JP2001136982A - Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 - Google Patents
Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法Info
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- JP2001136982A JP2001136982A JP2000257221A JP2000257221A JP2001136982A JP 2001136982 A JP2001136982 A JP 2001136982A JP 2000257221 A JP2000257221 A JP 2000257221A JP 2000257221 A JP2000257221 A JP 2000257221A JP 2001136982 A JP2001136982 A JP 2001136982A
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸など
の高価な原料を添加することなく、安価にＮ−アセチル
ノイラミン酸を製造する方法を提供する。 【解決手段】 水性媒体中に、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸アルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミン酸
シンセターゼ活性を有する微生物の培養液または該培養
液の処理物、ピルビン酸の生成能を有する微生物の培
養液または該培養液の処理物またはホスホエノールピル
ビン酸の生成能を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物、Ｎ−アセチルマンノサミン、およびピル
ビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成に必要な
エネルギー源、を存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセ
チルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ
−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ
−アセチルノイラミン酸の製造法に関する。
の高価な原料を添加することなく、安価にＮ−アセチル
ノイラミン酸を製造する方法を提供する。 【解決手段】 水性媒体中に、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸アルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミン酸
シンセターゼ活性を有する微生物の培養液または該培養
液の処理物、ピルビン酸の生成能を有する微生物の培
養液または該培養液の処理物またはホスホエノールピル
ビン酸の生成能を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物、Ｎ−アセチルマンノサミン、およびピル
ビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成に必要な
エネルギー源、を存在せしめ、該水性媒体中でＮ−アセ
チルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体中からＮ
−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴とするＮ
−アセチルノイラミン酸の製造法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸アルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミ
ン酸シンセターゼ活性を有する微生物を用いたＮ−アセ
チルノイラミン酸の製造法に関する。
ラミン酸アルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミ
ン酸シンセターゼ活性を有する微生物を用いたＮ−アセ
チルノイラミン酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法とし
て、抽出法、分解法、酵素を利用した方法等が知られて
いる。抽出法としては、ウミツバメの巣などからの抽出
する方法〔Carbohydrate Research, 56, 423 (1977)〕
等が知られている。
て、抽出法、分解法、酵素を利用した方法等が知られて
いる。抽出法としては、ウミツバメの巣などからの抽出
する方法〔Carbohydrate Research, 56, 423 (1977)〕
等が知られている。
【０００３】分解法としては、大腸菌などが生産するＮ
−アセチルノイラミン酸ポリマーであるコロミン酸を分
解する方法〔J. Biochem., 82, 1425 (1977)〕等が知ら
れている。酵素を利用した方法としては、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセ
チルマンノサミンを用いて製造する方法〔J. Am. Chem.
Soc., 110, 6481 (1988)、J. Am. Chem. Soc., 110, 7
159 (1988)〕、アルカリ条件下で、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルグ
ルコサミンを用いて製造する方法（米国特許第5,665,57
4号）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−
アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、ピルビン酸お
よびＮ−アセチルグルコサミンを用いて製造する方法
〔Angew. Chem.Int. Ed. Eng., 30, 827 (1991)、Carbo
hydrate Research, 306, 575 (1998)〕、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸シンセターゼ、ホスホエノールピルビン酸
およびＮ−アセチルマンノサミンを用いて製造する方法
〔特開平10-4961、Glycobiology,7, 697 (1997)〕が知
られている。
−アセチルノイラミン酸ポリマーであるコロミン酸を分
解する方法〔J. Biochem., 82, 1425 (1977)〕等が知ら
れている。酵素を利用した方法としては、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセ
チルマンノサミンを用いて製造する方法〔J. Am. Chem.
Soc., 110, 6481 (1988)、J. Am. Chem. Soc., 110, 7
159 (1988)〕、アルカリ条件下で、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸アルドラーゼ、ピルビン酸およびＮ−アセチルグ
ルコサミンを用いて製造する方法（米国特許第5,665,57
4号）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ−
アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、ピルビン酸お
よびＮ−アセチルグルコサミンを用いて製造する方法
〔Angew. Chem.Int. Ed. Eng., 30, 827 (1991)、Carbo
hydrate Research, 306, 575 (1998)〕、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸シンセターゼ、ホスホエノールピルビン酸
およびＮ−アセチルマンノサミンを用いて製造する方法
〔特開平10-4961、Glycobiology,7, 697 (1997)〕が知
られている。
【０００４】上記Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法の
いずれの方法においても、操作が煩雑あるいは、高価な
原料であるピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸
を必要とするため、Ｎ−アセチルノイラミン酸の安価な
製造法は確立されていない。
いずれの方法においても、操作が煩雑あるいは、高価な
原料であるピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸
を必要とするため、Ｎ−アセチルノイラミン酸の安価な
製造法は確立されていない。
【０００５】これまでに、微生物の培養物または該培養
物の処理物を利用してＮ−アセチルノイラミン酸を製造
することが可能であることに関する記載あるいは示唆さ
れるものはない。Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラー
ゼに関しては、動植物由来のものが知られており、微生
物ではエシェリヒア属に属する微生物にその活性のある
ことが知られている。エシェリヒア属に属する微生物で
あるエシェリヒア・コリにおいては、該酵素をコードす
る遺伝子ｎａｎＡも知られている〔Nucleic Acids Re
s.,13, 8843 (1985)〕。
物の処理物を利用してＮ−アセチルノイラミン酸を製造
することが可能であることに関する記載あるいは示唆さ
れるものはない。Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラー
ゼに関しては、動植物由来のものが知られており、微生
物ではエシェリヒア属に属する微生物にその活性のある
ことが知られている。エシェリヒア属に属する微生物で
あるエシェリヒア・コリにおいては、該酵素をコードす
る遺伝子ｎａｎＡも知られている〔Nucleic Acids Re
s.,13, 8843 (1985)〕。
【０００６】Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼに
関しては、エシェリヒア属、ナイセリア属、ストレプト
コッカス属に属する微生物等において存在が知られてお
り、エシェリヒア・コリにおいて該酵素をコードする遺
伝子ｎｅｕＢが知られている〔J. Bacteriol., 177, 31
2 (1995)〕。
関しては、エシェリヒア属、ナイセリア属、ストレプト
コッカス属に属する微生物等において存在が知られてお
り、エシェリヒア・コリにおいて該酵素をコードする遺
伝子ｎｅｕＢが知られている〔J. Bacteriol., 177, 31
2 (1995)〕。
【０００７】Ｎ−アセチルグルコサミン２-エピメラー
ゼに関しては、ブタおよびラットで該酵素の存在が知ら
れており、ブタ由来の該酵素に関しては性質が調べられ
〔Biochemistry, 17, 3363 (1970)〕、該酵素をコード
する遺伝子〔J. Biol. Chem.,271, 16294 (1996)〕が取
得されている。これまで、該酵素の活性を有する微生物
は知られていない。
ゼに関しては、ブタおよびラットで該酵素の存在が知ら
れており、ブタ由来の該酵素に関しては性質が調べられ
〔Biochemistry, 17, 3363 (1970)〕、該酵素をコード
する遺伝子〔J. Biol. Chem.,271, 16294 (1996)〕が取
得されている。これまで、該酵素の活性を有する微生物
は知られていない。
【０００８】ピルビン酸の製造法としては、エシェリヒ
ア・コリの変異株を用いたピルビン酸の製造法が知られ
ている〔Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164 (199
4)〕。ホスホエノールピルビン酸の製造法としては、サ
ッカロマイセス属などに属する微生物を用いたホスホエ
ノールピルビン酸の製造法が知られている(特開平6-197
778)。
ア・コリの変異株を用いたピルビン酸の製造法が知られ
ている〔Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164 (199
4)〕。ホスホエノールピルビン酸の製造法としては、サ
ッカロマイセス属などに属する微生物を用いたホスホエ
ノールピルビン酸の製造法が知られている(特開平6-197
778)。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ピル
ビン酸、ホスホエノールピルビン酸などの高価な原料を
添加することなく、安価にＮ−アセチルノイラミン酸を
製造する方法を提供することにある。また、本発明の目
的は、高価なＮ−アセチルマンノサミンを用いることな
くＮ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を提供する
ことにある。
ビン酸、ホスホエノールピルビン酸などの高価な原料を
添加することなく、安価にＮ−アセチルノイラミン酸を
製造する方法を提供することにある。また、本発明の目
的は、高価なＮ−アセチルマンノサミンを用いることな
くＮ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を提供する
ことにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行い、ピルビン酸またはホス
ホエノールピルビン酸の生成能を有する微生物を利用す
ることにより、安価な原料から効率的にＮ−アセチルノ
イラミン酸が生成することを見出し本発明を完成するに
至った。
解決するために鋭意研究を行い、ピルビン酸またはホス
ホエノールピルビン酸の生成能を有する微生物を利用す
ることにより、安価な原料から効率的にＮ−アセチルノ
イラミン酸が生成することを見出し本発明を完成するに
至った。
【００１１】即ち、本発明は以下の（１）〜（１１）に
関する。 （１） 水性媒体中に、Ｎ−アセチルノイラミン酸ア
ルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミン酸シンセ
ターゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処
理物、上記においてＮ−アセチルノイラミン酸アル
ドラーゼ活性を有する微生物を用いた場合にはピルビン
酸の生成能を有する微生物の培養物または該培養物の処
理物、上記においてＮ−アセチルノイラミン酸シンセ
ターゼ活性を有する微生物を用いた場合にはホスホエノ
ールピルビン酸の生成能を有する微生物の培養物または
該培養物の処理物、Ｎ−アセチルマンノサミン、およ
びピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成
に必要なエネルギー源、を存在せしめ、該水性媒体中で
Ｎ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体
中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴
とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
関する。 （１） 水性媒体中に、Ｎ−アセチルノイラミン酸ア
ルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミン酸シンセ
ターゼ活性を有する微生物の培養物または該培養物の処
理物、上記においてＮ−アセチルノイラミン酸アル
ドラーゼ活性を有する微生物を用いた場合にはピルビン
酸の生成能を有する微生物の培養物または該培養物の処
理物、上記においてＮ−アセチルノイラミン酸シンセ
ターゼ活性を有する微生物を用いた場合にはホスホエノ
ールピルビン酸の生成能を有する微生物の培養物または
該培養物の処理物、Ｎ−アセチルマンノサミン、およ
びピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成
に必要なエネルギー源、を存在せしめ、該水性媒体中で
Ｎ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該水性媒体
中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取することを特徴
とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。
【００１２】（２） Ｎ−アセチルマンノサミンが、Ｎ
−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する
微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−ア
セチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性
媒体中でＮ−アセチルマンノサミンを生成蓄積させるこ
とにより得られるＮ−アセチルマンノサミンである、上
記（１）の製造法。
−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する
微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−ア
セチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性
