JP2003189891A - 糖ヌクレオチド類および複合糖質の製造法 - Google Patents
糖ヌクレオチド類および複合糖質の製造法Info
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- JP2003189891A JP2003189891A JP2002339308A JP2002339308A JP2003189891A JP 2003189891 A JP2003189891 A JP 2003189891A JP 2002339308 A JP2002339308 A JP 2002339308A JP 2002339308 A JP2002339308 A JP 2002339308A JP 2003189891 A JP2003189891 A JP 2003189891A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細菌・ウィルス等の感染防御、心血管障害へ
の適応および免疫治療等に有用な複合糖質の製造方法お
よび該複合糖質の合成基質として重要である糖ヌクレオ
チドの安価で効率的な製造方法を提供する。 【解決手段】 本発明によれば、ａ）ヌクレオチドの前
駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養
液または該培養液の処理物およびｂ）糖とＮＴＰから糖
ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の培養液ま
たは該培養液の処理物を酵素源として用いた糖ヌクレオ
チドの製造法、上記ａ）、上記ｂ）およびｃ）糖ヌクレ
オチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力
を有する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液ま
たは該培養液の処理物、を酵素源として用いた複合糖質
の製造法が提供される。
の適応および免疫治療等に有用な複合糖質の製造方法お
よび該複合糖質の合成基質として重要である糖ヌクレオ
チドの安価で効率的な製造方法を提供する。 【解決手段】 本発明によれば、ａ）ヌクレオチドの前
駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養
液または該培養液の処理物およびｂ）糖とＮＴＰから糖
ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の培養液ま
たは該培養液の処理物を酵素源として用いた糖ヌクレオ
チドの製造法、上記ａ）、上記ｂ）およびｃ）糖ヌクレ
オチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力
を有する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液ま
たは該培養液の処理物、を酵素源として用いた複合糖質
の製造法が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌・ウィルス等
の感染防御、心血管障害への適応および免疫治療等に有
用な複合糖質の製造方法および該複合糖質の合成基質と
して重要である糖ヌクレオチドの製造方法に関する。
の感染防御、心血管障害への適応および免疫治療等に有
用な複合糖質の製造方法および該複合糖質の合成基質と
して重要である糖ヌクレオチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖ヌクレオチドの製造方法として、１）
化学合成法（非特許文献１〜４参照）、２）酵素を用い
た製造方法（非特許文献５〜７および特許文献１〜３参
照）、３）酵母等の微生物菌体を用いる方法（特許文献
４〜９参照）、４）耐塩性酵母の微生物菌体からの抽出
法（特許文献１０参照）等が知られている。
化学合成法（非特許文献１〜４参照）、２）酵素を用い
た製造方法（非特許文献５〜７および特許文献１〜３参
照）、３）酵母等の微生物菌体を用いる方法（特許文献
４〜９参照）、４）耐塩性酵母の微生物菌体からの抽出
法（特許文献１０参照）等が知られている。
【０００３】１）の方法においては、高価なヌクレオシ
ド−５’−一リン酸（以下、ＮＭＰと略す）のモルフォ
リデート誘導体や糖リン酸等が必要であり、２）の方法
においては、ヌクレオシド−５’−二リン酸（以下、Ｎ
ＤＰと略す）、ヌクレオシド−５’−三リン酸（以下、
ＮＴＰと略す）、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸
等の高価な原料やピルビン酸キナーゼ等多数の酵素が必
要であり、３）の方法においては菌体の乾燥処理等が必
要である。４）の方法を含め、上記いずれの方法におい
ても、原料として高価なヌクレオチドや糖リン酸等が用
いられていたり、操作的に大量生産が困難であるため、
今日に至るまで、糖ヌクレオチドの工業的規模での製造
法は確立されていない。複合糖質の製造法としては、
１）化学合成法（非特許文献８〜１０参照）、２）加水
分解酵素（非特許文献１１および１２参照）を用いる方
法、および３）糖転移酵素（特許文献１１〜１６参照）
を利用した方法が知られている。
ド−５’−一リン酸（以下、ＮＭＰと略す）のモルフォ
リデート誘導体や糖リン酸等が必要であり、２）の方法
においては、ヌクレオシド−５’−二リン酸（以下、Ｎ
ＤＰと略す）、ヌクレオシド−５’−三リン酸（以下、
ＮＴＰと略す）、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸
等の高価な原料やピルビン酸キナーゼ等多数の酵素が必
要であり、３）の方法においては菌体の乾燥処理等が必
要である。４）の方法を含め、上記いずれの方法におい
ても、原料として高価なヌクレオチドや糖リン酸等が用
いられていたり、操作的に大量生産が困難であるため、
今日に至るまで、糖ヌクレオチドの工業的規模での製造
法は確立されていない。複合糖質の製造法としては、
１）化学合成法（非特許文献８〜１０参照）、２）加水
分解酵素（非特許文献１１および１２参照）を用いる方
法、および３）糖転移酵素（特許文献１１〜１６参照）
を利用した方法が知られている。
【０００４】１）の方法では立体選択的合成のためには
保護基の導入が必須であり、２）の方法では収率・選択
性が十分でなく、３）の方法においてはＮＤＰ、ＮＴ
Ｐ、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸、あるいは糖
ヌクレオチド等の高価な原料やピルビン酸キナーゼ等多
数の酵素が必要であり、いずれの方法においても複合糖
質の安価な工業的製造方法は確立されていない。また、
安価なヌクレオチドの前駆物質および糖および複合糖質
前駆物質のみを原料として、直接複合糖質を工業的に製
造する方法は知られていない。
保護基の導入が必須であり、２）の方法では収率・選択
性が十分でなく、３）の方法においてはＮＤＰ、ＮＴ
Ｐ、ホスホエノールピルビン酸、糖リン酸、あるいは糖
ヌクレオチド等の高価な原料やピルビン酸キナーゼ等多
数の酵素が必要であり、いずれの方法においても複合糖
質の安価な工業的製造方法は確立されていない。また、
安価なヌクレオチドの前駆物質および糖および複合糖質
前駆物質のみを原料として、直接複合糖質を工業的に製
造する方法は知られていない。
【０００５】コリネバクテリウム属に属する微生物にお
いて、オロット酸を添加することによりＵＭＰが生産さ
れるとの報告がある（非特許文献１３参照）。また、オ
ロット酸を原料にしてシチジン二リン酸コリンを生成す
る方法も知られている（特許文献１７参照）。
いて、オロット酸を添加することによりＵＭＰが生産さ
れるとの報告がある（非特許文献１３参照）。また、オ
ロット酸を原料にしてシチジン二リン酸コリンを生成す
る方法も知られている（特許文献１７参照）。
【０００６】
【特許文献１】特表平7-508413号公報
【０００７】
【特許文献２】特表平7-500248号公報
【０００８】
【特許文献３】国際公開第96/27670号パンフレット
【０００９】
【特許文献４】特公昭45-2073号公報
【００１０】
【特許文献５】特公昭46-40756号公報
【００１１】
【特許文献６】特公昭47-1837号公報
【００１２】
【特許文献７】特公昭47-26703号公報
【００１３】
【特許文献８】特公昭49-8278号公報
【００１４】
【特許文献９】特開平2-268692号公報
【００１５】
【特許文献１０】特開平8-23993号公報
【００１６】
【特許文献１１】特開平7-79792号公報
【００１７】
【特許文献１２】特表平7-500248号公報
【００１８】
【特許文献１３】特公平5-82200号公報
【００１９】
【特許文献１４】国際公開第94/25614
【００２０】
【特許文献１５】特表平9-503905号公報
【００２１】
【特許文献１６】米国特許第5,583,042号明細書
【００２２】
【特許文献１７】特開平5-276974号公報
【００２３】
【非特許文献１】Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 2
8, 307 (1973)
8, 307 (1973)
【００２４】
【非特許文献２】Bull. Chem. Soc. Japan, 46, 3275
(1973)
(1973)
【００２５】
【非特許文献３】J. Org. Chem., 57, 146 (1992)
【００２６】
【非特許文献４】Carbohydr. Res., 242, 69 (1993)
【００２７】
【非特許文献５】J. Org. Chem., 55, 1834 (1990)
【００２８】
【非特許文献６】J. Org. Chem., 57, 152 (1992)
【００２９】
【非特許文献７】J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (198
8)
8)
【００３０】
【非特許文献８】Methods in Enzymol., 247, 193 (199
4)
4)
【００３１】
【非特許文献９】Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21, 1
55 (1982)
55 (1982)
【００３２】
【非特許文献１０】Carbohydr. Res., 211, c1 (1991)
【００３３】
【非特許文献１１】Anal. Biochem., 202, 215 (1992)
【００３４】
【非特許文献１２】Trends Biotechnol., 6, 256 (198
8)
8)
【００３５】
【非特許文献１３】Amino Acid Nucleic Acid, 23, 107
(1971)
(1971)
【００３６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、細菌
・ウィルス等の感染防御、心血管障害への適応および免
疫治療等に有用な複合糖質の製造方法および該複合糖質
の合成基質として重要である糖ヌクレオチドの安価で効
率的な製造方法を提供することにある。
・ウィルス等の感染防御、心血管障害への適応および免
疫治療等に有用な複合糖質の製造方法および該複合糖質
の合成基質として重要である糖ヌクレオチドの安価で効
率的な製造方法を提供することにある。
【００３７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物を
用いて、ヌクレオチドの前駆物質を原料とした複合糖質
および糖ヌクレオチドの生産について鋭意検討を行った
結果、ヌクレオチドの前駆物質および糖のみを原料とし
て糖ヌクレオチドが効率的に生産できること、糖ヌクレ
オチドの生成に関与する遺伝子の発現を強化することに
より、その生産性が向上することを見いだし、さらに、
該糖ヌクレオチドを生産可能な微生物、および、糖ヌク
レオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能
力を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞を
利用し、ヌクレオチドの前駆物質および糖および複合糖
質前駆物質のみを原料として効率的に複合糖質を生産で
きることを見いだし本発明を完成するに至った。
用いて、ヌクレオチドの前駆物質を原料とした複合糖質
および糖ヌクレオチドの生産について鋭意検討を行った
結果、ヌクレオチドの前駆物質および糖のみを原料とし
て糖ヌクレオチドが効率的に生産できること、糖ヌクレ
オチドの生成に関与する遺伝子の発現を強化することに
より、その生産性が向上することを見いだし、さらに、
該糖ヌクレオチドを生産可能な微生物、および、糖ヌク
レオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能
力を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞を
利用し、ヌクレオチドの前駆物質および糖および複合糖
質前駆物質のみを原料として効率的に複合糖質を生産で
きることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００３８】本発明は、ａ）ヌクレオチドの前駆物質か
らＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養液または
該培養液の処理物、ｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチド
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物、およびｃ）糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物
質から複合糖質を生産する能力を有する微生物、動物細
胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物、
を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前
駆物質、糖および複合糖質前駆物質を水性媒体中に存在
せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水
性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合
糖質の製造法、ａ）ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰ
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物、およびｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを
生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の
処理物、を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオ
チドの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、該
水性媒体中に糖ヌクレオチドを生成蓄積させ、該水性媒
体中から糖ヌクレオチドを採取することを特徴とする糖
ヌクレオチドの製造法、および糖ヌクレオチドと複合糖
質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生
物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液
の処理物を酵素源として用い、該酵素源、複合糖質前駆
物質および上記に記載の糖ヌクレオチドの製造法により
得られた糖ヌクレオチドを水性媒体中に存在せしめ、該
水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中か
ら複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造
法を提供する。更に、ガラクトキナーゼ活性の強い微生
物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用
い、該酵素源およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒
体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ−アセチルグルコ
サミン−１−リン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中から
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸を採取すること
を特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の
製造法を提供する。
らＮＴＰを生産する能力を有する微生物の培養液または
該培養液の処理物、ｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチド
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物、およびｃ）糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物
質から複合糖質を生産する能力を有する微生物、動物細
胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物、
を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前
駆物質、糖および複合糖質前駆物質を水性媒体中に存在
せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水
性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合
糖質の製造法、ａ）ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰ
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物、およびｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを
生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の
処理物、を酵素源として用い、これら酵素源、ヌクレオ
チドの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、該
水性媒体中に糖ヌクレオチドを生成蓄積させ、該水性媒
体中から糖ヌクレオチドを採取することを特徴とする糖
ヌクレオチドの製造法、および糖ヌクレオチドと複合糖
質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生
物、動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液
の処理物を酵素源として用い、該酵素源、複合糖質前駆
物質および上記に記載の糖ヌクレオチドの製造法により
得られた糖ヌクレオチドを水性媒体中に存在せしめ、該
水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中か
ら複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造
法を提供する。更に、ガラクトキナーゼ活性の強い微生
物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用
い、該酵素源およびＮ−アセチルグルコサミンを水性媒
体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ−アセチルグルコ
サミン−１−リン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中から
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸を採取すること
を特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の
製造法を提供する。
【００３９】表１および表２に本発明に用いる略号およ
び該略号の説明を記す。
び該略号の説明を記す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】本発明によれば、１）ＮＴＰや糖リン酸等
の高価な原料を必要とせず、オロット酸等の安価なヌク
レオチドの前駆物質および糖のみを原料とする、２）Ｎ
ＭＰあるいはＮＤＰからＮＴＰへの転換において高価な
ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼの添加
を必要としない、さらに、３）酵素の単離操作を必要と
しない等の特徴を有する糖ヌクレオチドの新規な製造法
および該糖ヌクレオチド製造法を利用した新規な複合糖
質の製造法を提供できる。
の高価な原料を必要とせず、オロット酸等の安価なヌク
レオチドの前駆物質および糖のみを原料とする、２）Ｎ
ＭＰあるいはＮＤＰからＮＴＰへの転換において高価な
ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼの添加
を必要としない、さらに、３）酵素の単離操作を必要と
しない等の特徴を有する糖ヌクレオチドの新規な製造法
および該糖ヌクレオチド製造法を利用した新規な複合糖
質の製造法を提供できる。
【００４３】本発明の製造法で製造される糖ヌクレオチ
ドとしては、ヌクレオシド−５’−二リン酸残基の末端
リン酸基と糖残基の還元基とがエステル結合をした一般
構造を有する化合物をあげることができ、更に、ヌクレ
チド残基がシチジン−５’−一リン酸のもの、糖残基が
ポリオールのものも本発明により製造される糖ヌクレオ
チドに含まれる。
ドとしては、ヌクレオシド−５’−二リン酸残基の末端
リン酸基と糖残基の還元基とがエステル結合をした一般
構造を有する化合物をあげることができ、更に、ヌクレ
チド残基がシチジン−５’−一リン酸のもの、糖残基が
ポリオールのものも本発明により製造される糖ヌクレオ
チドに含まれる。
【００４４】本発明の製造法で製造される複合糖質とし
ては、単糖、オリゴサッカライド、担体等に結合した単
糖またはオリゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂
質、糖蛋白質、糖脂質、グリコペプチドあるいはステロ
イド化合物等に糖質が結合した化合物をあげることがで
きる。以下に本発明を詳細に説明する。
ては、単糖、オリゴサッカライド、担体等に結合した単
糖またはオリゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂
質、糖蛋白質、糖脂質、グリコペプチドあるいはステロ
イド化合物等に糖質が結合した化合物をあげることがで
きる。以下に本発明を詳細に説明する。
【００４５】１） 本発明で用いられるヌクレオチドの
前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物とし
ては、ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能
力を有する微生物であればいずれも用いることができ、
例えば、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に
属する微生物等をあげることができる。エシェリヒア属
に属する微生物としてはエシェリヒア・コリ等をあげる
ことができる。
前駆物質からＮＴＰを生産する能力を有する微生物とし
ては、ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを生産する能
力を有する微生物であればいずれも用いることができ、
例えば、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に
属する微生物等をあげることができる。エシェリヒア属
に属する微生物としてはエシェリヒア・コリ等をあげる
ことができる。
【００４６】コリネバクテリウム属に属する微生物とし
てはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等をあげる
ことができる。 ２）本発明で用いられる糖とＮＴＰから糖ヌクレオチド
を生産する能力を有する微生物としては、目的とする糖
ヌクレオチドを生成する活性を有する生物であればいず
れでも用いることができ、例えば、 ２）− ＵＤＰ−Ｇｌｃの生産に関しては、下記、式
１に示した（１）から（４）の酵素活性の強い微生物を
用いることが好ましい。
てはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等をあげる
ことができる。 ２）本発明で用いられる糖とＮＴＰから糖ヌクレオチド
を生産する能力を有する微生物としては、目的とする糖
ヌクレオチドを生成する活性を有する生物であればいず
れでも用いることができ、例えば、 ２）− ＵＤＰ−Ｇｌｃの生産に関しては、下記、式
１に示した（１）から（４）の酵素活性の強い微生物を
用いることが好ましい。
【００４７】具体的には、エシェリヒア属に属する微生
物およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげる
ことができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・
コリまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあ
げることができる。また、（１）、（２）、（３）およ
び（４）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組
換え技術により増強した形質転換株を用いることもでき
る。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ
由来のｇａｌＵおよびｐｐａ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ（ｐＮＴ１２）を保有するエシェリヒア・コリKY8415
（FERM BP-408）株等をあげることができる。
物およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげる
ことができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・
コリまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあ
げることができる。また、（１）、（２）、（３）およ
び（４）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組
換え技術により増強した形質転換株を用いることもでき
る。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ
由来のｇａｌＵおよびｐｐａ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ（ｐＮＴ１２）を保有するエシェリヒア・コリKY8415
（FERM BP-408）株等をあげることができる。
【００４８】
【化１】
【００４９】(1):ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)あるいは
グルコキナーゼ(EC 2.7.1.2) (2):ホスホグルコムターゼ(EC 2.7.5.1) (3):グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラー
ゼ(EC 2.7.7.9) (4):（イノーガニック）ピロホスファターゼ(EC 3.6.1.
1) ２）− ＵＤＰ−Ｇａｌの生産に関しては、下記、式
２に示した（５）および（６）の酵素活性の強い微生物
を、また、好ましくは、式１に示した（１）から（４）
の酵素活性の強い性質をもあわせ持つような微生物を用
いることが好ましい。
グルコキナーゼ(EC 2.7.1.2) (2):ホスホグルコムターゼ(EC 2.7.5.1) (3):グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラー
ゼ(EC 2.7.7.9) (4):（イノーガニック）ピロホスファターゼ(EC 3.6.1.
