脂处理培养物或其澄清形式的步骤。
在一替代性例示性具体实例中，以以下方式进行所产生的中性未岩藻糖化寡糖中的至少一者、较佳全部的分离及纯化。将包含所产生的寡糖、生物质、培养基组分及污染物的培养物施用于以下纯化步骤：
i)自培养物分离生物质，
ii)进行阳离子交换剂处理以用于移除带正电物质，
iii)进行阴离子交换剂处理以用于移除带负电物质，
iv)进行纳米过滤步骤及/或电渗析步骤，
其中提供一种包含所产生的寡糖的纯化溶液，其纯度大于或等于80％。视情况，纯化溶液借由选自包含以下者的清单的任一或多个干燥步骤干燥：喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥、带式干燥、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥及真空滚筒干燥。
在一替代性例示性具体实例中，在一制程中进行所产生的中性未岩藻糖化寡糖中的至少一种、较佳全部的分离及纯化，该制程包含以下按任何次序的步骤：对培养物进行酶处理；自培养物移除生物质；超过滤；纳米过滤；及进行管柱层析步骤。较佳地，此类管柱层析为单个管柱或多个管柱。更佳地，管柱层析步骤为模拟移动床层析。此类模拟移动床层析较佳包含i)至少4个管柱，其中至少一个管柱包含弱或强阳离子交换树脂；及/或ii)具有不同流速的四个区域I、II、III及IV；及/或iii)包含水的溶离剂；及/或iv)15至60摄氏度的操作温度。
在一特定具体实例中，本发明提供所产生的寡糖或寡糖混合物，其借由选自包含以下的清单的任一或多个干燥步骤干燥成粉末：喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥、带式干燥、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥及真空滚筒干燥，其中干粉含有<15-wt.％的水、较佳<10-wt.％的水、更佳<7-wt.％的水、最佳<5-wt.％的水。
在第三态样中，本发明提供如本文所描述的代谢上经工程改造的细胞的用途，其用于生产包含至少三种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物。
为鉴别包含如本文所描述的细胞中产生的至少三种中性未岩藻糖化的不同寡糖的混合物中的寡糖，单体建构嵌段(例如单糖或聚糖单元组成物)、侧链的变旋异构组态、取代基的存在及位置、聚合度/分子量及键联模式可借由所属技术领域中已知的标准方法鉴别，所述标准方法诸如例如甲基化分析、还原裂解、水解、气相层析-质谱法(gaschromatography-mass spectrometry；GC-MS)、基质辅助镭射脱附/离子化-质谱法(Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry；MALDI-MS)、电洒离子化-质谱法(Electrospray ionization-mass spectrometry；ESI-MS)、具有紫外线或折射率侦测的高效液相层析(HPLC)、具有脉冲安培侦测的高效能阴离子交换层析(High-Performance Anion-Exchange chromatography with Pulsed Amperometric Detection；HPAEC-PAD)、毛细管电泳(capillary electrophoresis；CE)、红外线(infrared；IR)/拉曼光谱法及核磁共掁(Nuclear magnetic resonance；NMR)光谱技术。可使用例如固态NMR、傅立叶转换红外线(Fourier transform infrared；FT-IR)光谱法及广角X射线散射(wide-angle X-ray scattering；WAXS)来求解晶体结构。聚合度(degree of polymerization；DP)、DP分布及多分散性可借由例如黏度测定法及SEC(SEC-HPLC，高效粒径排阻层析)测定。为鉴别糖的单体组分，可使用方法诸如例如酸催化的水解、高效液相层析(highperformance liquid chromatography；HPLC)或气-液相层析(gas-liquidchromatography；GLC)(在转化成醛醇乙酸盐之后)。为确定糖苷键，在DMSO中用碘甲烷及强碱使糖甲基化，进行水解，实现部分甲基化糖醇的还原，进行甲基化醛醇乙酸盐的乙酰化，且借由GLC/MS(与质谱法结合的气-液相层析)进行分析。为测定寡糖序列，使用酸或酶进行部分解聚合以测定结构。为鉴别变旋异构组态，对寡糖进行酶分析，例如使其与对特定类型的键联，例如β-半乳糖苷酶或α-葡萄糖苷酶等具有特异性的酶接触，且NMR可用于分析产物。
包含寡糖混合物的产物
在一些具体实例中，将如本文所描述产生的寡糖混合物并入至食品(例如人类食品或进食(feed))、膳食补充剂、医药成分、化妆品成分或药品中。在一些具体实例中，寡糖混合物与一或多种适用于食品、进食、膳食补充剂、医药成份、化妆品成分或药品的成分混合。
在一些具体实例中，膳食补充剂包含至少一种益生质成分及/或至少一种益生菌成分。
「益生质(prebiotic)」为促进有益于宿主的微生物，尤其胃肠道中的微生物生长的物质。在一些具体实例中，膳食补充剂提供多种益生质，包括借由本说明书中所揭示的制程生产及/或纯化的寡糖混合物，以促进一或多种有益微生物的生长。膳食补充剂的益生质成分的实例包括其他益生质分子(诸如HMO)及植物多糖(诸如菊糖、果胶、b-葡聚糖及木质寡糖)。「益生菌(probiotic)」产品典型地含有置换或添加至胃肠道微生物群以便接受体受益的活微生物。此类微生物的实例包括乳杆菌属物种(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)及保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus))、双岐杆菌属物种(例如，动物双岐杆菌(B.animalis)、长双岐杆菌(B.longum)及婴儿双岐杆菌(B.infantis)(例如Bi-26))及布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。在一些具体实例中，由此说明书的制程生产及/或纯化的寡糖混合物与此类微生物组合经口投予。
膳食补充剂的其他成分的实例包括双糖(诸如乳糖)、单糖(诸如葡萄糖及半乳糖)、增稠剂(诸如阿拉伯胶)、酸性调节剂(诸如柠檬酸三钠)、水、脱脂乳及调味剂。
在一些具体实例中，寡糖混合物并入至人类婴儿食品(例如婴儿配方食品)中。婴儿配方食品通常为用于作为人类母乳的完整或部分替代物向婴儿喂养的制造食品。在一些具体实例中，婴儿配方食品以粉末形式出售，且借由与水混合制备以用于向婴儿瓶喂或杯喂。婴儿配方食品的组成物典型地经设计以大致模拟人类母乳。在一些具体实例中，借由此说明书的方法生产及/或纯化的寡糖混合物包括于婴儿配方食品中，以提供与由人类母乳中的寡糖提供的营养益处类似的营养益处。在一些具体实例中，将寡糖混合物与婴儿配方食品的一或多种成分混合。婴儿配方食品成分的实例包括脱脂乳、碳水化合物来源(例如乳糖)、蛋白质来源(例如乳清蛋白浓缩物及酪蛋白)、脂肪来源(例如植物油，诸如棕榈油、高油酸红花油、菜籽油、椰子油及/或葵花籽油；及鱼油)、维生素(诸如维生素A、Bb、Bi2、C及D)、矿物质(诸如柠檬酸钾、柠檬酸钙、氯化镁、氯化钠、柠檬酸钠及磷酸钙)及可能的人乳寡糖(HMO)。此类HMO可包括例如DiFL、乳-N-丙糖II、LNT、LNnT、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖及乳-N-新六糖。
在一些具体实例中，一或多种婴儿配方食品成分包含脱脂乳、碳水化合物来源、蛋白质来源、脂肪来源及/或维生素及矿物质。
在一些具体实例中，一或多种婴儿配方食品成分包含乳糖、乳清蛋白浓缩物及/或高油酸红花油。
在一些具体实例中，婴儿配方食品中的寡糖混合物的浓度与通常存在于人类母乳中的寡糖的浓度为大致相同浓度。在一些具体实例中，婴儿配方食品中的寡糖的混合物中的各单一寡糖的浓度与通常存在于人类母乳中的寡糖的浓度为大致相同浓度。
在一些具体实例中，寡糖混合物并入至饲料制剂中，其中该饲料是选自包含宠物食品、动物代乳品、兽医产品、断奶后饲料或教槽饲料的清单。
除非另外明确陈述，否则在本发明的一态样的上下文中揭示的各具体实例亦揭示于本发明的所有其他态样的上下文中。
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语一般具有与本发明所属技术领域中具有通常知识者通常所理解相同的含义。一般而言，本文所用的命名法及上文及下文所描述的细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合为所属领域中熟知且常用的命名法、细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合。使用标准技术进行核酸及肽合成。
一般而言，纯化步骤是根据制造商说明书进行。
其他优点来自特定具体实例及实施例。不言而喻，以上提及的特征及仍有待下文阐述的特征，在不脱离本发明的范围的情况下，不仅可以分别指定的组合使用而且可以其他组合或独立地使用。
本发明是关于以下特定具体实例：
1.一种代谢上经工程改造的细胞，其产生至少三种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物，其中该细胞
表现至少两种糖基转移酶，且
能够合成一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于所述糖基转移酶的一或多种供体。
2.如具体实例1的细胞，其中该细胞经基因表现模组修饰，其特征在于来自所述表现模组中的任一种的表现为持续性的或借由天然诱导剂产生。
3.如具体实例1至2中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同中性未岩藻糖化寡糖。
4.如具体实例1及3中任一项的细胞，其中该细胞产生四种或更多种不同中性未岩藻糖化寡糖。
5.如具体实例1至4中任一项的细胞，其中该糖基转移酶中的任一者是选自包含以下的清单：半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖胺基转移酶、鼠李糖基转移酶。
6.如具体实例1至5中任一项的细胞，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一种的表现或活性方面经修饰。
7.如具体实例1至6中任一项的细胞，其中所述糖基转移酶中的任一种为N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一种为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
8.如具体实例1至7中任一项的细胞，其中该糖基转移酶中的任一种为半乳糖基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一种为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
9.如具体实例1至8中任一项的细胞，其中该核苷酸-糖中的任一种是选自包含以下的清单：UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖。
10.如具体实例1至9中任一项的细胞，其中该混合物包含至少一种中性未岩藻糖化寡糖，该寡糖经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化，含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
11.如具体实例1至10中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少一种寡糖，该寡糖包含N-乙酰基葡萄糖胺单糖单元。
12.如具体实例1至11中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少一种半乳糖基化寡糖。
13.如具体实例1至12中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外部分泌来自该混合物的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种。
14.如具体实例1至13中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种的前驱体。
15.如具体实例1至14中任一项的细胞，其中该细胞产生用于合成所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种的前驱体。
16.如具体实例1至15中任一项的细胞，其中该中性未岩藻糖化寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
17.如具体实例1至16中任一项的细胞，其中所有所述中性未岩藻糖化寡糖为哺乳动物乳寡糖。
18.一种借由细胞产生至少三种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供细胞，该细胞表现至少两种糖基转移酶且能够合成一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于所述糖基转移酶的一或多种供体，
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成所述核苷酸-糖的条件下培养该细胞，
iii)较佳地，自该培养分离所述中性未岩藻糖化寡糖中的至少一种。
19.如具体实例18的方法，其中该细胞为如具体实例1至17中任一项的代谢上经工程改造的细胞。
20.如具体实例18及19中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同中性未岩藻糖化寡糖。
21.如具体实例18至20中任一项的方法，其中该细胞产生四种或更多种不同中性未岩藻糖化寡糖。
22.如具体实例18至21中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一者是选自包含以下的清单：半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖胺基转移酶、鼠李糖基转移酶。
23.如具体实例18至22中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一种为N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的任一种为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
24.如具体实例18至23中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一种为半乳糖基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一种为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
25.如具体实例18至24中任一项的方法，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下的清单：UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖。
26.如具体实例18至25中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少一种寡糖，该寡糖包含N-乙酰基葡萄糖胺单糖单元。
27.如具体实例18至26中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少一种半乳糖基化寡糖。
28.如具体实例18至27中任一项的方法，其中所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化，含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
29.如具体实例18至27中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于合成所述寡糖中的任一或多种的前驱体，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于合成所述寡糖中的任一或多种的前驱体。
30.如具体实例18至29中任一项的方法，其中该细胞产生用于合成所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种的前驱体。
31.如具体实例18至30中任一项的方法，其中该中性未岩藻糖化寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
32.如具体实例18至31中任一项的方法，其中所有所述中性未岩藻糖化寡糖为哺乳动物乳寡糖。
33.如具体实例18至32中任一项的方法，其中用于合成所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者的该前驱体经完全转化为所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种。
34.如具体实例18至33中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一种：澄清、超过滤、纳米过滤、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、切向流高效能过滤、切向流超过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水性交互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
35.如具体实例18至34中任一项的方法，其进一步包含自该细胞纯化所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种。
36.如具体实例18至35中任一项的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一种：使用活性炭或碳、使用木炭、纳米过滤、超过滤或离子交换、使用醇、使用水醇混合物、结晶、蒸发、沉淀、干燥、喷雾干燥或冻干。
37.如具体实例1至17中任一项的细胞或如具体实例18至36中任一项的方法，其中该细胞是选自由微生物、植物或动物细胞组成的群，较佳该微生物为细菌、真菌或酵母菌，较佳该植物为稻谷、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，较佳该动物为昆虫、鱼类、鸟或非人类哺乳动物，较佳该动物细胞为哺乳动物细胞系。
38.如具体实例1至17及37中任一项的细胞或如具体实例18至37中任一项的方法，其中该细胞为细菌、较佳大肠杆菌菌株、更佳作为K-12菌株的大肠杆菌菌株的细胞，甚至更佳大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655。
39.如具体实例1至17及37中任一项的细胞或如具体实例18至37中任一项的方法，其中该细胞为酵母细胞。
40.一种如具体实例1至17、37至39中任一项的细胞或如具体实例18至39中任一项的方法的用途，其用于产生至少三种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物。
此外，本发明是关于以下较佳特定具体实例：
1.一种代谢上经工程改造的细胞，其产生至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物，其中该细胞
代谢上经工程改造以用于产生该混合物，及
表现至少两种糖基转移酶，且
能够合成一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于所述糖基转移酶的一或多种供体。
2.如较佳具体实例1的细胞，其中该细胞经基因表现模组修饰，其特征在于来自所述表现模组中的任一种的表现为持续性的或借由天然诱导剂产生。
3.如较佳具体实例1或2中任一项的细胞，其中该细胞包含编码一种蛋白质的同一编码DNA序列的多个复本。
4.如较佳具体实例1至3中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同中性未岩藻糖化寡糖。
5.如较佳具体实例1至4中任一项的细胞，其中该细胞产生五种或更多种不同中性未岩藻糖化寡糖。
6.如较佳具体实例1至5中任一项的细胞，其中该糖基转移酶中的任一种是选自包含以下的清单：半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖胺基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖胺基转移酶，
较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下的清单：β-1,3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶及α-1,4-半乳糖基转移酶，