媒体中でＮ−アセチルマンノサミンを生成蓄積させるこ
とにより得られるＮ−アセチルマンノサミンである、上
記（１）の製造法。
【００１３】（３） Ｎ−アセチルグルコサミン２−エ
ピメラーゼ活性を有する微生物が、Ｎ−アセチルグルコ
サミン２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮ
Ａ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物
である、上記（２）の製造法。
ピメラーゼ活性を有する微生物が、Ｎ−アセチルグルコ
サミン２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮ
Ａ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物
である、上記（２）の製造法。
【００１４】（４） Ｎ−アセチルグルコサミン２−エ
ピメラーゼをコードするＤＮＡがシネコシスティス(Syn
echocystis)属に属する微生物由来のＤＮＡである、上
記（３）の製造法。 （５） Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼを
コードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮ
Ａである、上記（３）または（４）の製造法。
ピメラーゼをコードするＤＮＡがシネコシスティス(Syn
echocystis)属に属する微生物由来のＤＮＡである、上
記（３）の製造法。 （５） Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼを
コードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮ
Ａである、上記（３）または（４）の製造法。
【００１５】（ａ） 配列番号１記載のアミノ酸配列か
らなる蛋白質をコードするＤＮＡ （ｂ） 配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ （６） Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性を
有する微生物がエシェリヒア属またはコリネバクテリウ
ム属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいず
れか一つに記載の製造法。
らなる蛋白質をコードするＤＮＡ （ｂ） 配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ （６） Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活性を
有する微生物がエシェリヒア属またはコリネバクテリウ
ム属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいず
れか一つに記載の製造法。
【００１６】（７） Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセ
ターゼ活性を有する微生物がエシェリヒア属、ナイセリ
ア属およびストレプトコッカス属から選ばれる属に属す
る微生物である、上記（１）〜（６）のいずれか一つに
記載の製造法。 （８） ピルビン酸の生成能を有する微生物が、エシェ
リヒア属、コリネバクテリウム属およびサッカロマイセ
ス属から選ばれる属に属する微生物である、上記（１）
〜（７）のいずれか一つに記載の製造法。
ターゼ活性を有する微生物がエシェリヒア属、ナイセリ
ア属およびストレプトコッカス属から選ばれる属に属す
る微生物である、上記（１）〜（６）のいずれか一つに
記載の製造法。 （８） ピルビン酸の生成能を有する微生物が、エシェ
リヒア属、コリネバクテリウム属およびサッカロマイセ
ス属から選ばれる属に属する微生物である、上記（１）
〜（７）のいずれか一つに記載の製造法。
【００１７】（９） ホスホエノールピルビン酸の生成
能を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリ
ウム属およびサッカロマイセス属から選ばれる属に属す
る微生物である、上記（１）〜（８）のいずれか一つに
記載の製造法。 （１０） エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒ
ア・コリである、上記（６）〜（９）のいずれか一つに
記載の製造法。
能を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリ
ウム属およびサッカロマイセス属から選ばれる属に属す
る微生物である、上記（１）〜（８）のいずれか一つに
記載の製造法。 （１０） エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒ
ア・コリである、上記（６）〜（９）のいずれか一つに
記載の製造法。
【００１８】（１１） コリネバクテリウム属に属する
微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムおよび、コリネバクテリ
ウム・アセトアシドフィラムである、上記（６）、
（８）または（９）の製造法。 以下、本発明を詳細に説明する。
微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムおよび、コリネバクテリ
ウム・アセトアシドフィラムである、上記（６）、
（８）または（９）の製造法。 以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明で用いられるＮ−アセチル
ノイラミン酸アルドラーゼ活性を有する微生物として
は、該酵素活性を有する微生物であればいずれの微生物
も用いることができ、例えばエシェリヒア属またはコリ
ネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ
る。
ノイラミン酸アルドラーゼ活性を有する微生物として
は、該酵素活性を有する微生物であればいずれの微生物
も用いることができ、例えばエシェリヒア属またはコリ
ネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ
る。
【００２０】エシェリヒア属に属する微生物としてはエ
シェリヒア・コリ等をあげることができる。コリネバク
テリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム
・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミク
ム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム等をあ
げることができる。
シェリヒア・コリ等をあげることができる。コリネバク
テリウム属に属する微生物としてはコリネバクテリウム
・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミク
ム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム等をあ
げることができる。
【００２１】また、該酵素の活性を遺伝子組換え技術に
より増強した形質転換体を用いることもできる。該形質
転換体として、エシェリヒア・コリ由来のｎａｎＡ遺伝
子〔Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985)〕を含む組
換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体
的な例として、エシェリヒア・コリNM522/pTA3株等をあ
げることができる。エシェリヒア・コリNM522/pTA3株
は、平成１２年８月２８日付けで工業技術院生命工学工
業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目３番（郵
便番号３０５−８５６６）にFERM BP-7284として寄託さ
れている。
より増強した形質転換体を用いることもできる。該形質
転換体として、エシェリヒア・コリ由来のｎａｎＡ遺伝
子〔Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985)〕を含む組
換え体ＤＮＡを有する微生物をあげることができ、具体
的な例として、エシェリヒア・コリNM522/pTA3株等をあ
げることができる。エシェリヒア・コリNM522/pTA3株
は、平成１２年８月２８日付けで工業技術院生命工学工
業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目３番（郵
便番号３０５−８５６６）にFERM BP-7284として寄託さ
れている。
【００２２】本発明で用いられるＮ−アセチルノイラミ
ン酸シンセターゼ活性を有する微生物としては、該酵素
活性を有する微生物であればいずれの微生物も用いるこ
とができ、例えばエシェリヒア属、ナイセリア属、スト
レプトコッカス属に属する微生物をあげることができ
る。
ン酸シンセターゼ活性を有する微生物としては、該酵素
活性を有する微生物であればいずれの微生物も用いるこ
とができ、例えばエシェリヒア属、ナイセリア属、スト
レプトコッカス属に属する微生物をあげることができ
る。
【００２３】エシェリヒア属に属する微生物としてはエ
シェリヒア・コリ等をあげることができる。また、該酵
素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換体
を用いることもできる。該形質転換体として、エシェリ
ヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子〔J. Bacteriol., 17
7, 312 (1995)〕を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物
をあげることができ、具体的な例として、エシェリヒア
・コリNM522/pYP18株等をあげることができる。エシェ
リヒア・コリNM522/pYP18株は、平成１２年８月２８日
付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-72
83として寄託されている。
シェリヒア・コリ等をあげることができる。また、該酵
素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換体
を用いることもできる。該形質転換体として、エシェリ
ヒア・コリ由来のｎｅｕＢ遺伝子〔J. Bacteriol., 17
7, 312 (1995)〕を含む組換え体ＤＮＡを有する微生物
をあげることができ、具体的な例として、エシェリヒア
・コリNM522/pYP18株等をあげることができる。エシェ
リヒア・コリNM522/pYP18株は、平成１２年８月２８日
付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-72
83として寄託されている。
【００２４】ピルビン酸生成能を有する微生物として
は、該生成活性を有する微生物であればいずれの微生物
も用いることができ、エシェリヒア・コリ、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グ
ルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム、サッカロマイセス・セレビシエなどを例示すること
ができる。また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法に
より、該活性を増強した微生物を用いることもできる。
エシェリヒア・コリの変異株としては、Biosci.Biotec
h. Biochem., 58, 2164 (1994)記載の株をあげることが
できる。
は、該生成活性を有する微生物であればいずれの微生物
も用いることができ、エシェリヒア・コリ、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グ
ルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム、サッカロマイセス・セレビシエなどを例示すること
ができる。また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法に
より、該活性を増強した微生物を用いることもできる。
エシェリヒア・コリの変異株としては、Biosci.Biotec
h. Biochem., 58, 2164 (1994)記載の株をあげることが
できる。
【００２５】ホスホエノールピルビン酸生成能を有する
微生物としては、該生成活性を有する微生物であればい
ずれの微生物も用いることができ、エシェリヒア・コ
リ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバ
クテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセ
トアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエなど
を例示することができる。サッカロマイセス・セレビシ
エとしては、特開平6-197778に記載の株をあげることが
できる。また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法によ
り、該活性を増強した微生物を用いることもできる。
微生物としては、該生成活性を有する微生物であればい
ずれの微生物も用いることができ、エシェリヒア・コ
リ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバ
クテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセ
トアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエなど
を例示することができる。サッカロマイセス・セレビシ
エとしては、特開平6-197778に記載の株をあげることが
できる。また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法によ
り、該活性を増強した微生物を用いることもできる。
【００２６】Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラー
ゼ活性を有する微生物としては、該酵素活性を有する微
生物であればいずれの微生物も用いることができ、例え
ば該酵素の活性を遺伝子組換え手法により増強した形質
転換体をあげることができる。該形質転換体の具体例と
して、ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメ
ラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＥＰＩ１）を保
有するエシェリヒア・コリ（FERM BP-4602：米国特許第
5,795,767号）またはシネコシスティス属に属する微生
物由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有するエシェリヒア・コ
リNM522/pYP16株等をあげることができる。エシェリヒ
ア・コリNM522/pYP16株は、平成１２年８月２８日付け
で工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-7282と
して寄託されている。
ゼ活性を有する微生物としては、該酵素活性を有する微
生物であればいずれの微生物も用いることができ、例え
ば該酵素の活性を遺伝子組換え手法により増強した形質
転換体をあげることができる。該形質転換体の具体例と
して、ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメ
ラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（ｐＥＰＩ１）を保
有するエシェリヒア・コリ（FERM BP-4602：米国特許第
5,795,767号）またはシネコシスティス属に属する微生
物由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有するエシェリヒア・コ
リNM522/pYP16株等をあげることができる。エシェリヒ
ア・コリNM522/pYP16株は、平成１２年８月２８日付け
で工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-7282と
して寄託されている。
【００２７】シネコシスティス属に属する微生物由来の
Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子とし
ては、Synechocystis sp. PCC6803株の染色体に存在す
る、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードしている遺伝子をあげることができる。
より具体的には、配列番号２で示される塩基配列を有す
る遺伝子(slr1975)をあげることができる。配列番号１
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配
列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡは、後述実