1) ２）− ＵＤＰ−Ｇａｌの生産に関しては、下記、式
２に示した（５）および（６）の酵素活性の強い微生物
を、また、好ましくは、式１に示した（１）から（４）
の酵素活性の強い性質をもあわせ持つような微生物を用
いることが好ましい。
【００５０】具体的には、エシェリヒア属に属する微生
物およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげる
ことができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・
コリおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあ
げることができる。また、（５）および（６）から選ば
れる一つ以上の酵素の活性を、あるいは、（５）および
（６）から選ばれる一つ以上の酵素と（１）から（４）
から選ばれる一つ以上の酵素の活性を、遺伝子組換え技
術により増強した形質転換株を用いることもできる。該
形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来の
ｇａｌＴおよびｇａｌＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
（ｐＮＴ２５）を保有するエシェリヒア・コリNM522株
およびエシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴおよびｇａｌ
Ｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＴＫ７）を保有する
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170をあ
げることができる。
物およびコリネバクテリウム属に属する微生物をあげる
ことができ、好ましい具体例としては、エシェリヒア・
コリおよびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあ
げることができる。また、（５）および（６）から選ば
れる一つ以上の酵素の活性を、あるいは、（５）および
（６）から選ばれる一つ以上の酵素と（１）から（４）
から選ばれる一つ以上の酵素の活性を、遺伝子組換え技
術により増強した形質転換株を用いることもできる。該
形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来の
ｇａｌＴおよびｇａｌＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
（ｐＮＴ２５）を保有するエシェリヒア・コリNM522株
およびエシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴおよびｇａｌ
Ｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＴＫ７）を保有する
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170をあ
げることができる。
【００５１】
【化２】
【００５２】(5):ガラクトキナーゼ(EC 2.7.1.6)
(6):ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラー
ゼ(EC 2.7.7.12) ２）− ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産に関しては、下
記、式３に示した（７）から（１２）および式１に示し
た（４）の酵素活性の強い微生物、あるいは式３に示し
た（１３）および（１０）の酵素活性の強い微生物を用
いることが好ましい。
ゼ(EC 2.7.7.12) ２）− ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産に関しては、下
記、式３に示した（７）から（１２）および式１に示し
た（４）の酵素活性の強い微生物、あるいは式３に示し
た（１３）および（１０）の酵素活性の強い微生物を用
いることが好ましい。
【００５３】具体的には、エシェリヒア属およびコリネ
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（４）、（７）、（８）、（９）、（１
０）、および（１３）から選ばれる一つ以上の酵素の活
性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用い
ることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェ
リヒア・コリ由来のｇｌｍＭ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ（ｐＮＴ４４）を保有するエシェリヒア・コリNM522
株、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｍＵおよびｐｐａ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ１４）を保有するエ
シェリヒア・コリKY8415株、エシェリヒア・コリ由来の
ｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４６）を保
有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コ
リ由来のｇａｌＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ
５４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげ
ることができる。
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（４）、（７）、（８）、（９）、（１
０）、および（１３）から選ばれる一つ以上の酵素の活
性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用い
ることもできる。該形質転換体の具体例として、エシェ
リヒア・コリ由来のｇｌｍＭ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ（ｐＮＴ４４）を保有するエシェリヒア・コリNM522
株、エシェリヒア・コリ由来のｇｌｍＵおよびｐｐａ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ１４）を保有するエ
シェリヒア・コリKY8415株、エシェリヒア・コリ由来の
ｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４６）を保
有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コ
リ由来のｇａｌＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ
５４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげ
ることができる。
【００５４】遺伝子組換えによる（８）のホスホグルコ
サミンムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−
１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが[J. Biol. Chem.,
271,32 (1996)]、（１１）および（１２）の酵素の活
性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用い
ることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２を添加することな
く、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−
Ｐ２を供給することが可能である。
サミンムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−
１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが[J. Biol. Chem.,
271,32 (1996)]、（１１）および（１２）の酵素の活
性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用い
ることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ２を添加することな
く、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−
Ｐ２を供給することが可能である。
【００５５】このような形質転換体の具体例として、エ
シェリヒア・コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体Ｄ
ＮＡ（ｐＮＴ２４）を保有するエシェリヒア・コリNM52
2株、エシェリヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア
・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよ
びｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげること
ができる。
シェリヒア・コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体Ｄ
ＮＡ（ｐＮＴ２４）を保有するエシェリヒア・コリNM52
2株、エシェリヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア
・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよ
びｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげること
ができる。
【００５６】（１１）および（１２）の酵素活性を用い
てＧ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ
２を供給することにより、（８）のホスホグルコサミン
ムターゼ活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開
示された方法である。（１３）のガラクトキナーゼ(EC
2.7.1.6)を用いＧｌｃＮＡｃからＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ
を製造する方法は本発明で初めて開示された製造法であ
る。該製造法を用いてＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを製造する
ことが可能である。即ち、ガラクトキナーゼ活性の強い
微生物、例えば、ｇａｌＫをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生
物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用
い、該酵素源およびＧｌｃＮＡｃを水性媒体中に存在せ
しめ、該水性媒体中にＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを生成蓄積
させ、該水性媒体中からＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを採取す
ることによりＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを製造することがで
きる。
てＧ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ
２を供給することにより、（８）のホスホグルコサミン
ムターゼ活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開
示された方法である。（１３）のガラクトキナーゼ(EC
2.7.1.6)を用いＧｌｃＮＡｃからＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ
を製造する方法は本発明で初めて開示された製造法であ
る。該製造法を用いてＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを製造する
ことが可能である。即ち、ガラクトキナーゼ活性の強い
微生物、例えば、ｇａｌＫをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生
物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用
い、該酵素源およびＧｌｃＮＡｃを水性媒体中に存在せ
しめ、該水性媒体中にＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを生成蓄積
させ、該水性媒体中からＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを採取す
ることによりＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを製造することがで
きる。
【００５７】水性媒体より、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐの採
取は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法に
よって行うことができる。
取は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法に
よって行うことができる。
【００５８】
【化３】
【００５９】(7):ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)あるいは
グルコキナーゼ(EC 2.7.1.2) (8):ホスホグルコサミンムターゼ (9):グルコサミン-1-リン酸アセチルトランスフェラー
ゼ (10):N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトラン
スフェラーゼ(EC 2.7.7.23) (11):ホスホフルクトキナーゼ(EC 2.7.1.11) (12):ホスホグルコムターゼ(EC 2.7.5.1) (13):ガラクトキナーゼ(EC 2.7.1.6) ２）− ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生産に関しては、式
３に示した（７）から（１２）、式４に示した（１４）
および式１に示した（４）の酵素活性の強い微生物、あ
るいは式３に示した（１０）、（１３）および式４に示
した（１４）の酵素活性の強い微生物を用いることが好
ましい。
グルコキナーゼ(EC 2.7.1.2) (8):ホスホグルコサミンムターゼ (9):グルコサミン-1-リン酸アセチルトランスフェラー
ゼ (10):N-アセチルグルコサミン-1-リン酸ウリジルトラン
スフェラーゼ(EC 2.7.7.23) (11):ホスホフルクトキナーゼ(EC 2.7.1.11) (12):ホスホグルコムターゼ(EC 2.7.5.1) (13):ガラクトキナーゼ(EC 2.7.1.6) ２）− ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生産に関しては、式
３に示した（７）から（１２）、式４に示した（１４）
および式１に示した（４）の酵素活性の強い微生物、あ
るいは式３に示した（１０）、（１３）および式４に示
した（１４）の酵素活性の強い微生物を用いることが好
ましい。
【００６０】具体的には、エシェリヒア属およびコリネ
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（７）から（１４）および（４）から選ばれ
る一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強
した形質転換株を用いることもできる。
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（７）から（１４）および（４）から選ばれ
る一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強
した形質転換株を用いることもできる。
【００６１】
【化４】
【００６２】(14):ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ４−エピメラ
ーゼ(EC 5.1.3.7) ２）− ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの生産に関しては、式１
に示した（１）から（４）および式５に示した（１５）
の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
ーゼ(EC 5.1.3.7) ２）− ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの生産に関しては、式１
に示した（１）から（４）および式５に示した（１５）
の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
【００６３】具体的には、エシェリヒア属およびコリネ
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（１）、（２）、（３）、（４）および（１
５）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え
技術により増強した形質転換株を用いることもできる。
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよびコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（１）、（２）、（３）、（４）および（１
５）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え
技術により増強した形質転換株を用いることもできる。
【００６４】
【化５】
【００６５】(15):ＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼ(EC
1.1.1.22) ２）− ＧＤＰ−Ｍａｎの生産に関しては、下記、式
６に示した（１６）から（１８）および式３に示した
（１１）および（１２）の酵素活性の強い微生物を用い
ることが好ましい。
1.1.1.22) ２）− ＧＤＰ−Ｍａｎの生産に関しては、下記、式
６に示した（１６）から（１８）および式３に示した
（１１）および（１２）の酵素活性の強い微生物を用い
ることが好ましい。
【００６６】具体的には、エシェリヒア属またはコリネ
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（１６）、（１７）および（１８）から選ば
れる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増
強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体
の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｍａｎＢお
よびｍａｎＣ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＫ７）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア
・コリ由来のｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮ
Ｔ４６）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあ
げることができる。
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（１６）、（１７）および（１８）から選ば
れる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増
強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体
の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のｍａｎＢお
よびｍａｎＣ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＫ７）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア
・コリ由来のｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮ
Ｔ４６）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあ
げることができる。
【００６７】遺伝子組換え技術による（１７）のホスホ
マンノムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−
１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが、（１１）および
（１２）の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強し
た形質転換株を用いることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ
２を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−Ｐか
らＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することが可能である。
このような形質転換体の具体例として、エシェリヒア・
コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ
２４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェ
リヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア・コリNM522
株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよびｐｆｋＢ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）を保有するエ
シェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
マンノムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−
１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが、（１１）および
（１２）の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強し
た形質転換株を用いることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ
２を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−Ｐか
らＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することが可能である。
このような形質転換体の具体例として、エシェリヒア・
コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ
２４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェ
リヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア・コリNM522
株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよびｐｆｋＢ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）を保有するエ
シェリヒア・コリNM522株等をあげることができる。
【００６８】（１１）および（１２）の酵素活性を用い
てＧ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ
２を供給することにより、（１７）のホスホマンノムタ
ーゼ活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開示さ
れた方法である。
てＧ−６−ＰおよびＦ−６−ＰからＧｌｃ−１，６−Ｐ
２を供給することにより、（１７）のホスホマンノムタ
ーゼ活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開示さ
れた方法である。
【００６９】
【化６】
【００７０】(16):ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)あるい
はグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2) (17):ホスホマンノムターゼ(EC 2.7.5.7) (18):マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ
(EC 2.7.7.13) ２）− ＧＤＰ−Ｆｕｃの生産に関しては、下記、式
７に示した（１９）および（２０）および式６に示した
（１６）から（１８）および式３に示した（１１）およ
び（１２）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ま
しい。
はグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2) (17):ホスホマンノムターゼ(EC 2.7.5.7) (18):マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ
(EC 2.7.7.13) ２）− ＧＤＰ−Ｆｕｃの生産に関しては、下記、式
７に示した（１９）および（２０）および式６に示した
（１６）から（１８）および式３に示した（１１）およ
び（１２）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ま
しい。
【００７１】具体的には、エシェリヒア属またはコリネ
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）お
よび（２０）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株を用いることも
できる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・
コリ由来のｍａｎＢおよびｍａｎＣ遺伝子を含む組換え
体ＤＮＡ（ｐＮＫ７）を保有するエシェリヒア・コリNM
522株、エシェリヒア・コリ由来のｇｍｄおよびｗｃａ
Ｇ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＫ８）を保有する
エシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来
のｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４６）を
保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることが
できる。
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）お
よび（２０）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株を用いることも
できる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・
コリ由来のｍａｎＢおよびｍａｎＣ遺伝子を含む組換え
体ＤＮＡ（ｐＮＫ７）を保有するエシェリヒア・コリNM
522株、エシェリヒア・コリ由来のｇｍｄおよびｗｃａ
Ｇ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＫ８）を保有する
エシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来
のｇｌｋ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４６）を
保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることが
できる。
【００７２】遺伝子組換え技術による（１７）のホスホ
マンノムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−
１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが、（１１）および
（１２）の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強し
た形質転換株を用いることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ
２を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−Ｐか
らＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することが可能である。
マンノムターゼ活性の発現および増強には、Ｇｌｃ−
１，６−Ｐ２の添加が必要とされるが、（１１）および
（１２）の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強し
た形質転換株を用いることにより、Ｇｌｃ−１，６−Ｐ
２を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−Ｐか
らＧｌｃ−１，６−Ｐ２を供給することが可能である。
【００７３】このような形質転換体の具体例として、エ
シェリヒア・コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体Ｄ
ＮＡ（ｐＮＴ２４）を保有するエシェリヒア・コリNM52
2株、エシェリヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア
・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよ
びｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげること
ができる。
シェリヒア・コリ由来のｐｇｍ遺伝子を含む組換え体Ｄ
ＮＡ（ｐＮＴ２４）を保有するエシェリヒア・コリNM52
2株、エシェリヒア・コリ由来のｐｆｋＢ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ４７）を保有するエシェリヒア
・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のｐｇｍおよ
びｐｆｋＢ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮＴ５５）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげること
ができる。
【００７４】
【化７】
【００７５】(19):GDP-Man-4,6-デヒドラターゼ(EC4.2.
1.47) (20):GDP-4-keto-6-deoxymannnoseエピメラーゼ／レダ
クターゼ ２）− ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産に関しては、下
記、式８に示した（２１）、（２２）または（２３）、
（２４）および（２５）の酵素活性の強い微生物を用い
ることが好ましい。
1.47) (20):GDP-4-keto-6-deoxymannnoseエピメラーゼ／レダ
クターゼ ２）− ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産に関しては、下
記、式８に示した（２１）、（２２）または（２３）、
（２４）および（２５）の酵素活性の強い微生物を用い
ることが好ましい。
【００７６】具体的には、エシェリヒア属またはコリネ
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）お
よび（２５）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株を用いることも
できる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・
コリ由来のｎａｎＡ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮ
ＡＬ１）を保有するエシェリヒア・コリC600株［Appl.
Environ. Microbiol., 51, 562 (1986)］、エシェリヒ
ア・コリ由来のｎｅｕＡ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
（ｐＴＡ１４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株
等をあげることができる。
バクテリウム属に属する微生物をあげることができ、好
ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまたはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ
る。また、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）お
よび（２５）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株を用いることも
できる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・
コリ由来のｎａｎＡ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＮ
ＡＬ１）を保有するエシェリヒア・コリC600株［Appl.
Environ. Microbiol., 51, 562 (1986)］、エシェリヒ
ア・コリ由来のｎｅｕＡ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
（ｐＴＡ１４）を保有するエシェリヒア・コリNM522株
等をあげることができる。
【００７７】
【化８】
【００７８】(21):GlcNAc 2-エピメラーゼ(EC 5.1.3.8)
(22):NeuAcアルドラーゼ(EC 4.1.3.3)
(23):NeuAcシンセターゼ(EC 4.1.3.19)
(24):CMP-NeuAcシンセターゼ(EC 2.7.7.43)
(25):CTPシンセターゼ(EC 6.3.4.2)
微生物が１）に記載の微生物の性質および２）に記載の
微生物の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用
し、ヌクレオチドの前駆物質と糖より糖ヌクレオチドを
生産することが可能である。
微生物の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用
し、ヌクレオチドの前駆物質と糖より糖ヌクレオチドを
生産することが可能である。
【００７９】微生物が１）に記載の微生物の性質および
２）−に記載の性質を同時に有する場合には、該微生
物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコー
スよりＵＤＰ−Ｇｌｃを、１）に記載の微生物の性質お
よび２）−に記載の微生物の性質を同時に有する場合
には、該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物
質とガラクトースよりＵＤＰ−Ｇａｌを、１）に記載の
微生物の性質および２）−に記載の性質を同時に有す
る場合には該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前
駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン
よりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、１）に記載の微生物の性
質および２）−に記載の性質を同時に有する場合には
該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグ
ルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ
−ＧａｌＮＡｃを、１）に記載の微生物の性質および
２）−に記載の性質を同時に有する場合には該微生物
を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコース
よりＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを、１）に記載の微生物の性質
および２）−に記載の性質を同時に有する場合には、
該微生物を利用し、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノ
ースよりＧＤＰ−Ｍａｎを、１）に記載の微生物の性質
および２）−に記載の性質を同時に有する場合には、
該微生物を利用し、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノ
ースよりＧＤＰ−Ｆｕｃを、１）に記載の微生物の性質
および２）−に記載の性質を同時に有する場合には、
該微生物を利用し、オロット酸等のＣＴＰ前駆物質とＮ
−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルマンノサミ
ンよりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産することが可能であ
る。
２）−に記載の性質を同時に有する場合には、該微生
物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコー
スよりＵＤＰ−Ｇｌｃを、１）に記載の微生物の性質お
よび２）−に記載の微生物の性質を同時に有する場合
には、該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物
質とガラクトースよりＵＤＰ−Ｇａｌを、１）に記載の
微生物の性質および２）−に記載の性質を同時に有す
る場合には該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前
駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン
よりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、１）に記載の微生物の性
質および２）−に記載の性質を同時に有する場合には
該微生物を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグ
ルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ
−ＧａｌＮＡｃを、１）に記載の微生物の性質および
２）−に記載の性質を同時に有する場合には該微生物
を利用し、オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコース
よりＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを、１）に記載の微生物の性質
および２）−に記載の性質を同時に有する場合には、
該微生物を利用し、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノ
ースよりＧＤＰ−Ｍａｎを、１）に記載の微生物の性質
および２）−に記載の性質を同時に有する場合には、
該微生物を利用し、ＧＭＰ等のＧＴＰ前駆物質とマンノ
ースよりＧＤＰ−Ｆｕｃを、１）に記載の微生物の性質
および２）−に記載の性質を同時に有する場合には、
該微生物を利用し、オロット酸等のＣＴＰ前駆物質とＮ
−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルマンノサミ
ンよりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産することが可能であ
る。
【００８０】このような微生物の具体例としては、エシ
ェリヒア・コリ由来のｇａｌＴおよびｇａｌＫ遺伝子を
発現するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげ
ることができる。また、上記の菌株とは異なり、１菌株
中に糖ヌクレオチドの製造に必要な活性の一部しか有し
ていない微生物の場合、それぞれの活性を有する微生物
を適宜組み合わせ、糖ヌクレオチドの製造を行うことが
できる。
ェリヒア・コリ由来のｇａｌＴおよびｇａｌＫ遺伝子を
発現するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげ
ることができる。また、上記の菌株とは異なり、１菌株
中に糖ヌクレオチドの製造に必要な活性の一部しか有し
ていない微生物の場合、それぞれの活性を有する微生物
を適宜組み合わせ、糖ヌクレオチドの製造を行うことが
できる。
【００８１】１）に記載の性質を有する微生物も１種類
である必要はなく、２種類以上で１）に記載する性質を
構成する場合にも１）に記載の性質を有する微生物とし
て利用できる。具体的には、エシェリヒア・コリ由来の
ｐｙｒＧ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリとコリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスとの組み合わせを例示
することができる（特開平5-276974）。
である必要はなく、２種類以上で１）に記載する性質を
構成する場合にも１）に記載の性質を有する微生物とし
て利用できる。具体的には、エシェリヒア・コリ由来の
ｐｙｒＧ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリとコリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスとの組み合わせを例示
することができる（特開平5-276974）。
【００８２】同様に２）に記載の性質を有する微生物も
１種類である必要はなく、２種類以上で構成することが
できる。該微生物群を適宜組み合わせることにより、目
的とする糖ヌクレオチドを生産することができる。例え
ば、１）に記載の性質を有する微生物および２）−に
記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロッ
ト酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−Ｇｌ
ｃを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−
に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロ
ット酸等のＵＴＰ前駆物質とガラクトースよりＵＤＰ−
Ｇａｌを、１）に記載の性質を有する微生物および２）
−に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、
オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ
−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、
１）に記載の性質を有する微生物および２）−に記載
の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸
等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチル
グルコサミンよりＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを、１）に記載
の性質を有する微生物および２）−に記載の性質を有
する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＵＴＰ
前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを、１）
に記載の性質を有する微生物および２）−に記載の性
質を有する一種類以上の微生物を用い、ＧＭＰ等のＧＴ
Ｐ前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｍａｎを、１）に
記載の性質を有する微生物および２）−に記載の性質
を有する一種類以上の微生物を用い、ＧＭＰ等のＧＴＰ
前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｆｕｃを、１）に記
載の性質を有する微生物および２）−に記載の性質を
有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＣＴ
Ｐ前駆物質とＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセ
チルマンノサミンよりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産するこ
とが可能である。
１種類である必要はなく、２種類以上で構成することが
できる。該微生物群を適宜組み合わせることにより、目
的とする糖ヌクレオチドを生産することができる。例え
ば、１）に記載の性質を有する微生物および２）−に
記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロッ
ト酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−Ｇｌ
ｃを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−
に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロ
ット酸等のＵＴＰ前駆物質とガラクトースよりＵＤＰ−
Ｇａｌを、１）に記載の性質を有する微生物および２）
−に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、
オロット酸等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ
−アセチルグルコサミンよりＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、
１）に記載の性質を有する微生物および２）−に記載
の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸
等のＵＴＰ前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチル
グルコサミンよりＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを、１）に記載
の性質を有する微生物および２）−に記載の性質を有
する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＵＴＰ
前駆物質とグルコースよりＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを、１）
に記載の性質を有する微生物および２）−に記載の性
質を有する一種類以上の微生物を用い、ＧＭＰ等のＧＴ
Ｐ前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｍａｎを、１）に
記載の性質を有する微生物および２）−に記載の性質
を有する一種類以上の微生物を用い、ＧＭＰ等のＧＴＰ
前駆物質とマンノースよりＧＤＰ−Ｆｕｃを、１）に記
載の性質を有する微生物および２）−に記載の性質を
有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸等のＣＴ
Ｐ前駆物質とＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセ
チルマンノサミンよりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生産するこ
とが可能である。
【００８３】上述のように、糖ヌクレオチドの製造にお
いて、遺伝子組換え微生物を利用することが可能である
が、該製造に関与する、表３に記載した遺伝子は、エシ
ェリヒア・コリの染色体よりクローン化され、その全塩
基配列が決定されている。
いて、遺伝子組換え微生物を利用することが可能である
が、該製造に関与する、表３に記載した遺伝子は、エシ
ェリヒア・コリの染色体よりクローン化され、その全塩
基配列が決定されている。
【００８４】
【表３】
【００８５】該遺伝子を含有するプラスミドを保有する
エシェリヒア・コリからのプラスミドＤＮＡの単離精
製、プラスミドＤＮＡの制限酵素による切断、切断した
ＤＮＡ断片の単離精製、ＤＮＡ断片の酵素的結合、組換
え体ＤＮＡを用いたエシェリヒア・コリの形質転換等、
遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法［例えば
J. Sambrook らの成書；Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual Second edition Cold Spring Harbor Labor
atory (1989)］に準じて行うことができる。またポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略
す）はパーキン・エルマー・シータス社製のサーマル・
サイクラー等を用いて行うことができる。
エシェリヒア・コリからのプラスミドＤＮＡの単離精
製、プラスミドＤＮＡの制限酵素による切断、切断した
ＤＮＡ断片の単離精製、ＤＮＡ断片の酵素的結合、組換
え体ＤＮＡを用いたエシェリヒア・コリの形質転換等、
遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法［例えば
J. Sambrook らの成書；Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual Second edition Cold Spring Harbor Labor
atory (1989)］に準じて行うことができる。またポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略
す）はパーキン・エルマー・シータス社製のサーマル・
サイクラー等を用いて行うことができる。
【００８６】糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子を
宿主中で発現させるためには、該遺伝子を含むＤＮＡ断
片を、制限酵素類あるいはＰＣＲで、該遺伝子を含む適
当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロ
モーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した
発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主中に導入
することにより達成できる。
宿主中で発現させるためには、該遺伝子を含むＤＮＡ断
片を、制限酵素類あるいはＰＣＲで、該遺伝子を含む適
当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロ
モーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した
発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主中に導入
することにより達成できる。
【００８７】宿主としては、目的とする遺伝子を発現で
きるものは全て用いることができる。例えば、エシェリ
ヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバ
クテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、等に属
する微生物の他、サッカロマイセス属、キャンディダ属
等に属する酵母等をあげることができる。発現ベクター
としては、上記宿主に於いて自立複製可能ないしは染色
体中への組込みが可能で、糖ヌクレオチドの製造に関与
する遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有して
いるものが用いられる。
きるものは全て用いることができる。例えば、エシェリ
ヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバ
クテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、等に属
する微生物の他、サッカロマイセス属、キャンディダ属
等に属する酵母等をあげることができる。発現ベクター
としては、上記宿主に於いて自立複製可能ないしは染色
体中への組込みが可能で、糖ヌクレオチドの製造に関与
する遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有して
いるものが用いられる。
【００８８】上記の微生物を宿主として用いる場合は、
糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子の発現ベクター
は微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモータ
ー、リボソーム結合配列、糖ヌクレオチドの製造に関与
する遺伝子、転写終結配列より構成されていることが好
ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていて
もよい。
糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子の発現ベクター
は微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモータ
ー、リボソーム結合配列、糖ヌクレオチドの製造に関与
する遺伝子、転写終結配列より構成されていることが好
ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていて
もよい。
【００８９】発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒ
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリン
ガーマンハイム社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭58-11060