较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1,2-葡萄糖基转移酶、β-1,3-葡萄糖基转移酶及β-1,4-葡萄糖基转移酶，
较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下的清单：α-1,2-甘露糖基转移酶、α-1,3-甘露糖基转移酶及α-1,6-甘露糖基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶及β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基半乳糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：α-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶及β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶。
7.如较佳具体实例1至6中任一项的细胞，其中该细胞能够表现、较佳表现至少三种、更佳至少四种、甚至更佳至少五种、最佳至少六种糖基转移酶。
8.如较佳具体实例1至7中任一项的细胞，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一种的表现或活性方面经修饰。
9.如较佳具体实例1至8中任一项的细胞，其中所述糖基转移酶中的任一种为N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一种为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
10.如较佳具体实例1至9中任一项的细胞，其中该糖基转移酶中的任一种为半乳糖基转移酶且该供体核苷酸-糖中任一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
11.如较佳具体实例1至10中任一项的细胞，其中该糖基转移酶为N-乙酰基半乳糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
12.如较佳具体实例1至11中任一项的细胞，其中该糖基转移酶为N-乙酰基甘露糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
13.如较佳具体实例1至12中任一项的细胞，其中该核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
14.如较佳具体实例1至13中任一项的细胞，其中该细胞表现一或多种多肽，该一或多种多肽选自包含以下者的清单：L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶。
15.如较佳具体实例1至14中任一项的细胞，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
16.如较佳具体实例1至15中任一项的细胞，其中该混合物包含至少一种中性未岩藻糖化寡糖，该寡糖经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化，含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
17.如较佳具体实例1至16中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少一种寡糖，该寡糖包含N-乙酰基葡萄糖胺单糖单元。
18.如较佳具体实例1至17中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少一种半乳糖基化寡糖。
19.如较佳具体实例1至18中任一项的细胞，其中该细胞使用至少一种用于生产所述寡糖中的任一或多种的前驱体，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于生产所述寡糖中的任一或多种的前驱体，所述前驱体自培养基馈入至该细胞中。
20.如较佳具体实例1至19中任一项的细胞，其中该细胞产生至少一种用于生产所述寡糖中的任一种的前驱体。
21.如较佳具体实例1至20中任一项的细胞，其中该至少一种用于生产所述寡糖中的任一者的前驱体经完全转化为所述寡糖中的任一者。
22.如较佳具体实例1至21中任一项的细胞，其中该细胞胞内产生所述寡糖，且其中所述所产生的寡糖的部分或实质上全部保持在胞内且/或经由被动或主动输送在该细胞外部排出。
23.如较佳具体实例1至22中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外部分泌来自该混合物的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者，较佳地，其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所述寡糖中的全部。
24.如较佳具体实例1至23中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者的前驱体及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述所需前驱体，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
25.如较佳具体实例23或24中任一项的细胞，其中该膜蛋白是选自包含以下者的清单：运输蛋白(porter)、P-P-键水解驱动的转运蛋白(transporter)、β-桶状孔蛋白、辅助转运蛋白(transport protein)、推定转运蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，
较佳地，所述运输蛋白包含MFS转运蛋白、糖流出转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白，
较佳地，所述P-P-键水解驱动的转运蛋白包含ABC转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
26.如较佳具体实例23至25中任一项的细胞，其中该膜蛋白提供所述寡糖中的任一者的改善的生产及/或能够实现及/或增强所述寡糖中的任一者的流出。
27.如较佳具体实例1至26中任一项的细胞，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。
28.如较佳具体实例1至27中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
29.如较佳具体实例28的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下者的蛋白质中的任一或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶(L-fuculokinase)、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-
Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶(phosphotransferase；PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
30.如较佳具体实例1至29中任一项的细胞，其中该细胞能够产生磷酸烯醇丙酮酸盐(phosphoenolpyruvate；PEP)。
31.如较佳具体实例1至30中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的产生及/或供应。
32.如较佳具体实例1至31中任一项的细胞，其中该中性未岩藻糖化寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
33.如较佳具体实例1至32中任一项的细胞，其中所有所述中性未岩藻糖化寡糖为哺乳动物乳寡糖。
34.一种借由细胞、较佳单个细胞产生至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供细胞，该细胞能够表现、较佳表现至少两种糖基转移酶且能够合成一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于所述糖基转移酶的一或多种供体，
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成所述核苷酸-糖的条件下培养该细胞，
iii)较佳地，自该培养分离所述中性未岩藻糖化寡糖中的至少一者，更佳地，自该培养分离所述中性未岩藻糖化寡糖中的全部。
35.如较佳具体实例34的方法，其中该细胞为如较佳具体实例1至33中任一项的代谢上经工程改造的细胞。
36.如较佳具体实例35的方法，其中该细胞经基因表现模组修饰，其特征在于来自所述表现模组中的任一者的表现为持续性的或借由天然诱导剂产生。
37.如较佳具体实例35或36中任一项的方法，其中该细胞包含编码一种蛋白质的同一编码DNA序列的多个复本。
38.如较佳具体实例34至37中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同中性未岩藻糖化寡糖。
39.如较佳具体实例34至38中任一项的方法，其中该细胞产生五种或更多种不同中性未岩藻糖化寡糖。
40.如较佳具体实例34至39中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一者是选自包含以下的清单：半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖胺基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖胺基转移酶，
较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下的清单：β-1,3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶及α-1,4-半乳糖基转移酶，
较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1,2-葡萄糖基转移酶、β-1,3-葡萄糖基转移酶及β-1,4-葡萄糖基转移酶，
较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下者的清单：α-1,2-甘露糖基转移酶、α-1,3-甘露糖基转移酶及α-1,6-甘露糖基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶及β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基半乳糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：α-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶及β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶，
较佳地，该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
41.如较佳具体实例34至40中任一项的方法，其中该细胞能够表现、较佳表现至少三种、更佳至少四种、甚至更佳至少五种、最佳至少六种糖基转移酶。
42.如较佳具体实例34至41中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的任一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
43.如较佳具体实例34至42中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
44.如较佳具体实例34至43中任一项的方法，其中该糖基转移酶为N-乙酰基半乳糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
45.如较佳具体实例34至44中任一项的方法，其中该糖基转移酶为N-乙酰基甘露糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
46.如较佳具体实例34至45中任一项的方法，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
47.如较佳具体实例34至46中任一项的方法，其中该细胞表现一或多种多肽，该一或多种多肽选自包含以下者的清单：L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶。
48.如较佳具体实例34至47中任一项的方法，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
49.如较佳具体实例34至48中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少一种寡糖，该寡糖包含N-乙酰基葡萄糖胺单糖单元。
50.如较佳具体实例34至49中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少一种半乳糖基化寡糖。
51.如较佳具体实例34至50中任一项的方法，其中所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化，含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
52.如较佳具体实例34至51中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于生产所述寡糖中的任一或多者的前驱体，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于生产所述寡糖中的任一或多者的前驱体，所述前驱体自培养基馈入至该细胞中。
53.如较佳具体实例34至52中任一项的方法，其中该细胞产生用于生产所述寡糖中的任一者的前驱体。
54.如较佳具体实例34至53中任一项的方法，其中该至少一种用于生产所述寡糖中的任一者的前驱体经完全转化为所述寡糖中的任一者。
55.如较佳具体实例34至54中任一项的方法，其中该细胞胞内产生所述寡糖，且其中所述所产生的寡糖的部分或实质上全部保持在胞内且/或经由被动或主动输送在该细胞外部排出。
56.如较佳具体实例34至55中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外部分泌来自该混合物的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者，较佳地，其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所述寡糖中的全部。
57.如较佳具体实例34至56中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者的前驱体及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述所需前驱体，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
58.如较佳具体实例56或57中任一项的方法，其中该膜蛋白选自包含以下者的清单：运输蛋白、P-P-键水解驱动的转运蛋白、β-桶状孔蛋白、辅助转运蛋白、推定转运蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，
较佳地，所述运输蛋白包含MFS转运蛋白、糖流出转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白，
较佳地，所述P-P-键水解驱动的转运蛋白包含ABC转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
59.如较佳具体实例56至58中任一项的方法，其中该膜蛋白提供所述寡糖中的任一者的改善的生产及/或能够实现及/或增强所述寡糖中的任一者的流出。
60.如较佳具体实例34至59中任一项的方法，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。
61.如较佳具体实例34至60中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
62.如较佳具体实例61的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下的蛋白质中的任一或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
63.如较佳具体实例34至62中任一项的方法，其中该细胞能够产生磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)。
64.如较佳具体实例34至63中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的产生及/或供应。
65.如较佳具体实例34至64中任一项的方法，其中该中性未岩藻糖化寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
66.如较佳具体实例34至65中任一项的方法，其中所有所述中性未岩藻糖化寡糖为哺乳动物乳寡糖。
67.如较佳具体实例34至66中任一项的方法，其中所述条件包含：
使用包含至少一种用于生产所述寡糖中的任一者的前驱体及/或受体的培养基，及/或
向该培养基中添加至少一种前驱体及/或受体进料以用于产生所述寡糖中的任一者。
68.如较佳具体实例34至67中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含至少一种前驱体及/或受体的培养基；
ii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍；
iii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，其中该总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的该时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
69.如较佳具体实例34至67中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)向该培养基添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍；
iii)向该培养基添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍，且其中较佳地，该乳糖进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该乳糖进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的该时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液之浓度为50g/L、较佳75g/L、更佳100g/L、更佳125g/L、更佳150g/L、更佳175g/L、更佳200g/L、更佳225g/L、更佳250g/L、更佳275g/L、更佳300g/L、更佳325g/L、更佳350g/L、更佳375g/L、更佳400g/L、更佳450g/L、更佳500g/L、甚至更佳550g/L、最佳600g/L，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一种。
70.如较佳具体实例69的方法，其中该乳糖进料借由自该培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以>300mM的浓度添加乳糖来实现。
71.如较佳具体实例69或70中任一项的方法，其中该乳糖进料是借由以一定浓度向该培养中添加乳糖，使得在该培养的整个生产阶段中获得至少5mM、较佳10mM或30mM的乳糖浓度来实现。
72.如较佳具体实例34至71中任一项的方法，其中宿主细胞经培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