施例に従い、本発明者らが初めて取得したものである。
Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子とし
ては、Synechocystis sp. PCC6803株の染色体に存在す
る、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードしている遺伝子をあげることができる。
より具体的には、配列番号２で示される塩基配列を有す
る遺伝子(slr1975)をあげることができる。配列番号１
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配
列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡは、後述実
施例に従い、本発明者らが初めて取得したものである。
【００２８】Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活
性およびピルビン酸生成能を有する微生物においては、
該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチルマンノサミンよ
りＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失
している微生物においては、弱いあるいは欠失している
活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適宜組
み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製
造することができる。
性およびピルビン酸生成能を有する微生物においては、
該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチルマンノサミンよ
りＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができる。
上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失
している微生物においては、弱いあるいは欠失している
活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適宜組
み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製
造することができる。
【００２９】Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造において
用いることのできるＮ−アセチルマンノサミンとして
は、市販品等の標品をあげることができる。また、Ｎ−
アセチルグルコサミンから、アルカリ条件下で化学的
に、あるいはＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラー
ゼを用い酵素的に変換することにより得られるＮ−アセ
チルマンノサミンを用いることができる。更に、Ｎ−ア
セチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する微生
物の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−アセチ
ルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、生成蓄積さ
れたＮ−アセチルマンノサミンを含む標品、または該標
品から精製されたＮ−アセチルマンノサミンを用いるこ
とができる。
用いることのできるＮ−アセチルマンノサミンとして
は、市販品等の標品をあげることができる。また、Ｎ−
アセチルグルコサミンから、アルカリ条件下で化学的
に、あるいはＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラー
ゼを用い酵素的に変換することにより得られるＮ−アセ
チルマンノサミンを用いることができる。更に、Ｎ−ア
セチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する微生
物の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−アセチ
ルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、生成蓄積さ
れたＮ−アセチルマンノサミンを含む標品、または該標
品から精製されたＮ−アセチルマンノサミンを用いるこ
とができる。
【００３０】Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ活
性およびＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活
性、並びにピルビン酸生成能を有する微生物において
は、該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができ
る。上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは
欠失している微生物においては、弱いあるいは欠失して
いる活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適
宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸
を製造することができる。
性およびＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活
性、並びにピルビン酸生成能を有する微生物において
は、該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造することができ
る。上記活性あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは
欠失している微生物においては、弱いあるいは欠失して
いる活性あるいは生産能を補うことのできる微生物と適
宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸
を製造することができる。
【００３１】Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造において
用いることのできるＮ−アセチルグルコサミンとして
は、市販品等の標品をあげることができる。Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸シンセターゼ活性およびホスホエノール
ピルビン酸生成能を有する微生物においては、該微生物
１種のみを用い、Ｎ−アセチルマンノサミンよりＮ−ア
セチルノイラミン酸を製造することができる。上記活性
あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失している
微生物においては、弱いあるいは欠失している活性ある
いは生産能を補うことのできる微生物と適宜組み合わせ
ることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するこ
とができる。
用いることのできるＮ−アセチルグルコサミンとして
は、市販品等の標品をあげることができる。Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸シンセターゼ活性およびホスホエノール
ピルビン酸生成能を有する微生物においては、該微生物
１種のみを用い、Ｎ−アセチルマンノサミンよりＮ−ア
セチルノイラミン酸を製造することができる。上記活性
あるいは生産能のいずれかが弱いあるいは欠失している
微生物においては、弱いあるいは欠失している活性ある
いは生産能を補うことのできる微生物と適宜組み合わせ
ることにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するこ
とができる。
【００３２】Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ活
性およびＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活
性、並びにホスホエノールピルビン酸生成能を有する微
生物においては、該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造す
ることができる。上記活性あるいは生産能のいずれかが
弱いあるいは欠失している微生物においては、弱いある
いは欠失している活性あるいは生産能を補うことのでき
る微生物と適宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸を製造することができる。
性およびＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活
性、並びにホスホエノールピルビン酸生成能を有する微
生物においては、該微生物1種のみを用い、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンよりＮ−アセチルノイラミン酸を製造す
ることができる。上記活性あるいは生産能のいずれかが
弱いあるいは欠失している微生物においては、弱いある
いは欠失している活性あるいは生産能を補うことのでき
る微生物と適宜組み合わせることにより、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸を製造することができる。
【００３３】また、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ
−アセチルマンノサミンの生成に際して用いる微生物
は、増殖を伴なった状態で生成反応に供してもよいし、
培養終了後の微生物の培養物またはその処理物を生成反
応に供してもよい。上述のように、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの製造におい
て、遺伝子組換え微生物を利用することも可能である
が、該遺伝子を含むプラスミドを保有する微生物からの
プラスミドＤＮＡの単離精製、プラスミドＤＮＡの制限
酵素による切断、切断したＤＮＡ断片の単離精製、ＤＮ
Ａ断片の酵素的結合、組換え体ＤＮＡを用いた形質転換
等、遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法〔例
えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Seco
ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19
89)(以下、モレキュラー・クローニング第２版と略
す)、Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコ
ールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）〕
に準じて行うことができる。また、ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション(以下ＰＣＲと略す)は公知の方法
〔PCR Protocols,Academic Press (1990)〕に従って行
うことができる。
−アセチルマンノサミンの生成に際して用いる微生物
は、増殖を伴なった状態で生成反応に供してもよいし、
培養終了後の微生物の培養物またはその処理物を生成反
応に供してもよい。上述のように、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの製造におい
て、遺伝子組換え微生物を利用することも可能である
が、該遺伝子を含むプラスミドを保有する微生物からの
プラスミドＤＮＡの単離精製、プラスミドＤＮＡの制限
酵素による切断、切断したＤＮＡ断片の単離精製、ＤＮ
Ａ断片の酵素的結合、組換え体ＤＮＡを用いた形質転換
等、遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法〔例
えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Seco
ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19
89)(以下、モレキュラー・クローニング第２版と略
す)、Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコ
ールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）〕
に準じて行うことができる。また、ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション(以下ＰＣＲと略す)は公知の方法
〔PCR Protocols,Academic Press (1990)〕に従って行
うことができる。
【００３４】Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセ
チルマンノサミンの製造に関与する遺伝子を宿主内で発
現させるためには、該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限
酵素類あるいはＰＣＲで該遺伝子を含む適当な長さのＤ
ＮＡ断片とした後に、適当な発現ベクターのプロモータ
ーの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベ
クターを、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する
ことにより達成できる。
チルマンノサミンの製造に関与する遺伝子を宿主内で発
現させるためには、該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限
酵素類あるいはＰＣＲで該遺伝子を含む適当な長さのＤ
ＮＡ断片とした後に、適当な発現ベクターのプロモータ
ーの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベ
クターを、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する
ことにより達成できる。
【００３５】宿主細胞としては、細菌、酵母等、目的と
する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いるこ
とができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体への組込が可能で、目
的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有
しているものが用いられる。
する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いるこ
とができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体への組込が可能で、目
的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有
しているものが用いられる。
【００３６】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合は、遺伝子の発現ベクターは原核生物中で自立複製
可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配
列、目的とするＤＮＡ、転写終結配列、より構成された
組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを
制御する遺伝子が含まれていてもよい。
場合は、遺伝子の発現ベクターは原核生物中で自立複製
可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配
列、目的とするＤＮＡ、転写終結配列、より構成された
組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを
制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３７】発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、
pBTac2、pHelix1（いずれもロシュ・ダイアグノスティ
ス社製）、pKK233-2、pKK223-3、pGEX-2T（いずれもア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280
（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社
製）、pQE-8、pQE-30（いずれもキアゲン社製）、pET-3
（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKY
P200〔Agric. Biol. Chem.,48, 669 (1984)〕、pLSA1
〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBlue
scriptII SK+（ストラタジーン社製）、pBluescript II
SK-（ストラタジーン社製）、pTrS30〔大腸菌JM109/pT