0）、ｐＫＹＰ２００［Agric. Biol. Chem., 48, 669
(1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277
(1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
82, 4306 (1985)］、pBluescriptＩＩ SK+（STRATAGEN
E社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリJM109/pTr
S30（FERM BP-5407）より調製］およびｐＴｒＳ３２
［エシェリヒア・コリJM109/pTrS32（FERM BP-5408）よ
り調製］、ｐＵＣ１９［Gene, 33, 103 (1985)］、ｐＳ
ＴＶ２８（宝酒造社製 ）、ｐＰＡ１（特開昭63-23379
8）、ｐＣＧ１１（特公平6-91827）等を例示することが
できる。
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリン
ガーマンハイム社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭58-11060
0）、ｐＫＹＰ２００［Agric. Biol. Chem., 48, 669
(1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277
(1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
82, 4306 (1985)］、pBluescriptＩＩ SK+（STRATAGEN
E社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリJM109/pTr
S30（FERM BP-5407）より調製］およびｐＴｒＳ３２
［エシェリヒア・コリJM109/pTrS32（FERM BP-5408）よ
り調製］、ｐＵＣ１９［Gene, 33, 103 (1985)］、ｐＳ
ＴＶ２８（宝酒造社製 ）、ｐＰＡ１（特開昭63-23379
8）、ｐＣＧ１１（特公平6-91827）等を例示することが
できる。
【００９０】プロモーターとしては、上記の宿主中で発
現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰLプ ロモ
ーター、ＰRプロモーター等の、エシェリヒア・コリや
ファージ等に由来するプロモーターをあげることができ
る。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモー
ター、tacプロモーターのように人為的に設計改変され
たプロモーター等も用いることができる。
現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰLプ ロモ
ーター、ＰRプロモーター等の、エシェリヒア・コリや
ファージ等に由来するプロモーターをあげることができ
る。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモー
ター、tacプロモーターのように人為的に設計改変され
たプロモーター等も用いることができる。
【００９１】リボソーム結合配列としては、上記の宿主
中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、
リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離
（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いる
ことが好ましい。糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝
子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、
好適には構造遺伝子の下流に転写終結配列を配置するこ
とが望ましい。
中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、
リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離
（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いる
ことが好ましい。糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝
子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、
好適には構造遺伝子の下流に転写終結配列を配置するこ
とが望ましい。
【００９２】宿主としては、組換え体ＤＮＡが発現で
き、糖ヌクレオチドの生成反応に利用できるものならい
かなる微生物も使用でき、具体的には、Escherichia co
li XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichi
a coli DH1、Escherichia coliMC1000、Escherichia co
li KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia col
i JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli
No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY
49、Escherichia coli KY8415、Escherichia coli NM52
2、Bacillus subtilis、Bacillus brevis、Bacillus am
yloliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC
14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Br
evibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lact
ofermentum ATCC13869、Corynebacterium ammoniagenes
ATCC21170、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microb
acterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas puti
da、Serratia marcescens等をあげることができる。
き、糖ヌクレオチドの生成反応に利用できるものならい
かなる微生物も使用でき、具体的には、Escherichia co
li XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichi
a coli DH1、Escherichia coliMC1000、Escherichia co
li KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia col
i JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli
No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY
49、Escherichia coli KY8415、Escherichia coli NM52
2、Bacillus subtilis、Bacillus brevis、Bacillus am
yloliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC
14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Br
evibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lact
ofermentum ATCC13869、Corynebacterium ammoniagenes
ATCC21170、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microb
acterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas puti
da、Serratia marcescens等をあげることができる。
【００９３】酵母菌株を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC3711
5）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC3741
9）等を例示することができる。プロモーターとして
は、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかな
るものでもよい。例えば、ヘキソキナーゼ等の解糖系の
遺伝子のプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａ
ｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモー
ター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター
等のプロモーターをあげることができる。
現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC3711
5）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC3741
9）等を例示することができる。プロモーターとして
は、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかな
るものでもよい。例えば、ヘキソキナーゼ等の解糖系の
遺伝子のプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａ
ｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモー
ター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター
等のプロモーターをあげることができる。
【００９４】宿主としては、組換え体ＤＮＡが発現で
き、糖ヌクレオチドの生成反応に利用できるものならい
かなる酵母も使用でき、具体的には、Saccharomyces ce
revisiae、Candida utilis、Candida parapsilosis、Ca
ndida krusei、Candida versatilis、Candida lipolyti
ca、Candida zeylanoides、Candida guilliermondii、C
andida albicans、Candida humicola、Pichia farinos
a、Pichia ohmeri、Torulopsis candida、Torulopsis s
phaerica、Torulopsis xylinus、Torulopsis famata、T
orulopsis versatilis、Debaryomyces subglobosus、De
baryomyces cantarellii、Debaryomyces globosus、Deb
aryomyces hansenii、Debaryomyces japonicus、Zygosa
ccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces bailii、Kluy
veromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Hansenu
la anomala、Hansenula jadinii、Brettanomyces lambi
cus、Brettanomyces anomalus、Schizosaccharomyces p
ombe、Trichosporon pullulansおよびSchwanniomyces a
lluvius等をあげることができる。
き、糖ヌクレオチドの生成反応に利用できるものならい
かなる酵母も使用でき、具体的には、Saccharomyces ce
revisiae、Candida utilis、Candida parapsilosis、Ca
ndida krusei、Candida versatilis、Candida lipolyti
ca、Candida zeylanoides、Candida guilliermondii、C
andida albicans、Candida humicola、Pichia farinos
a、Pichia ohmeri、Torulopsis candida、Torulopsis s
phaerica、Torulopsis xylinus、Torulopsis famata、T
orulopsis versatilis、Debaryomyces subglobosus、De
baryomyces cantarellii、Debaryomyces globosus、Deb
aryomyces hansenii、Debaryomyces japonicus、Zygosa
ccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces bailii、Kluy
veromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Hansenu
la anomala、Hansenula jadinii、Brettanomyces lambi
cus、Brettanomyces anomalus、Schizosaccharomyces p
ombe、Trichosporon pullulansおよびSchwanniomyces a
lluvius等をあげることができる。
【００９５】本発明に用いる微生物の培養は、通常の培
養方法に従って行うことができる。該微生物を培養する
培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩
類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源と
しては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよ
く、グルコース、フルクトース、シュークロース、ラク
トース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、糖
蜜、澱粉あるいは澱粉加水分解物等の炭水化物、ピルビ
ン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸等の各種有機酸、グル
タミン酸、メチオニン、リジン等の各種アミノ酸、エタ
ノール、プロパノール、グリセロール等のアルコール類
が用いられる。また、白糠、キャッサバ、バガス、コー
ン・スティープ・リカー等の天然有機栄養源も用いるこ
とができる。
養方法に従って行うことができる。該微生物を培養する
培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩
類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源と
しては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよ
く、グルコース、フルクトース、シュークロース、ラク
トース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、糖
蜜、澱粉あるいは澱粉加水分解物等の炭水化物、ピルビ
ン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸等の各種有機酸、グル
タミン酸、メチオニン、リジン等の各種アミノ酸、エタ
ノール、プロパノール、グリセロール等のアルコール類
が用いられる。また、白糠、キャッサバ、バガス、コー
ン・スティープ・リカー等の天然有機栄養源も用いるこ
とができる。
【００９６】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機および有
機アンモニウム塩類、グルタミン酸、グルタミン、メチ
オニン等のアミノ酸、ペプトン、NZアミン、コーン・ス
ティープ・リカー、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、
フィッシュミールあるいはその消化物等が用いられる。
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機および有
機アンモニウム塩類、グルタミン酸、グルタミン、メチ
オニン等のアミノ酸、ペプトン、NZアミン、コーン・ス
ティープ・リカー、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、
フィッシュミールあるいはその消化物等が用いられる。
【００９７】無機物としては、リン酸一カリウム、リン
酸二カリウム、リン酸一ナトリウムリン酸二ナトリウ
ム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム
等が用いられる。ビタミン、アミノ酸、核酸等を必要に
応じて添加してもよい。
酸二カリウム、リン酸一ナトリウムリン酸二ナトリウ
ム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム
等が用いられる。ビタミン、アミノ酸、核酸等を必要に
応じて添加してもよい。
【００９８】培養は、振盪培養または通気攪拌培養等の
好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４５℃がよく、
培養時間は、通常５〜９６時間である。培養中ｐＨは、
３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるい
は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、ア
ンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じてアン
ピシリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコール等
の抗生物質を培地に添加してもよい。
好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４５℃がよく、
培養時間は、通常５〜９６時間である。培養中ｐＨは、
３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるい
は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、ア
ンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じてアン
ピシリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコール等
の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００９９】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
ときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加し
てもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベク
ターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等
を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換
した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸
（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
ときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加し
てもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベク
ターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等
を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換
した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸
（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【０１００】本発明の糖ヌクレオチドの製造において、
２種以上の微生物を用いる場合、該微生物それぞれを個
別に培養し、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造
に用いてもよいし、一つの培養器に同時に植菌し、混合
培養した後、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造
に用いてもよい。また、いずれかの微生物の培養中もし
くは培養終了時に残りの微生物を植菌し、培養した後、
該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよ
い。更に、上述１）に記載の性質を有する微生物と２）
に記載の性質を有する微生物とを別々に培養し、各々の
培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよ
い。
２種以上の微生物を用いる場合、該微生物それぞれを個
別に培養し、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造
に用いてもよいし、一つの培養器に同時に植菌し、混合
培養した後、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造
に用いてもよい。また、いずれかの微生物の培養中もし
くは培養終了時に残りの微生物を植菌し、培養した後、
該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよ
い。更に、上述１）に記載の性質を有する微生物と２）
に記載の性質を有する微生物とを別々に培養し、各々の
培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよ
い。
【０１０１】該培養により得られた微生物の培養液およ
び該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源とし
て用い、水性媒体中で糖ヌクレオチドの生成に用いるこ
とができる。培養液の処理物としては、培養液の濃縮
物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培
養上清、該培養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵
素標品、培養液を遠心分離して得られる細胞（菌体を含
む）、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の
界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機
械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処
理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるい
は該細胞より抽出して得られる酵素標品等を挙げること
ができる。
び該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源とし
て用い、水性媒体中で糖ヌクレオチドの生成に用いるこ
とができる。培養液の処理物としては、培養液の濃縮
物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培
養上清、該培養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵
素標品、培養液を遠心分離して得られる細胞（菌体を含
む）、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の
界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機
械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処
理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるい
は該細胞より抽出して得られる酵素標品等を挙げること
ができる。
【０１０２】糖ヌクレオチドの生成において用いられる
酵素源の量は、湿菌体として、１〜５００ｇ／ｌであ
り、好ましくは５〜３００ｇ／ｌである。また、同時に
２種以上の微生物を用いて水性媒体中で反応を行う場合
には、水性媒体中の該微生物の全湿菌体量は２〜５００
ｇ／ｌであり、好ましくは５〜４００ｇ／ｌである。糖
ヌクレオチドの生成において用いられる水性媒体として
は、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン
酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール等の
アルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等
のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげること
ができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を
水性媒体として用いることができる。
酵素源の量は、湿菌体として、１〜５００ｇ／ｌであ
り、好ましくは５〜３００ｇ／ｌである。また、同時に
２種以上の微生物を用いて水性媒体中で反応を行う場合
には、水性媒体中の該微生物の全湿菌体量は２〜５００
ｇ／ｌであり、好ましくは５〜４００ｇ／ｌである。糖
ヌクレオチドの生成において用いられる水性媒体として
は、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン
酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール等の
アルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等
のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげること
ができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を
水性媒体として用いることができる。
【０１０３】糖ヌクレオチドの生成において用いられる
ヌクレオチドの前駆物質としては、オロット酸、ウラシ
ル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、アデ
ニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、ヒポキサン
チン、イノシン、キサンチン、キサントシン、イノシン
−５’−一リン酸、キサントシン−５’−一リン酸、グ
アノシン−５’−一リン酸、ウリジン−５’−一リン酸
およびシチジン−５’−一リン酸等をあげることがで
き、好ましくはオロット酸およびグアノシン−５’−一
リン酸をあげることができる。該ヌクレオチドの前駆物
質は、純品および該前駆物質の塩並びに夾雑物が反応を
阻害しない限り、微生物により発酵生産された該前駆物
質含有培養液および該培養液の該前駆物質粗精製物を用
いることができる。ヌクレオチドの前駆物質は０．１ｍ
Ｍ〜１．０Ｍ、好ましくは０．０１〜０．３Ｍの濃度で
用いられる。
ヌクレオチドの前駆物質としては、オロット酸、ウラシ
ル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、アデ
ニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、ヒポキサン
チン、イノシン、キサンチン、キサントシン、イノシン
−５’−一リン酸、キサントシン−５’−一リン酸、グ
アノシン−５’−一リン酸、ウリジン−５’−一リン酸
およびシチジン−５’−一リン酸等をあげることがで
き、好ましくはオロット酸およびグアノシン−５’−一
リン酸をあげることができる。該ヌクレオチドの前駆物
質は、純品および該前駆物質の塩並びに夾雑物が反応を
阻害しない限り、微生物により発酵生産された該前駆物
質含有培養液および該培養液の該前駆物質粗精製物を用
いることができる。ヌクレオチドの前駆物質は０．１ｍ
Ｍ〜１．０Ｍ、好ましくは０．０１〜０．３Ｍの濃度で
用いられる。
【０１０４】糖ヌクレオチドの生成において用いられる
糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトー
ス、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−ア
セチルマンノサミン、アセチルノイラミン酸およびこれ
らの誘導体等をあげることができる。該糖は、純品を用
いてもよいし、これらを含有するもので、夾雑物が反応
を阻害しないものであればいずれも用いることができ
る。糖は、反応開始時に一括して添加しても良いし、あ
るいは反応中分割して、あるいは連続して添加すること
もでき、０．１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いられる。
糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトー
ス、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−ア
セチルマンノサミン、アセチルノイラミン酸およびこれ
らの誘導体等をあげることができる。該糖は、純品を用
いてもよいし、これらを含有するもので、夾雑物が反応
を阻害しないものであればいずれも用いることができ
る。糖は、反応開始時に一括して添加しても良いし、あ
るいは反応中分割して、あるいは連続して添加すること
もでき、０．１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いられる。
【０１０５】糖ヌクレオチドの生成において、必要に応
じて、ＡＴＰ再生に必要なエネルギー供与体、補酵素、
リン酸イオン、マグネシウムイオン、フィチン酸等のキ
レート剤、界面活性剤および有機溶剤を添加してもよ
い。エネルギー供与体としては、グルコース、フルクト
ース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マン
ニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳
酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解
物等をあげることができ、１．０ｍＭ〜２．０Ｍの濃度
で用いられる。
じて、ＡＴＰ再生に必要なエネルギー供与体、補酵素、
リン酸イオン、マグネシウムイオン、フィチン酸等のキ
レート剤、界面活性剤および有機溶剤を添加してもよ
い。エネルギー供与体としては、グルコース、フルクト
ース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マン
ニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳
酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解
物等をあげることができ、１．０ｍＭ〜２．０Ｍの濃度
で用いられる。
【０１０６】リン酸イオンとしては、正リン酸、ピロリ
ン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ポリリン
酸、メタリン酸、トリメタリン酸、リン酸一カリウム、
リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナト
リウム等の無機のリン酸塩等をあげることができ、１．
０ｍＭ〜１．０Ｍの濃度で用いることができる。マグネ
シウムイオンとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム等の無機のマグネシウム塩、
クエン酸マグネシウム等の有機のマグネシウム塩等をあ
げることができ、通常１〜１００ｍＭの濃度で用いられ
る。
ン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、ポリリン
酸、メタリン酸、トリメタリン酸、リン酸一カリウム、
リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナト
リウム等の無機のリン酸塩等をあげることができ、１．
０ｍＭ〜１．０Ｍの濃度で用いることができる。マグネ
シウムイオンとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム等の無機のマグネシウム塩、
クエン酸マグネシウム等の有機のマグネシウム塩等をあ
げることができ、通常１〜１００ｍＭの濃度で用いられ
る。
【０１０７】界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
・オクタデシルアミン等の非イオン系界面活性剤（例え
ばナイミーンS-215、日本油脂社製）、セチルトリメチ
ルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベン
ジルアンモニウムクロライド等のカチオン系界面活性剤
（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）、ラウロイル
・ザルコシネート等のアニオン系界面活性剤、アルキル
ジメチルアミン等の三級アミン類（例えば三級アミンF
B、日本油脂社製）等、各種糖ヌクレオチドの生成を促
進するものであればいずれでも良く、１種または数種を
混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常
０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
・オクタデシルアミン等の非イオン系界面活性剤（例え
ばナイミーンS-215、日本油脂社製）、セチルトリメチ
ルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベン
ジルアンモニウムクロライド等のカチオン系界面活性剤
（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）、ラウロイル
・ザルコシネート等のアニオン系界面活性剤、アルキル
ジメチルアミン等の三級アミン類（例えば三級アミンF
B、日本油脂社製）等、各種糖ヌクレオチドの生成を促
進するものであればいずれでも良く、１種または数種を
混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常
０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【０１０８】有機溶剤としては、キシレン、トルエン、
脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチル等が挙げら
れ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。糖
ヌクレオチドの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１
０、好ましくはｐＨ６〜９、２０〜５０℃の条件で２〜
９６時間行う。該方法により糖ヌクレオチドを生成する
ことができ、例えば、ウリジン二リン酸化合物、グアノ
シン二リン酸化合物およびシチジン一リン酸化合物等を
あげることができる。具体的には、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、Ｕ
ＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ
ＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ
−Ｆｕｃ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃおよびこれらの誘導体か
ら選ばれる糖ヌクレオチド等をあげることができる。
脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチル等が挙げら
れ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。糖
ヌクレオチドの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１
０、好ましくはｐＨ６〜９、２０〜５０℃の条件で２〜
９６時間行う。該方法により糖ヌクレオチドを生成する
ことができ、例えば、ウリジン二リン酸化合物、グアノ
シン二リン酸化合物およびシチジン一リン酸化合物等を
あげることができる。具体的には、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、Ｕ
ＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ
ＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ
−Ｆｕｃ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃおよびこれらの誘導体か
ら選ばれる糖ヌクレオチド等をあげることができる。
【０１０９】水性媒体中に生成した糖ヌクレオチドの定
量は公知の方法に準じて行うことができ、例えば、ＵＤ
Ｐ−ＧｌｃとＵＤＰ−Ｇａｌの分離定量はAnal. Bioche
m.,216, 188 (1994)記載の高速液体クロマトグラフィー
（以下、ＨＰＬＣと略す）による方法で行うことができ
る。また、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、Ｇ
ＤＰ−Ｆｕｃ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃの分離定量は以下の
条件のＨＰＬＣにより行うことができる。
量は公知の方法に準じて行うことができ、例えば、ＵＤ
Ｐ−ＧｌｃとＵＤＰ−Ｇａｌの分離定量はAnal. Bioche
m.,216, 188 (1994)記載の高速液体クロマトグラフィー
（以下、ＨＰＬＣと略す）による方法で行うことができ
る。また、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、Ｇ
ＤＰ−Ｆｕｃ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃの分離定量は以下の
条件のＨＰＬＣにより行うことができる。
【０１１０】溶出液：０．１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4（Ｈ3ＰＯ4
を用いてｐＨ３．２に調整） 流速 ：１ｍｌ／ｍｉｎ カラム：Partisil-10 SAX（ワットマン社製） 検出 ：ＵＶ２６２ｎｍ 定量 ：スタンダードの吸光度値の比較により算出 反応液中に生成した糖ヌクレオチドの採取は、活性炭や
イオン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うこと
ができ、例えば、ＵＤＰ−ＧａｌおよびＵＤＰ−Ｇｌｃ
においてはJ. Org. Chem., 57, 152 (1992)、ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃにおいてはJ. Org. Chem., 57, 146 (199
2)に記載の方法に準じて行うことができる。
を用いてｐＨ３．２に調整） 流速 ：１ｍｌ／ｍｉｎ カラム：Partisil-10 SAX（ワットマン社製） 検出 ：ＵＶ２６２ｎｍ 定量 ：スタンダードの吸光度値の比較により算出 反応液中に生成した糖ヌクレオチドの採取は、活性炭や
イオン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うこと
ができ、例えば、ＵＤＰ−ＧａｌおよびＵＤＰ−Ｇｌｃ
においてはJ. Org. Chem., 57, 152 (1992)、ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃにおいてはJ. Org. Chem., 57, 146 (199
2)に記載の方法に準じて行うことができる。
【０１１１】本発明の複合糖質の製造に用いることので
きる微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞として
は、糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を
生産する能力を有する微生物あるいは動物細胞あるいは
昆虫細胞であればいずれも用いることができる。例え
ば、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフ
ェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノ
シルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ
およびフコシルトランスフェラーゼ等の活性を有する微
生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞をあげることが
できる。
きる微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞として
は、糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を
生産する能力を有する微生物あるいは動物細胞あるいは
昆虫細胞であればいずれも用いることができる。例え
ば、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフ
ェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノ
シルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ
およびフコシルトランスフェラーゼ等の活性を有する微
生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞をあげることが
できる。
【０１１２】また、前述の糖ヌクレオチドの製造の場合
と同様に、遺伝子組換え技術により造成された微生物あ
るいは動物細胞あるいは昆虫細胞を利用することもでき
る。例えば、ヒト・メラノーマ細胞SK-Mel-28細胞由来
のセラミドグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現
するエシェリヒア・コリ［Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 93, 4638 (1996)］、β1,3-ガラクトシルトランス
フェラーゼを産生するヒト・メラノーマ細胞WM266-4株
（ATCC CRL1676）、およびヒト・メラノーマ細胞WM266-
4由来β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を
含有するナマルバ細胞KJM-1株等の組換え株（特開平6-1
81759）、ヒトＨｅｌａ細胞由来のβ1,4-ガラクトシル
トランスフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コ
リ［EMBO J.,9, 3171 (1990)］あるいはSaccharomyces
cerevisiae［Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 1
60 (1994)］、ラット由来のβ1,6-N-アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するＣＯＳ−７
細胞（ATCC CRL1651）［J. Biol. Chem., 268, 15381
(1993)］、ヒト由来のN-アセチルガラクトサミニルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を発現するＳｆ９細胞［J. Bioch
em., 118, 568 (1995)］、ヒト由来のグルクロノシルト
ランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［Bioc
hem. Biophys. Res. Commun., 196, 473 (1993)］、ヒ
ト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼを発現する
ナマルバ細胞［J. Biol. Chem., 269, 14730 (199
4)］、ヒト由来のα1,3/1,4-フコシルトランスフェラー
ゼを発現するＣＯＳ−１細胞［Genes Dev., 4, 1288 (1
990)］、ヒト由来のα1,2-フコシルトランスフェラーゼ
を発現するＣＯＳ−１細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., 87,6674 (1990)］、チキン由来のα2,6-シアリル
トランスフェラーゼを発現するＣＯＳ−７細胞［Eur.
J. Biochem., 219, 375 (1994)］、ヒト由来のα2,8-シ
アリルトランスフェラーゼを発現するＣＨＯ細胞［Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA.,91, 7952 (1994)］、ナイセ
リア由来のβ1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼあるいはβ1,4-ガラクトシルトランスフェラー
ゼあるいはβ1,3-N-アセチルガラクトサミニルトランス
フェラーゼあるいはα1,4-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼを発現するエシェリヒア・コリ(WO96/10086)、ナ
イセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラーゼを発
現するエシェリヒア・コリ［J. Biol.Chem., 271, 2827
1 (1996)］、ヘリコバクター・ピロリ由来のα1,3-フコ
シルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ
［J. Biol. Chem., 272, 21349および21357 (1997)］、
酵母由来のα1,２-マンノシルトランスフェラーゼを発
現するエシェリヒア・コリ［J. Org. Chem., 58, 3985
(1993)］等の微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞
をあげることができる。
と同様に、遺伝子組換え技術により造成された微生物あ
るいは動物細胞あるいは昆虫細胞を利用することもでき
る。例えば、ヒト・メラノーマ細胞SK-Mel-28細胞由来
のセラミドグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現
するエシェリヒア・コリ［Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 93, 4638 (1996)］、β1,3-ガラクトシルトランス
フェラーゼを産生するヒト・メラノーマ細胞WM266-4株
（ATCC CRL1676）、およびヒト・メラノーマ細胞WM266-
4由来β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を
含有するナマルバ細胞KJM-1株等の組換え株（特開平6-1
81759）、ヒトＨｅｌａ細胞由来のβ1,4-ガラクトシル
トランスフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コ
リ［EMBO J.,9, 3171 (1990)］あるいはSaccharomyces
cerevisiae［Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 1
60 (1994)］、ラット由来のβ1,6-N-アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するＣＯＳ−７
細胞（ATCC CRL1651）［J. Biol. Chem., 268, 15381
(1993)］、ヒト由来のN-アセチルガラクトサミニルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を発現するＳｆ９細胞［J. Bioch
em., 118, 568 (1995)］、ヒト由来のグルクロノシルト
ランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［Bioc
hem. Biophys. Res. Commun., 196, 473 (1993)］、ヒ
ト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼを発現する
ナマルバ細胞［J. Biol. Chem., 269, 14730 (199
4)］、ヒト由来のα1,3/1,4-フコシルトランスフェラー
ゼを発現するＣＯＳ−１細胞［Genes Dev., 4, 1288 (1
990)］、ヒト由来のα1,2-フコシルトランスフェラーゼ
を発現するＣＯＳ−１細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., 87,6674 (1990)］、チキン由来のα2,6-シアリル
トランスフェラーゼを発現するＣＯＳ−７細胞［Eur.
J. Biochem., 219, 375 (1994)］、ヒト由来のα2,8-シ
アリルトランスフェラーゼを発現するＣＨＯ細胞［Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA.,91, 7952 (1994)］、ナイセ
リア由来のβ1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼあるいはβ1,4-ガラクトシルトランスフェラー
ゼあるいはβ1,3-N-アセチルガラクトサミニルトランス
フェラーゼあるいはα1,4-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼを発現するエシェリヒア・コリ(WO96/10086)、ナ
イセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラーゼを発
現するエシェリヒア・コリ［J. Biol.Chem., 271, 2827
1 (1996)］、ヘリコバクター・ピロリ由来のα1,3-フコ
シルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ
［J. Biol. Chem., 272, 21349および21357 (1997)］、
酵母由来のα1,２-マンノシルトランスフェラーゼを発
現するエシェリヒア・コリ［J. Org. Chem., 58, 3985
(1993)］等の微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞
をあげることができる。
【０１１３】本発明の複合糖質の製造に微生物を用いる
場合には、該微生物を、上記ヌクレオチドの前駆物質と
糖から糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の
培養と同様の培地、培養条件により培養することができ
る。本発明の複合糖質の製造に動物細胞を用いる場合に
は、該動物細胞を培養する培地として、一般に使用され
ているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地
またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用
いられる。培養は、５％ＣＯ2存在下等の条件下で行
う。培養温度は２０〜４０℃がよく、培養時間は、通常
３〜１４日間である。また必要に応じて、抗生物質を培
地に添加してもよい。
場合には、該微生物を、上記ヌクレオチドの前駆物質と
糖から糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の
培養と同様の培地、培養条件により培養することができ
る。本発明の複合糖質の製造に動物細胞を用いる場合に
は、該動物細胞を培養する培地として、一般に使用され
ているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地
またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用
いられる。培養は、５％ＣＯ2存在下等の条件下で行
う。培養温度は２０〜４０℃がよく、培養時間は、通常
３〜１４日間である。また必要に応じて、抗生物質を培
地に添加してもよい。
【０１１４】本発明の複合糖質の製造に昆虫細胞を用い
る場合には、該昆虫細胞の培養を公知の方法[J. Biol.
Chem., 268, 12609 (1993)]に準じて行うことができ
る。該培養により得られた微生物あるは動物細胞あるい
は昆虫細胞の培養液および該培養液を種々処理した培養
液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中で複合糖質
の生成に用いることができる。培養液の処理物として
は、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分
離して得られる培養上清、該培養上清の濃縮物、培養上
清から得られる酵素標品、培養液を遠心分離して得られ
る細胞（菌体を含む）、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結
乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処
理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理
物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細
胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素
標品等を挙げることができる。
る場合には、該昆虫細胞の培養を公知の方法[J. Biol.