73.如较佳具体实例34至72中任一项的方法，其中该细胞培养于包含碳源的培养基中，该碳源包含单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油、包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物的复合培养基；较佳地，其中该碳源选自包含以下者的清单：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽-寡糖、麦芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖浆、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐及丙酮酸盐。
74.如较佳具体实例34至73中任一项的方法，其中该培养基含有至少一种选自包含以下者的群组的前驱体：乳糖、半乳糖、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(LNB)、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
75.如较佳具体实例34至74中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由在将该较佳为乳糖的前驱体在第二阶段中添加至该培养基之前将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至该培养基中来提供。
76.如较佳具体实例34至75中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至包含较佳为乳糖的前驱体的该培养基中来提供，之后为其中仅将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至该培养基的第二阶段。
77.如较佳具体实例34至76中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至包含较佳为乳糖的前驱体的该培养基中来提供，之后为其中将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质，及较佳为乳糖的前驱体添加至该培养基的第二阶段。
78.如较佳具体实例34至77中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一种：澄清、超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效过滤、切向流超过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水性交互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
79.如较佳具体实例34至78中任一项的方法，其进一步包含自该细胞纯化所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种。
80.如较佳具体实例79中任一项的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换、使用醇、使用水醇混合物、结晶、蒸发、沉淀、干燥、干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(band drying)、带式干燥(belt drying)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
81.如较佳具体实例1至33中任一项的细胞或如较佳具体实例34至80中任一项的方法，其中该细胞为细菌、真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞或原虫细胞，
较佳地，该细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，更佳作为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655，
较佳地，该真菌属于选自包含以下者的群组的属：根霉菌属(Rhizopus)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)，
较佳地，该酵母菌属于选自包含以下者的群组的属：酵母菌属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉森酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、球拟假丝酵母属(Starmerella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，
较佳地，该植物细胞为藻类细胞或衍生自烟草、苜蓿、稻谷、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，
较佳地，该动物细胞衍生自非人类哺乳动物、鸟类、鱼类、无脊椎动物、爬虫类、两栖动物或昆虫，或为衍生自不包括胚胎干细胞的人类细胞的经遗传修饰的细胞系，更佳地该人类及非人类哺乳动物细胞为上皮细胞、胚胎肾细胞、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，更佳地该昆虫细胞衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、家蚕(Bombyx mori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，
较佳地，该原虫细胞为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
82.如较佳具体实例81的细胞或如较佳具体实例81的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞为存活的革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacterium)，该细菌包含减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG)、肠内菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen；ECA)、纤维素、可拉酸、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖。
83.一种如较佳具体实例1至33、81、82中任一项的细胞或如较佳具体实例34至82中任一项的方法的用途，其用于产生至少三种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物。
本发明将在实施例中更详细地描述。
以下实施例将充当本发明的进一步说明及阐明，且并不意欲为限制性的。
实施例
实施例1.大肠杆菌的材料及方法
培养基
鲁利亚培养液(Luria Broth；LB)培养基是由1％胰胨(Difco，比利时埃伦博德海姆(Erembodegem,Belgium))、0.5％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，比利时鲁汶(Leuven,Belgium))组成。培养实验中在96孔盘或摇瓶中使用的基本培养基含有2.00g/LNH4Cl、5.00g/L(NH4)2SO4、2.993g/L KH2PO4、7.315g/L K2HPO4、8.372g/L MOPS、0.5g/LNaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1ml/L维生素溶液、100μl/L钼酸盐溶液及1mL/L硒溶液。如各别实施例中所指定，将20g/L乳糖、20g/L LacNAc及/或20g/L LNB作为前驱体另外添加至培养基中。使用1M KOH将基本培养基设定为pH 7。维生素溶液是由3.6g/L FeCl2.4H2O、5g/L CaCl2.2H2O、1.3g/L MnCl2.2H2O、0.38g/L CuCl2.2H2O、0.5g/LCoCl2.6H2O、0.94g/L ZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/L Na2EDTA.2H2O及1.01g/L硫胺.HCl组成。钼酸盐溶液含有0.967g/L NaMoO4.2H2O。硒溶液含有42g/L Seo2。
用于发酵的基本培养基含有6.75g/L NH4Cl、1.25g/L(NH4)2SO4、2.93g/L KH2PO4及7.31g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1mL/L维生素溶液、100μL/L钼酸盐溶液及1mL/L硒溶液，其组成与上文所描述相同。如各别实施例中所指定，将20g/L乳糖、20g/L LacNAc及/或20g/L LNB作为前驱体另外添加至培养基中。
借由高压处理(121℃，21min)对复合培养基进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素使培养基具有选择性：例如氯霉素(20mg/L)、卡本西林(100mg/L)、观霉素(40mg/L)及/或康霉素(50mg/L)。
质体
pKD46(Red辅助质体，安比西林抗性)、pKD3(含有FRT侧接氯霉素抗性(cat)基因)、pKD4(含有FRT侧接康霉素抗性(kan)基因)及pCP20(表现FLP重组酶活性)质体获自R.Cunin教授(比利时布鲁塞尔自由大学(Vrije Universiteit Brussel,Belgium)，2007)。将质体保持在购自Invitrogen的宿主大肠杆菌DH5α(F-、phi80dlacZΔM15、Δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-,mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA1)中。
菌株及突变
大肠杆菌K12 MG1655[λ-、F-、rph-1]是于2007年3月获自大肠杆菌基因储备中心(美国)，CGSC菌株编号：7740。基因破坏、基因引入及基因置换是使用Datsenko及Wanner(PNAS 97(2000),6640-6645)公开的技术进行。此技术基于借由λRed重组酶进行同源重组之后的抗生素选择。翻转酶重组酶的后续催化确保在最终产生菌株中移除抗生素选择卡匣。携带Red辅助质体pKD46的转形体在30℃下在10mL含安比西林(100mg/L)及L-阿拉伯糖(10mM)的LB培养基中生长至OD600nm为0.6。借由第一次用50mL冰冷水且第二次用1mL冰冷水洗涤细胞使其为电感受态。接着，将细胞再悬浮于50μL冰冷水中。用50μL细胞及10-100ng线性双股DNA产物，借由使用Gene PulserTM(BioRad)(600Ω，25μFD及250伏)进行电穿孔。在电穿孔之后，将细胞添加至1mL LB培养基中，在37℃下培育1小时，且最后涂敷至含有25mg/L氯霉素或50mg/L康霉素的LB琼脂上以选择抗生素抗性转形体。借由PCR用在经修饰区上游及下游的引子验证所选突变体，且在42℃下使其生长于LB琼脂中以使辅助质体损失。测试突变体的安比西林敏感性。借由PCR使用pKD3、pKD4及其衍生物作为模板获得线性ds-DNA扩增子。所用引子具有与模板互补的序列的一部分且与染色体DNA上必须发生重组之侧互补的另一部分。对于基因体剔除，同源区经设计在所关注基因的起始及终止密码子上游50-nt及下游50-nt。对于基因体嵌入，必须考虑转录起始点(+1)。将PCR产物进行PCR纯化，用Dpnl消化，自琼脂糖凝胶再纯化，且悬浮于溶离缓冲液(5mM Tris，pH 8.0)中。用pCP20质体转形所选突变体，该质体为显示温度敏感性复制及FLP合成的热诱导的安比西林及氯霉素抗性质体。在30℃下选择安比西林抗性转形体，其后将一些转形体在42℃下在LB中群落纯化，且接着测试所有抗生素抗性及FLP辅助质体的损失。用对照引子检查基因剔除及基因嵌入。
在产生乳糖(Gal-b1,4-Glc)的一实施例中，突变型菌株衍生自大肠杆菌K12MG1655且经大肠杆菌lacZ、glk基因及大肠杆菌galETKM操纵子的基因体剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续性转录单元用于如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的lgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶(UniProt IDQ51116)及如例如来自大肠杆菌的galE的UDP-葡萄糖4-表异构酶(UniProt ID P09147)。
在产生乳-N-丙糖(LN3、LNT-II、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)及源于其的包含乳-N-四糖(LNT)及乳-N-新四糖(LNnT)的中性未岩藻糖化寡糖的一实施例中，突变型菌株衍生自大肠杆菌K12 MG1655且经大肠杆菌LacZ及nagB基因的基因剔除及经持续性转录单元的基因体嵌入修饰，该持续性转录单元用于如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(UniProt ID Q9JXQ6)。对于LNT或LNnT生产，突变型菌株进一步经可经由基因体嵌入或自表现质体递送至菌株的以下的持续性转录单元分别修饰：如例如来自大肠杆菌O55:H7的WbgO的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶(UniProtID D3QY14)或如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶(UniProt ID Q51116)。视情况，可将半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶及/或N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶基因的多个复本添加至突变型大肠杆菌菌株中。此外，LNT及/或LNnT生产可借由使用用于L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶的持续性转录单元的一或多种基因体嵌入对菌株进行修饰(如例如来自大肠杆菌的突变型glmS*54，借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))来改善UDP-GlcNAc生产而增强。另外，菌株可视情况经修饰以借由大肠杆菌ushA、galT、ldhA及agp基因的基因体剔除增强UDP-半乳糖产生。突变型大肠杆菌菌株亦可视情况经调适具有持续性转录单元的基因体嵌入，该持续性转录单元用于以下：如例如来自大肠杆菌的galE的UDP-葡萄糖-4-表异构酶(UniProt ID P09147)、如例如来自大肠杆菌的glmM的磷酸葡萄糖胺变位酶(UniProt ID P31120)及如例如来自大肠杆菌的glmU的N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶(UniProt ID P0ACC7)。突变型菌株亦可视情况适用于经由持续性转录单元的基因体嵌入在蔗糖上生长，所述持续性转录单元含有如例如来自大肠杆菌W的CscB的蔗糖转运蛋白(UniProt ID E0IXR1)、如例如源自运动发酵单胞菌的Frk的果糖激酶(UniProt IDQ03417)及如例如源自青春双歧杆菌的BaSP的蔗糖磷酸化酶(UniProt ID A0ZZH6)。
在产生N-乙酰基乳糖胺(LacNAc、Gal-b-1,4-GlcNAc)或乳-N-二糖(LNB、Gal-b1,3-GlcNAc)的一实施例中，突变型菌株源自大肠杆菌K12MG1655，包含大肠杆菌nagA及nagB基因的基因剔除及含有如例如来自酿酒酵母的GNA1的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(UniProt ID P43577)的持续性转录单元的基因体嵌入。突变型菌株进一步经用于如例如来自大肠杆菌O55:H7的WbgO的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶(UniProt IDD3QY14)的持续性转录单元修饰以产生LNB或经用于如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶(UniProt ID Q51116)的持续性转录单元修饰以产生LacNAc。用于N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶及N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶的彼等转录单元可经由基因体嵌入或自表现质体递送至菌株。视情况，可将N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶及/或N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶基因的多个复本添加至突变型大肠杆菌菌株中。视情况，突变型菌株可经用于如例如来自大肠杆菌的突变型glmS*54(其借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProtID P17169))的L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶的持续性转录单元修饰，以增强UDP-GlcNAc合成。视情况，突变型菌株可经用于磷酸酶的持续性转录单元进一步修饰以增强GlcNAc生产，如例如以下中的任一者：大肠杆菌基因，包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU，或来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草芽孢杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述。另外，菌株可视情况经修饰以借由大肠杆菌ushA、galT、ldhA及agp基因的基因体剔除增强UDP-半乳糖产生。突变型大肠杆菌菌株亦可视情况经用于如例如来自大肠杆菌的galE的UDP-葡萄糖-4-表异构酶(UniProt ID P09147)的持续性转录单元的基因体嵌入调适。突变型菌株亦可视情况适用于经由持续性转录单元的基因体嵌入在蔗糖上生长，所述持续性转录单元含有如例如来自大肠杆菌W的CscB的蔗糖转运蛋白(UniProt ID E0IXR1)、如例如源自运动发酵单胞菌的Frk的果糖激酶(UniProt ID Q03417)及如例如源自青春双歧杆菌的BaSP的蔗糖磷酸化酶(UniProt ID A0ZZH6)。
可替换地及/或附加地，生产LNB、LacNAc、LN3、LNT、LNnT及其衍生的寡糖可进一步经持续性转录单元的基因体嵌入在突变型大肠杆菌菌株中经最佳化，该持续性转录单元包含膜转运蛋白，如例如来自莫金斯克罗诺杆菌的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、来自杨氏柠檬酸杆菌的MdfA(UniProt ID D4BC23)、来自大肠杆菌的MdfA(UniProt ID P0AEY8)、来自雷金斯堡约克氏菌的MdfA(UniProt ID G9Z5F4)、来自大肠杆菌的iceT(UniProt IDA0A024L207)或来自杨氏柠檬酸杆菌的iceT(UniProt ID D4B8A6)。
较佳但非必要地，糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质及/或膜转运蛋白经N端及/或C端融合至如例如以下的可溶性强化子标签：SUMO标签、MBP标签、His、FLAG、Strep-II、Halo-标签、NusA、硫氧还原蛋白、GST及/或Fh8标签以增强其可溶性(Cost等人，Front.Microbiol.2014,https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063；Fox等人，ProteinSci.2001,10(3),622-630；Jia及Jeaon,Open Biol.2016,6:160196)。
视情况，突变大肠杆菌菌株经编码伴随蛋白，如例如DnaK、DnaJ、GrpE或GroEL/ES伴随蛋白系统的持续性转录单元的基因体嵌入修饰(Baneyx F.、Palumbo J.L.(2003)Improving Heterologous Protein Folding via Molecular Chaperone and FoldaseCo-Expression.In:Vaillancourt P.E.(编)E.coliGene Expression Protocols.Methodsin Molecular BiologyTM,第205卷.Humana Press)。
视情况，突变大肠杆菌菌株经修饰以产生糖基最小化的大肠杆菌菌株，其包含非必需糖基转移酶基因中的任一或多种的基因体剔除，所述非必需糖基转移酶基因包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP。