rS30(FERM BP-5407)より調製〕、pTrS32〔大腸菌JM109/
pTrS32(FERM BP-5408)より調製〕、pUC19〔Gene, 33, 1
03 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pUC118（宝酒造社
製）、pPAC31（WO98/12343）、pPA1（特開昭63-23379
8）等を例示することができる。
pBTac2、pHelix1（いずれもロシュ・ダイアグノスティ
ス社製）、pKK233-2、pKK223-3、pGEX-2T（いずれもア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280
（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社
製）、pQE-8、pQE-30（いずれもキアゲン社製）、pET-3
（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKY
P200〔Agric. Biol. Chem.,48, 669 (1984)〕、pLSA1
〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBlue
scriptII SK+（ストラタジーン社製）、pBluescript II
SK-（ストラタジーン社製）、pTrS30〔大腸菌JM109/pT
rS30(FERM BP-5407)より調製〕、pTrS32〔大腸菌JM109/
pTrS32(FERM BP-5408)より調製〕、pUC19〔Gene, 33, 1
03 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pUC118（宝酒造社
製）、pPAC31（WO98/12343）、pPA1（特開昭63-23379
8）等を例示することができる。
【００３８】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター
（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSE
プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロ
モーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。ま
たＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモータ
ー、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人
為的に設計改変されたプロモーター等も用いることがで
きる。
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター
（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSE
プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロ
モーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。ま
たＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモータ
ー、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人
為的に設計改変されたプロモーター等も用いることがで
きる。
【００３９】リボソーム結合配列であるシャイン−ダル
ガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当
な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいて
は、目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずし
も必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を
配置することが好ましい。
ガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当
な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいて
は、目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずし
も必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を
配置することが好ましい。
【００４０】原核生物としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-B
lue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli D
H1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli W148
5、Escherichia coli NM522、Escherichia coli JM10
9、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liq
uefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtili
s、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium imma
riophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticu
m ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Coryneb
acterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glu
tamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC
13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC1387
0、Microbacterium ammoniaphilumATCC15354、Pseudomo
nas sp. D-0110等をあげることができる。
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-B
lue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli D
H1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli W148
5、Escherichia coli NM522、Escherichia coli JM10
9、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liq
uefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtili
s、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium imma
riophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticu
m ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Coryneb
acterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glu
tamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC
13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC1387
0、Microbacterium ammoniaphilumATCC15354、Pseudomo
nas sp. D-0110等をあげることができる。
【００４１】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポ
レーション法〔Nucleic Acids Research, 16, 6127 (19
88)〕等をあげることができる。
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポ
レーション法〔Nucleic Acids Research, 16, 6127 (19
88)〕等をあげることができる。
【００４２】酵母菌株を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC3711
5）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS1
9、pHS15等を用いることができる。プロモーターとして
は、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのもの
を用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロ
モーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1
プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポ
リペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1
プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
は、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC3711
5）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS1
9、pHS15等を用いることができる。プロモーターとして
は、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのもの
を用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロ
モーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1
プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポ
リペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1
プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００４３】宿主細胞としては、サッカロマイセス属、
シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコ
スポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディ
ダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的に
は、Saccharomyces cerevisi ae、Schizosaccharomyces
pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulan
s、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、Candi
da utilis等をあげることができる。 組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導
入する方法であればいずれも用いることができ、例え
ば、エレクトロポレーション法〔Methods in Enzymol.,
194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)〕、酢酸リチウ
ム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕等をあげるこ
とができる。
シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコ
スポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディ
ダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的に
は、Saccharomyces cerevisi ae、Schizosaccharomyces
pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulan
s、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、Candi
da utilis等をあげることができる。 組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導
入する方法であればいずれも用いることができ、例え
ば、エレクトロポレーション法〔Methods in Enzymol.,
194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)〕、酢酸リチウ
ム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕等をあげるこ
とができる。
【００４４】本発明の形質転換体を培地に培養する方法
は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うこ
とができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等
を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であ
れば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うこ
とができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等
を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であ
れば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４５】炭素源としては、該生物が資化し得るもの
であればよく、グルコース、フラクトース、シュークロ
ース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプ
ン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有
機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を
用いることができる。
であればよく、グルコース、フラクトース、シュークロ
ース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプ
ン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有
機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を
用いることができる。
【００４６】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。
【００４７】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条
件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間
は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜
９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の
酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア
等を用いて行う。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条
件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間
は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜
９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の
酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア
等を用いて行う。
【００４８】また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモータ
ーを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養す