Chem., 268, 12609 (1993)]に準じて行うことができ
る。該培養により得られた微生物あるは動物細胞あるい
は昆虫細胞の培養液および該培養液を種々処理した培養
液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中で複合糖質
の生成に用いることができる。培養液の処理物として
は、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分
離して得られる培養上清、該培養上清の濃縮物、培養上
清から得られる酵素標品、培養液を遠心分離して得られ
る細胞（菌体を含む）、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結
乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処
理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理
物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細
胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素
標品等を挙げることができる。
【０１１５】複合糖質の生成において用いられる酵素源
の量は、酵素の活性を、３７℃で１分間に１μmoleの複
合糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）とし
て、０．１ｍＵ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌであり、好まし
くは１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌの濃度で用いることが
できる。複合糖質の生成において用いられる水性媒体と
しては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、ク
エン酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール
等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセト
ン等のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげる
ことができる。また、酵素源として用いた微生物、動物
細胞あるいは昆虫細胞の培養液を水性媒体として用いる
ことができる。
の量は、酵素の活性を、３７℃で１分間に１μmoleの複
合糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）とし
て、０．１ｍＵ／ｌ〜１００００Ｕ／ｌであり、好まし
くは１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌの濃度で用いることが
できる。複合糖質の生成において用いられる水性媒体と
しては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、ク
エン酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール
等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセト
ン等のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげる
ことができる。また、酵素源として用いた微生物、動物
細胞あるいは昆虫細胞の培養液を水性媒体として用いる
ことができる。
【０１１６】複合糖質の生成において、必要に応じて、
フィチン酸等のキレート剤、ＭｎＣｌ2等の無機塩、β
−メルカプトエタノール等を添加することができる。複
合糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチドとして
は、上記糖ヌクレオチドの生成で得られた反応液あるい
は該反応液から精製した糖ヌクレオチドを用いることが
でき、０．０１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いることがで
きる。
フィチン酸等のキレート剤、ＭｎＣｌ2等の無機塩、β
−メルカプトエタノール等を添加することができる。複
合糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチドとして
は、上記糖ヌクレオチドの生成で得られた反応液あるい
は該反応液から精製した糖ヌクレオチドを用いることが
でき、０．０１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で用いることがで
きる。
【０１１７】また、複合糖質の生成反応液中で、上述の
方法により糖ヌクレオチドを生成させることにより、糖
ヌクレオチドを供給することもできる。複合糖質の生成
において用いられる複合糖質前駆物質としては、単糖、
オリゴサッカライド、担体等に結合した単糖およびオリ
ゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂質、糖蛋白質、
糖脂質、グリコペプチドあるいはステロイド化合物等糖
転移酵素の基質となるものであればいかなるものでも用
いることができる。
方法により糖ヌクレオチドを生成させることにより、糖
ヌクレオチドを供給することもできる。複合糖質の生成
において用いられる複合糖質前駆物質としては、単糖、
オリゴサッカライド、担体等に結合した単糖およびオリ
ゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂質、糖蛋白質、
糖脂質、グリコペプチドあるいはステロイド化合物等糖
転移酵素の基質となるものであればいかなるものでも用
いることができる。
【０１１８】具体的にはグルコース、ガラクトース、マ
ンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−
アセチルガラクトサミン、ラクトース、Ｎ−アセチルラ
クトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ＧｌｃＮＡｃβ1-
3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇ
ｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌ
ｃＮＡｃ、2'-フコシルラクトース、3-フコシルラクト
ース、3'-シアリルラクトース、6'-シアリルラクトー
ス、3'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、6'-シア
リル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シアリルラクト−Ｎ
−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ−テトラ
オース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクトジフコ
テトラオース、3'-シアリル-3-フコシルラクトース、シ
アリルルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコ
ペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フ
コペンタオースＶ、LS-テトラサッカライドａ、LS-テト
ラサッカライドｂ、LS-テトラサッカライドｃ、（α
２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよび
これらの誘導体、セリン、スレオニン、アスパラギンお
よび該アミノ酸を含有するぺプチドおよびその誘導体、
セラミドおよびその誘導体等を例示することができる。
該複合糖質前駆物質は０．０１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で
用いることができる。
ンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−
アセチルガラクトサミン、ラクトース、Ｎ−アセチルラ
クトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ＧｌｃＮＡｃβ1-
3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇ
ｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌ
ｃＮＡｃ、2'-フコシルラクトース、3-フコシルラクト
ース、3'-シアリルラクトース、6'-シアリルラクトー
ス、3'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、6'-シア
リル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シアリルラクト−Ｎ
−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ−テトラ
オース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクトジフコ
テトラオース、3'-シアリル-3-フコシルラクトース、シ
アリルルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコ
ペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フ
コペンタオースＶ、LS-テトラサッカライドａ、LS-テト
ラサッカライドｂ、LS-テトラサッカライドｃ、（α
２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよび
これらの誘導体、セリン、スレオニン、アスパラギンお
よび該アミノ酸を含有するぺプチドおよびその誘導体、
セラミドおよびその誘導体等を例示することができる。
該複合糖質前駆物質は０．０１ｍＭ〜２．０Ｍの濃度で
用いることができる。
【０１１９】本発明の複合糖質としては、グルコース、
ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン、グルクロン酸、マンノース、Ｎ−ア
セチルマンノサミン、フコース、シアル酸、ラクトー
ス、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオー
ス、ＧｌｃＮＡcβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡ
ｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌ
α1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、2'-フコシルラクトー
ス、3-フコシルラクトース、3'-シアリルルラクトー
ス、6'-シアリルルラクトース、3'-シアリル−Ｎ−アセ
チルラクトサミン、6'-シアリル−Ｎ−アセチルラクト
サミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ル
イスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオ
テトラオース、ラクトジフコテトラオース、3'-シアリ
ル3-フコシルラクトース、シアリルルイスＸ、シアリル
ルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−
Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオ
ースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、LS-テ
トラサッカライドａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テ
トラサッカライドｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ
−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース
Ｉ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、ラクト−Ｎ
−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ジシ
アリルラクト−Ｎ−テトラオースおよびこれらの誘導体
から選ばれる糖を１あるいはそれ以上含有する複合糖質
または該複合糖質を含む複合糖質をあげることができ、
例えば、Ｇａｌβ1-3Ｇｌｃ、Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、Ｇａ
ｌβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａ
ｌβ1-3Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-4Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-3Ｇａ
ｌＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇｌ
ｃ、Ｇａｌα1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌα1-3ＧｌｃＮＡｃ，Ｇ
ａｌα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇａｌ、Ｇａｌα
1-4Ｇａｌ、Ｇａｌα1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-4Ｇ
ａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ
β1-4Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ
β1-3Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ
β1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃβ1-6ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-2Ｍ
ａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｍ
ａｎ、ＧａｌＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4Ｇ
ａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ
α1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ
α1-6Ｍａｎ，Ｍａｎα1-3Ｍａｎ，Ｍａｎα1-2Ｍａ
ｎ，ＧｌｃＵＡβ1-4ＧｌｃＮ、ＧｌｃＵＡβ1-3Ｇａ
ｌ、ＧｌｃＵＡβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＵＡβ1-3Ｇ
ａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-6
Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2
-6ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅ
ｕＡｃα2-6ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-8ＮｅｕＡ
ｃ、Ｆｕｃα1-3Ｇｌｃ、Ｆｕｃα1-4Ｇｌｃ、Ｆｕｃα
1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα
1-2ＧａｌおよびＦｕｃα1-6ＧｌｃＮＡｃから選ばれる
結合を有する糖を含む複合糖質または該複合糖質を含む
複合糖質をあげることができる。また、該糖を有する複
合糖質に含まれる糖の数としては、１０個以下あるいは
６個以下のものをあげることができる。
ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン、グルクロン酸、マンノース、Ｎ−ア
セチルマンノサミン、フコース、シアル酸、ラクトー
ス、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオー
ス、ＧｌｃＮＡcβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡ
ｃβ1-4Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌ
α1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、2'-フコシルラクトー
ス、3-フコシルラクトース、3'-シアリルルラクトー
ス、6'-シアリルルラクトース、3'-シアリル−Ｎ−アセ
チルラクトサミン、6'-シアリル−Ｎ−アセチルラクト
サミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ル
イスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオ
テトラオース、ラクトジフコテトラオース、3'-シアリ
ル3-フコシルラクトース、シアリルルイスＸ、シアリル
ルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−
Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオ
ースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、LS-テ
トラサッカライドａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テ
トラサッカライドｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ
−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース
Ｉ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、ラクト−Ｎ
−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ジシ
アリルラクト−Ｎ−テトラオースおよびこれらの誘導体
から選ばれる糖を１あるいはそれ以上含有する複合糖質
または該複合糖質を含む複合糖質をあげることができ、
例えば、Ｇａｌβ1-3Ｇｌｃ、Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、Ｇａ
ｌβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａ
ｌβ1-3Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-4Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-3Ｇａ
ｌＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇｌ
ｃ、Ｇａｌα1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌα1-3ＧｌｃＮＡｃ，Ｇ
ａｌα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα1-3Ｇａｌ、Ｇａｌα
1-4Ｇａｌ、Ｇａｌα1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌα1-4Ｇ
ａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ
β1-4Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ
β1-3Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ
β1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃβ1-6ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-2Ｍ
ａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｍ
ａｎ、ＧａｌＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4Ｇ
ａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ
α1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ
α1-6Ｍａｎ，Ｍａｎα1-3Ｍａｎ，Ｍａｎα1-2Ｍａ
ｎ，ＧｌｃＵＡβ1-4ＧｌｃＮ、ＧｌｃＵＡβ1-3Ｇａ
ｌ、ＧｌｃＵＡβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＵＡβ1-3Ｇ
ａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-6
Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2
-6ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅ
ｕＡｃα2-6ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-8ＮｅｕＡ
ｃ、Ｆｕｃα1-3Ｇｌｃ、Ｆｕｃα1-4Ｇｌｃ、Ｆｕｃα
1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα
1-2ＧａｌおよびＦｕｃα1-6ＧｌｃＮＡｃから選ばれる
結合を有する糖を含む複合糖質または該複合糖質を含む
複合糖質をあげることができる。また、該糖を有する複
合糖質に含まれる糖の数としては、１０個以下あるいは
６個以下のものをあげることができる。
【０１２０】具体的な複合糖質製造法としては、
（１）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前
駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖と
ＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生
物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵
素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースと
グルコースからラクトースを生成させることができる。 （２）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前
駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖と
ＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生
物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵
素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースと
Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルラクトサミ
ンを生成させることができる。 （３）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラ
ーゼ［J．Biol．Chem.,271, 28271 (1996)］を発現する
微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生
産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処
理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロ
ット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とラク
トースから3'-シアリルラクトースを生成させることが
できる。 （４）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラ
ーゼ［J．Biol．Chem.,271, 28271 (1996)］を発現する
微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生
産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処
理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロ
ット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とＮ−
アセチルラクトサミンから3'-シアリル−Ｎ−アセチル
ラクトサミンを生成させることができる。
ェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前
駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖と
ＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生
物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵
素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースと
グルコースからラクトースを生成させることができる。 （２）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前
駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖と
ＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生
物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵
素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースと
Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルラクトサミ
ンを生成させることができる。 （３）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラ
ーゼ［J．Biol．Chem.,271, 28271 (1996)］を発現する
微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生
産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処
理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロ
ット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とラク
トースから3'-シアリルラクトースを生成させることが
できる。 （４）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェラ
ーゼ［J．Biol．Chem.,271, 28271 (1996)］を発現する
微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生
産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処
理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロ
ット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸とＮ−
アセチルラクトサミンから3'-シアリル−Ｎ−アセチル
ラクトサミンを生成させることができる。
【０１２１】（５）チキン由来のα2,6-シアリルトラン
スフェラーゼを発現するＣＯＳ−７細胞［Eur. J. Bioc
hem., 219, 375 (1994)］、 ＣＴＰの前駆物質からＣＴ
Ｐを生産する能力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液
または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行
うことにより、オロット酸とＮ−アセチルマンノサミン
とピルビン酸とＮ−アセチルラクトサミンから６'-シア
リル−Ｎ−アセチルラクトサミンを生成させることがで
きる。 （６）ナイセリア由来のβ1,3-Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生
物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有す
る微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生産
する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理
物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロッ
ト酸とＮ−アセチルグルコサミンとラクトースからＧｌ
ｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを生成させることがで
きる。 （７）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを産生す
るヒト・メラノーマ細胞WM266-4株（ATCC CRL1676）、
あるいはヒト・メラノーマ細胞WM266-4由来β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するナマルバ
細胞KJM-1株等の組換え株（特開平6-181759）、 ＵＴＰ
の前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、
糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する
微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とし
た酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトー
スとＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃからラクト−
Ｎ−テトラオースを生成させることができる。 （８）ヒトＨｅｌａ細胞由来のβ1,4-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ[E
MBO J., 9, 3171 (1990)]あるいはSaccharomycescerevi
siae［Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 160 (19
94)］、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産す
る能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物
とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット
酸とガラクトースとＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌ
ｃからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させること
ができる。 （９）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前
駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖と
ＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生
物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵
素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースと
ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃからラクト−Ｎ−
ネオテトラオースを生成させることができる。
スフェラーゼを発現するＣＯＳ−７細胞［Eur. J. Bioc
hem., 219, 375 (1994)］、 ＣＴＰの前駆物質からＣＴ
Ｐを生産する能力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃを生産する能力を有する微生物の培養液
または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行
うことにより、オロット酸とＮ−アセチルマンノサミン
とピルビン酸とＮ−アセチルラクトサミンから６'-シア
リル−Ｎ−アセチルラクトサミンを生成させることがで
きる。 （６）ナイセリア由来のβ1,3-Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生
物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有す
る微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生産
する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理
物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロッ
ト酸とＮ−アセチルグルコサミンとラクトースからＧｌ
ｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを生成させることがで
きる。 （７）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼを産生す
るヒト・メラノーマ細胞WM266-4株（ATCC CRL1676）、
あるいはヒト・メラノーマ細胞WM266-4由来β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するナマルバ
細胞KJM-1株等の組換え株（特開平6-181759）、 ＵＴＰ
の前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、
糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する
微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とし
た酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトー
スとＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃからラクト−
Ｎ−テトラオースを生成させることができる。 （８）ヒトＨｅｌａ細胞由来のβ1,4-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ[E
MBO J., 9, 3171 (1990)]あるいはSaccharomycescerevi
siae［Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 160 (19
94)］、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産す
る能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物
とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オロット
酸とガラクトースとＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌ
ｃからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させること
ができる。 （９）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前
駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖と
ＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生
物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵
素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースと
ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃからラクト−Ｎ−
ネオテトラオースを生成させることができる。
【０１２２】（１０）ナイセリア由来のβ1,3-Ｎ−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）
を発現する微生物、ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生
物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有す
る微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生産
する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａ
ｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養
液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことによ
り、オロット酸とＮ−アセチルグルコサミンとガラクト
ースとラクトースからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを
生成させることができる。 （１１）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェ
ラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現
する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能
力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、
オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸と
ラクト−Ｎ−ネオテトラオースから（α２，３）シアリ
ルラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させることがで
きる。 （１２）ヒト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼ
を発現するナマルバ細胞［J. Biol. Chem., 269, 14730
(1994)］、 ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能
力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生
産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処
理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭ
Ｐとマンノースとラクト−Ｎ−ネオテトラオースからラ
クト−Ｎ−フコペンタオースIIIを生成させることがで
きる。 （１３）ヘリコバクター・ピロリ由来のα1,3-フコシル
トランスフェラーゼ［J．Biol．Chem., 272, 21349およ
び21357 (1997)］を発現する微生物、ＧＴＰの前駆物質
からＧＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰ
からＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する能力を有する微生物の培
養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応
を行うことにより、ＧＭＰとマンノースとラクト−Ｎ−
ネオテトラオースからラクト−Ｎ−フコペンタオースII
Iを生成させることができる。 （１４）ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの
前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖
とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微
生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした
酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトース
とラクトースからグロボトリオースを生成させることが
できる。
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）
を発現する微生物、ナイセリア由来のβ1,4-ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生
物、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有す
る微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを生産
する能力を有する微生物、糖とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａ
ｌを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養
液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことによ
り、オロット酸とＮ−アセチルグルコサミンとガラクト
ースとラクトースからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを
生成させることができる。 （１１）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェ
ラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現
する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能
力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、
オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸と
ラクト−Ｎ−ネオテトラオースから（α２，３）シアリ
ルラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成させることがで
きる。 （１２）ヒト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼ
を発現するナマルバ細胞［J. Biol. Chem., 269, 14730
(1994)］、 ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能
力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生
産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処
理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭ
Ｐとマンノースとラクト−Ｎ−ネオテトラオースからラ
クト−Ｎ−フコペンタオースIIIを生成させることがで
きる。 （１３）ヘリコバクター・ピロリ由来のα1,3-フコシル
トランスフェラーゼ［J．Biol．Chem., 272, 21349およ
び21357 (1997)］を発現する微生物、ＧＴＰの前駆物質
からＧＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰ
からＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する能力を有する微生物の培
養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応
を行うことにより、ＧＭＰとマンノースとラクト−Ｎ−
ネオテトラオースからラクト−Ｎ−フコペンタオースII
Iを生成させることができる。 （１４）ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの
前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖
とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微
生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした
酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトース
とラクトースからグロボトリオースを生成させることが
できる。
【０１２３】（１５）ナイセリア由来のβ1,4-ガラクト
シルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生
物、ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆
物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵ
ＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物
の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素
反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとグ
ルコースからグロボトリオースを生成させることができ
る。 （１６）ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの
前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖
とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微
生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした
酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトース
とＮ−アセチルラクトサミンからＧａｌα1-4Ｇａｌβ1
-4ＧｌｃＮＡｃを生成させることができる。 （１７）ヒト由来のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（特開平6-181759）を発現する動物細胞、ＵＴＰの
前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖
とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微
生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした
酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトース
とＮ−アセチルグルコサミンからラクト−Ｎ−ビオース
を生成させることができる。 （１８）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェ
ラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現
する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能
力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、
オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸と
ラクト−Ｎ−ビオースからシアリルラクト−Ｎ−ビオー
スを生成させることができる。 （１９）ヒト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼ
［J. Biol. Chem., 269,14730 (1994)］を発現する動物
細胞、ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を有
する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する
能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物と
を酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰとマ
ンノースと3'-シアリルＮ−アセチルラクトサミンから
シアリルルイスＸを生成させることができる。
シルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生
物、ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの前駆
物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖とＵ
ＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微生物
の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素
反応を行うことにより、オロット酸とガラクトースとグ
ルコースからグロボトリオースを生成させることができ
る。 （１６）ナイセリア由来のα1,4-ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ＵＴＰの
前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖
とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微
生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした
酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトース
とＮ−アセチルラクトサミンからＧａｌα1-4Ｇａｌβ1
-4ＧｌｃＮＡｃを生成させることができる。 （１７）ヒト由来のβ1,3-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（特開平6-181759）を発現する動物細胞、ＵＴＰの
前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有する微生物、糖
とＵＴＰからＵＤＰ−Ｇａｌを生産する能力を有する微
生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした
酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトース
とＮ−アセチルグルコサミンからラクト−Ｎ−ビオース
を生成させることができる。 （１８）ナイセリア由来のα2,3-シアリルトランスフェ
ラーゼ［J．Biol．Chem., 271, 28271 (1996)］を発現
する微生物、ＣＴＰの前駆物質からＣＴＰを生産する能
力を有する微生物、糖とＣＴＰからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、
オロット酸とＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸と
ラクト−Ｎ−ビオースからシアリルラクト−Ｎ−ビオー
スを生成させることができる。 （１９）ヒト由来のα1,3-フコシルトランスフェラーゼ
［J. Biol. Chem., 269,14730 (1994)］を発現する動物
細胞、ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を有
する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産する
能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物と
を酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰとマ
ンノースと3'-シアリルＮ−アセチルラクトサミンから
シアリルルイスＸを生成させることができる。
【０１２４】（２０）ヒト由来のα1,3/1,4-フコシルト
ランスフェラーゼ［Carbohydrate Research, 190, 1 (1
989)］、ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産す
る能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物
とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰと
マンノースとシアリルラクト−Ｎ−ビオ−スからシアリ
ルルイスａを生成させることができる。 （２１）酵母由来のα1,２-マンノシルトランスフェラ
ーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J. Org. Chem., 5
8, 3985 (1993)］、 ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生
産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｍ
ａｎを生産する能力を有する微生物の培養液または該培
養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことによ
り、ＧＭＰとマンノースからＭａｎα1-2Ｍａｎを生成
させることができる。等をあげることができる。
ランスフェラーゼ［Carbohydrate Research, 190, 1 (1
989)］、ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生産する能力を
有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｆｕｃを生産す
る能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物
とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、ＧＭＰと
マンノースとシアリルラクト−Ｎ−ビオ−スからシアリ
ルルイスａを生成させることができる。 （２１）酵母由来のα1,２-マンノシルトランスフェラ
ーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J. Org. Chem., 5
8, 3985 (1993)］、 ＧＴＰの前駆物質からＧＴＰを生
産する能力を有する微生物、糖とＧＴＰからＧＤＰ−Ｍ
ａｎを生産する能力を有する微生物の培養液または該培
養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことによ
り、ＧＭＰとマンノースからＭａｎα1-2Ｍａｎを生成
させることができる。等をあげることができる。
【０１２５】複合糖質の製造法は、上記に記載された例
に限定されるものではなく、本特許に記載された糖ヌク
レオチド製造法と組み合わせることができる糖転移酵
素、および該酵素が許容する基質特異性の範囲におい
て、どのような糖鎖でも、ヌクレオチドの前駆物質、
糖、複合糖質前駆物質のみを原料として工業的に製造す
ることが可能である。
に限定されるものではなく、本特許に記載された糖ヌク
レオチド製造法と組み合わせることができる糖転移酵
素、および該酵素が許容する基質特異性の範囲におい
て、どのような糖鎖でも、ヌクレオチドの前駆物質、
糖、複合糖質前駆物質のみを原料として工業的に製造す
ることが可能である。
【０１２６】本発明の製造方法により製造される複合糖
質として、例えば、（１）病原性微生物やウィルスの感
染に関与する複合糖質類、例えば、病原性微生物やウィ
ルスの受容体として認識される複合糖質類、（２）病原
性微生物やウィルスが生産する毒素の受容体として認識
される複合糖質類、（３）生体内で、細胞接着、異物の
認識、各種リンフォカインの結合等に関与する複合糖質
類、等の、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン
酸、マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、フコー
ス、シアル酸等の糖を、単独あるいは複数、化学的に許
容される結合形式で含有する複合糖質をあげることがで
き、より具体的には、
質として、例えば、（１）病原性微生物やウィルスの感
染に関与する複合糖質類、例えば、病原性微生物やウィ
ルスの受容体として認識される複合糖質類、（２）病原
性微生物やウィルスが生産する毒素の受容体として認識
される複合糖質類、（３）生体内で、細胞接着、異物の
認識、各種リンフォカインの結合等に関与する複合糖質
類、等の、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン
酸、マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、フコー
ス、シアル酸等の糖を、単独あるいは複数、化学的に許