所有持续性启动子、UTR及终止子序列源自由Mutalik等人(Nat.Methods2013,第10期,354-360)及Cambray等人(Nucleic Acids Res.2013,41(9),5139-5148)描述的库。所有基因在Twist Bioscience(twistbioscience.com)或IDT(eu.idtdna.com)处合成订购，且使用供应商的工具调适密码子使用。
所有菌株在-80℃下储存于冷冻小瓶中(隔夜LB培养物以1:1比率与70％甘油混合)。
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶，于150μL LB中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，用400μL基本培养基借由稀释400倍。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72h或更短或更长。为量测培养实验结束时的糖浓度，借由使培养液在60℃下沸腾15min，之后使细胞短暂离心而自各孔获取全培养液样品(＝胞内及胞外糖浓度的平均值)。
生物反应器的预培养始于某一菌株的整个1mL冷冻小瓶，在1L或2.5L摇瓶中的250mL或500mL基本培养基中接种，且在37℃下在定轨振荡器上以200rpm培育24小时。接着接种5L生物反应器(250mL接种物于2L批料培养基中)；该过程由MFCS控制软件(SartoriusStedim Biotech,Melsungen,Germany)控制。培养条件设定为37℃及最大搅拌；压力气体流动速率视菌株及生物反应器而定。使用0.5M H2S04及20％ NH4OH将pH控制在6.8。冷却废气。在发酵期间起泡产生时，添加10％聚硅氧消泡剂溶液。
光密度
培养物的细胞密度通常借由量测600nm下的光密度(Implen NanophotometerNP80,Westburg,Belgium，或用Spark 10M微量盘读取器，Tecan,Switzerland)来监测。
解析型分析
标准品，诸如(但不限于)蔗糖、乳糖、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)、乳-N-二糖(LNB)、乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-四糖(LNT)及乳-N-新-四糖(LNnT)是购自Carbosynth(英国)、Elicityl(法国(France))及IsoSep(瑞典(Sweden))。用内部制造的标准品分析其他化合物。
在Waters Acquity H级UPLC上用蒸发光散射侦测器(Evaporative LightScattering Detector；ELSD)或折射率(RI)侦测分析寡糖。在Waters Acquity UPLC BEHAmide管柱(2.1×100mm；
Figure BDA0004113332510001311
1.7μm)管柱及Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱(
Figure BDA0004113332510001312
2.1×5mm)上注射0.7μL体积的样品。管柱温度为50℃。移动相由其中添加0.2％三乙胺的1/4水及3/4乙腈溶液组成。该方法以0.130mL/min的流速等度。ELS侦测器的漂移管温度为50℃，且N2气体压力为50psi，增益为200且数据速率为10pps。RI侦测器的温度设定为35℃。
亦在Waters Acquity H级UPLC上用折射率(Refractive Index；RI)侦测分析寡糖。在Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱(2.1×100mm；
Figure BDA0004113332510001313
1.7μm)上注射0.5μL体积的样品。管柱温度为50℃。移动相由其中添加0.1％三乙胺的72％乙腈与28％乙酸铵缓冲液(100mM)的混合物组成。该方法以0.260mL/min的流速等度。RI侦测器的温度设定为35℃。
对于质谱仪上的分析，使用具有电洒离子化(ESI)的Waters Xevo TQ-MS，去溶剂化温度为450℃，氮气去溶剂化气体流速为650L/h且锥电压为20V。对于所有寡糖，MS在选定离子监测(selected ion monitoring；SIM)中在负模式下操作。在具有Thermo Hypercarb管柱(2.1×100mm；3μm)的Waters Acquity UPLC上在35℃下进行分离。使用梯度，其中溶离剂A为含0.1％甲酸的超纯水且其中溶离剂B为含0.1％甲酸的乙腈。寡糖在55min内使用以下梯度分离：在21min内自2％至12％溶离剂B初始增加，在11min内自12％至40％溶离剂B第二次增加，且在5min内自40％至100％溶离剂B第三次增加。作为洗涤步骤，使用100％溶离剂B持续5min。对于管柱平衡，在1min内恢复2％溶离剂B的初始条件且维持12min。
在Dionex HPAEC系统上用脉冲型电流侦测(pulsed amperometric detection；PAD)分析低浓度(低于50mg/L)下的糖类。在Dionex CarboPac PA200管柱4×250mm及Dionex CarboPac PA200保护管柱4×50mm上注射5μL体积的样品。管柱温度设定成30℃。使用梯度，其中溶离剂A为去离子水，其中溶离剂B为200mM氢氧化钠且其中溶离剂C为500mM乙酸钠。寡糖在60min内分离，同时使用以下梯度维持25％的溶离剂B的恒定比率：75％溶离剂A的初始等度步骤维持10min，0％至4％溶离剂C在8min内的初始增加，71％溶离剂A及4％溶离剂C的第二等度步骤维持6min，4％至12％溶离剂C在2.6min内的第二增加，63％溶离剂A及12％溶离剂C的第三等度步骤维持3.4min，及12％至48％溶离剂C在5min内的第三增加。作为洗涤步骤，使用48％溶离剂C持续3min。对于管柱平衡，在1min内恢复75％溶离剂A及0％溶离剂C的初始条件且维持11min。应用的流速为0.5mL/min。
实施例2.酿酒酵母的材料及方法
培养基
在具有完整补充混合物(SD CSM)或CSM省却(drop-out)(SD CSM-His)的合成限定酵母培养基上生长菌株，该培养基含有6.7g/L的不含氨基酸的酵母氮源基础(不含AA的YNB，Difco)、20g/L琼脂(Difco)(固体培养物)、22g/L葡萄糖单水合物或20g/L乳糖及0.79g/L CSM或0.77g/L CSM-His(MP Biomedicals)。
菌株
使用由Brachmann等人(Yeast(1998)14:115-32)产生的酿酒酵母BY4742，可获自Euroscarf培养物收集。所有突变型菌株借由使用Gietz方法(Yeast11:355-360,1995)的同源重组或质体转形产生。
质体
在生产UDP-半乳糖的实施例中，酵母表现质体衍生自含有HIS3选择标记及如例如来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)的UDP-葡萄糖-4-表异构酶的持续性转录单元的pRS420-质体系列(Christianson等人，1992,Gene 110:119-122)。在生产LN3及LN3衍生的寡糖如LNT或LNnT的实施例中，此质体分别经持续性转录单元进一步修饰，所述持续性转录单元用于如例如来自乳酸克鲁维酵母的LAC12的乳糖透过酶(UniProt ID P07921)、如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(UniProt IDQ9JXQ6)及如例如来自大肠杆菌O55:H7的WbgO的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶(UniProt ID D3QY14)或如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶(UniProt ID Q51116)。
较佳但非必要地，糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质及/或膜转运蛋白中的任一或多者经N端及/或C端融合至SUMOstar标签(例如获自pYSUMOstar,LifeSensors,Malvern,PA)以增强其可溶性。
视情况，突变型酵母菌菌株经持续性转录单元的基因体嵌入修饰，该单元编码伴随蛋白，如例如Hsp31、Hsp32、Hsp33、Sno4、Kar2、Ssb1、Sse1、Sse2、Ssa1、Ssa2、Ssa3、Ssa4、Ssb2、Ecm10、Ssc1、Ssq1、Ssz1、Lhs1、Hsp82、Hsc82、Hsp78、Hsp104、Tcp1、Cct4、Cct8、Cct2、Cct3、Cct5、Cct6及Cct7(Gong等人，2009,Mol.Syst.Biol.5:275)。
将质体保持在购自Invitrogen的宿主大肠杆菌DH5α(F-、phi80dlacZdeltaM15、delta(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-、mk+)、phoA、supE44、lambda-、thi-1、gyrA96、relA1)中。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一种合成：DNA2.0、Gen9、IDT或Twist Bioscience。可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
一般而言，酵母菌株最初在SD CSM盘上生长以获得单一菌落。使此等盘在30℃下生长2-3天。始于单一菌落，使预培养物在30℃下在5mL下生长隔夜，在200rpm下振荡。后续的125mL摇瓶实验在25mL培养基中以此预培养物的2％接种。在30℃下在200rpm的定轨振荡下培育此等摇瓶。
基因表现启动子
使用合成持续性启动子表现基因，如借由Blazeck所描述(Biotechnology andBioengineering,第109卷,第11号,2012)。
实施例3.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc及聚-LacNAc(Gal-b1,4-GlcNAc)n结构的寡糖混合物
大肠杆菌K-12MG1655菌株经大肠杆菌nagB基因的基因剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰以产生LacNAc，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自酿酒酵母的GNA1(UniProt ID P43577)及来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)。在下一步骤中，将新颖菌株另外用表现质体转形，该表现质体含有用于来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)的持续性转录单元。借由同源EcGlmS、EcGlmM及EcGlmU酶的后续作用，突变型菌株能够产生由异源LgtA蛋白质使用以修饰LacNAc的UDP-GlcNAc。在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件在全培养液样品中，针对生产LacNAc、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc及聚-LacNAc结构(Gal-b1,4-GlcNAc)n评估新颖菌株，所述结构由β1,3-彼此键联的重复N-乙酰基乳糖胺单元建构，其中培养基含有甘油作为碳源。
实施例4.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc、β-Gal-(1,4)-β-GlcNAc-(1,3)-[β-GlcNAc-(1,6)]-β-Gal-(1,4)-GlcNAc及聚-LacNAc结构的寡糖混合物
如实施例3中所描述的突变型大肠杆菌菌株进一步经第二表现质体修饰，该第二表现质体含有用于人类N-乙酰基乳糖胺糖β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶GCNT2(UniProt ID Q8N0V5)的持续性转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中生产包含LacNAc、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc、GlcNAc-b1,6-Gal-b1,4-GlcNAc、(Gal-b1,4-GlcNAc)n结构及β-Gal-(1,4)-β-GlcNAc-(1,3)-[β-GlcNAc-(1,6)]-β-Gal-(1,4)-GlcNAc的寡糖混合物评估新颖菌株，其中该培养基含有甘油作为碳源。
实施例5.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含Gal-a1,3-LacNAc、LN3、LNnT及Gal-a1,3-LNnT的寡糖混合物
如实施例3中所描述经修饰以产生LacNAc的大肠杆菌菌株进一步经大肠杆菌lacZ基因的基因体剔除修饰且经含有持续性转录单元的相容表现质体转形，该持续性转录单元用于包含来自温带牛的α-1,3-半乳糖基转移酶(a3FTcd)(UniProt ID P14769)的氨基酸残基80至367的C端催化域。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中产生包含Gal-a1,3-LacNAc(Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc)、LN3、LNnT及Gal-a1,3-LNnT(Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有甘油作为碳源及乳糖作为前驱体。
实施例6.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含LacNAc、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc基化聚-LacNAc结构的寡糖混合物
大肠杆菌K-12MG1655菌株经大肠杆菌nagB及lacZ基因的基因剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自酿酒酵母的GNA1(UniProt ID UniProt ID P43577)、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的4-表异构酶(WbpP)(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的β1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(LgtD)(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件，针对生产包含LacNAc、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc结构亦即(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc基化聚-LacNAc结构的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基包含甘油作为碳源及乳糖作为前驱体。
实施例7.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物
大肠杆菌菌株经大肠杆菌nagB基因的基因体剔除及持续性表现卡匣的基因体嵌入修饰以产生LNB，所述卡匣用于来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自酿酒酵母的GNA1(UniProt ID P43577)及来自大肠杆菌O55:H7的WbgO(UniProt IDD3QY14)。在下一步骤中，产生LNB的大肠杆菌菌株进一步经大肠杆菌lacZ基因的基因剔除及经持续性表现单元的基因嵌入修饰，所述持续性表现单元用于绿脓假单胞菌的4-表异构酶(WbpP)(UniProt ID Q8KN66)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)及来自流感嗜血杆菌的β1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(LgtD)(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基包含甘油作为碳源及乳糖作为前驱体。
实施例8.当在分批补料发酵中评估时在经修饰的大肠杆菌宿主中生产包含LNT、LNnT及聚-半乳糖基化结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以产生LNnT的大肠杆菌菌株进一步经用于来自大肠杆菌O55:H7的WbgO(UniProt ID D3QY14)的持续性转录单元的基因体嵌入修饰。在下一步骤中，如实施例1中所描述，在5L生物反应器中在分批补料发酵过程中评估新颖菌株。在此实施例中，蔗糖用作碳源且乳糖作为前驱体添加至分批培养基中。获取常规培养液样品，且如实施例1中所描述量测所产生的糖。针对生产包含乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、对-乳-N-新五糖、对-乳-N-五糖、对-乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖苷-对-乳-N-新五糖及β-(1,4)半乳糖苷-对-乳-N-五糖的寡糖混合物，评估分批补料阶段的常规时间点处获取的选定菌株的发酵培养液。
实施例9.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含半乳糖基化及GalNAc基化乳糖结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经最佳化用于UDP-半乳糖的大肠杆菌菌株进一步经大肠杆菌lacZ基因的基因剔除及持续性表现单元的基因嵌入修饰，该持续性表现单元用于来自淋病奈瑟氏菌的a1,4-半乳糖基转移酶(LgtC)(UniProt ID Q50948)以当在甘油及乳糖上生长时产生α-1,4-半乳糖基化乳糖(Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc)。在下一步骤中，突变型菌株经包含用于绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProtID A0A2X4DBP3)的持续性表现单元的表现质体转形。除其β1,3-N-乙酰基-半乳糖胺基转移酶活性以外，HiLgtD酶亦具有β1,3-半乳糖基转移酶活性且可将半乳糖添加至非还原末端GalNAc分子，从而在聚糖的非还原末端处产生末端Gal-b1,3-GalNAc。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对生产包含Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(Gal-a1,4-乳糖)、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc(GalNAc-b1,3-乳糖)、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(球-N-四糖)及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有甘油作为碳源及乳糖作为前驱体。
实施例10.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含LN3、LNT、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以产生LNT的大肠杆菌菌株进一步经持续性表现单元的基因嵌入修饰，所述持续性表现单元用于来自绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt IDQ8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，针对在全培养液样品中产生包含LN3、LNT、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有甘油作为碳源及乳糖作为前驱体。
实施例11.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖及(GalNAc)-聚-LNnT结构的寡糖混合物