るときにはインドールアクリル酸等を培地に添加しても
よい。
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモータ
ーを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養す
るときにはインドールアクリル酸等を培地に添加しても
よい。
【００４９】培養物の処理物としては、培養物の濃縮
物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌
体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界
面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械
的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理
物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは
該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげること
ができる。
物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌
体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界
面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械
的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理
物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは
該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげること
ができる。
【００５０】Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセ
チルマンノサミンの生成において用いられる微生物の量
は、用いる各微生物各々について、湿菌体として１〜５
００ｇ／ｌであり、好ましくは１〜３００ｇ／ｌであ
る。ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成
に必要なエネルギー源としては、生成を促すものであれ
ばいずれも用いることができるが、好適にはグルコース
やフラクトースなどをあげることができる。これらエネ
ルギー源は、通常１０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いられ
る。
チルマンノサミンの生成において用いられる微生物の量
は、用いる各微生物各々について、湿菌体として１〜５
００ｇ／ｌであり、好ましくは１〜３００ｇ／ｌであ
る。ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の生成
に必要なエネルギー源としては、生成を促すものであれ
ばいずれも用いることができるが、好適にはグルコース
やフラクトースなどをあげることができる。これらエネ
ルギー源は、通常１０〜３００ｇ／ｌの濃度で用いられ
る。
【００５１】Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセ
チルマンノサミンの生成において用いられる水性媒体と
しては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、ク
エン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノー
ルなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、
アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類
などをあげることができる。また、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成において
用いられる微生物の培地、培養物等を水性媒体として用
いることができる。
チルマンノサミンの生成において用いられる水性媒体と
しては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、ク
エン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノー
ルなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、
アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類
などをあげることができる。また、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成において
用いられる微生物の培地、培養物等を水性媒体として用
いることができる。
【００５２】Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセ
チルマンノサミンの生成において、必要に応じてフィチ
ン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添
加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレ
ン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日
本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメ
チルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベ
ンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40
E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウ
ロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、
アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油
脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成を促進す
るものであればいずれでもよく、１種または数種を混合
して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１
〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
チルマンノサミンの生成において、必要に応じてフィチ
ン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添
加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレ
ン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日
本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメ
チルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベ
ンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40
E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウ
ロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、
アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油
脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの生成を促進す
るものであればいずれでもよく、１種または数種を混合
して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１
〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５３】有機溶剤としては、キシレン、トルエン、
脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげら
れ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。Ｎ
−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミ
ンの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましく
はｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行
う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノ
シン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン−５’−
三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシ
ウムなどを添加することができる。アデニン、ＡＭＰ、
ＡＴＰは、通常０．０１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で
用いられる。
脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげら
れ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。Ｎ
−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミ
ンの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましく
はｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行
う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノ
シン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン−５’−
三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシ
ウムなどを添加することができる。アデニン、ＡＭＰ、
ＡＴＰは、通常０．０１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で
用いられる。
【００５４】水性媒体中に生成したＮ−アセチルノイラ
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの定量はDionex
社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Ana
l. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成した
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサ
ミンの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通
常の方法によって行うことができる。以下に本発明の実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
ミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンの定量はDionex
社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Ana
l. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成した
Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサ
ミンの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通
常の方法によって行うことができる。以下に本発明の実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００５５】実施例１．エシェリヒア・コリ由来のＮー
アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子発現株の造成Escherichia coli W3110(ATCC27325)株をカレント・プ
ロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記
載の方法により培養後、該微生物の染色体ＤＮＡを単離
精製した。
アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子発現株の造成Escherichia coli W3110(ATCC27325)株をカレント・プ
ロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記
載の方法により培養後、該微生物の染色体ＤＮＡを単離
精製した。
【００５６】配列番号３記載のＤＮＡプライマーと配列
番号４記載のＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイ
オシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成し
た。
番号４記載のＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイ
オシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成し
た。
【００５７】上記合成ＤＮＡをプライマーとして用い、
Escherichia coli W3110(ATCC27325)株の染色体ＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ
０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ(STRATAGENE社製) ２．５ｕｎｉｔ
ｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液(STRATA
GENE社製) ４μｌ、deoxyＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌ
を含む反応液４０μｌを用い、９４℃-１分間、４２℃-
２分間、７２℃-３分間の工程を１サイクルとして３０
サイクル繰り返すことにより行った。
Escherichia coli W3110(ATCC27325)株の染色体ＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ
０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ(STRATAGENE社製) ２．５ｕｎｉｔ
ｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液(STRATA
GENE社製) ４μｌ、deoxyＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌ
を含む反応液４０μｌを用い、９４℃-１分間、４２℃-
２分間、７２℃-３分間の工程を１サイクルとして３０
サイクル繰り返すことにより行った。
【００５８】該反応液の１／１０量をアガロースゲル電
気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残
りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ〕飽
和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を
添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上
層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃
に３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈
殿を得た。該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解し
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
IIIおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキ
ット（バイオ101社製）により１．２ｋｂの断片を回収
した。ｐＵＣ１９ ＤＮＡ〔Gene, 33, 103 (1985)〕
０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分