容される結合形式で含有する複合糖質をあげることがで
き、より具体的には、
【０１２７】（１）ヒトや動物のミルク中に含有される
乳幼児の微生物感染防御に関与する複合糖質類、例え
ば、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテト
ラオース等の複合糖質、（２）Escherichia coli、Prop
ionibacterium granulosium、Mycobacterium tuberculo
sis、Moraxella catarahlis、Candida albicans、Staph
ylococcus saprophyticus、Streptococcus pneumonia
e、Streptococcus agalactiae、Pseudomonasaeruginos
a、Actinomyces naeslundii、Neisseria gonorrhoeae、
Helicobacterpylori、Haemophilus influenzae等の微生
物を認識する受容体複合糖質、（３）インフルエンザウ
ィルス、コロナウィルス、センダイウィルス、ニューカッ
スル病ウィルス、レオウィルス、ロタウィルス、エイズ
ウィルス、等のウィルスの受容体複合糖質、（４）クリ
プトスポリジウム、トリパノゾーマなどの原虫の受容体
複合糖質（５）コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、ボツリ
ヌス毒素、クロストリジウムδ毒素、クロストリジウム
Ａ毒素、志賀毒素、ベロ毒素、志賀毒素様毒素、腸炎ビ
ブリオ耐熱性毒素、破傷風毒素、等の毒素が結合する受
容体複合糖質、
乳幼児の微生物感染防御に関与する複合糖質類、例え
ば、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテト
ラオース等の複合糖質、（２）Escherichia coli、Prop
ionibacterium granulosium、Mycobacterium tuberculo
sis、Moraxella catarahlis、Candida albicans、Staph
ylococcus saprophyticus、Streptococcus pneumonia
e、Streptococcus agalactiae、Pseudomonasaeruginos
a、Actinomyces naeslundii、Neisseria gonorrhoeae、
Helicobacterpylori、Haemophilus influenzae等の微生
物を認識する受容体複合糖質、（３）インフルエンザウ
ィルス、コロナウィルス、センダイウィルス、ニューカッ
スル病ウィルス、レオウィルス、ロタウィルス、エイズ
ウィルス、等のウィルスの受容体複合糖質、（４）クリ
プトスポリジウム、トリパノゾーマなどの原虫の受容体
複合糖質（５）コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、ボツリ
ヌス毒素、クロストリジウムδ毒素、クロストリジウム
Ａ毒素、志賀毒素、ベロ毒素、志賀毒素様毒素、腸炎ビ
ブリオ耐熱性毒素、破傷風毒素、等の毒素が結合する受
容体複合糖質、
【０１２８】（６）ＧＤ３，ＧＭ３等のガングリオシド
やグロボ系糖脂質等の、ガン関連複合糖質、（７）シア
リルルイスｘ糖鎖等の、白血球の炎症部位への接着や機
能修飾に関与する複合糖質類、（８）慢性関節リュウマ
チやIgA腎症等の自己免疫疾患に関与する複合糖質類、
（９）異物認識やガン細胞の認識に関与する各種のレク
チン様物質が認識する複合糖質類等をあげることができ
る。
やグロボ系糖脂質等の、ガン関連複合糖質、（７）シア
リルルイスｘ糖鎖等の、白血球の炎症部位への接着や機
能修飾に関与する複合糖質類、（８）慢性関節リュウマ
チやIgA腎症等の自己免疫疾患に関与する複合糖質類、
（９）異物認識やガン細胞の認識に関与する各種のレク
チン様物質が認識する複合糖質類等をあげることができ
る。
【０１２９】水性媒体中に生成した複合糖質の定量は公
知の方法に準じて行うことができる。［Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., 85, 3289 (1988)、Anal. Biochem., 17
4, 459 (1988)］。反応液中に生成した複合糖質の採取
は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法によ
って行うことができ、例えば、Ｎ−アセチルラクトサミ
ンにおいてはJ. Org. Chem., 47, 5416 (1982)記載の方
法に準じて行うことができる。
知の方法に準じて行うことができる。［Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., 85, 3289 (1988)、Anal. Biochem., 17
4, 459 (1988)］。反応液中に生成した複合糖質の採取
は、活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法によ
って行うことができ、例えば、Ｎ−アセチルラクトサミ
ンにおいてはJ. Org. Chem., 47, 5416 (1982)記載の方
法に準じて行うことができる。
【０１３０】以下に本発明の実施例を示すが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。
これら実施例に限定されるものではない。
【０１３１】
【実施例】以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ ｇａｌＵ、ｐｐａを発現する組換え体プラス
ミドの造成 ｇａｌＵ、ｐｐａを発現する組換え体プラスミドｐＮＴ
１２の造成方法について以下に述べる（図１、図２）。 １）ＰLプロモーターを含む発現ベクターの造成 ＰLプロモーターを含む発現ベクターであるｐＰＡ３１
およびｐＰＡＣ３１は以下に示す方法で造成した（図
１）。
ミドの造成 ｇａｌＵ、ｐｐａを発現する組換え体プラスミドｐＮＴ
１２の造成方法について以下に述べる（図１、図２）。 １）ＰLプロモーターを含む発現ベクターの造成 ＰLプロモーターを含む発現ベクターであるｐＰＡ３１
およびｐＰＡＣ３１は以下に示す方法で造成した（図
１）。
【０１３２】トリプトファンプロモーターを含むプラス
ミドｐＴｒＳ３０を保有するエシェリヒア・コリJM109/
pTrS30（FERM BP-5407）およびＰLプ ロモーターを含む
プラスミドｐＰＡ１（特開昭63-233798）、ＰLプロモー
ターおよびｃＩ８５７リプレッサーを含むプラスミドｐ
ＰＡＣ１（FERM BP-6054）を保有するエシェリヒア・コ
リを、それぞれＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ
社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ｐＨを７．２］に植菌し、３
０℃で１８時間培養した。
ミドｐＴｒＳ３０を保有するエシェリヒア・コリJM109/
pTrS30（FERM BP-5407）およびＰLプ ロモーターを含む
プラスミドｐＰＡ１（特開昭63-233798）、ＰLプロモー
ターおよびｃＩ８５７リプレッサーを含むプラスミドｐ
ＰＡＣ１（FERM BP-6054）を保有するエシェリヒア・コ
リを、それぞれＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ
社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ｐＨを７．２］に植菌し、３
０℃で１８時間培養した。
【０１３３】該培養により得られた菌体から前述の公知
の方法により、ｐＴｒＳ３０、ｐＰＡ１およびｐＰＡＣ
１プラスミドＤＮＡを単離精製した。精製したｐＴｒＳ
３０ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌ
ａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断
片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ１０１
社製）により３．４ｋｂの断片を回収した。精製したｐ
ＰＡ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣ
ｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ
断片を分離し、同様に１．０ｋｂの断片を回収した。
の方法により、ｐＴｒＳ３０、ｐＰＡ１およびｐＰＡＣ
１プラスミドＤＮＡを単離精製した。精製したｐＴｒＳ
３０ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌ
ａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断
片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ１０１
社製）により３．４ｋｂの断片を回収した。精製したｐ
ＰＡ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣ
ｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ
断片を分離し、同様に１．０ｋｂの断片を回収した。
【０１３４】該３．４ｋｂの断片および１．０ｋｂの断
片をライゲーションキット（TAKARAligation Kit、宝酒
造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行っ
た。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株
を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３７℃で一晩培養した。
片をライゲーションキット（TAKARAligation Kit、宝酒
造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行っ
た。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株
を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３７℃で一晩培養した。
【０１３５】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ＰLプロ
モーターによる発現ベクターであるｐＰＡ３１を得た。
該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図
１）。精製したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵
素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより３．４ｋｂの断片を回収した。精製したｐ
ＰＡＣ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよび
ＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に２．３ｋｂの断片を回収した。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ＰLプロ
モーターによる発現ベクターであるｐＰＡ３１を得た。
該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図
１）。精製したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵
素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより３．４ｋｂの断片を回収した。精製したｐ
ＰＡＣ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよび
ＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に２．３ｋｂの断片を回収した。
【０１３６】該３．４ｋｂの断片および２．３ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
【０１３７】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｃＩ８５
７リプレッサーを含むＰLプロモーターによる発現ベク
ターであるｐＰＡＣ３１を取得した。該プラスミドの構
造を制限酵素消化により確認した（図１）。 ２）ｇａｌＵ発現プラスミドの造成 エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを公知の方
法［例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons Inc.(1994)］により単離精製し
た。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｃＩ８５
７リプレッサーを含むＰLプロモーターによる発現ベク
ターであるｐＰＡＣ３１を取得した。該プラスミドの構
造を制限酵素消化により確認した（図１）。 ２）ｇａｌＵ発現プラスミドの造成 エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを公知の方
法［例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons Inc.(1994)］により単離精製し
た。
【０１３８】配列番号１記載のセンス鎖ＤＮＡプライマ
ーと、配列番号２記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマ
ーをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該
合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体ＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはW3110染色体
ＤＮＡ ０．０４μｇ、プライマー各０．５μＭ、ＴＡ
ＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）１．０ｕｎｉｔ、
１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液（宝酒造社製）４μｌ、deoxy
ＮＴＰ各２００μＭを含む反応液４０μｌを用い、９４
℃―１分、４２℃―２分、７２℃―３分の工程を３０回
繰り返すことにより行った。
ーと、配列番号２記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマ
ーをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）社製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該
合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体ＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはW3110染色体
ＤＮＡ ０．０４μｇ、プライマー各０．５μＭ、ＴＡ
ＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）１．０ｕｎｉｔ、
１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液（宝酒造社製）４μｌ、deoxy
ＮＴＰ各２００μＭを含む反応液４０μｌを用い、９４
℃―１分、４２℃―２分、７２℃―３分の工程を３０回
繰り返すことにより行った。
【０１３９】該反応液の１／１０量をアガロースゲル電
気泳動にかけ、目的の断片が増幅されていることを確認
後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍＭ トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノ
ール／クロロホ ルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加
し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に
２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３
０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得
た。該沈殿を７０％冷エタノールで洗浄し、真空乾燥し
て沈殿を得た。以後、ＴＥ飽和フェノール／クロロホル
ムを添加し、エタノールで洗浄したＤＮＡの沈殿を得る
までの操作をエタノール沈殿法と呼ぶ。
気泳動にかけ、目的の断片が増幅されていることを確認
後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍＭ トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノ
ール／クロロホ ルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加
し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に
２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３
０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得
た。該沈殿を７０％冷エタノールで洗浄し、真空乾燥し
て沈殿を得た。以後、ＴＥ飽和フェノール／クロロホル
ムを添加し、エタノールで洗浄したＤＮＡの沈殿を得る
までの操作をエタノール沈殿法と呼ぶ。
【０１４０】該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解し
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩ
Ｉキットにより０．９ｋｂの断片を回収した。実施例１
−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロ
ースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に
４．２ｋｂの断片を回収した。
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩ
Ｉキットにより０．９ｋｂの断片を回収した。実施例１
−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロ
ースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に
４．２ｋｂの断片を回収した。
【０１４１】該０．９ｋｂの断片および４．２ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４２】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＵ
発現プラスミドであるｐＮＴ９を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図２）。 ３）ｇａｌＵ，ｐｐａ同時発現プラスミドの造成 配列番号３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番
号４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し、
該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＵ
発現プラスミドであるｐＮＴ９を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図２）。 ３）ｇａｌＵ，ｐｐａ同時発現プラスミドの造成 配列番号３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番
号４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し、
該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。
【０１４３】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法により、
ＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶
解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩ
キットにより１．０ｋｂの断片を回収した。実施例１−
２）で取得したｐＮＴ９ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素
ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．９ｋｂの
断片を回収した。
ＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶
解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩ
キットにより１．０ｋｂの断片を回収した。実施例１−
２）で取得したｐＮＴ９ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素
ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．９ｋｂの
断片を回収した。
【０１４４】該１．０ｋｂの断片および４．９ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１４５】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌ
Ｕ，ｐｐａ同時発現プラスミドであるｐＮＴ１２を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図２）。該ｐＮＴ１２ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素
ＥｃｏＲＩお よびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーンＩＩ
キットにより２．２ｋｂの断片を回収した。一方、ｐＳ
ＴＶ２８ ＤＮＡ（宝酒造社製）０．２μｇを制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの
断片を回収した。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌ
Ｕ，ｐｐａ同時発現プラスミドであるｐＮＴ１２を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図２）。該ｐＮＴ１２ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素
ＥｃｏＲＩお よびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーンＩＩ
キットにより２．２ｋｂの断片を回収した。一方、ｐＳ
ＴＶ２８ ＤＮＡ（宝酒造社製）０．２μｇを制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの
断片を回収した。
【０１４６】該２．２ｋｂの断片および３．０ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をクロラムフェニコール10μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出
し、ｇａｌＵ，ｐｐａ遺伝子発現プラスミドであるｐＮ
Ｔ３２を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化によ
り確認した（図２）。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をクロラムフェニコール10μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出
し、ｇａｌＵ，ｐｐａ遺伝子発現プラスミドであるｐＮ
Ｔ３２を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化によ
り確認した（図２）。
【０１４７】実施例２ ＵＤＰ−Ｇｌｃの生産
実施例１で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT12株を、
アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌ
の入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、３
０℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養
液１２５ｍｌをグルコース１０ｇ／ｌ、バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ
社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ（別殺
菌）、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ（別殺菌）、アンピ
シリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ
無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０
℃で４時間、更に、４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通
気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。
アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌ
の入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、３
０℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養
液１２５ｍｌをグルコース１０ｇ／ｌ、バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ
社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ（別殺
菌）、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ（別殺菌）、アンピ
シリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ
無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０
℃で４時間、更に、４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通
気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。
【０１４８】該培養中、２８％アンモニア水を用いて、
培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必
要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心分離
し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０
℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いるこ
とができる。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株を、グルコース５０ ｇ／ｌ、ポリペプトン
（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタ
ル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素 ５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2Ｓ
Ｏ4 ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ
2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／
ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４
〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／
ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム １０ｍｇ／ｌ、ビタ
ミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸 ５ｍｇ／ｌ 、およ
びビオチン ３０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．
２に調整）の組成からなる液体培地２０ｍｌの入った３
００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃
で２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。
培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必
要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心分離
し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０
℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いるこ
とができる。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株を、グルコース５０ ｇ／ｌ、ポリペプトン
（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタ
ル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素 ５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2Ｓ
Ｏ4 ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ
2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／
ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４
〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／
ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム １０ｍｇ／ｌ、ビタ
ミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸 ５ｍｇ／ｌ 、およ
びビオチン ３０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．
２に調整）の組成からなる液体培地２０ｍｌの入った３
００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃
で２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。
【０１４９】該培養液２０ｍｌを上記と同一組成の液体
培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラス
コに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で、２４時間
培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。該
種培養液２５０ｍｌを、グルコース １５０ｇ／ｌ、肉
エキス（極東製薬社製） ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ
／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １０ｇ／ｌ 、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
１０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １
０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ２０ｍｇ／ｌ（別
殺菌）、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−
システイン ２０ｍｇ／ｌ、ビオチン １００μｇ／ｌ、
尿素 ２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺
菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成か
らなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種
し、３２℃で６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの
条件で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニ
ア水を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラス
コに接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で、２４時間
培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。該
種培養液２５０ｍｌを、グルコース １５０ｇ／ｌ、肉
エキス（極東製薬社製） ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ
／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １０ｇ／ｌ 、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
１０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １
０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ２０ｍｇ／ｌ（別
殺菌）、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−
システイン ２０ｍｇ／ｌ、ビオチン １００μｇ／ｌ、
尿素 ２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺
菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成か
らなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種
し、３２℃で６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの
条件で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニ
ア水を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
【０１５０】該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができる。エシェ
リヒア・コリKY8415/pNT12株湿菌体 ４０ｇ／ｌ、コリ
ネバクテリウ ム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体
１５０ｇ／ｌ、グルコ ース １００ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ
4 ２０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｇ／ｌ、フィチ
ン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）２１．２ｇ
／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０
ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容
ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラ
ーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２１時間反応
を行った。
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができる。エシェ
リヒア・コリKY8415/pNT12株湿菌体 ４０ｇ／ｌ、コリ
ネバクテリウ ム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体
１５０ｇ／ｌ、グルコ ース １００ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ
4 ２０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ｇ／ｌ、フィチ
ン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）２１．２ｇ
／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０
ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容
ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラ
ーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２１時間反応
を行った。
【０１５１】反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応
液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてグルコース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、反応液中に４
３．９ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇｌｃ（２Ｎａ塩）が生成し
た。
液のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてグルコース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、反応液中に４
３．９ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇｌｃ（２Ｎａ塩）が生成し
た。
【０１５２】実施例３ ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現する
組換え体プラスミドの造成 ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現する組換え体プラスミドｐＮ
Ｔ２５の造成方法について以下に述べる（図３）。
組換え体プラスミドの造成 ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現する組換え体プラスミドｐＮ
Ｔ２５の造成方法について以下に述べる（図３）。
【０１５３】配列番号５記載のセンス鎖ＤＮＡプライマ
ーと、配列番号６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマ
ーを合成し、該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110
株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該ＤＮＡ沈殿を２０μｌのＴＥ
に溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーン
クリーンＩＩキットにより２．３ｋｂの断片を回収し
た。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０
ｋｂの断片を回収した。
ーと、配列番号６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマ
ーを合成し、該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110
株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該ＤＮＡ沈殿を２０μｌのＴＥ
に溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーン
クリーンＩＩキットにより２．３ｋｂの断片を回収し
た。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０
ｋｂの断片を回収した。
【０１５４】該２．３ｋｂの断片および３．０ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、
該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、
該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１５５】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌ
Ｔ、ｇａｌＫ遺伝子を含むプラスミドであるｐＮＴ１９
を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認
した（図３）。該ｐＮＴ１９ ＤＮＡ０．５μｇを制限
酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．３ｋ
ｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡ
Ｃ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌ
Ｔ、ｇａｌＫ遺伝子を含むプラスミドであるｐＮＴ１９
を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認
した（図３）。該ｐＮＴ１９ ＤＮＡ０．５μｇを制限
酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．３ｋ
ｂの断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡ
Ｃ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０１５６】該２．３ｋｂの断片および５．５ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリNM52株を前述の公知の方法に従って形質転換し、
該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリNM52株を前述の公知の方法に従って形質転換し、
該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１５７】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌ
Ｔ、ｇａｌＫ同時発現プラスミドであるｐＮＴ２５を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図３）。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌ
Ｔ、ｇａｌＫ同時発現プラスミドであるｐＮＴ２５を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図３）。
【０１５８】実施例４ ＵＤＰ−Ｇａｌの生産
１）ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、ｇａｌＵ、ｐｐａ発現株の造
成 実施例１−３）で得たｐＮＴ３２ ＤＮＡを用いてエシ
ェリヒア・コリNM522/pNT25株を常法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび
クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体を選択することにより、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、ｇ
ａｌＵ、ｐｐａ発現株であるエシェリヒア・コリNM522/
pNT25/pNT32株を得た。 ２）ＵＤＰ−Ｇａｌの生産 実施例４−１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/
pNT32株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各
々の培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。また、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分
離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２
０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができる。
成 実施例１−３）で得たｐＮＴ３２ ＤＮＡを用いてエシ
ェリヒア・コリNM522/pNT25株を常法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび
クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体を選択することにより、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、ｇ
ａｌＵ、ｐｐａ発現株であるエシェリヒア・コリNM522/
pNT25/pNT32株を得た。 ２）ＵＤＰ−Ｇａｌの生産 実施例４−１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/
pNT32株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各
々の培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。また、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分
離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２
０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができる。
【０１５９】エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、グルコース
８０ｇ／ｌ、ガラクトース ２０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １
５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５ｇ／ ｌ、フィチン酸
５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） ２１．２ｇ／
ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍ
ｌ／ｌの組成からなる反応液２Ｌを５Ｌ容培養槽に入
れ、該反応液を６００ｒｐｍにて攪拌し、１Ｌ／ｍｉｎ
にて通気し、３２℃で２６時間反応を行った。
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、グルコース
８０ｇ／ｌ、ガラクトース ２０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １
５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５ｇ／ ｌ、フィチン酸
５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） ２１．２ｇ／
ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍ
ｌ／ｌの組成からなる反応液２Ｌを５Ｌ容培養槽に入
れ、該反応液を６００ｒｐｍにて攪拌し、１Ｌ／ｍｉｎ
にて通気し、３２℃で２６時間反応を行った。
【０１６０】反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応
液のｐＨ７．２に維持し、必要に応じて、グルコース、
ガラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、
反応液中に４７．４ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ
塩）が生成した。
液のｐＨ７．２に維持し、必要に応じて、グルコース、
ガラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、
反応液中に４７．４ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ
塩）が生成した。
【０１６１】実施例５ ｇａｌＴ、ｇａｌＫをコリネバ
クテリウム・アンモニアゲネスで発現する組換え体プラ
スミドの造成 エシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴ、ｇａｌＫをコリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスで発現する組換え体プ
ラスミドｐＴＫ７の造成方法について以下に述べる（図
４）。 １）ｐＣＧ１１６の造成 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスで複製できるプ
ラスミドｐＣＧ１１６の造成を以下のように行った。
クテリウム・アンモニアゲネスで発現する組換え体プラ
スミドの造成 エシェリヒア・コリ由来のｇａｌＴ、ｇａｌＫをコリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスで発現する組換え体プ
ラスミドｐＴＫ７の造成方法について以下に述べる（図
４）。 １）ｐＣＧ１１６の造成 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスで複製できるプ
ラスミドｐＣＧ１１６の造成を以下のように行った。
【０１６２】プラスミドｐＣＧ１１(特公平6-91827) Ｄ
ＮＡ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切
断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離
し、ジーンクリーンＩＩキットにより６．５ｋｂの断片
を回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１９ ＤＮＡ１．
０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで 切断後、DNA Blunting
Kit(宝酒造社製)により平滑末端化した。平滑末端化し
た該ＤＮＡをＰｓｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離し、MERmaid Kit（Ｂｉｏ１
０１社製）により４３ｂｐの断片を回収した。
ＮＡ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｔｕＩで切
断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離
し、ジーンクリーンＩＩキットにより６．５ｋｂの断片
を回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１９ ＤＮＡ１．
０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで 切断後、DNA Blunting
Kit(宝酒造社製)により平滑末端化した。平滑末端化し
た該ＤＮＡをＰｓｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離し、MERmaid Kit（Ｂｉｏ１
０１社製）により４３ｂｐの断片を回収した。
【０１６３】該６．５ｋｂの断片および４３ｂｐの断片
をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてコリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170 株をエレクトロポ
ーレーション法[FEMS Microbiol. Lett., 65, 299 (198
9)]で形質転換し、該形質転換体をスペクチノマイシン
１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃
で2日間培養した。
をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてコリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170 株をエレクトロポ
ーレーション法[FEMS Microbiol. Lett., 65, 299 (198
9)]で形質転換し、該形質転換体をスペクチノマイシン
１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃
で2日間培養した。
【０１６４】生育してきた形質転換体のコロニーより公
知の方法[J. Bacteriol., 159 306(1984)]に従ってプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＣＧ１１６を得た。該プ
ラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図
４）。 ２）ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現するプラスミドｐＴＫ７
の造成 実施例３で造成したｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現するプラ
スミドｐＮＴ２５ＤＮＡ１．０μｇを制限酵素ＸｈｏＩ
およびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットに
より３．５ｋｂの断片を回収した。
知の方法[J. Bacteriol., 159 306(1984)]に従ってプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＣＧ１１６を得た。該プ
ラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図
４）。 ２）ｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現するプラスミドｐＴＫ７
の造成 実施例３で造成したｇａｌＴ、ｇａｌＫを発現するプラ
スミドｐＮＴ２５ＤＮＡ１．０μｇを制限酵素ＸｈｏＩ
およびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットに
より３．５ｋｂの断片を回収した。
【０１６５】一方、実施例５−１）で造成したプラスミ
ドｐＣＧ１１６ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＳａｌＩ
およびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離し、同様に６．５ｋｂの断片を回
収した。該３．５ｋｂの断片および６．５ｋｂの断片を
ライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結
反応を行った。
ドｐＣＧ１１６ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＳａｌＩ
およびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離し、同様に６．５ｋｂの断片を回
収した。該３．５ｋｂの断片および６．５ｋｂの断片を
ライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、連結
反応を行った。
【０１６６】該連結反応液を用いてコリネバクテリウム
・アンモニアゲネスATCC21170株をエレクトロポーレー
ション法で形質転換し、該形質転換体をスペクチノマイ
シン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３
０℃で2日間培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａ
ｌＴ、ｇａｌＫ同時発現プラスミドであるｐＴＫ７を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図４）。
・アンモニアゲネスATCC21170株をエレクトロポーレー
ション法で形質転換し、該形質転換体をスペクチノマイ
シン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３
０℃で2日間培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａ
ｌＴ、ｇａｌＫ同時発現プラスミドであるｐＴＫ７を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図４）。
【０１６７】実施例６ ＵＤＰ−Ｇａｌの生産
実施例５で得たコリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ATCC21170/pTK7株を実施例２と同様の方法で３２℃で２