如实施例1中所描述经修饰以产生LNnT的大肠杆菌菌株进一步经持续性表现单元的基因嵌入修饰，所述持续性表现单元用于来自绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt IDQ8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，针对在全培养液样品中生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖以及聚-LNnT结构(借由NmlgtA及NmLgtB的替代活性)及GalNAc基化聚-LNnT结构(借由HiLgtD的额外活性)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有甘油作为碳源及乳糖作为前驱体。
实施例12.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含Gal-a1,3-LacNAc、LN3、LNnT及Gal-a1,3-LNnT的寡糖混合物
大肠杆菌K-12MG1655菌株经大肠杆菌lacZ、glk基因及大肠杆菌galETKM操纵子的基因体剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰以产生乳糖(Gal-b1,4-Glc)，所述持续性转录单元用于来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(UniProt ID Q51116)及来自大肠杆菌的UDP-葡萄糖4-表异构酶(galE)(P09147)。在下一步骤中，突变型菌株进一步经大肠杆菌nagB基因的基因剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰以产生GlcNAc及LacNAc，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))及来自酿酒酵母的GNA1(UniProt ID P43577)。在最终步骤中，新颖菌株另外经表现质体转形，该表现质体含有用于来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)及包含来自温带牛的α-1,3-半乳糖基转移酶(a3FTcd)(UniProt ID P14769)的氨基酸残基80至367的C端催化域的持续性转录单元。在生长实验中根据实施例1中所提供的培养条件，针对在全培养液样品中生产包含Gal-a1,3-乳糖、Gal-a1,3-LacNAc(Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc)、LN3、LNnT及Gal-a1,3-LNnT(Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有甘油作为碳源。
实施例13.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含LacNAc、GalNAc-b1,3-乳糖(b3'-GalNAcL)、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc基化聚-LacNAc结构的寡糖混合物
大肠杆菌K-12MG1655菌株经大肠杆菌lacZ、glk基因及大肠杆菌galETKM操纵子的基因体剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰以产生乳糖(Gal-b1,4-Glc)，所述持续性转录单元用于来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(UniProt ID Q51116)及来自大肠杆菌的UDP-葡萄糖4-表异构酶(galE)(UniProt ID P09147)。在下一步骤中，突变型菌株进一步经大肠杆菌nagB基因的基因剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰以产生GlcNAc及LacNAc，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))及来自酿酒酵母的GNA1(UniProt ID P43577)。在最终步骤中，新颖菌株另外经含有持续性转录单元的表现质体转形，所述持续性转录单元用于绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt IDA0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件，针对生产包含LacNAc、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc结构亦即(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc基化聚-LacNAc结构的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基包含甘油作为碳源。
实施例14.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含半乳糖基化及GalNAc基化乳糖结构的寡糖混合物
大肠杆菌K-12MG1655菌株经大肠杆菌nagB、ushA、galT、lacZ、glk基因及大肠杆菌galETKM操纵子的基因体剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续性转录单元用于来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(UniProt ID Q51116)、来自大肠杆菌的galE(UniProtID P09147)、来自淋病奈瑟氏菌的a1,4-半乳糖基转移酶(LgtC)(UniProt ID Q50948)及来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))。在下一步骤中，突变型菌株经包含用于绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt IDA0A2X4DBP3)的持续性表现单元的表现质体转形。在生长实验中根据实施例1中提供的培养条件，针对生产包含Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(Gal-a1,4-乳糖)、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc(GalNAc-b1,3-乳糖)、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(球-N-四糖)及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有甘油作为碳源。
实施例15.使用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖及(GalNAc)-聚-LNnT结构的寡糖混合物
大肠杆菌K-12MG1655菌株经大肠杆菌nagB、lacZ、glk基因及大肠杆菌galETKM操纵子的基因体剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续性转录单元用于来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(UniProt ID Q51116)、来自大肠杆菌的galE(UniProt IDP09147)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(UniProt ID Q9JXQ6)、来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，针对在全培养液样品中生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖以及聚-LNnT结构及GalNAc基化聚-LNnT结构的寡糖混合物评估新颖菌株，其中培养基含有甘油作为碳源。
实施例16.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc及聚-LacNAc(Gal-b1,4-GlcNAc)n结构的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经含有HIS3选择标记及包含持续性转录单元的酵母表现pRS420-质体转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自大肠杆菌的galE(UniProtID P09147)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)及来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用SD CSM-Ura-His省却培养基，针对生产包含LacNAc、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc及聚-LacNAc结构(Gal-b1,4-GlcNAc)n的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例17.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc、β-Gal-(1,4)-β-GlcNAc-(1,3)-[β-GlcNAc-(1,6)]-β-Gal-(1,4)-GlcNAc及聚-LacNAc结构的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经含有HIS3选择标记及包含持续性转录单元的酵母表现pRS420-质体转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)及人类N-乙酰基乳糖胺糖β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶GCNT2(UniProt ID Q8N0V5)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用SD CSM-Ura-His省却培养基，针对生产包含LacNAc、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc、GlcNAc-b1,6-Gal-b1,4-GlcNAc、(Gal-b1,4-GlcNAc)n结构及β-Gal-(1,4)-β-GlcNAc-(1,3)-[β-GlcNAc-(1,6)]-β-Gal-(1,4)-GlcNAc的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例18.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含Gal-a1,3-LacNAc、LN3、LNnT及Gal-a1,3-LNnT的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经含有HIS3选择标记及包含持续性转录单元的酵母表现pRS420-质体转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)及包含来自温带牛的α-1,3-半乳糖基转移酶(a3FTcd)(UniProt ID P14769)的氨基酸残基80至367的C端催化域。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用SD CSM-Ura-His省却培养基，针对生产包含Gal-a1,3-LacNAc(Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc)、LN3、LNnT及Gal-a1,3-LNnT(Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例19.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含LacNAc、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc基化聚-LacNAc结构的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经包含持续性转录单元的酵母人工染色体(yeast artificialchromosome；YAC)转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt IDQ51116)、来自绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用包含乳糖的SDCSM培养基，针对生产包含LacNAc、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc结构亦即(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc-基化聚-LacNAc结构的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例20.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经包含持续性转录单元的YAC转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt IDP17169))、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自大肠杆菌O55:H7的WbgO(UniProt ID D3QY14)、绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt id Q9JXQ6)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt IDA0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用包含乳糖的SD CSM培养基，针对生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例21.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含半乳糖基化及GalNAc基化乳糖结构的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经包含持续性转录单元的YAC转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt IDP17169))、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)、绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(A0A2X4DBP3)、来自淋病奈瑟氏菌的a1,4-半乳糖基转移酶(LgtC)(UniProt ID Q50948)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用包含乳糖的SD CSM培养基，针对生产包含Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(Gal-a1,4-乳糖)、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc(GalNAc-b1,3-乳糖)、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc(球-N-四糖)及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例22.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含LN3、LNT、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经包含持续性转录单元的YAC转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt IDP17169))、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt id Q9JXQ6)、来自大肠杆菌O55:H7的WbgO(UniProt ID D3QY14)、来自绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用包含乳糖的SD CSM培养基，针对生产包含LN3、LNT、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例23.使用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖及(GalNAc)-聚-LNnT结构的寡糖混合物
酿酒酵母菌株经包含持续性转录单元的YAC转形，所述持续性转录单元用于来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt IDP17169))、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)、来自绿脓假单胞菌的WbpP(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中根据实施例1中的培养条件，使用包含乳糖的SD CSM培养基，针对生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖以及聚-LNnT结构及GalNAc基化聚-LNnT结构的寡糖混合物评估突变型酵母菌株。
实施例24.枯草芽孢杆菌的材料及方法
培养基
使用两种不同培养基，亦即富集的鲁利亚培养液(LB)及摇瓶用基本培养基(minimal medium for shake flask；MMsf)。基本培养基使用痕量元素混合物。
痕量元素混合物由0.735g/L CaCl2.2H2O、0.1g/L MnCl2.2H2O、0.033g/LCuCl2.2H2O、0.06g/L CoCl2.6H2O、0.17g/L ZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/LNa2EDTA.2H2O及0.06g/L Na2MoO4组成。柠檬酸铁溶液含有0.135g/L FeCl3.6H2O、1g/L柠檬酸钠(Hoch 1973PMC1212887)。
鲁利亚培养液(Luria Broth；LB)培养基是由1％胰胨(Difco，比利时埃伦博德海姆(Erembodegem,Belgium))、0.5％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，比利时鲁汶(Leuven,Belgium))组成。鲁利亚培养液琼脂(Luria Broth agar；LBA)盘是由LB培养基组成，其中添加12g/L琼脂(Difco，比利时埃伦博德海姆(Erembodegem,Belgium))。
摇瓶用基本培养基(MMsf)实验含有2.00g/L(NH4)2SO4、7.5g/L KH2PO4、17.5g/LK2HPO4、1.25g/L柠檬酸钠、0.25g/L MgSO4.7H2O、0.05g/L色氨酸、10多至30g/L葡萄糖或另一碳源(包括(但不限于)实施例中指定的果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油及麦芽三糖)、10ml/L痕量元素混合物及10ml/L柠檬酸铁溶液。用1M KOH将培养基设定为pH 7。视实验而定，可添加乳糖、LNB或LacNAc作为前驱体。
借由高压处理(121℃，21')对复合培养基(例如LB)进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素(例如吉欧霉素(zeocin)(20mg/L))使培养基具有选择性。
菌株、质体及突变
枯草芽孢杆菌168，可获自于芽孢杆菌基因储备中心(美国俄亥俄州(Ohio,USA))。
经由Cre/lox的基因缺失的质体如由Yan等人(Appl.&Environm.Microbial.,2008年9月,第5556-5562页)所描述进行构筑。基因破坏经由与线性DNA同源重组及经由电穿孔转形进行，如Xue等人(J.Microb.Meth.34(1999)183-191)所描述。基因剔除的方法由Liu等人(Metab.Engine.24(2014)61-69)描述。此方法使用目标基因的上游及下游的1000bp同源性。