離し、同様に２．７ｋｂの断片を回収した。
気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残
りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ〕飽
和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を
添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上
層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃
に３０分間放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈
殿を得た。該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解し
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
IIIおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキ
ット（バイオ101社製）により１．２ｋｂの断片を回収
した。ｐＵＣ１９ ＤＮＡ〔Gene, 33, 103 (1985)〕
０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分
離し、同様に２．７ｋｂの断片を回収した。
【００５９】該１．２ｋｂおよび２．７ｋｂの断片をラ
イゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結
反応を行った。該連結反応液を用いて、ピルビン酸生産
能を有するEscherichia coli NM522株を前述の公知の方
法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一
晩培養した。
イゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結
反応を行った。該連結反応液を用いて、ピルビン酸生産
能を有するEscherichia coli NM522株を前述の公知の方
法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一
晩培養した。
【００６０】生育してきた形質転換体のコロニーより、
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子ｎａｎＡ
を保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pTA3を
取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラスミド
を抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝
子発現プラスミドであるｐＴＡ３を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子ｎａｎＡ
を保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pTA3を
取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラスミド
を抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝
子発現プラスミドであるｐＴＡ３を得た。該プラスミド
の構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
【００６１】実施例２．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生
産 実施例１で得たEscherichia coli NM522/pTA3株をアン
ピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの
入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８
℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液
１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ
社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの
組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った
５Ｌ容培養槽に接種し、３７℃で６時間、６００ｒｐ
ｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。培養
中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．
０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコー
スを添加した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができた。
産 実施例１で得たEscherichia coli NM522/pTA3株をアン
ピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの
入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８
℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液
１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ
社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの
組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った
５Ｌ容培養槽に接種し、３７℃で６時間、６００ｒｐ
ｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。培養
中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．
０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコー
スを添加した。該培養液を遠心分離し湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００６２】Escherichia coli NM522/pTA3株湿菌体 ５
０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマ
ンノサミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイ
ミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの
組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに
入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌
（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２５時間反応を行った。
反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを
７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2Ｐ
Ｏ4を添加した。
０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマ
ンノサミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイ
ミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／ｌの
組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに
入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌
（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２５時間反応を行った。
反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを
７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2Ｐ
Ｏ4を添加した。
【００６３】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
０．３４ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積
していることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
０．３４ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積
していることを確認した。
【００６４】実施例３．エシェリヒア・コリ由来のＮー
アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子発現株の造成Escherichia coli K235(ATCC13027)株をカレント・プロ
トコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載
の方法により培養後、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精
製した。
アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子発現株の造成Escherichia coli K235(ATCC13027)株をカレント・プロ
トコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載
の方法により培養後、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精
製した。
【００６５】配列番号５記載のＤＮＡプライマーと配列
番号６記載のＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイ
オシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成し
た。
番号６記載のＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイ
オシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成し
た。
【００６６】上記合成ＤＮＡをプライマーとして用い、
Escherichia coli K235(ATCC13027)株の染色体ＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ
０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ(STRATAGENE社製) ２．５ｕｎｉｔ
ｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液(STRATA
GENE社製) ４μｌ、deoxyＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌ
を含む反応液４０μｌを用い、９４℃-１分間、４２℃-
２分間、７２℃-３分間の工程を１サイクルとして３０
サイクル繰り返すことにより行った。
Escherichia coli K235(ATCC13027)株の染色体ＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ
０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ(STRATAGENE社製) ２．５ｕｎｉｔ
ｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液(STRATA
GENE社製) ４μｌ、deoxyＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌ
を含む反応液４０μｌを用い、９４℃-１分間、４２℃-
２分間、７２℃-３分間の工程を１サイクルとして３０
サイクル繰り返すことにより行った。
【００６７】該反応液の１／１０量をアガロースゲル電
気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残
りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム
（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液
を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノール
を加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該放置
液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残
りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム
（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液
を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノール
を加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該放置
液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
【００６８】該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解し
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ
およびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット
（バイオ101社製）により１．１ｋｂの断片を回収し
た。ｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ（WO98/12343）０．２μｇを
制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．
５ｋｂの断片を回収した。
た。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ
およびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動に
よりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット
（バイオ101社製）により１．１ｋｂの断片を回収し
た。ｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ（WO98/12343）０．２μｇを
制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．
５ｋｂの断片を回収した。
【００６９】該１．１ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をラ
イゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結
反応を行った。該連結反応液を用いてホスホエノールピ
ルビン酸生産能を有するEscherichia coli NM522株を前
述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
イゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結
反応を行った。該連結反応液を用いてホスホエノールピ
ルビン酸生産能を有するEscherichia coli NM522株を前
述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布
後、３０℃で一晩培養した。
【００７０】生育してきた形質転換体のコロニーより、
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子ｎｅｕＢ
を保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pYP18を
取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラスミド
を抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝
子発現プラスミドであるｐＹＰ１8を得た。該プラスミ
ドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝子ｎｅｕＢ
を保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pYP18を
取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラスミド
を抽出し、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝
子発現プラスミドであるｐＹＰ１8を得た。該プラスミ
ドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
【００７１】実施例４．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株をアン
ピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの
入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８
℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液
１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ
社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの
組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った
５Ｌ容培養槽に接種し、３７℃で４時間培養した後、４
０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条
件で培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用い
て、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中
で必要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心
分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２
０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができた。
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株をアン
ピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの
入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８
℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。該培養液
１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バクトトリプト
ン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ
社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの
組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った
５Ｌ容培養槽に接種し、３７℃で４時間培養した後、４
０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条
件で培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用い
て、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中
で必要に応じてグルコースを添加した。該培養液を遠心
分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２
０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができた。
【００７２】Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体
５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチル
マンノサミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナ
イミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌ
の組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカー
に入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪
拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１９時間反応を行っ
た。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨ
を７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2
ＰＯ4を添加した。
５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチル
マンノサミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナ
イミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌ
の組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカー
に入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪
拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１９時間反応を行っ
た。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨ
を７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2
ＰＯ4を添加した。
【００７３】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
１．４ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
１．４ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
【００７４】実施例５．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株を実施
例２記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を
取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株を実施
例２記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を
取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００７５】Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170
株をグルコース ５０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬
社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社
製）１０ｇ／ｌ、尿素 ５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ 2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．
１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パ
ントテン酸カルシウム １０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ1 ５
ｍｇ／ｌ、ニコチン酸 ５ｍｇ／ｌ、およびビオチン ３
０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の
組成からなる液体培地２５ｍｌの入った３００ｍｌ容バ
ッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐ
ｍの条件で、２４時間培養した。
株をグルコース ５０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬
社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社
製）１０ｇ／ｌ、尿素 ５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ 2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．
１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パ
ントテン酸カルシウム １０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ1 ５
ｍｇ／ｌ、ニコチン酸 ５ｍｇ／ｌ、およびビオチン ３
０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の
組成からなる液体培地２５ｍｌの入った３００ｍｌ容バ
ッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐ
ｍの条件で、２４時間培養した。
【００７６】該培養液２０ｍｌを上記と同一組成の液体
培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラス
コに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間
培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。該
種培養液２５０ｍｌを、グルコース １５０ｇ／ｌ、肉
エキス（極東製薬社製） ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ
／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １
０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０
ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ（別
殺菌）、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−
システイン ２０ｍｇ／ｌ、ビオチン １００μｇ／ｌ、
尿素 ２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺
菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成か
らなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種
し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件
で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水
を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
培地２５０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラス
コに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間
培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。該
種培養液２５０ｍｌを、グルコース １５０ｇ／ｌ、肉
エキス（極東製薬社製） ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ
／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １
０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０
ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ（別
殺菌）、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−
システイン ２０ｍｇ／ｌ、ビオチン １００μｇ／ｌ、
尿素 ２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺
菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成か
らなる液体培地２．２５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種
し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件
で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水
を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
【００７７】該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができた。Escher
ichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Coryneb
acterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／
ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサ
ミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーン
Ｓ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成か
らなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、
該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９０
０ｒｐｍ）し、３２℃で６時間反応を行った。反応中、
４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維
持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加し
た。
た。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができた。Escher
ichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０ｇ／ｌ、Coryneb
acterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 １５０ｇ／
ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチルマンノサ
ミン ４０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーン
Ｓ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成か
らなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、
該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９０
０ｒｐｍ）し、３２℃で６時間反応を行った。反応中、
４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維
持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2ＰＯ4を添加し
た。
【００７８】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
３．１ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
３．１ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
【００７９】実施例６．シネコシスティス由来のＮ−ア
セチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子発現株の造