０時間培養した後、４０℃で４時間培養し、得られた培
養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要
に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解
凍して用いることができる。
ATCC21170/pTK7株を実施例２と同様の方法で３２℃で２
０時間培養した後、４０℃で４時間培養し、得られた培
養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要
に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解
凍して用いることができる。
【０１６８】コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170/pTK7株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ４
０ｇ／ｌ、ガラクトース ２０ｇ／ｌ 、ＫＨ2ＰＯ4 １
５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸
５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０．６ｇ／ｌ、
ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／
ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカ
ーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて
攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２２時間反応を行っ
た。
CC21170/pTK7株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ４
０ｇ／ｌ、ガラクトース ２０ｇ／ｌ 、ＫＨ2ＰＯ4 １
５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸
５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０．６ｇ／ｌ、
ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／
ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカ
ーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて
攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２２時間反応を行っ
た。
【０１６９】反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応
液のｐＨ７．２に維持し、必要に応じて、フルクトー
ス、ガラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応によ
り、反応液中に７．２ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ
塩）が生成した。
液のｐＨ７．２に維持し、必要に応じて、フルクトー
ス、ガラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応によ
り、反応液中に７．２ｇ／ｌのＵＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ
塩）が生成した。
【０１７０】実施例７ ｇｌｍＵ、ｐｐａ、ｐｇｍ、ｇ
ｌｍＭ、ｇｌｋ、ｐｆｋＢ発現プラスミドの造成 １）ｇｌｍＵ、ｐｐａ発現プラスミドの造成 配列番号７記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番
号８記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色
体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行っ
た。
ｌｍＭ、ｇｌｋ、ｐｆｋＢ発現プラスミドの造成 １）ｇｌｍＵ、ｐｐａ発現プラスミドの造成 配列番号７記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番
号８記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色
体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行っ
た。
【０１７１】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該ＤＮＡ沈殿を２０μｌのＴＥ
に溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリー
ンＩＩキットにより１．４ｋｂの断片を回収した。実施
例１−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ０．５μｇを
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様
に４．２ｋｂの断片を回収した。
ＮＡの沈殿を取得した。該ＤＮＡ沈殿を２０μｌのＴＥ
に溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリー
ンＩＩキットにより１．４ｋｂの断片を回収した。実施
例１−１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ０．５μｇを
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様
に４．２ｋｂの断片を回収した。
【０１７２】該１．４ｋｂの断片および４．２ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１７３】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍＵ
発現プラスミドであるｐＮＴ１０を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図５）。実施例
１−３）で取得したｐＮＴ１２ ＤＮＡ０．５μｇを制
限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し同様に１．０ｋ
ｂの断片を回収した。上記ｐＮＴ１０ ＤＮＡ ０．２μ
ｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガ
ロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に
５．３ｋｂの断片を回収した。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍＵ
発現プラスミドであるｐＮＴ１０を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図５）。実施例
１−３）で取得したｐＮＴ１２ ＤＮＡ０．５μｇを制
限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し同様に１．０ｋ
ｂの断片を回収した。上記ｐＮＴ１０ ＤＮＡ ０．２μ
ｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断後、アガ
ロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に
５．３ｋｂの断片を回収した。
【０１７４】該１．０ｋｂの断片および５．３ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリKY8415株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１７５】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍ
Ｕ、ｐｐａ同時発現プラスミドであるｐＮＴ１４を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図５）。 ２）ｐｇｍ発現プラスミドの造成 配列番号９記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番
号１０記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色
体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行っ
た。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍ
Ｕ、ｐｐａ同時発現プラスミドであるｐＮＴ１４を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図５）。 ２）ｐｇｍ発現プラスミドの造成 配列番号９記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番
号１０記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとして、W3110株の染色
体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行っ
た。
【０１７６】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法により、
ＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶
解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｃｌ
ａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキッ
トにより１．８ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）
で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素
ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの
断片を回収した。
ＤＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶
解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｃｌ
ａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキッ
トにより１．８ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）
で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素
ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの
断片を回収した。
【０１７７】該１．８ｋｂの断片および５．５ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間、
連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア
・コリNM522株を前述の公知の方法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０１７８】生育してきた形質転換体のコロニーより前
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍ発
現プラスミドであるｐＮＴ２４を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図６）。 ３）ｇｌｍＭ発現プラスミドの造成 配列番号１１記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１２記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条
件でＰＣＲを行った。
述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍ発
現プラスミドであるｐＮＴ２４を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図６）。 ３）ｇｌｍＭ発現プラスミドの造成 配列番号１１記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１２記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条
件でＰＣＲを行った。
【０１７９】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解
した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｃｌａ
ＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動
によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット
により１．６ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で
取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素Ｃ
ｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断
片を回収した。
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解
した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｃｌａ
ＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動
によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット
により１．６ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）で
取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素Ｃ
ｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断
片を回収した。
【０１８０】該１．６ｋｂの断片および５．５ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
【０１８１】生育してきた形質転換体のコロニーより常
法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍＭ発現プラスミ
ドであるｐＮＴ４４を得た。該プラスミドの構造を制限
酵素消化により確認した（図７）。 ４）ｇｌｋ発現プラスミドの造成 配列番号１３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条
件でＰＣＲを行った。
法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｍＭ発現プラスミ
ドであるｐＮＴ４４を得た。該プラスミドの構造を制限
酵素消化により確認した（図７）。 ４）ｇｌｋ発現プラスミドの造成 配列番号１３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条
件でＰＣＲを行った。
【０１８２】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得し、該沈殿を２０μlのＴＥに溶解し
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキ
ットにより０．５ｋｂの断片を回収した。実施例１−
１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．
２ｋｂの断片を回収した。
ＮＡの沈殿を取得し、該沈殿を２０μlのＴＥに溶解し
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキ
ットにより０．５ｋｂの断片を回収した。実施例１−
１）で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．
２ｋｂの断片を回収した。
【０１８３】該０．５ｋｂの断片および４．２ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体の
コロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｋ
の一部を有するプラスミドであるｐＮＴ４５を得た。該
プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図
８）。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体の
コロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｋ
の一部を有するプラスミドであるｐＮＴ４５を得た。該
プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図
８）。
【０１８４】上述と同一の条件でＰＣＲを行い、得られ
たＤＮＡ溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に０．５ｋｂの断片を回収した。
上に記した方法で取得したｐＮＴ４５ ＤＮＡ ０．２μ
ｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後アルカリホスファ
ターゼにより脱リン酸化処理を行い、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．７ｋｂの
断片を回収した。
たＤＮＡ溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に０．５ｋｂの断片を回収した。
上に記した方法で取得したｐＮＴ４５ ＤＮＡ ０．２μ
ｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後アルカリホスファ
ターゼにより脱リン酸化処理を行い、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に４．７ｋｂの
断片を回収した。
【０１８５】該０．５ｋｂの断片および４．７ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
【０１８６】生育してきた形質転換体のコロニーより常
法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｋを発現するプラ
スミドであるｐＮＴ４６を得た。該プラスミドの構造を
制限酵素消化により確認した（図８）。 ５）ｐｆｋＢ発現プラスミドの造成 配列番号１５記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、W3110株の染色体
ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行っ
た。
法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｌｋを発現するプラ
スミドであるｐＮＴ４６を得た。該プラスミドの構造を
制限酵素消化により確認した（図８）。 ５）ｐｆｋＢ発現プラスミドの造成 配列番号１５記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、W3110株の染色体
ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行っ
た。
【０１８７】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより１．３ｋｂの断片を回収した。pBluescrip
tＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＥｃｏＲＶで切断後、アガロースゲル電気泳動
によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を
回収した。
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより１．３ｋｂの断片を回収した。pBluescrip
tＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＥｃｏＲＶで切断後、アガロースゲル電気泳動
によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を
回収した。
【０１８８】該１．３ｋｂの断片および３．０ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後３０℃で一晩培養した。
【０１８９】生育してきた形質転換体のコロニーより常
法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｆｋＢ遺伝子を保有
するプラスミドｐＮＴ４３を得た。該プラスミドの構造
を制限酵素消化により確認した（図９）。ｐＮＴ４３
ＤＮＡ ０．５μｇを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ
およびＳａｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りＤＮＡ断片を分離し、同様に１．３ｋｂの断片を回収
した。
法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｆｋＢ遺伝子を保有
するプラスミドｐＮＴ４３を得た。該プラスミドの構造
を制限酵素消化により確認した（図９）。ｐＮＴ４３
ＤＮＡ ０．５μｇを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ
およびＳａｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りＤＮＡ断片を分離し、同様に１．３ｋｂの断片を回収
した。
【０１９０】実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１
ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＳａｃＩ
で切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を
分離し同様に５．７ｋｂの断片を回収した。該１．３ｋ
ｂの断片および５．７ｋｂの断片をライゲーションキッ
トを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＳａｃＩ
で切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を
分離し同様に５．７ｋｂの断片を回収した。該１．３ｋ
ｂの断片および５．７ｋｂの断片をライゲーションキッ
トを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。
【０１９１】該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリ
NM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｆｋＢ発
現プラスミドであるｐＮＴ４７を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図９）。
NM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｆｋＢ発
現プラスミドであるｐＮＴ４７を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図９）。
【０１９２】実施例８ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産
実施例７で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、NM
522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株を実施例
２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心
分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−
２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用い
ることができる。
522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株を実施例
２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠心
分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−
２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用い
ることができる。
【０１９３】エシェリヒア・コリNM522/pNT24株湿菌体
６ｇ／ｌ、NM522/pNT47株湿菌体６ｇ／ｌ、１００ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2・
６Ｈ2Ｏ 、１０ｍＭ グルコース-6-リン酸、２．５ｍＭ
フルクトース6-リン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、ナイミー
ンＳ−２１５ ４ｇ／ｌの組成からなる反応液０．１ｍ
ｌを１．５ｍｌ容チューブに入れ、３７℃で１時間反応
を行った。反応液を６５℃で５分間処理後、エシェリヒ
ア・コリKY8415/pNT14株湿菌体０．３ｇ／ｌ、NM522/pN
T44株湿菌体６ｇ／ｌ、５ｍＭ グルコサミン-6-リン
酸、５ｍＭ アセチルＣｏＡ、５ｍＭ ＵＴＰとなるよう
に菌体および基質を添加し、さらに３７℃で３０分間反
応させたところ、反応液中に２．５ｍＭ（１．６ｇ／
ｌ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）が生成した。
この際、エシェリヒア・コリNM522/pNT24株湿菌体ある
いはNM522/pNT47株湿菌体を添加しなかった場合のＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ生成量はそれぞれ０．０８ｍＭ、０．
１６ｍＭであった。
６ｇ／ｌ、NM522/pNT47株湿菌体６ｇ／ｌ、１００ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2・
６Ｈ2Ｏ 、１０ｍＭ グルコース-6-リン酸、２．５ｍＭ
フルクトース6-リン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、ナイミー
ンＳ−２１５ ４ｇ／ｌの組成からなる反応液０．１ｍ
ｌを１．５ｍｌ容チューブに入れ、３７℃で１時間反応
を行った。反応液を６５℃で５分間処理後、エシェリヒ
ア・コリKY8415/pNT14株湿菌体０．３ｇ／ｌ、NM522/pN
T44株湿菌体６ｇ／ｌ、５ｍＭ グルコサミン-6-リン
酸、５ｍＭ アセチルＣｏＡ、５ｍＭ ＵＴＰとなるよう
に菌体および基質を添加し、さらに３７℃で３０分間反
応させたところ、反応液中に２．５ｍＭ（１．６ｇ／
ｌ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）が生成した。
この際、エシェリヒア・コリNM522/pNT24株湿菌体ある
いはNM522/pNT47株湿菌体を添加しなかった場合のＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ生成量はそれぞれ０．０８ｍＭ、０．
１６ｍＭであった。
【０１９４】このことは、ｐｇｍ発現株とｐｆｋＢ発現
株の組み合わせにより、ｇｌｍＭの活性発現に必要なＧ
ｌｃ−１，６−Ｐ２が供給できることを示している。
株の組み合わせにより、ｇｌｍＭの活性発現に必要なＧ
ｌｃ−１，６−Ｐ２が供給できることを示している。
【０１９５】実施例９ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産
実施例７で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、NM
522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT46株、NM522/p
NT47株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々
の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例
２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し
湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で
保存することが可能で、使用前に解凍して用いることが
できる。
522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT46株、NM522/p
NT47株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々
の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例
２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し
湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で
保存することが可能で、使用前に解凍して用いることが
できる。
【０１９６】エシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、NM52
2/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株、NM522/pNT
46株湿菌体を各１０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アン
モニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルク
トース ５０ｇ／ｌ、グルコサミン塩酸塩８０ｇ／ｌ、
ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／
ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）
１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレ
ン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２０
０ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック
・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１
０時間反応を行った。
2/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株、NM522/pNT
46株湿菌体を各１０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アン
モニアゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルク
トース ５０ｇ／ｌ、グルコサミン塩酸塩８０ｇ／ｌ、
ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／
ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）
１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレ
ン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２０
０ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック
・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１
０時間反応を行った。
【０１９７】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフルクトース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、反応液中に６．
２ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ 塩）が生成
した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフルクトース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、反応液中に６．
２ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ 塩）が生成
した。
【０１９８】実施例１０ ｇａｌＫ発現プラスミドの造
成 実施例３−１）で取得したｐＮＴ２５ ＤＮＡ ０．５μ
ｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで切断後、アガ
ロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーン
クリーンＩＩキットにより６．７ｋｂの断片を回収し
た。回収したＤＮＡをDNA Blunting Kitにより平滑末端
化した後、ライゲーションキットを用いて１６℃で１６
時間連結反応を行った。
成 実施例３−１）で取得したｐＮＴ２５ ＤＮＡ ０．５μ
ｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで切断後、アガ
ロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーン
クリーンＩＩキットにより６．７ｋｂの断片を回収し
た。回収したＤＮＡをDNA Blunting Kitにより平滑末端
化した後、ライゲーションキットを用いて１６℃で１６
時間連結反応を行った。
【０１９９】該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリ
NM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＫ発
現プラスミドであるｐＮＴ５４を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図１０）。
NM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｇａｌＫ発
現プラスミドであるｐＮＴ５４を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図１０）。
【０２００】実施例１１ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生産
実施例１０で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT54株を
実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心
分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法
で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができる。
実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心
分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法
で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２０１】エシェリヒア・コリNM522/pNT54株湿菌体
５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体１５０ｇ／ｌ、フルクトース４０ｇ／
ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン６７ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4
１５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン
酸５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０ ｇ／ｌ、
ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／
ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカ
ーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーに
て攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２７時間反応を行
った。
５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体１５０ｇ／ｌ、フルクトース４０ｇ／
ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン６７ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4
１５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン
酸５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０ ｇ／ｌ、
ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／
ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカ
ーに入れ、この反応液をマグネティック・スターラーに
て攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２７時間反応を行
った。
【０２０２】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフルクトース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、反応液中に１
７．１ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）が生
成した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフルクトース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、反応液中に１
７．１ｇ／ｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）が生
成した。
【０２０３】実施例１２ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとＵＤ
Ｐ−Ｇａｌの同時生産 実施例３で得たNM522/pNT25株を実施例２と同様の方法
で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得し
た。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC
21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培
養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に
応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍
して用いることができる。
Ｐ−Ｇａｌの同時生産 実施例３で得たNM522/pNT25株を実施例２と同様の方法
で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得し
た。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC
21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた培
養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に
応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍
して用いることができる。
【０２０４】エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体
２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ６０ｇ
／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン ５０ｇ／ｌ、ガラク
トース ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロッ
ト酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１
５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反
応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応
液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。
２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ６０ｇ
／ｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン ５０ｇ／ｌ、ガラク
トース ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロッ
ト酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１
５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反
応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応
液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。
【０２０５】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に１１．４ｇ／ｌのＵ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）および１８ｇ／ｌのＵ
ＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ塩）が生成した。 実施例１３ ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐｇｍ、ｐｆｋＢ発
現プラスミドの造成 １）ｍａｎＢ、ｍａｎＣ発現プラスミドの造成 配列番号１７記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１８記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件
でＰＣＲを行った。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に１１．４ｇ／ｌのＵ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｎａ塩）および１８ｇ／ｌのＵ
ＤＰ−Ｇａｌ（２Ｎａ塩）が生成した。 実施例１３ ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐｇｍ、ｐｆｋＢ発
現プラスミドの造成 １）ｍａｎＢ、ｍａｎＣ発現プラスミドの造成 配列番号１７記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号１８記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件
でＰＣＲを行った。
【０２０６】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより３．０ｋｂの断片を回収した。pBluescrip
tＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
お よびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動
によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を
回収した。
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより３．０ｋｂの断片を回収した。pBluescrip
tＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
お よびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動
によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を
回収した。
【０２０７】該３．０ｋｂの両断片をライゲーションキ
ットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連
結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に
従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培
養した。生育してきた形質転換体のコロニーより常法に
従ってプラスミドを抽出し、ｍａｎＣおよびｍａｎＢを
含むプラスミドであるｐＮＫ６を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図１１）。
ットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連
結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に
従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培
養した。生育してきた形質転換体のコロニーより常法に
従ってプラスミドを抽出し、ｍａｎＣおよびｍａｎＢを
含むプラスミドであるｐＮＫ６を得た。該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認した（図１１）。
【０２０８】該ｐＮＫ６ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素
ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し３．０ｋｂの断片を回収
した実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ
０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し
同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離し３．０ｋｂの断片を回収
した実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ
０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し
同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０２０９】該３．０ｋｂの断片および５．５ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体
のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｍａ
ｎＣおよびｍａｎＢ発現プラスミドであるｐＮＫ７を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図１１）。 ２）ｐｇｍ、ｐｆｋＢ同時発現プラスミドの造成 実施例７で取得したｐＮＴ２４ ＤＮＡ ０．５μｇを制
限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーン
ＩＩキットにより３．０ｋｂの断片を回収した。一方、
ｐＳＴＶ２８ＤＮＡ（宝酒造社製）０．２μｇを制限酵
素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂ
の断片を回収した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体
のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｍａ
ｎＣおよびｍａｎＢ発現プラスミドであるｐＮＫ７を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図１１）。 ２）ｐｇｍ、ｐｆｋＢ同時発現プラスミドの造成 実施例７で取得したｐＮＴ２４ ＤＮＡ ０．５μｇを制
限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロース
ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーン
ＩＩキットにより３．０ｋｂの断片を回収した。一方、
ｐＳＴＶ２８ＤＮＡ（宝酒造社製）０．２μｇを制限酵
素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂ
の断片を回収した。
【０２１０】該３．０ｋｂの両断片をライゲーションキ
ットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連
結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に
従って形質転換し、該形質転換体をクロラムフェニコー
ル１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃
で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーよ
り常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍ遺伝子を有
するプラスミドであるｐＮＴ５３を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１２）。
ットを用いて１６℃で１６時間連結反応を行った。該連
結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に
従って形質転換し、該形質転換体をクロラムフェニコー
ル１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃
で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーよ
り常法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍ遺伝子を有
するプラスミドであるｐＮＴ５３を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１２）。
【０２１１】配列番号１９記載のセンス鎖ＤＮＡプライ
マーを合成し、該センス鎖ＤＮＡプライマーおよび配列
番号１６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを用
い、実施例７で取得したプラスミドｐＮＴ４７ ＤＮＡ
を鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。ＰＣ
Ｒ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得
した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液5
μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌ
ＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断
片を分離し、同様に１．３ｋｂの断片を回収した。ｐＮ
Ｔ５３ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＳｍａＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に６．０ｋｂの断片を回収した。
マーを合成し、該センス鎖ＤＮＡプライマーおよび配列
番号１６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを用
い、実施例７で取得したプラスミドｐＮＴ４７ ＤＮＡ
を鋳型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。ＰＣ
Ｒ終了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得
した。該沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液5
μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌ
ＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断
片を分離し、同様に１．３ｋｂの断片を回収した。ｐＮ
Ｔ５３ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＳｍａＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離し、同様に６．０ｋｂの断片を回収した。
【０２１２】該１．３ｋｂの断片および６．０ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天
培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天
培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
【０２１３】生育してきた形質転換体のコロニーより常
法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍおよびｐｆｋＢ
発現プラスミドであるｐＮＴ５５を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１２）。
法に従ってプラスミドを抽出し、ｐｇｍおよびｐｆｋＢ
発現プラスミドであるｐＮＴ５５を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１２）。
【０２１４】実施例１４ ＧＤＰ−Ｍａｎの生産
１）ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐｇｍ、ｐｆｋＢ発現株の造
成 実施例１３−２）で得たｐＮＴ５５ ＤＮＡを用いてエ
シェリヒア・コリNM522/pNK7株を常法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび
クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体を選択することにより、ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐ
ｇｍ、ｐｆｋＢ発現株であるエシェリヒア・コリNM522/
pNK7/pNT55株を得た。 ２）ＧＤＰ−Ｍａｎの生産 上記１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株
および実施例７で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT46
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存す
ることが可能で、使用前に解凍して用いることができ
る。
成 実施例１３−２）で得たｐＮＴ５５ ＤＮＡを用いてエ
シェリヒア・コリNM522/pNK7株を常法に従って形質転換
し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌおよび
クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体を選択することにより、ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｐ
ｇｍ、ｐｆｋＢ発現株であるエシェリヒア・コリNM522/
pNK7/pNT55株を得た。 ２）ＧＤＰ−Ｍａｎの生産 上記１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株
および実施例７で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT46
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存す
ることが可能で、使用前に解凍して用いることができ
る。
【０２１５】エシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株湿
菌体２５ｇ／ｌ、NM522/pNT46株湿菌体２５ｇ／ｌ、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌
体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ６０ｇ／ｌ、マンノー
ス ５０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１５ｇ／ｌ、 ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ＧＭＰ（２
Ｎａ，７Ｈ2Ｏ塩） ６０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、２４時間反応を行った。
菌体２５ｇ／ｌ、NM522/pNT46株湿菌体２５ｇ／ｌ、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌
体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ６０ｇ／ｌ、マンノー
ス ５０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１５ｇ／ｌ、 ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ＧＭＰ（２
Ｎａ，７Ｈ2Ｏ塩） ６０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、２４時間反応を行った。
【０２１６】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に１４．６ｇ／ｌのＧ
ＤＰ−Ｍａｎ（２Ｎａ，１Ｈ2Ｏ塩）が生成した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に１４．６ｇ／ｌのＧ
ＤＰ−Ｍａｎ（２Ｎａ，１Ｈ2Ｏ塩）が生成した。
【０２１７】実施例１５ ｇｍｄ、ｗｃａＧ発現プラス
ミドの造成 配列番号２０記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号２１記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件
でＰＣＲを行った。
ミドの造成 配列番号２０記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号２１記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシェリヒア・コ
リW3110株染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一の条件
でＰＣＲを行った。
【０２１８】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーンＩＩキッ
トにより２．３ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）
で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．９ｋｂ
の断片を回収した。
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりＤＮＡ断片を分離しジーンクリーンＩＩキッ
トにより２．３ｋｂの断片を回収した。実施例１−１）
で取得したｐＰＡ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．９ｋｂ
の断片を回収した。
【０２１９】該２．３ｋｂおよび３．９ｋｂの断片をラ
イゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間連結反
応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリ
NM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
イゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間連結反
応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリ
NM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
【０２２０】生育してきた形質転換体のコロニーより常
法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｍｄおよびｗｃａＧ
を含むプラスミドであるｐＮＫ８を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１３）。
法に従ってプラスミドを抽出し、ｇｍｄおよびｗｃａＧ
を含むプラスミドであるｐＮＫ８を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１３）。
【０２２１】実施例１６ ＧＤＰ−Ｆｕｃの生産
実施例１４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55
株、実施例１５で得たNM522/pNK8株および実施例７で得
たNM522/pNT46を実施例２と同様の方法で培養し得られ
た各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を
実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心
分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２
０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができる。
株、実施例１５で得たNM522/pNK8株および実施例７で得
たNM522/pNT46を実施例２と同様の方法で培養し得られ
た各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を
実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心
分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２
０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができる。
【０２２２】エシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株湿
菌体 ２５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNK8株湿
菌体 ２５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT46株湿
菌体２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネ
スATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ４
０ｇ／ｌ、マンノース ６０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 1５ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ
／ｌ、ＧＭＰ（２Ｎａ/７Ｈ2Ｏ塩） ６０ｇ／ｌ、ナイ
ミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの
組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに
入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪
拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行っ
た。
菌体 ２５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNK8株湿
菌体 ２５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT46株湿
菌体２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネ
スATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、フルクトース ４
０ｇ／ｌ、マンノース ６０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 1５ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ
／ｌ、ＧＭＰ（２Ｎａ/７Ｈ2Ｏ塩） ６０ｇ／ｌ、ナイ
ミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの
組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに
入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて攪
拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行っ
た。
【０２２３】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に１．０ｇ／ｌのＧＤ
Ｐ−Ｆｕｃ（２．５Ｎａ，１Ｈ 2Ｏ塩）が生成した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に１．０ｇ／ｌのＧＤ
Ｐ−Ｆｕｃ（２．５Ｎａ，１Ｈ 2Ｏ塩）が生成した。
【０２２４】実施例１７ ｎｅｕＡ発現プラスミドの造
成 エシェリヒア・コリK235株（ATCC13027）染色体ＤＮＡ
を実施例１と同様の方法で調製した。
成 エシェリヒア・コリK235株（ATCC13027）染色体ＤＮＡ
を実施例１と同様の方法で調製した。
【０２２５】配列番号２２記載のセンス鎖ＤＮＡプライ
マーと配列番号２３記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライ
マーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシ
ェリヒア・コリK235株（ATCC13027）染色体ＤＮＡを鋳
型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ終
了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得し
た。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液５μ
ｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片
を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．３ｋｂ
の断片を回収した。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２
μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同
様に３．０ｋｂの断片を回収した。
マーと配列番号２３記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライ
マーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、エシ
ェリヒア・コリK235株（ATCC13027）染色体ＤＮＡを鋳
型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ終
了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得し
た。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液５μ
ｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片
を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．３ｋｂ
の断片を回収した。pBluescriptＩＩSK+ ＤＮＡ ０．２
μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同
様に３．０ｋｂの断片を回収した。
【０２２６】該１．３ｋｂおよび３．０ｋｂの断片をラ
イゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応
を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM
522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｎｅｕＡ遺
伝子を含むプラスミドであるｐＴＡ１２を得た。該プラ
スミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１
４）。
イゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連結反応
を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM
522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｎｅｕＡ遺
伝子を含むプラスミドであるｐＴＡ１２を得た。該プラ
スミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１
４）。
【０２２７】該ｐＴＡ１２ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵
素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．３ｋｂ
の断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ
３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａ
ｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ
断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．３ｋｂ
の断片を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ
３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａ
ｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ
断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０２２８】該１．３ｋｂの断片および５．５ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。
【０２２９】生育してきた形質転換体のコロニーより常
法に従ってプラスミドを抽出し、ｎｅｕＡ発現プラスミ
ドであるｐＴＡ１４を得た。該プラスミドの構造を制限
酵素消化により確認した（図１４）。
法に従ってプラスミドを抽出し、ｎｅｕＡ発現プラスミ
ドであるｐＴＡ１４を得た。該プラスミドの構造を制限
酵素消化により確認した（図１４）。
【０２３０】実施例１８ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生産
実施例１７で得たエシェリヒア・コリNM522/pTA14株、C
600/pNAL1株［Appl. Environ. Micribiol., 51 562 (19
86)］およびJF646/pMW5株［J. Biol. Chem., 261, 5568
(1986)］を実施例２と同様の方法で培養し、得られた
各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分
離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０
℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いるこ
とができる。
600/pNAL1株［Appl. Environ. Micribiol., 51 562 (19
86)］およびJF646/pMW5株［J. Biol. Chem., 261, 5568
(1986)］を実施例２と同様の方法で培養し、得られた
各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分
離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０
℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いるこ
とができる。
【０２３１】エシェリヒア・コリNM522/pTA14株湿菌体
５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリC600/pNAL1株湿菌体
１５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリJF646/pMW5株湿菌体
２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム
塩） １０ｇ／ｌ、ピルビン酸（Ｎａ塩） ２０ｇ／ｌ、
フルクトース ４０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサミン
１０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２
１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる
反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反
応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒ
ｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。
５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリC600/pNAL1株湿菌体
１５ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリJF646/pMW5株湿菌体
２５ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム
塩） １０ｇ／ｌ、ピルビン酸（Ｎａ塩） ２０ｇ／ｌ、
フルクトース ４０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサミン
１０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２
１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる
反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反
応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒ
ｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を行った。
【０２３２】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に２．７ｇ／ｌのＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃ（Ｎａ塩）が生成した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に２．７ｇ／ｌのＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃ（Ｎａ塩）が生成した。
【０２３３】実施例１９ ラクト−Ｎ−テトラオースの
生産 １）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの調製 プロテインＡのＩｇＧ結合領域とβ1,3-ガラクトシルト
ランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードしている遺伝
子を含むプラスミドpAMoERSAW1（特開平6-181759）で形
質転換したナマルバＫＪＭ−１株をＧ４１８（ギブコ社
製）を０．５ｍｇ／ｍｌ含むＲＰＭＩ６４０・ＩＴＰＳ
ＧＦ培地３０ｍｌに５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌになる
ように懸濁し、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で８
日間培養した。
生産 １）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの調製 プロテインＡのＩｇＧ結合領域とβ1,3-ガラクトシルト
ランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードしている遺伝
子を含むプラスミドpAMoERSAW1（特開平6-181759）で形
質転換したナマルバＫＪＭ−１株をＧ４１８（ギブコ社
製）を０．５ｍｇ／ｍｌ含むＲＰＭＩ６４０・ＩＴＰＳ
ＧＦ培地３０ｍｌに５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌになる
ように懸濁し、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で８
日間培養した。
【０２３４】該培養液から遠心分離により細胞を除き上
清を回収した。該上清は、必要に応じて−８０℃で保存
可能であり、使用前に解凍して使用することができる。
該プロテインＡのＩｇＧ結合領域とβ1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼとの融合蛋白質が生成された培養上
清にアジ化ナトリウムを最終濃度０．１％になるように
添加した後、製品説明書に従って前処理したＩｇＧセフ
ァロース（ファルマシア社製）を５０μｌ添加し、４℃
で一晩緩やかに攪拌した。
清を回収した。該上清は、必要に応じて−８０℃で保存
可能であり、使用前に解凍して使用することができる。
該プロテインＡのＩｇＧ結合領域とβ1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼとの融合蛋白質が生成された培養上
清にアジ化ナトリウムを最終濃度０．１％になるように
添加した後、製品説明書に従って前処理したＩｇＧセフ
ァロース（ファルマシア社製）を５０μｌ添加し、４℃
で一晩緩やかに攪拌した。
【０２３５】攪拌後、遠心分離によりβ1,3-ガラクトシ
ルトランスフェラーゼの結合したＩｇＧセファロースを
回収し、ＲＰＭＩ６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地１ｍｌで３
回洗浄後、該ＩｇＧセファロースをβ1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼの酵素源として用いた。 ２）ラクト−Ｎ−テトラオースの生産 ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・グ
ライコシステムズ社製）を公知の方法により［Agric. B
iol. Chem., 54, 2169 (1990)］に従って２−アミノピ
リジンにより蛍光標識した後、０．１Ｕのβ−ガラクト
シダーゼ（生化学工業社製）を加えて３７℃で１６時間
反応させ、非還元末端のガラクトースを除去した。
ルトランスフェラーゼの結合したＩｇＧセファロースを
回収し、ＲＰＭＩ６４０・ＩＴＰＳＧＦ培地１ｍｌで３
回洗浄後、該ＩｇＧセファロースをβ1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼの酵素源として用いた。 ２）ラクト−Ｎ−テトラオースの生産 ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・グ
ライコシステムズ社製）を公知の方法により［Agric. B
iol. Chem., 54, 2169 (1990)］に従って２−アミノピ
リジンにより蛍光標識した後、０．１Ｕのβ−ガラクト
シダーゼ（生化学工業社製）を加えて３７℃で１６時間
反応させ、非還元末端のガラクトースを除去した。
【０２３６】該反応液を、５分間、１００℃で加熱し、
β−ガラクトシダーゼを失活させた。該反応により得ら
れたＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを複合糖質前
駆体として用いた。該複合糖質前駆物質 ０．５ｍＭ、
上記１）で取得したＩｇＧセファロース結合β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ ０．５Ｕ、実施例４で取
得したＵＤＰ−Ｇａｌを含む反応液６μｌ（５ｍＭ）、
１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９） １０ｍＭ
ＭｎＣｌ2、２ｍＭ β−メルカプトエタノールの組成
からなる反応液３６μｌを、３２℃で６５時間放置し、
反応を行った。
β−ガラクトシダーゼを失活させた。該反応により得ら
れたＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを複合糖質前
駆体として用いた。該複合糖質前駆物質 ０．５ｍＭ、
上記１）で取得したＩｇＧセファロース結合β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ ０．５Ｕ、実施例４で取
得したＵＤＰ−Ｇａｌを含む反応液６μｌ（５ｍＭ）、
１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９） １０ｍＭ
ＭｎＣｌ2、２ｍＭ β−メルカプトエタノールの組成
からなる反応液３６μｌを、３２℃で６５時間放置し、
反応を行った。
【０２３７】反応終了後、該反応液に蓄積された生成物
を下記条件でＨＰＬＣを用いて定量した。 カラム：TSKgel ODS-80TMカラム(4.6mm x 30cm、TOSOH
社製) 液相 ：０．０２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．
０） 温度 ：５０℃ 流速 ：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出 ：蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４
００ｎｍ） 生成物の同定はアミノピリジンで標識したラクト−Ｎ−
テトラオースと標識された生成物の溶出時間を比較する
ことにより行った。該反応により０．１７ｍＭ（０．１
２ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−テトラオースが生成した。
を下記条件でＨＰＬＣを用いて定量した。 カラム：TSKgel ODS-80TMカラム(4.6mm x 30cm、TOSOH
社製) 液相 ：０．０２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．
０） 温度 ：５０℃ 流速 ：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出 ：蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４
００ｎｍ） 生成物の同定はアミノピリジンで標識したラクト−Ｎ−
テトラオースと標識された生成物の溶出時間を比較する
ことにより行った。該反応により０．１７ｍＭ（０．１
２ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−テトラオースが生成した。
【０２３８】実施例２０ ラクト−Ｎ−ネオテトラオー
スの生産 実施例１９と同様な方法で、ラクト−Ｎ−ネオテトラオ
ースからＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを調製
し、複合糖質前駆体として用いた。
スの生産 実施例１９と同様な方法で、ラクト−Ｎ−ネオテトラオ
ースからＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃを調製
し、複合糖質前駆体として用いた。
【０２３９】該複合糖質前駆体０．５ｍＭ、β1,4-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ（シグマ社製）０．５Ｕ、
実施例４で取得したＵＤＰ−Ｇａｌを含む反応液６μｌ
（５ｍＭ）、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
９）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、２ｍＭ β-メルカプトエタ
ノールの組成からなる反応液３６μｌを、３２℃で６５
時間放置し、反応を行った。
クトシルトランスフェラーゼ（シグマ社製）０．５Ｕ、
実施例４で取得したＵＤＰ−Ｇａｌを含む反応液６μｌ
（５ｍＭ）、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
９）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、２ｍＭ β-メルカプトエタ
ノールの組成からなる反応液３６μｌを、３２℃で６５
時間放置し、反応を行った。
【０２４０】反応終了後、該反応液に蓄積された生成物
を、実施例１９−２）と同様の条件で、ＨＰＬＣを用い
て定量した。なお、生成物の同定はアミノピリジンで標
識したラクト−Ｎ−ネオテトラオースと生成物の溶出時
間を比較することにより行った。該反応により、０．１
５ｍＭ（０．１１ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−ネオテトラオ
ースが生成した。
を、実施例１９−２）と同様の条件で、ＨＰＬＣを用い
て定量した。なお、生成物の同定はアミノピリジンで標
識したラクト−Ｎ−ネオテトラオースと生成物の溶出時
間を比較することにより行った。該反応により、０．１
５ｍＭ（０．１１ｇ／ｌ）のラクト−Ｎ−ネオテトラオ
ースが生成した。
【０２４１】実施例２１ ラクト−Ｎ−フコペンタオー
スＩＩＩの生産 α1,3-フコシルトランスフェラーゼの結合したＩｇＧセ
ファロースはプロテインＡのＩｇＧ結合領域とα1,3-フ
コシルトランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードして
いる遺伝子を含むプラスミドpAMoA-FT6［J. Biol. Che
m., 269, 14730(1994)］で形質転換したナマルバＫＪＭ
−１株から実施例１９−１）と同様な方法で調製し、α
1,3-フコシルトランスフェラーゼの酵素源として用い
た。
スＩＩＩの生産 α1,3-フコシルトランスフェラーゼの結合したＩｇＧセ
ファロースはプロテインＡのＩｇＧ結合領域とα1,3-フ
コシルトランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードして
いる遺伝子を含むプラスミドpAMoA-FT6［J. Biol. Che
m., 269, 14730(1994)］で形質転換したナマルバＫＪＭ
−１株から実施例１９−１）と同様な方法で調製し、α
1,3-フコシルトランスフェラーゼの酵素源として用い
た。
【０２４２】ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックス
フォード・グライコシステムズ社製）０．２５ｍＭ、Ｉ
ｇＧセファロース結合α1,3-フコシルトランスフェラー
ゼ１．０Ｕ、実施例１６で取得したＧＤＰ−Ｆｕｃを含
む反応液６μｌ（０．２５ｍＭ）、１００ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2の組成
からなる反応液５０μｌを、３７℃で２４時間放置し、
反応を行った。
フォード・グライコシステムズ社製）０．２５ｍＭ、Ｉ
ｇＧセファロース結合α1,3-フコシルトランスフェラー
ゼ１．０Ｕ、実施例１６で取得したＧＤＰ−Ｆｕｃを含
む反応液６μｌ（０．２５ｍＭ）、１００ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2の組成
からなる反応液５０μｌを、３７℃で２４時間放置し、
反応を行った。
【０２４３】反応終了後、該反応液に蓄積された生成物
をダイオネックス社製の糖分析装置（ＤＸ−５００）に
て定量した。なお、生成物の同定はラクト−Ｎ−フコペ
ンタオースＩＩＩ（オックスフォード・グライコシステ
ムズ社製）と生成物の溶出時間を比較することにより行
った。該反応により、０．２１ｍＭ（０．１８ｇ／ｌ）
のラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩが生成した。
をダイオネックス社製の糖分析装置（ＤＸ−５００）に
て定量した。なお、生成物の同定はラクト−Ｎ−フコペ
ンタオースＩＩＩ（オックスフォード・グライコシステ
ムズ社製）と生成物の溶出時間を比較することにより行
った。該反応により、０．２１ｍＭ（０．１８ｇ／ｌ）
のラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩが生成した。
【０２４４】実施例２２ α1,-4ガラクトシルトランス
フェラーゼ（ｌｇｔＣ）発現プラスミドの造成Neisseria gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを
実施例１と同一の方法で調製した。
フェラーゼ（ｌｇｔＣ）発現プラスミドの造成Neisseria gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを
実施例１と同一の方法で調製した。
【０２４５】配列番号２４記載のセンス鎖ＤＮＡプライ
マーと、配列番号２５記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプラ
イマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、Ne
isseria gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを鋳
型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ終
了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得し
た。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌ
を用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ
ＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断
片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋ
ｂの断片を回収した。実施例１―１）で取得したｐＰＡ
３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により
ＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂの断片を回収し
た。
マーと、配列番号２５記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプラ
イマーを合成した。該合成ＤＮＡをプライマーとし、Ne
isseria gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを鋳
型として前述と同一の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ終
了後、エタノール沈殿法によりＤＮＡの沈殿を取得し
た。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解した。該溶解液5μｌ
を用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ
ＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断
片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋ
ｂの断片を回収した。実施例１―１）で取得したｐＰＡ
３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により
ＤＮＡ断片を分離し、同様に４．２ｋｂの断片を回収し
た。
【０２４６】該１．０ｋｂの断片および４．２ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体
のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＣ発現プラスミドであるｐＧＴ３を得た。該プラスミ
ドの構造を制限酵素消化により確認した（図１５）。
片をライゲーションキットを用いて１６℃で１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体
のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＣ発現プラスミドであるｐＧＴ３を得た。該プラスミ
ドの構造を制限酵素消化により確認した（図１５）。
【０２４７】実施例２３ グロボトリオースの生産
実施例４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32
株、実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存す
ることが可能で、使用前に解凍して用いることができ
る。
株、実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存す
ることが可能で、使用前に解凍して用いることができ
る。
【０２４８】エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ ／ｌ、フルクトー
ス １００ｇ／ｌ、ガラクトース１００ｇ／ｌ、ラクト
ース １００ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット
酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で３６時間反応を行った。
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ ／ｌ、フルクトー
ス １００ｇ／ｌ、ガラクトース１００ｇ／ｌ、ラクト
ース １００ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、オロット
酸（カリウム塩） １０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で３６時間反応を行った。
【０２４９】反応中は４Ｎ ＮａＯＨを用いて該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてガラクトース、
ラクトース、フルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該
反応により、反応液中に１８８ｇ／ｌのグロボトリオー
スが生成した。該反応液から遠心分離により菌体を除去
し、得られた上清１０ｍｌから、活性炭を用いる方法に
より精製を行い、グロボトリオースの白色粉末１．５ｇ
を得た。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてガラクトース、
ラクトース、フルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該
反応により、反応液中に１８８ｇ／ｌのグロボトリオー
スが生成した。該反応液から遠心分離により菌体を除去
し、得られた上清１０ｍｌから、活性炭を用いる方法に
より精製を行い、グロボトリオースの白色粉末１．５ｇ
を得た。
【０２５０】実施例２４． Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4Ｇ
ｌｃＮＡｃの生産 実施例４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32
株、実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存す
ることが可能で、使用前に解凍して用いることができ
る。
ｌｃＮＡｃの生産 実施例４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32
株、実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存す
ることが可能で、使用前に解凍して用いることができ
る。
【０２５１】エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ ／ｌ、フルクトー
ス ５０ｇ／ｌ、ガラクトース ５０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチ
ルラクトサミン ９６ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、
オロット酸（カリウム塩）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−
２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からな
る反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この
反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００
ｒｐｍ）し、３２℃で２３時間反応を行った。反応中は
４Ｎ ＮａＯＨを用いて該反応液のｐＨを７．２に維持
し、必要に応じてガラクトース、フルクトース、ＫＨ2
ＰＯ4を添加した。
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株
湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスATCC21170株湿菌体 １５０ｇ ／ｌ、フルクトー
ス ５０ｇ／ｌ、ガラクトース ５０ｇ／ｌ、Ｎ−アセチ
ルラクトサミン ９６ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、
オロット酸（カリウム塩）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−
２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からな
る反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この
反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００
ｒｐｍ）し、３２℃で２３時間反応を行った。反応中は
４Ｎ ＮａＯＨを用いて該反応液のｐＨを７．２に維持
し、必要に応じてガラクトース、フルクトース、ＫＨ2
ＰＯ4を添加した。
【０２５２】該反応により、反応液中に１０ｇ／ｌのＧ
ａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃが生成した。該反応
液から遠心分離により菌体を除去し、得られた上清３０
ｍｌから、活性炭を用いる方法により生成物を精製し、
Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃの白色粉末０．２
ｇを得た。
ａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃが生成した。該反応
液から遠心分離により菌体を除去し、得られた上清３０
ｍｌから、活性炭を用いる方法により生成物を精製し、
Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃの白色粉末０．２
ｇを得た。
【０２５３】実施例２５ β1,4-ガラクトシルトランス
フェラーゼ（ｌｇｔＢ）発現プラスミドの造成 配列番号２６記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号２７記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、N. gonorrhoeae
（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一
の条件でＰＣＲを行った。
フェラーゼ（ｌｇｔＢ）発現プラスミドの造成 配列番号２６記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと配列番
号２７記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーを合成し
た。該合成ＤＮＡをプライマーとし、N. gonorrhoeae
（ATCC33084株）染色体ＤＮＡを鋳型として前述と同一
の条件でＰＣＲを行った。
【０２５４】ＰＣＲ終了後、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより０．８ｋｂの断片を回収した。pBluescrip
tII SK+ ＤＮＡ ０．2μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収
した。
ＮＡの沈殿を取得した。該沈殿を２０μlのＴＥに溶解
した。該溶解液5μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ
キットにより０．８ｋｂの断片を回収した。pBluescrip
tII SK+ ＤＮＡ ０．2μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収
した。
【０２５５】該０．８ｋｂおよび３．０ｋｂの断片をラ
イゲーションキットを用いて１６℃、１６時間連結反応
を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM
522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＢ遺
伝子を含むプラスミドであるｐＮＴ６０Ｐを得た。該プ
ラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１
６）。
イゲーションキットを用いて１６℃、１６時間連結反応
を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM
522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体をアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、
３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロ
ニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＢ遺
伝子を含むプラスミドであるｐＮＴ６０Ｐを得た。該プ
ラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１
６）。
【０２５６】該ｐＮＴ６０Ｐ ＤＮＡ ０．５μｇを制限
酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し０．８ｋｂの断片
を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１
ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片
を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し０．８ｋｂの断片
を回収した。実施例１−１）で取得したｐＰＡＣ３１
ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨ
Ｉで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片
を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
【０２５７】該０．８ｋｂの断片および５．５ｋｂの断
片をライゲーションキットを用いて１６℃、１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体
のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＢ発現プラスミドであるｐＮＴ６０を得た。該プラス
ミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１６）。
片をライゲーションキットを用いて１６℃、１６時間連
結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・
コリNM522株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体
のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇ
ｔＢ発現プラスミドであるｐＮＴ６０を得た。該プラス
ミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１６）。
【０２５８】実施例２６ Ｎ−アセチルラクトサミンの
生産 実施例２５で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
生産 実施例２５で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
【０２５９】エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体
５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体
５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム
塩） １０ｇ／ｌ、フルクトース １００ｇ／ｌ、Ｎ−ア
セチルグルコサミン １００ｇ／ｌ、ガラクトース１０
０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２
１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる
反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反
応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒ
ｐｍ）し、３２℃で３４時間反応を行った。
５０ｇ／ｌ、エシェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体
５０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株湿菌体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム
塩） １０ｇ／ｌ、フルクトース １００ｇ／ｌ、Ｎ−ア
セチルグルコサミン １００ｇ／ｌ、ガラクトース１０
０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２
１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる
反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反
応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒ
ｐｍ）し、３２℃で３４時間反応を行った。
【０２６０】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてガラクトース、
フルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、
反応液中に１１４ｇ／ｌのＮ−アセチルラクトサミンが
生成した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてガラクトース、
フルクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。該反応により、
反応液中に１１４ｇ／ｌのＮ−アセチルラクトサミンが
生成した。
【０２６１】実施例２７ ラクトースの生産
実施例２５で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。エ
シェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エ
シェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌
体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／
ｌ、グルコース １１５ｇ／ｌ、ガラクトース １１５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５
ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で１５時間反応を行った。
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。エ
シェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エ
シェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌
体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／
ｌ、グルコース １１５ｇ／ｌ、ガラクトース １１５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５
ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で１５時間反応を行った。
【０２６２】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に４９ｇ／ｌのラクト
ースが生成した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に４９ｇ／ｌのラクト
ースが生成した。
【０２６３】実施例２８ グロボトリオースの生産
実施例２５で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株およ
び実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。エ
シェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エ
シェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エ
シェリヒア・コリNM522/pGT3株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌
体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／
ｌ、グルコース １１５ｇ／ｌ、ガラクトース １１５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５
ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で１３時間反応を行った。
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株およ
び実施例２２で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができる。エ
シェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エ
シェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、エ
シェリヒア・コリNM522/pGT3株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌
体 １５０ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩） １０ｇ／
ｌ、グルコース １１５ｇ／ｌ、ガラクトース １１５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５
ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５
４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの組成からなる反応
液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、この反応液
をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐ
ｍ）し、３２℃で１３時間反応を行った。
【０２６４】反応中４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に５ｇ／ｌのグロボト
リオースが生成した。
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてＫＨ2ＰＯ4を添
加した。該反応により、反応液中に５ｇ／ｌのグロボト
リオースが生成した。
【０２６５】
【発明の効果】本発明により、ヌクレオチドの前駆物質
および糖のみを原料にして糖ヌクレオチドを、該糖ヌク
レオチドおよび複合糖質前駆物質から複合糖質を工業的
に効率よく製造できる。
および糖のみを原料にして糖ヌクレオチドを、該糖ヌク
レオチドおよび複合糖質前駆物質から複合糖質を工業的
に効率よく製造できる。
【０２６６】
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０２６７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
<120> Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrate
s.