如由Popp等人(Sci.Rep.,2017,7,15158)所描述的整合载体用作表现载体且必要时可进一步用于基因体整合。适用于表现的启动子可衍生自部分储存库(iGem)：序列id：Bba_K143012、Bba_K823000、Bba_K823002或Bba_K823003。选殖可使用吉布森组装(GibsonAssembly)、金门组装(Golden Gate assembly)、Cliva组装、LCR或限制接合(restrictionligation)来进行。
在生产基于乳糖的寡糖的一实施例中，产生枯草芽孢杆菌突变型菌株以含有编码乳糖输入体(importer)(诸如具有UniProt ID P02920的大肠杆菌lacY)的基因。
在产生乳糖(Gal-b1,4-Glc)的一实施例中，枯草芽孢杆菌菌株经lacZ、glk、galE、galT、galK及galM基因的基因体剔除以及持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续性转录单元用于如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(UniProt ID Q51116)的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶及如例如来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)的UDP-葡萄糖4-表异构酶。
在产生乳-N-丙糖(LN3、LNT-II、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)及源于其的包含乳-N-四糖(LNT)及乳-N-新四糖(LNnT)的中性未岩藻糖化寡糖的一实施例中，枯草芽孢杆菌菌株经LacZ及nagB基因的基因剔除及经持续性转录单元的基因体嵌入修饰，该持续性转录单元用于如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶。对于LNT或LNnT生产，突变型菌株进一步经可经由基因体嵌入或自表现质体递送至菌株的以下的持续性转录单元分别修饰：如例如来自大肠杆菌O55:H7的WbgO的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶(UniProt ID D3QY14)或如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶(UniProt ID Q51116)。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一种合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶或始于LB盘的单一菌落，于150μL LB中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，用400μL MMsf培养基借由稀释400倍。使各菌株在96孔盘的多个孔中生长作为生物复制物。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72h或更短或更长。在培养实验结束时，自各孔获取样品以量测上清液浓度(胞外糖浓度，在短暂离心细胞5min后)，或在短暂离心细胞前借由使培养液在90℃下沸腾15min或在60℃下沸腾60min量测(＝全培养液浓度，胞内及胞外糖浓度，如本文所定义)。
此外，对培养物进行稀释以量测600nm下的光学密度。借由寡糖浓度除以生物质(以与参考菌株相比的相对百分比)来确定细胞效能指数或CPI。凭经验确定生物质在600nm下量测的光学密度的大致1/3。
实施例25.使用经修饰的枯草芽孢杆菌菌株生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖及(GalNAc)-聚-LNnT的寡糖混合物
枯草芽孢杆菌菌株首先借由lacZ、nagB、gamA、glk、galE、galT、galK及galM基因的基因体剔除及包含基因的持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述基因编码来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)(UniProt ID P02920)、天然果糖-6-P-胺基转移酶(UniProt IDP0CI73)、来自大肠杆菌W的蔗糖转运蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)及来自青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)。由此获得的突变型菌株进一步经持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续性转录单元包含来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(UniProt ID Q51116)、来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)、来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自绿脓假单胞菌的WbpP(UniProtID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的LgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中在包含乳糖作为前驱体的MMsf培养基上根据实施例24中提供的培养条件，针对生产包含LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖以及聚-LNnT结构及GalNAc基化聚-LNnT结构的寡糖混合物评估新颖菌株。
实施例26.使用经修饰的枯草芽孢杆菌菌株生产包含LacNAc、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc基化聚LacNAc结构的寡糖混合物
枯草芽孢杆菌菌株首先借由lacZ、nagB、gamA、glk、galE、galT、galK及galM基因的基因体剔除及包含基因的持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述基因编码来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)(UniProt ID P02920)、天然果糖-6-P-胺基转移酶(UniProt IDP0CI73)、来自大肠杆菌的突变型L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自酿酒酵母的GNA1(UniProt ID UniProt ID P43577)、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)、绿脓假单胞菌的4-表异构酶(WbpP)(UniProt ID Q8KN66)及来自流感嗜血杆菌的β1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(LgtD)(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中在包含乳糖作为前驱体的MMsf培养基上根据实施例24中提供的培养条件，针对生产包含LacNAc、LN3、LNnT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LacNAc、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LacNAc、聚-LacNAc结构亦即(Gal-b1,4-GlcNAc)n及GalNAc基化聚-LacNAc结构的寡糖混合物评估新颖菌株。
实施例27.麸氨酸棒状杆菌的材料及方法
培养基
使用两种不同培养基，亦即富集的胰胨-酵母萃取物(tryptone-yeast；TY)培养基及摇瓶用基本培养基(minimal medium for shake flask；MMsf)。基本培养基使用1000x储备痕量元素混合物。
痕量元素混合物是由10g/L CaCl2、10g/L FeSO4.7H2O、10g/L MnSO4.H2O、1g/LZnSO4.7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2.6H2O、0.2g/L生物素(pH 7.0)及0.03g/L原儿茶酸组成。
摇瓶用基本培养基(MMsf)实验含有20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素、1g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4、0.25g/L MgSO4.7H2O、42g/L MOPS、10多至30g/L葡萄糖或另一碳源(包括(但不限于)实施例中指定的果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油及麦芽三糖)及1ml/L痕量元素混合物。视实验而定，可添加乳糖、LNB或LacNAc作为前驱体。
TY培养基是由1.6％胰胨(Difco，比利时埃伦博德海姆)、1％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，比利时鲁汶)组成。TY琼脂(TYA)盘是由TY培养基组成，其中添加12g/L琼脂(Difco，比利时埃伦博德海姆)。
借由高压处理(121℃，21')对复合培养基(例如TY)进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素(例如康霉素(kanamycin)、安比西林(ampicillin))使培养基具有选择性。
菌株及突变
麸氨酸棒状杆菌ATCC 13032可获自于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)。
如借由Suzuki等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2005Apr,67(2):225-33)所描述基于Cre/loxP技术的整合质体载体及如借由Okibe等人(Journal of MicrobiologicalMethods 85,2011,155-163)所描述的热敏穿梭载体经构筑用于基因缺失、突变及插入。用于(异源)基因表现的适合启动子可源自Yim等人(Biotechnol.Bioeng.,2013Nov,110(11):2959-69)。选殖可使用吉布森组装、金门组装、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。
在生产基于乳糖的寡糖的一实施例中，产生麸氨酸棒状杆菌突变型菌株以含有编码乳糖输入体(importer)(诸如具有UniProt ID P02920的大肠杆菌lacY)的基因。
在生产乳糖(Gal-b1,4-Glc)的一实施例中，麸氨酸棒状杆菌菌株经持续性转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续性转录单元用于如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖苷基转移酶(UniProt ID Q51116)及如例如来自大肠杆菌的galE的UDP-葡萄糖4-表异构酶(UniProt ID P09147)。
在产生乳-N-丙糖(LN3、LNT-II、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)及源于其的包含乳-N-四糖(LNT)及乳-N-新四糖(LNnT)的中性未岩藻糖化寡糖的一实施例中，麸氨酸棒状杆菌菌株经持续性转录单元的基因体嵌入修饰，该持续性转录单元用于如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(UniProt ID Q9JXQ6)。对于LNT或LNnT生产，突变型菌株进一步经可经由基因体嵌入或自表现质体递送至菌株的以下的持续性转录单元分别修饰：如例如来自大肠杆菌O55:H7的WbgO的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶(UniProt ID D3QY14)或如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB的N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶(UniProt ID Q51116)。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一种合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶或始于TY盘的单一菌落，于150μL TY中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，用400μL MMsf培养基借由稀释400倍。使各菌株在96孔盘的多个孔中生长作为生物复制物。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72h或更短或更长。在培养实验结束时，自各孔获取样品以量测上清液浓度(胞外糖浓度，在短暂离心细胞5min后)，或在短暂离心细胞前借由使培养液在60℃下沸腾15min量测(＝全培养液浓度，胞内及胞外糖浓度，如本文所定义)。
此外，对培养物进行稀释以量测600nm下的光学密度。借由全培养液中量测的寡糖浓度，例如唾液酸乳糖浓度，除以生物质(以与参考菌株相比的相对百分比)来确定细胞效能指数或CPI。凭经验确定生物质在600nm下量测的光学密度的大致1/3。
实施例28.在突变型麸氨酸棒状杆菌菌株中生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物
野生型麸氨酸棒状杆菌菌株首先经麸氨酸棒状杆菌基因ldh、cgl2645、nagB、gamA及nagA的基因体剔除以及包含基因的持续性转录单元的基因体嵌入修饰以产生LNB，所述基因编码来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自酿酒酵母的GNA1(UniProt ID P43577)及来自大肠杆菌O55:H7的WbgO(UniProt ID D3QY14)。在下一步骤中，LNB生产进一步经持续性表现单元的基因嵌入修饰，所述持续性表现单元用于绿脓假单胞菌的4-表异构酶(WbpP)(UniProt ID Q8KN66)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)及来自流感嗜血杆菌的β1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(LgtD)(UniProt ID A0A2X4DBP3)。在生长实验中在包含乳糖作为前驱体的MMsf培养基上根据实施例27中所提供的培养条件，针对生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物评估新颖菌株。
实施例29.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的材料及方法
培养基
将莱茵衣藻细胞在Tris-乙酸-磷酸(Tris-acetate-phosphate；TAP)培养基(pH7.0)中培养。TAP培养基使用1000×储备赫特纳氏(Hutner's)痕量元素混合物。赫特纳氏痕量元素混合物是由50g/L Na2EDTA.H2O(Titriplex III)、22g/L ZnSO4.7H2O、11.4g/LH3BO3、5g/L MnCl2.4H2O、5g/L FeSO4.7H2O、1.6g/L CoCl2.6H2O、1.6g/L CuSO4.5H2O及1.1g/L(NH4)6MoO3组成。
TAP培养基含有2.42g/L Tris(参(羟甲基)胺基甲烷)、25mg/L盐储备溶液、0.108g/L K2HPO4、0.054g/L KH2PO4及1.0mL/L冰乙酸。盐储备溶液是由15g/L NH4CL、4g/LMgSO4.7H2O及2g/L CaCl2.2H2O组成。作为用于糖合成的前驱体，可添加前驱体，如例如半乳糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖、GlcNAc。借由高压处理(121℃，21')来对培养基进行灭菌。对于斜面琼脂上的储备培养物，使用含有1％琼脂(具有经纯化高强度，1000g/cm2)的TAP培养基。
菌株、质体及突变
莱茵衣藻野生型菌株21gr(CC-1690，野生型，mt+)、6145C(CC-1691，野生型，mt－)、CC-125(137c，野生型，mt+)、CC-124(137c，野生型，mt－)可购自美国明尼苏达大学(University of Minnesota,U.S.A.)的衣藻属资源中心(Chlamydomonas ResourceCenter)(https://www.chlamycollection.org)。
表现质体源自pSI103，如可购自衣藻属资源中心。选殖可使用吉布森组装、金门组装、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。用于(异源)基因表现的适合启动子可衍生自例如Scranton等人(Algal Res.2016,15:135-142)。靶向基因修饰(如基因剔除或基因置换)可使用如例如借由Jiang等人(Eukaryotic Cell2014,13(11):1465-1469)所描述的Crispr-Cas技术进行。
经由电穿孔的转形是如借由Wang等人(Biosci.Rep.2019,39:BSR2018210)所描述进行。在恒定通气及光强度为8000Lx的连续光照下，使细胞在液体TAP培养基中生长，直至细胞密度达到1.0-2.0×107个细胞/毫升。接着，将细胞以1.0×106个细胞/毫升的浓度接种至新制液体TAP培养基中且在连续光照下生长18-20h，直至细胞密度达到4.0×106个细胞/毫升。接下来，将细胞借由在室温下以1250g离心5min收集，洗涤且用含有60mM山梨醇的预冷却液体TAP培养基(Sigma,美国)再悬浮且冰冻10min。接着，将250μL细胞悬浮液(对应于5.0×107个细胞)置放于具有100ng质体DNA的预冷却0.4cm电穿孔比色管(400ng/mL)中。使用BTX ECM830电穿孔装置(1575Ω，50μFD)用6个500V脉冲进行电穿孔，各脉冲具有4ms的脉冲长度及100ms的脉冲间隔时间。在电穿孔之后，立即将比色管置放于冰上10分钟。最后，将细胞悬浮液转移至含有10mL含60mM山梨糖醇的新鲜液体TAP培养基的50ml锥形离心管中，以便在暗光下借由缓慢振荡隔夜恢复。在隔夜恢复之后，将细胞再收集且用淀粉包埋方法接种至含有安比西林(100mg/L)或氯霉素(100mg/L)的选择性1.5％(w/v)琼脂-TAP盘上。接着在23+-0.5℃下在光强度为8000Lx的连续照明下培育盘。5-7天后分析细胞。
在生产UDP-半乳糖的一实施例中，莱茵衣藻细胞经包含基因的转录单元修饰，所述基因编码如例如阿拉伯芥的半乳糖激酶(KIN，UniProt ID Q9SEE5)及如例如来自阿拉伯芥(A.thaliana)的USP的UDP-糖焦磷酸化酶(UniProt ID Q9C5I1)。
在LN3生产的一实施例中，将包含半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(UniProt ID Q9JXQ6))的持续性转录单元另外添加至菌株。在LNT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶(如例如来自大肠杆菌O55:H7的WbgO(UniProt ID D3QY14))的持续性转录单元修饰。在LNnT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(UniProt ID Q51116))的持续性转录单元修饰。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一种合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
在23+/-0.5℃下，在14/10h光/暗循环下以8000Lx的光强度，在选择性TAP-琼脂盘中培养莱茵衣藻细胞。在培养5至7天之后分析细胞。
对于高密度培养，细胞可在封闭系统中培养，封闭系统如例如Chen等人(Bioresour.Technol.2011,102:71-81)及Johnson等人(Biotechnol.Prog.2018,34:811-827)所描述的竖直或水平管光生物反应器、搅拌槽光生物反应器或平板光生物反应器。
实施例30.在突变型莱茵衣藻细胞中生产包含GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc、β-Gal-(1,4)-β-GlcNAc-(1,3)-[β-GlcNAc-(1,6)]-β-Gal-(1,4)-GlcNAc及聚-LacNAc结构的寡糖混合物
莱茵衣藻细胞如实施例29中所描述经工程改造，包含有包含阿拉伯芥基因的持续性转录单元的基因体嵌入，所述基因编码半乳糖激酶(KIN，UniProt ID Q9SEE5)及UDP-糖焦磷酸化酶(USP)(UniProt ID Q9C5I1)，来自大肠杆菌的突变型glmS*54(借由A39T、R250C及G472S突变不同于野生型glmS(UniProt ID P17169))、来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB(UniProt ID NP_417175.1)、来自大肠杆菌的galE(UniProt ID P09147)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB(UniProt ID Q51116)及人类N-乙酰基乳糖胺糖β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶GCNT2(UniProt ID Q8N0V5)。在培养实验中在包含半乳糖及GlcNAc作为前驱体的TAP琼脂盘上根据实施例29中提供的培养条件，针对生产包含GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc、β-Gal-(1,4)-β-GlcNAc-(1,3)-[β-GlcNAc-(1,6)]-β-Gal-(1,4)-GlcNAc及聚-LacNAc结构的寡糖混合物评估新颖菌株。
实施例31.动物细胞的材料及方法
自不同哺乳动物的脂肪组织分离间叶干细胞
新鲜脂肪组织是获自屠宰场(例如，牛、猪、绵羊、鸡、鸭、鲶鱼、蛇、蛙)或抽脂手术(例如，在人类的情况下，在签署知情同意书之后)且保持在补充有抗生素的磷酸盐缓冲盐水中。进行脂肪组织的酶消化，之后进行离心以分离间叶干细胞。将经分离之间叶干细胞转移至细胞培养烧瓶中且在标准生长条件(例如37℃，5％CO2)下生长。初始培养基包括DMEM-F12、RPMI及Alpha-MEM培养基(补充有15％胎牛血清)及1％抗生素。随后在第一次通过之后，培养基用补充有10％FBS(胎牛血清)的培养基置换。举例而言，Ahmad及Shakoori(2013,Stem Cell Regen Med.9(2):29-36)，出于所有目的将该文献以全文引用的方式并入本文中，描述本文在此实施例中所描述的方法的某些变化形式。
自乳汁分离间叶干细胞
此实施例说明自在无菌条件下自人类或任何其他哺乳动物(诸如本文所描述)收集的乳汁分离间叶干细胞。将相等体积的磷酸盐缓冲盐水添加至经稀释乳汁中，之后离心20 min。将细胞集结粒用磷酸盐缓冲生理食盐水洗涤三次，且在标准培养条件下将细胞接种于细胞培养烧瓶中补充有10％胎牛血清及1％抗生素的DMEM-F12、RPMI及Alpha-MEM培养基中。举例而言，Hassiotou等人(2012,Stem Cells.30(10):2164-2174)，出于所有目的将该文献以全文引用的方式并入本文中，描述此实施例中所描述的方法的某些变化形式。
使用2D及3D培养系统分化干细胞
经分离之间叶细胞可在2D及3D培养系统中分化成乳腺样上皮细胞及腔细胞。参见例如Huynh等人.1991.Exp Cell Res.197(2):191 -199；Gibson等人.1991,In Vitro CellDev Biol Anim.27(7):585-594；Blatchford等人.1999；Animal Cell Technology':Basic&Applied Aspects,Springer,Dordrecht.141-145；Williams等人.2009,BreastCancer Res 11(3):26-43；及Arevalo等人.2015,Am J Physiol Cell Physiol.310(5):C348-C356；其中的各者出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
对于2D培养，经分离细胞最初接种于培养盘中补充有10ng/ml上皮生长因子及5pg/ml胰岛素的生长培养基中。在汇合时，将细胞用补充有2％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)及5pg/ml胰岛素的生长培养基喂饲48小时。为诱发分化，将细胞用含有5pg/ml胰岛素、1pg/ml皮质醇、0.65ng/ml三碘甲状腺素、100nM地塞米松及1pg/ml促乳素的完整生长培养基喂饲。24h后，自完整诱导培养基移除血清。
对于3D培养，将经分离细胞用胰蛋白酶消化且在基质胶、玻尿酸或超低附着表面培养盘中培养六天，且借由添加补充有10ng/ml上皮生长因子及5pg/ml胰岛素的生长培养基诱导以分化及泌乳。在汇合时，将细胞用补充有2％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)及5pg/ml胰岛素的生长培养基喂饲48小时。为诱发分化，将细胞用含有5pg/ml胰岛素、1pg/ml皮质醇、0.65ng/ml三碘甲状腺素、100nM地塞米松及1pg/ml促乳素的完整生长培养基喂饲。24h后，自完整诱导培养基移除血清。
制造乳腺样细胞的方法
哺乳动物细胞借由用编码Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的病毒载体再程序化来诱导多能性。接着将所得再程序化细胞在Mammocult培养基(可获自Stem Cell Technologies)或乳腺细胞富集培养基(DMEM、3％ FBS、雌激素、孕酮、肝素、皮质醇、胰岛素、EGF)中培养以使其类乳腺，可自其诱导所选乳组分的表现。或者，表观遗传重塑是使用诸如CRISPR/Cas9的重塑系统执行，以活化所关注的选择基因，诸如酪蛋白、待持续性a-乳白蛋白，以允许其各自蛋白质的表现，及/或下调及/或剔除所选内源性基因，如例如WO21067641中所描述，出于所有目的将该文献以全文引用的方式并入本文中。
培养
完整生长培养基包括高葡萄糖DMEM/F12、10％ FBS、1％ NEAA、1％青霉素-链霉素、1％ ITS-X、1％ F-Glu、10ng/ml EGF及5pg/ml皮质醇。完整泌乳培养基包括高葡萄糖DMEM/F12、1％ NEAA、1％青霉素-链霉素、1％ ITS-X、1％F-Glu、10ng/ml EGF、5pg/ml皮质醇及1pg/ml促乳素(5μg/ml，在Hyunh1991中)。细胞以20,000个细胞/平方厘米的密度接种于完整生长培养基中的经胶原蛋白涂布的培养瓶上，且在完整生长培养基中静置以黏附及扩增48小时，其后将该培养基换为完整泌乳培养基。在暴露于泌乳培养基后，细胞开始分化且停止生长。在约一周内，细胞开始分泌泌乳产物，诸如乳脂质、乳糖、酪蛋白及乳清至培养基中。可借由超过滤借由浓缩或稀释来达成所需浓度的泌乳培养基。可借由透析，例如以自培养基移除非所需代谢产物来达成泌乳培养基的所需盐平衡。可借由树脂纯化，例如使用镍树脂以移除HIS标记的生长因子来选择性萃取激素及所使用的其他生长因子，以进一步减少泌乳产物中的污染物含量。
实施例32.评估在非乳腺成体干细胞中生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物
如实施例31中所描述的经分离间叶细胞及经再程序化成乳腺样细胞经由CRISPR-CAS修饰以过度表现来自智人的β-1,4-半乳糖基转移酶1 B4GalT1(UniProt ID P15291)、来自酿酒酵母的磷酸酶ScDOG1(UniProt ID P38774)、来自酿酒酵母的GNA1(UniProt IDP43577)及来自大肠杆菌O55:H7的WbgO(UniProt ID D3QY14)、绿脓假单胞菌的4-表异构酶(WbpP)(UniProt ID Q8KN66)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶(LgtA)(UniProt ID Q9JXQ6)及来自流感嗜血杆菌的β1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(LgtD)(UniProt ID A0A2X4DBP3)。对于宿主，引入细胞中的所有基因经密码子最佳化。细胞以20,000个细胞/平方厘米的密度接种于完整生长培养基中的经胶原蛋白涂布的培养瓶上，且在完整生长培养基中静置以黏附及扩增48小时，其后将该培养基换为完整泌乳培养基，持续约7天。如实施例31中所描述培养之后，细胞经受UPLC且针对生产包含LNB、LN3、LNT、GalNAc-b1,3-乳糖、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNB及Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNB的寡糖混合物加以评估。

Claims (83)

1.一种代谢上经工程改造的细胞，其产生至少四种不同中性未岩藻糖化(non-fucosylated)寡糖的混合物，其中该细胞
代谢上经工程改造以用于产生该混合物，及
表现至少两种糖基转移酶(glycosyltransferase)，且
能够合成一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于所述糖基转移酶的一或多种供体。
2.如权利要求1的细胞，其中该细胞经基因表现模组修饰，其特征在于来自所述表现模组中的任一种的表现为持续性的(constitutive)或借由天然诱导剂产生。
3.如权利要求1或2中任一项的细胞，其中该细胞包含编码一种蛋白质的同一编码DNA序列的多个复本。
4.如权利要求1至3中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同中性未岩藻糖化寡糖。
5.如权利要求1至4中任一项的细胞，其中该细胞产生五种或更多种不同中性未岩藻糖化寡糖。
6.如权利要求1至5中任一项的细胞，其中该糖基转移酶中的任一种是选自包含以下的清单：半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶(xylosyltransferase)、葡萄糖胺基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺(altrosamine)转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶(UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase)及岩藻糖胺基转移酶，
较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下的清单：β-1,3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶及α-1,4-半乳糖基转移酶，
较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1,2-葡萄糖基转移酶、β-1,3-葡萄糖基转移酶及β-1,4-葡萄糖基转移酶，
较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下的清单：α-1,2-甘露糖基转移酶、α-1,3-甘露糖基转移酶及α-1,6-甘露糖基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶及β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基半乳糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：α-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶及β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶。
7.如权利要求1至6中任一项的细胞，其中该细胞能够表现、较佳表现至少三种、更佳至少四种、甚至更佳至少五种、最佳至少六种糖基转移酶。
8.如权利要求1至7中任一项的细胞，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一种的表现或活性方面经修饰。
9.如权利要求1至8中任一项的细胞，其中所述糖基转移酶中的任一种为N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一种为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
10.如权利要求1至9中任一项的细胞，其中该糖基转移酶中的任一种为半乳糖基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一种为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
11.如权利要求1至10中任一项的细胞，其中该糖基转移酶为N-乙酰基半乳糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
12.如权利要求1至11中任一项的细胞，其中该糖基转移酶为N-乙酰基甘露糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
13.如权利要求1至12中任一项的细胞，其中该核苷酸-糖中的任一种是选自包含以下的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖(arabino)-4-己酮糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-来苏糖(lyxo)-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(rhamnosamine)(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(pneumosamine)(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸(acetylmuramic acid)、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
14.如权利要求1至13中任一项的细胞，其中该细胞表现一或多种多肽，该一或多种多肽是选自包含以下的清单：L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶(N-acetylglucosamine-6-phosphate phosphatase)、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(uridylyltransferase)、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶。
15.如权利要求1至14中任一项的细胞，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
16.如权利要求1至15中任一项的细胞，其中该混合物包含至少一种中性未岩藻糖化寡糖，该寡糖经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化，含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
17.如权利要求1至16中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少一种寡糖，该寡糖包含N-乙酰基葡萄糖胺单糖单元。
18.如权利要求1至17中任一项的细胞，其中该寡糖混合物包含至少一种半乳糖基化寡糖。
19.如权利要求1至18中任一项的细胞，其中该细胞使用至少一种用于生产所述寡糖中的任一或多种的前驱体，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于生产所述寡糖中的任一或多种的前驱体，所述所述前驱体自培养基馈入至该细胞中。
20.如权利要求1至19中任一项的细胞，其中该细胞产生至少一种用于生产所述寡糖中的任一种的前驱体。
21.如权利要求1至20中任一项的细胞，其中该至少一种用于生产所述寡糖中的任一种的前驱体经完全转化为所述寡糖中的任一种。
22.如权利要求1至21中任一项的细胞，其中该细胞胞内产生所述寡糖，且其中所述所产生的寡糖的部分或实质上全部保持在胞内且/或经由被动或主动输送在该细胞外部排出。
23.如权利要求1至22中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外部分泌来自该混合物的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一种，较佳地，其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所述寡糖中的全部。
24.如权利要求1至23中任一项的细胞，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任的前驱体及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述所需前驱体，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
25.如权利要求23或24中任一项的细胞，其中该膜蛋白选自包含以下者的清单：运输蛋白(porter)、P-P-键水解驱动的转运蛋白(transporter)、β-桶状孔蛋白、辅助转运蛋白(transport protein)、推定转运蛋白(putative transport protein)及磷酸转移驱动的基团移位蛋白(translocator)，
较佳地，所述运输蛋白包含MFS转运蛋白、糖流出转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白(siderophore exporter)，
较佳地，所述P-P-键水解驱动的转运蛋白包含ABC转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
26.如权利要求23至25中任一项的细胞，其中该膜蛋白提供所述寡糖中的任一者的改善的生产及/或能够实现及/或增强所述寡糖中的任一者的流出。
27.如权利要求1至26中任一项的细胞，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象(lactose killing)。
28.如权利要求1至27中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞(progenitor)相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
29.如权利要求28的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下者的蛋白质中的任一或多种：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶(L-fuculokinase)、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶(phosphotransferase；PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶(phosphoacyltransferase)、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
30.如权利要求1至29中任一项的细胞，其中该细胞能够产生磷酸烯醇丙酮酸盐(phosphoenolpyruvate；PEP)。
31.如权利要求1至30中任一项的细胞，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的产生及/或供应。
32.如权利要求1至31中任一项的细胞，其中该中性未岩藻糖化寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
33.如权利要求1至32中任一项的细胞，其中所有所述中性未岩藻糖化寡糖为哺乳动物乳寡糖。
34.一种借由细胞、较佳单个细胞产生至少四种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供细胞，该细胞能够表现、较佳表现至少两种糖基转移酶且能够合成一或多种核苷酸-糖，其中该一或多种核苷酸-糖为用于所述糖基转移酶的一或多种供体，
ii)在容许表现所述糖基转移酶及合成所述核苷酸-糖的条件下培养该细胞，
iii)较佳地，自该培养分离所述中性未岩藻糖化寡糖中的至少一种，更佳地，自该培养分离所述中性未岩藻糖化寡糖中的全部。
35.如权利要求34的方法，其中该细胞为如权利要求1至33中任一项的代谢上经工程改造的细胞。
36.如权利要求35的方法，其中该细胞经基因表现模组修饰，其特征在于来自所述表现模组中的任一种的表现为持续性的或借由天然诱导剂产生。