<130> H14-189
<140>
<141>
<160> 27
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 1
ggagaaagct tatggctgcc attaatacga a 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 2
aacacggatc cggatgttac ttcttaatgc 30
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 3
atggaggatc ctgctctgta taccgtct 28
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 4
tgctggtcga cctgcgcttg 20
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 5
aaggaaagct tatgacgcaa tttaatcccg t 31
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 6
gcaaagttaa cagtcggtac 20
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 7
tcaggaagct tatgttgaat aatgctatga g 31
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 8
tctccggatc ccatgtgacc gggttag 27
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 9
tctaaatcga tgcagacaaa ggacaaag 28
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 10
ttgcaggatc ctcgtaggcc tgataag 27
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 11
tgatatccgc tccctttccg 20
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 12
acagcggatc cgatgtgttc gctgag 26
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 13
acagcaagct tttgacttta gcggagcag 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 14
gagttggatc ccgatataaa aggaaggat 29
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 15
tttttaagct tcatttatca agagt 25
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 16
tttttgatat ccccaatgct gggggttttt g 31
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 17
cgtcaaagct taaatgatat tcggggataa t 31
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 18
agggaggatc cgacattact cgttc 25
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 19
ccgcaagatc tcgtaaaaag ggtatcgata agc 33
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 20
ttgggaagct tccggcaaat gtggttt 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 21
ataaactcga gagagacaag cggag 25
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
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tattatcgat gaattaataa ttcatag 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
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ctctggatcc agttacgtat aatat 25
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
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cggcaagctt attgtgcctt tccaataaaa 30
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 25
acttggatcc ccgtcaataa atcttgcg 28
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
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ggtaaagctt atgcaaaacc acgttatcag 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 27
aaacggatcc ttattggaaa ggcacaata 29
【図１】 図１は発現プラスミドｐＰＡ３１およびｐＰ
ＡＣ３１の造成工程を示す。
ＡＣ３１の造成工程を示す。
【図２】 図２はｇａｌＵ、ｐｐａ遺伝子発現プラスミ
ドｐＮＴ１２およびｐＮＴ３２の造成工程を示す
ドｐＮＴ１２およびｐＮＴ３２の造成工程を示す
【図３】 図３はｇａｌＴ、ｇａｌＫ遺伝子発現プラス
ミドｐＮＴ２５の造成工程を示す。
ミドｐＮＴ２５の造成工程を示す。
【図４】 図４はｇａｌＴ、ｇａｌＫ遺伝子をコリネバ
クテリウム・アンモニアゲネスで発現するプラスミドｐ
ＴＫ７の造成工程を示す。
クテリウム・アンモニアゲネスで発現するプラスミドｐ
ＴＫ７の造成工程を示す。
【図５】 図５はｇｌｍＵ、ｐｐａ遺伝子発現プラスミ
ドｐＮＴ１４の造成工程を示す。
ドｐＮＴ１４の造成工程を示す。
【図６】 図６はｐｇｍ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ２
４の造成工程を示す。
４の造成工程を示す。
【図７】 図７はｇｌｍＭ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ
４４の造成工程を示す。
４４の造成工程を示す。
【図８】 図８はｇｌｋ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ４
６の造成工程を示す。
６の造成工程を示す。
【図９】 図９はｐｆｋＢ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ
４７の造成工程を示す。
４７の造成工程を示す。
【図１０】 図１０はｇａｌＫ遺伝子発現プラスミドｐ
ＮＴ５４の造成工程を示す。
ＮＴ５４の造成工程を示す。
【図１１】 図１１はｍａｎＢ、ｍａｎＣ遺伝子発現プ
ラスミドｐＮＫ７の造成工程を示す。
ラスミドｐＮＫ７の造成工程を示す。
【図１２】 図１２はｐｇｍ、ｐｆｋＢ遺伝子発現プラ
スミドｐＮＴ５５の造成工程を示す。
スミドｐＮＴ５５の造成工程を示す。
【図１３】 図１３はｇｍｄ、ｗｃａＧ遺伝子発現プラ
スミドｐＮＫ８の造成工程を示す。
スミドｐＮＫ８の造成工程を示す。
【図１４】 第１４図はｎｅｕＡ遺伝子発現プラスミド
ｐＴＡ１４の造成工程を示す。
ｐＴＡ１４の造成工程を示す。
【図１５】 図１５はｌｇｔＣ遺伝子発現プラスミドｐ
ＧＴ３の造成工程を示す。
ＧＴ３の造成工程を示す。
【図１６】 図１６はｌｇｔＢ遺伝子発現プラスミドｐ
ＮＴ６０の造成工程を示す。
ＮＴ６０の造成工程を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 尾崎 明夫
東京都町田市中町３−９−13
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA01 DA06 DA10
DA12 EA04 GA11 HA08
4B064 AF11 AF22 CA02 CA06 CA10
CA19 CB27 CB30 CC10 CC24
CD09 CD12 CE03 DA01 DA13
DA20
Claims (70)
- 【請求項１】 ａ）ヌクレオチドの前駆物質からヌクレ
オシド−５’−三リン酸（以下、ＮＴＰと略す）を生産
する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理
物、ｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力
を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、およ
びｃ）糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質
を生産する能力を有する微生物、動物細胞あるいは昆虫
細胞の培養液または該培養液の処理物、を酵素源として
用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質、糖およ
び複合糖質前駆物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性
媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中から複
合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法。 - 【請求項２】 糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から
複合糖質を生産する能力を有する微生物、動物細胞ある
いは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物を酵素源
として用い、該酵素源、複合糖質前駆物質および下記
［１］の製造法により得られた糖ヌクレオチドを水性媒
体中に存在せしめ、該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積
させ、該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴
とする複合糖質の製造法。 ［１］ａ）ヌクレオチドの前駆物質からヌクレオシド−
５’−三リン酸（以下、ＮＴＰと略す）を生産する能力
を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、およ
びｂ）糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産する能力を
有する微生物の培養液または該培養液の処理物、を酵素
源として用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質
および糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に糖
ヌクレオチドを生成蓄積させ、該水性媒体中から糖ヌク
レオチドを採取することを特徴とする糖ヌクレオチドの
製造法。 - 【請求項３】 培養液の処理物が、培養液の濃縮物、培
養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培養上
清、該培養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵素標
品、培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の乾燥
物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、
該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該
細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白
質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出し
て得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１
または２記載の製造法。 - 【請求項４】 ヌクレオチドの前駆物質が、オロット
酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチ
ジン、アデニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、
ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン、キサントシ
ン、イノシン−５’−一リン酸、キサントシン−５’−
一リン酸、グアノシン−５’−一リン酸、ウリジン−
５’−一リン酸またはシチジン−５’−一リン酸である
請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項５】 糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸化
合物、グアノシン二リン酸化合物またはシチジン一リン
酸化合物である、請求項１または２記載の製造法 - 【請求項６】 ウリジン二リン酸化合物、グアノシン二
リン酸化合物およびシチジン一リン酸化合物が、ウリジ
ン二リン酸グルコース、ウリジン二リン酸ガラクトー
ス、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウ
リジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ウリジ
ン二リン酸グルクロン酸、グアノシン二リン酸マンノー
ス、グアノシン二リン酸フコース、シチジン一リン酸−
Ｎ−アセチルノイラミン酸およびこれらの誘導体から選
ばれる化合物である、請求項５記載の製造法。 - 【請求項７】 糖が、グルコース、フルクトース、ガラ
クトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、
Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、
Ｎ−アセチルマンノサミン、アセチルノイラミン酸およ
びこれらの誘導体から選ばれる糖である、請求項１また
は２記載の製造法。 - 【請求項８】 複合糖質が、グルコース、ガラクトー
ス、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクト
サミン、グルクロン酸、マンノース、Ｎ−アセチルマン
ノサミン、フコース、シアル酸、ラクトース、Ｎ−アセ
チルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ＧｌｃＮＡ
cβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌβ
1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4Ｇａｌβ1-
4ＧｌｃＮＡｃ、2'-フコシルラクトース、3-フコシルラ
クトース、3'-シアリルルラクトース、6'-シアリルルラ
クトース、3'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、
6'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シアリルラ
クト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ
−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラク
トジフコテトラオース、3'-シアリル3-フコシルラクト
ース、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−
Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオー
スＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト
−Ｎ−フコペンタオースＶ、LS-テトラサッカライド
ａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テトラサッカライド
ｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオー
ス、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−
ジフコヘキサオースＩＩ、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、
ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ジシアリルラクト−Ｎ
−テトラオースおよびこれらの誘導体から選ばれる糖を
１あるいはそれ以上含有する複合糖質または該複合糖質
を含む複合糖質である、請求項１または２記載の製造
法。 - 【請求項９】 複合糖質が、Ｇａｌβ1-3Ｇｌｃ、Ｇａ
ｌβ1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-
4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ1-3Ｇａｌ、Ｇａｌβ1-4Ｇａ
ｌ、Ｇａｌβ1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ1-4ＧａｌＮＡ
ｃ、Ｇａｌα1-3Ｇｌｃ、Ｇａｌα1-4Ｇｌｃ、Ｇａｌα
1-3ＧｌｃＮＡｃ，Ｇａｌα1-4ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌα
1-3Ｇａｌ、Ｇａｌα1-4Ｇａｌ、Ｇａｌα1-3ＧａｌＮ
Ａｃ、Ｇａｌα1-4ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇ
ａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｇ
ａｌ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｇ
ｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ
β1-4ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-6ＧａｌＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃβ1-2Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃβ1-4Ｍａｎ、
ＧｌｃＮＡｃβ1-6Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃβ1-3Ｇａｌ、
ＧａｌＮＡｃβ1-4Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃβ1-4ＧｌｃＮ
Ａｃ、ＧａｌＮＡｃα1-3ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎβ1-4Ｇ
ｌｃＮＡｃ、Ｍａｎα1-6Ｍａｎ，Ｍａｎα1-3Ｍａｎ，
Ｍａｎα1-2Ｍａｎ，ＧｌｃＵＡβ1-4ＧｌｃＮ、Ｇｌｃ
ＵＡβ1-3Ｇａｌ、ＧｌｃＵＡβ1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌ
ｃＵＡβ1-3ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3Ｇａｌ、Ｎ
ｅｕＡｃα2-6Ｇａｌ、ＮｅｕＡｃα2-3ＧｌｃＮＡｃ、
ＮｅｕＡｃα2-6ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-3Ｇａｌ
ＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2-6ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα2
-8ＮｅｕＡｃ、Ｆｕｃα1-3Ｇｌｃ、Ｆｕｃα1-4Ｇｌ
ｃ、Ｆｕｃα1-3ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα1-4ＧｌｃＮＡ
ｃ、Ｆｕｃα1-2ＧａｌおよびＦｕｃα1-6ＧｌｃＮＡｃ
から選ばれる結合を有する糖を含む複合糖質または該複
合糖質を含む複合糖質である、請求項１または２記載の
製造法。 - 【請求項１０】 複合糖質に含まれる糖が１０個以下で
ある、請求項８または９記載の方法。 - 【請求項１１】 複合糖質に含まれる糖が６個以下であ
る、請求項８または９記載の方法。 - 【請求項１２】 複合糖質前駆物質が、単糖、オリゴサ
ッカライド、蛋白質、ペプチド、脂質、糖蛋白質、糖脂
質、グリコペプチドおよびステロイド化合物から選ばれ
る複合糖質前駆物質である、請求項１または２記載の製
造法。 - 【請求項１３】 複合糖質前駆物質が、グルコース、ガ
ラクトース、マンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルグル
コサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、
Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、Ｇ
ｌｃＮＡｃβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ1-
4Ｇａｌβ1-4Ｇｌｃ、グロボトリオース、Ｇａｌα1-4
Ｇａｌβ1-4ＧｌｃＮＡｃ、2'-フコシルラクトース、3-
フコシルラクトース、3'-シアリルラクトース、6'-シア
リルラクトース、3'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサ
ミン、6'-シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、シア
リルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ルイスａ、ラク
ト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオー
ス、ラクトジフコテトラオース、3'-シアリル-3-フコシ
ルラクトース、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａ、
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペ
ンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ
Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、LS-テトラサッ
カライドａ、LS-テトラサッカライドｂ、LS-テトラサッ
カライドｃ、（α２，３）シアリルラクト−Ｎ−ネオテ
トラオースおよびこれらの誘導体、セリン、スレオニ
ン、アスパラギンおよび該アミノ酸を含有するペプチド
およびその誘導体、セラミドおよびその誘導体から選ば
れる複合糖質前駆物質または該複合糖質前駆物質を含む
複合糖質前駆物質である、請求項１２記載の製造法。 - 【請求項１４】 ヌクレオチドの前駆物質からＮＴＰを
生産する能力を有する微生物が、コリネバクテリウム属
に属する微生物から選ばれる微生物であることを特徴と
する、請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項１５】 コリネバクテリウム属に属する微生物
が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであること
を特徴とする請求項１４記載の製造法。 - 【請求項１６】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、１種類ないしそれ以上の微
生物より構成されることを特徴とする、請求項１または
２記載の製造法。 - 【請求項１７】 微生物が、エシェリヒア属およびコリ
ネバクテリウム属に属する微生物から選ばれる１種類な
いしそれ以上の微生物であることを特徴とする、請求項
１６記載の製造法 - 【請求項１８】 エシェリヒア属に属する微生物がエシ
ェリヒア・コリである、請求項１７記載の製造法。 - 【請求項１９】 コリネバクテリウム属に属する微生物
が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請
求項１８記載の製造法。 - 【請求項２０】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、グルコキナーゼ（以下、ｇ
ｌｋと略す）、ホスホグルコムターゼ（以下、ｐｇｍと
略す）、グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェ
ラーゼ（以下、ｇａｌＵと略す）およびピロフォスファ
ターゼ（以下、ｐｐａと略す）から選ばれる１つ以上の
酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする、請求
項１または２記載の製造法。 - 【請求項２１】 微生物が、ｇｌｋをコードする遺伝
子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする
遺伝子およびｐｐａをコードする遺伝子から選ばれる１
種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換
え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成され
ることを特徴とする、請求項２０記載の製造法。 - 【請求項２２】 ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍを
コードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子および
ｐｐａをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリ由来
の遺伝子であることを特徴とする、請求項２１記載の製
造法。 - 【請求項２３】 糖ヌクレオチドがウリジン二リン酸グ
ルコースである、請求項２０記載の製造法。 - 【請求項２４】 微生物がウリジン二リン酸グルコース
デヒドロゲナーゼ活性の強い微生物であり、糖ヌクレオ
チドがウリジン二リン酸グルクロン酸である、請求項２
０記載の製造法。 - 【請求項２５】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、ガラクトキナーゼ（以下、
ｇａｌＫと略す）活性の強い微生物であることを特徴と
する、請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項２６】 請求項２５記載のｇａｌＫ活性の強い
微生物により、Ｎ−アセチルグルコサミンを基質にして
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸が供給されるこ
とを特徴とする、請求項２６記載の製造法。 - 【請求項２７】 微生物が、ｇａｌＫをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保
有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴と
する、請求項２５記載の製造法。 - 【請求項２８】 ｇａｌＫをコードする遺伝子がエシェ
リヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする、請
求項２７記載の製造法。 - 【請求項２９】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、ガラクトース−１−リン酸
ウリジルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＴと略す）
活性の強い微生物であることを特徴とする、請求項２５
記載の製造法。 - 【請求項３０】 微生物が、ｇａｌＴをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保
有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴と
する、請求項２９記載の製造法。 - 【請求項３１】 ｇａｌＴをコードする遺伝子がエシェ
リヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする、請
求項３０記載の製造法。 - 【請求項３２】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、グルコキナーゼ（以下、ｇ
ｌｋと略す）、ホスホグルコムターゼ（以下、ｐｇｍと
略す）、グルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェ
ラーゼ（以下、ｇａｌＵと略す）およびピロフォスファ
ターゼ（以下、ｐｐａと略す）から選ばれる１つ以上の
酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする、請求
項２９記載の製造法。 - 【請求項３３】 微生物が、ｇｌｋをコードする遺伝
子、ｐｇｍをコードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする
遺伝子およびｐｐａをコードする遺伝子から選ばれる１
種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換
え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成され
ることを特徴とする、請求項３２記載の製造法。 - 【請求項３４】 ｇｌｋをコードする遺伝子、ｐｇｍを
コードする遺伝子、ｇａｌＵをコードする遺伝子および
ｐｐａをコードする遺伝子エシェリヒア・コリ由来の遺
伝子であることを特徴とする、請求項３３記載の製造
法。 - 【請求項３５】 糖ヌクレオチドがウリジン二リン酸ガ
ラクトースである、請求項２９または３２記載の製造
法。 - 【請求項３６】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、Ｎ−アセチルグルコサミン
−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（以下、ｇｌ
ｍＵと略す）活性の強い微生物であることを特徴とす
る、請求項２５記載の製造法。 - 【請求項３７】 微生物が、ｇｌｍＵをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保
有する１種類以上の微生物から構成されることを特徴と
する、請求項３６記載の製造法。 - 【請求項３８】 ｇｌｍＵをコードする遺伝子がエシェ
リヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とする、請
求項３７記載の製造法。 - 【請求項３９】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、ホスホグルコムターゼ（以
下ｐｇｍと略す）およびホスホフルクトキナーゼ（以
下、ｐｆｋＢと略す）活性の強い微生物であることを特
徴とする、請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項４０】 微生物が、ｐｇｍをコードする遺伝
子、ｐｆｋＢをコードする遺伝子から選ばれる１種類以
上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体Ｄ
ＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成されること
を特徴とする、請求項３９記載の製造法。 - 【請求項４１】 ｐｇｍをコードする遺伝子、ｐｆｋＢ
をコードする遺伝子がエシェリヒア・コリ由来の遺伝子
であることを特徴とする、請求項４０記載の製造法。 - 【請求項４２】 請求項３９記載のｐｇｍおよびｐｆｋ
Ｂ活性の強い微生物により、グルコース−６−リン酸お
よびフルクトース−６−リン酸を基質にして、グルコー
ス−１，６−二リン酸が供給されることを特徴とする、
請求項３９記載の製造法。 - 【請求項４３】 請求項４２記載の方法により供給され
たグルコース−１，６−二リン酸により、ホスホグルコ
サミンムターゼまたはホスホマンノムターゼ活性が増強
されることを特徴とする、請求項４２記載の製造法。 - 【請求項４４】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、グルコサミン−１−リン酸
アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（以下、ｇ
ｌｍＵと略す）、ピロフォスファターゼ（以下、ｐｐａ
と略す）、ホスホグルコサミンムターゼ（以下、ｇｌｍ
Ｍと略す）、グルコキナーゼ（以下、ｇｌｋと略す）か
ら選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であるこ
とを特徴とする、請求項３９記載の製造法。 - 【請求項４５】 微生物が、ｇｌｍＵをコードする遺伝
子、ｐｐａをコードする遺伝子、ｇｌｍＭをコードする
遺伝子およびｇｌｋをコードする遺伝子から選ばれる１
種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換
え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成され
ることを特徴とする、請求項４４記載の製造法。 - 【請求項４６】 ｇｌｍＵをコードする遺伝子、ｐｐａ
をコードする遺伝子、ｇｌｍＭをコードする遺伝子およ
びｇｌｋをコードする遺伝子がエシェリヒア・コリ由来
の遺伝子であることを特徴とする、請求項４５記載の製
造法。 - 【請求項４７】 糖ヌクレオチドがウリジン二リン酸−
Ｎ−アセチルグルコサミンである、請求項２５、３６、
３９または４４記載の製造法。 - 【請求項４８】 微生物がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エ
ピメラーゼ活性の強い微生物であり、糖ヌクレオチドが
ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンであ
る、請求項２５、３６、３９または４４記載の製造法。 - 【請求項４９】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、ホスホマンノムターゼ（以
下、ｍａｎＢと略す）、マンノース−１−リン酸グアニ
ルトランスフェラーゼ（以下、ｍａｎＣと略す）、グル
コキナーゼ（以下、ｇｌｋと略す）から選ばれる１つ以
上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする、
請求項３９記載の製造法。 - 【請求項５０】 微生物が、ｍａｎＢをコードする遺伝
子、ｍａｎＣをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする
遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上
の微生物から構成されることを特徴とする、請求項４９
記載の製造法。 - 【請求項５１】 ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎ
Ｃをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子がエ
シェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特徴とす
る、請求項５０記載の製造法。 - 【請求項５２】 糖ヌクレオチドがグアノシン二リン酸
マンノースである、請求項３９または４９記載の製造
法。 - 【請求項５３】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、ホスホマンノムターゼ（以
下、ｍａｎＢと略す）、マンノース−１−リン酸グアニ
ルトランスフェラーゼ（以下、ｍａｎＣと略す）、グル
コキナーゼ（以下、ｇｌｋと略す）、ＧＤＰ-４,６-マ
ンノースデヒドラターゼ（以下、ｇｍｄと略す）および
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース エピメラ
ーゼ／レダクターゼ（以下、ｗｃａＧと略す）から選ば
れる１つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特
徴とする、請求項３９記載の製造法。 - 【請求項５４】 微生物が、ｍａｎＢをコードする遺伝
子、ｍａｎＣをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする
遺伝子、ｇｍｄをコードする遺伝子およびｗｃａＧをコ
ードする遺伝子から選ばれる１種類以上の遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する１
種類以上の微生物から構成されることを特徴とする、請
求項５３記載の製造法。 - 【請求項５５】 ｍａｎＢをコードする遺伝子、ｍａｎ
Ｃをコードする遺伝子、ｇｌｋをコードする遺伝子、ｇ
ｍｄをコードする遺伝子およびｗｃａＧをコードする遺
伝子がエシェリヒア・コリ由来の遺伝子であることを特
徴とする、請求項５４記載の製造法。 - 【請求項５６】 糖ヌクレオチドがグアノシン二リン酸
フコースである、請求項３９または５３記載の製造法。 - 【請求項５７】 糖とＮＴＰから糖ヌクレオチドを生産
する能力を有する微生物が、ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメ
ラーゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（以下、ｎｅ
ｕＡと略す）、ＮｅｕＡｃアルドラーゼ（以下、ｎａｎ
Ａと略す）、ＮｅｕＡｃシンセターゼ（以下、ｎｅｕＢ
と略す）およびＣＴＰシンセターゼ（以下、ｐｙｒＧと
略す）から選ばれる１つ以上の酵素の活性の強い微生物
であることを特徴とする、請求項１または２記載の製造
法。 - 【請求項５８】 微生物が、ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメ
ラーゼをコードする遺伝子、ｎｅｕＡをコードする遺伝
子、ｎａｎＡをコードする遺伝子、ｎｅｕＢをコードす
る遺伝子およびｐｙｒＧをコードする遺伝子から選ばれ
る１種類以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとの
組換え体ＤＮＡを保有する１種類以上の微生物から構成
されることを特徴とする、請求項５７記載の製造法。 - 【請求項５９】 ｎｅｕＡをコードする遺伝子、ｎａｎ
Ａをコードする遺伝子、ｎｅｕＢをコードする遺伝子お
よびｐｙｒＧをコードする遺伝子がエシェリヒア・コリ
由来の遺伝子であることを特徴とする、請求項５８記載
の製造法。 - 【請求項６０】 糖ヌクレオチドがシチジン一リン酸−
Ｎ−アセチルノイラミン酸である、請求項５７記載の製
造法。 - 【請求項６１】 糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質か
ら複合糖質を生産する能力を有する微生物が、エシェリ
ヒア・コリまたはサッカロマイセス・セレビシエまたは
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであることを特
徴とする請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項６２】 微生物が、グルコシルトランスフェラ
ーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラ
クトサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトラ
ンスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シア
リルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラ
ーゼから選ばれるトランスフェラーゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保
有する微生物であることを特徴とする、請求項６１記載
の製造法。 - 【請求項６３】 グルコシルトランスフェラーゼ、ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラ
ーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトラン
スフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選
ばれるトランスフェラーゼをコードする遺伝子が微生物
由来であることを特徴とする、請求項６２記載の製造
法。 - 【請求項６４】 動物細胞が、ＣＯＳ−７細胞またはナ
マルバＫＪＭ−１細胞であり、昆虫細胞がＳｆ９細胞で
あることを特徴とする、請求項１または３記載の製造
法。 - 【請求項６５】 動物細胞あるいは昆虫細胞が、グルコ
シルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラー
ゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラー
ゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルト
ランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよび
フコシルトランスフェラーゼから選ばれるトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクター
との組換え体ＤＮＡを保有する動物細胞あるいは昆虫細
胞であることを特徴とする、請求項１または２記載の製
造法。 - 【請求項６６】 グルコシルトランスフェラーゼ、ガラ
クトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミ
ニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラ
ーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトラン
スフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選
ばれるトランスフェラーゼをコードする遺伝子が動物細
胞由来であることを特徴とする、請求項６５記載の製造
法。 - 【請求項６７】 請求項２５記載のｇａｌＫ活性の強い
微生物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として
用い、該酵素源およびＮ−アセチルグルコサミンを水性
媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ−アセチルグル
コサミン−１−リン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中か
らＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸を採取するこ
とを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸
の製造法。 - 【請求項６８】 微生物が、ｇａｌＫをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保
有する微生物である、請求項６７記載の製造法。 - 【請求項６９】 ｇａｌＫをコードする遺伝子が、エシ
ェリヒア・コリ由来のガラクトキナーゼをコードする遺
伝子である、請求項６８記載の製造法。 - 【請求項７０】 培養液の処理物が、培養液の濃縮物、
培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培養上
清、該培養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵素標
品、培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の乾燥
物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、
該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理物、該
細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白
質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出し
て得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項６
７記載の製造法。
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|---|---|---|---|---|
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| CN113481180A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-10-08 | 吉林大学 | 碱性嗜热无机焦磷酸酶及其在增强聚合酶链式反应和合成udp-半乳糖反应中的应用 |
-
2002
- 2002-11-22 JP JP2002339308A patent/JP3739352B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| CN113481180A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-10-08 | 吉林大学 | 碱性嗜热无机焦磷酸酶及其在增强聚合酶链式反应和合成udp-半乳糖反应中的应用 |
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