37.如权利要求35或36中任一项的方法，其中该细胞包含编码一种蛋白质的同一编码DNA序列的多个复本。
38.如权利要求34至37中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少三种在聚合度方面不同的不同中性未岩藻糖化寡糖。
39.如权利要求34至38中任一项的方法，其中该细胞产生五种或更多种不同中性未岩藻糖化寡糖。
40.如权利要求34至39中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一者是选自包含以下清单：半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶、N-乙酰基半乳糖胺基转移酶、N-乙酰基甘露糖胺基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖胺基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖胺基转移酶，
较佳地，该半乳糖基转移酶是选自包含以下的清单：β-1,3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基转移酶、α-1,3-半乳糖基转移酶及α-1,4-半乳糖基转移酶，
较佳地，该葡萄糖基转移酶是选自包含以下的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1,2-葡萄糖基转移酶、β-1,3-葡萄糖基转移酶及β-1,4-葡萄糖基转移酶，
较佳地，该甘露糖基转移酶是选自包含以下的清单：α-1,2-甘露糖基转移酶、α-1,3-甘露糖基转移酶及α-1,6-甘露糖基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：半乳糖苷β-1,3-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶及β-1,6-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基半乳糖胺基转移酶是选自包含以下的清单：α-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶及β-1,3-N-乙酰基半乳糖胺基转移酶，
较佳地，该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。
41.如权利要求34至40中任一项的方法，其中该细胞能够表现、较佳表现至少三种、更佳至少四种、甚至更佳至少五种、最佳至少六种糖基转移酶。
42.如权利要求34至41中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一者为N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶且所述供体核苷酸-糖中的任一者为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。
43.如权利要求34至42中任一项的方法，其中所述糖基转移酶中的任一者为半乳糖基转移酶且该供体核苷酸-糖中的任一者为UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
44.如权利要求34至43中任一项的方法，其中该糖基转移酶为N-乙酰基半乳糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)。
45.如权利要求34至44中任一项的方法，其中该糖基转移酶为N-乙酰基甘露糖胺基转移酶且该供体核苷酸-糖为UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)。
46.如权利要求34至45中任一项的方法，其中所述核苷酸-糖中的任一者是选自包含以下的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧--L-来苏糖-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖。
47.如权利要求34至46中任一项的方法，其中该细胞表现一或多种多肽，该一或多种多肽选自包含以下的清单：L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶。
48.如权利要求34至47中任一项的方法，其中该细胞能够合成至少两种核苷酸-糖，较佳至少三种核苷酸-糖，更佳至少四种核苷酸-糖，甚至更佳至少五种核苷酸-糖。
49.如权利要求34至48中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少一种寡糖，该寡糖包含N-乙酰基葡萄糖胺单糖单元。
50.如权利要求34至49中任一项的方法，其中该寡糖混合物包含至少一种半乳糖基化寡糖。
51.如权利要求34至50中任一项的方法，其中所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者经半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化，含有N-乙酰基葡萄糖胺、含有N-乙酰基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙酰基甘露糖胺。
52.如权利要求34至51中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于生产所述寡糖中的任一或多者的前驱体，较佳地，该细胞使用两种或更多种用于生产所述寡糖中的任一或多种的前驱体，所述前驱体自培养基馈入至该细胞中。
53.如权利要求34至52中任一项的方法，其中该细胞产生用于生产所述寡糖中的任一者的前驱体。
54.如权利要求34至53中任一项的方法，其中该至少一种用于生产所述寡糖中的任一者的前驱体经完全转化为所述寡糖中的任一者。
55.如权利要求34至54中任一项的方法，其中该细胞胞内产生所述寡糖，且其中所述所产生的寡糖的部分或实质上全部保持在胞内且/或经由被动或主动输送在该细胞外部排出。
56.如权利要求34至55中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与在该细胞外部分泌来自该混合物的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者，较佳地，其中该膜蛋白参与自该细胞分泌来自该混合物的所述寡糖中的全部。
57.如权利要求34至56中任一项的方法，其中该细胞进一步经遗传修饰以用于
i)内源膜蛋白的经修饰表现，及/或
ii)内源膜蛋白的经修饰活性，及/或
iii)同源膜蛋白的表现，及/或
iv)异源膜蛋白的表现，
其中该膜蛋白参与吸收用于合成该混合物中的所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者的前驱体及/或受体，较佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述所需前驱体，更佳地其中该膜蛋白参与吸收所有所述受体。
58.如权利要求56或57中任一项的方法，其中该膜蛋白是选自包含以下者的清单：运输蛋白、P-P-键水解驱动的转运蛋白、β-桶状孔蛋白、辅助转运蛋白、推定转运蛋白及磷酸转移驱动的基团移位蛋白，
较佳地，所述运输蛋白包含MFS转运蛋白、糖流出转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白，
较佳地，所述P-P-键水解驱动的转运蛋白包含ABC转运蛋白及螯铁蛋白输出蛋白。
59.如权利要求56至58中任一项的方法，其中该膜蛋白提供所述寡糖中的任一者的改善的生产及/或能够实现及/或增强所述寡糖中的任一者的流出。
60.如权利要求34至59中任一项的方法，其中该细胞在乳糖与一或多种其他碳源合并的环境中生长时抵抗乳糖杀灭现象。
61.如权利要求34至60中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含用于减少乙酸盐的产生的修饰。
62.如权利要求61的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞包含降低或减少表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性的包含以下的所述蛋白质中的任一或多种：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖-特异性易位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
63.如权利要求34至62中任一项的方法，其中该细胞能够产生磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)。
64.如权利要求34至63中任一项的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞经修饰用于增强磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)的产生及/或供应。
65.如权利要求34至64中任一项的方法，其中该中性未岩藻糖化寡糖中的任一者为哺乳动物乳寡糖。
66.如权利要求34至65中任一项的方法，其中所有所述中性未岩藻糖化寡糖为哺乳动物乳寡糖。
67.如权利要求34至66中任一项的方法，其中所述条件包含：
使用包含至少一种用于生产所述寡糖中的任一者的前驱体及/或受体的培养基，及/或
向该培养基中添加至少一种前驱体及/或受体进料(acceptor feed)以用于产生所述寡糖中的任一者。
68.如权利要求34至67中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含至少一种前驱体及/或受体的培养基；
ii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍；
iii)在反应器中向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，其中该总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱体及/或受体进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该前驱体及/或受体进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的该时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加至少一种前驱体及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
69.如权利要求34至67中任一项的方法，该方法包含以下步骤中的至少一者：
i)使用包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的培养基，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内；
ii)向该培养基添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍；
iii)向该培养基添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中该反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前的该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于两倍，且其中较佳地，该乳糖进料的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该乳糖进料的温度保持在20℃与80℃之间；
iv)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料；
v)历经1天、2天、3天、4天、5天的该时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L、较佳75g/L、更佳100g/L、更佳125g/L、更佳150g/L、更佳175g/L、更佳200g/L、更佳225g/L、更佳250g/L、更佳275g/L、更佳300g/L、更佳325g/L、更佳350g/L、更佳375g/L、更佳400g/L、更佳450g/L、更佳500g/L、甚至更佳550g/L、最佳600g/L，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定为3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在最终培养中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的所述寡糖中的任一者。
70.如权利要求69的方法，其中该乳糖进料借由自该培养开始以至少5mM的浓度、较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度、更佳以>300mM的浓度添加乳糖来实现。
71.如权利要求69或70中任一项的方法，其中该乳糖进料系借由使得在该培养的整个生产阶段中获得至少5mM、较佳10mM或30mM的乳糖浓度的浓度向培养基中添加乳糖来实现。
72.如权利要求34至71中任一项的方法，其中宿主细胞经培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
73.如权利要求34至72中任一项的方法，其中该细胞培养于包含碳源的培养基中，该碳源包含单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油、包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物的复合培养基；较佳地，其中该碳源系选自包含以下者的清单：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖(arabinose)、麦芽-寡糖、麦芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖(trehalose)、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖浆、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐及丙酮酸盐。
74.如权利要求34至73中任一项的方法，其中该培养基含有至少一种选自包含以下者的群组的前驱体：乳糖、半乳糖、岩藻糖(fucose)、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(LNB)、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
75.如权利要求34至74中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由在将该较佳为乳糖的前驱体在第二阶段中添加至该培养基之前将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至该培养基中来提供。
76.如权利要求34至75中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至包含较佳为乳糖的前驱体的该培养基中来提供，之后为其中仅将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至该培养基的第二阶段。
77.如权利要求34至76中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至包含较佳为乳糖的前驱体的该培养基中来提供，之后为其中将较佳为葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质及较佳为乳糖的前驱体添加至该培养基的第二阶段。
78.如权利要求34至77中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一者：澄清、超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效过滤、切向流超过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水性交互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
79.如权利要求34至78中任一项的方法，其进一步包含自该细胞纯化所述中性未岩藻糖化寡糖中的任一者。
80.如权利要求79中任一项的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换、使用醇、使用水醇(aqueousalcohol)混合物、结晶、蒸发、沉淀、干燥、干燥、冻干(lyophilization)、喷雾冷冻干燥(spray freeze drying)、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(band drying)、带式干燥(beltdrying)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒(drum)干燥、滚筒(roller)干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
81.如权利要求1至33中任一项的细胞或如权利要求34至80中任一项的方法，其中该细胞为细菌、真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞或原虫细胞，
较佳地，该细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，更佳作为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655，
较佳地，该真菌属于选自包含以下的群组的属：根霉菌属(Rhizopus)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)，
较佳地，该酵母菌属于选自包含以下的群组的属：酵母菌属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉森酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、球拟假丝酵母属(Starmerella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，
较佳地，该植物细胞为藻类细胞或衍生自烟草、苜蓿、稻谷、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，
较佳地，该动物细胞衍生自非人类哺乳动物、鸟类、鱼类、无脊椎动物、爬虫类、两栖动物或昆虫，或为衍生自排除胚胎干细胞的人类细胞的经遗传修饰的细胞系，更佳地该人类及非人类哺乳动物细胞为上皮细胞、胚胎肾细胞、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，更佳地该昆虫细胞衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、家蚕(Bombyxmori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，
较佳地，该原虫细胞为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
82.如权利要求81的细胞或如权利要求81的方法，其中与未经修饰的先驱细胞相比，该细胞为存活的革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacterium)，该细菌包含减少或消除合成的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG)、肠内菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen；ECA)、纤维素、可拉酸(colanic acid)、核心寡糖(core oligosaccharide)、渗透调节周质葡聚糖(Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG)、甘油葡萄糖苷(glucosylglycerol)、聚糖及/或海藻糖。
83.一种如权利要求1至33、81、82中任一项的细胞或如权利要求34至82中任一项的方法的用途，其用于产生至少三种不同中性未岩藻糖化寡糖的混合物。
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