成 ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ
のアミノ酸配列〔J. Biol. Chem., 271, 16294 (199
6)〕をQueryとして、GenbankのBlast SearchおよびSyne
chocystis sp.(PCC6803)株のゲノム配列のデータベース
であるCyanoBase(http：//www.kazusa.or.jp/cyano/)に
おいて相同性検索（Similarity Search）を行った結
果、該アミノ酸配列はrenin-binding proteinとの記載
のあるSynechocystis sp.(PCC6803)由来の配列(slr197
5)と高い相同性を示した。
セチルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子発現株の造
成 ブタ由来のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ
のアミノ酸配列〔J. Biol. Chem., 271, 16294 (199
6)〕をQueryとして、GenbankのBlast SearchおよびSyne
chocystis sp.(PCC6803)株のゲノム配列のデータベース
であるCyanoBase(http：//www.kazusa.or.jp/cyano/)に
おいて相同性検索（Similarity Search）を行った結
果、該アミノ酸配列はrenin-binding proteinとの記載
のあるSynechocystis sp.(PCC6803)由来の配列(slr197
5)と高い相同性を示した。
【００８０】Synechocystis sp.(PCC6803)株をJ. Gen.
Microbiol., 111, 1 (1979)に記載の方法で培養後、カ
レント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオ
ロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを
単離精製した。パーセプティブ・バイオシステムズ社製
8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成した配列番号７および
８に記載のＤＮＡをプライマーとして用いて、Synechoc
ystissp.(PCC6803)株の染色体ＤＮＡを鋳型として実施
例１記載の方法に従ってＰＣＲ反応を行った。
Microbiol., 111, 1 (1979)に記載の方法で培養後、カ
レント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオ
ロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを
単離精製した。パーセプティブ・バイオシステムズ社製
8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成した配列番号７および
８に記載のＤＮＡをプライマーとして用いて、Synechoc
ystissp.(PCC6803)株の染色体ＤＮＡを鋳型として実施
例１記載の方法に従ってＰＣＲ反応を行った。
【００８１】該反応液の１／１０量をアガロースゲル電
気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残
りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム
（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残
りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルム
（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。
【００８２】該混合液を遠心分離後、得られた上層に２
倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０
分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得
た。該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶
解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット（バイオ
101社製）により１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０
分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得
た。該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶
解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢ
ａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット（バイオ
101社製）により１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
【００８３】ｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵
素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂ
のＤＮＡ断片を回収した。該１．２ｋｂおよび５．５ｋ
ｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１
６時間、連結反応を行った。
素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂ
のＤＮＡ断片を回収した。該１．２ｋｂおよび５．５ｋ
ｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１
６時間、連結反応を行った。
【００８４】該連結反応液を用いてEscherichia coli N
M522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質
転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体のコロニーより、Synechocystis sp.由来のＮ−
アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするＤ
ＮＡを保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pYP
16を取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラス
ミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＹＰ１６を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図３）。
M522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質
転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布後、３０℃で一晩培養した。生育してきた形質
転換体のコロニーより、Synechocystis sp.由来のＮ−
アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするＤ
ＮＡを保有する形質転換体Escherichia coli NM522/pYP
16を取得した。該菌株より、公知の方法に従ってプラス
ミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＹＰ１６を得
た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した
（図３）。
【００８５】実施例７．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生
産 実施例１で得たEscherichia coli NM522/pTA3株を実施
例２記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を
取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
産 実施例１で得たEscherichia coli NM522/pTA3株を実施
例２記載の方法により培養し、遠心分離により湿菌体を
取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００８６】実施例６で得たEscherichia coli NM522/p
YP16株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに
接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養し
た。該培養液１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バ
クトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキ
ス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ
／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０
μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．
５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で４時間培
養した後、４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．
５Ｌ／分の条件で培養を行った。培養中、２８％アンモ
ニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。ま
た、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。該
培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要
に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解
凍して用いることができた。
YP16株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに
接種し、２８℃で２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養し
た。該培養液１２５ｍｌをグルコース １０ｇ／ｌ、バ
クトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキ
ス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２．３ｇ
／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １２．５ｇ／ｌ、アンピシリン ５０
μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．
５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で４時間培
養した後、４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．
５Ｌ／分の条件で培養を行った。培養中、２８％アンモ
ニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。ま
た、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。該
培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要
に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解
凍して用いることができた。
【００８７】Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170
株を、実施例５記載の方法で培養し、遠心分離により湿
菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保
存することが可能で、使用前に解凍して用いることがで
きた。Escherichia coli NM522/pTA3株湿菌体 ５０ｇ／
ｌ、Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０ｇ／
ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体
１５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／
ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／
ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍ
ｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビ
ーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラー
にて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を
行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液の
ｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、Ｋ
Ｈ2ＰＯ4を添加した。
株を、実施例５記載の方法で培養し、遠心分離により湿
菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保
存することが可能で、使用前に解凍して用いることがで
きた。Escherichia coli NM522/pTA3株湿菌体 ５０ｇ／
ｌ、Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０ｇ／
ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿菌体
１５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／
ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／
ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍ
ｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビ
ーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラー
にて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応を
行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液の
ｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、Ｋ
Ｈ2ＰＯ4を添加した。
【００８８】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
１．０ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
１．０ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
【００８９】実施例８．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および
実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施
例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心
分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて
−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用
いることができた。
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および
実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施
例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心
分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて
−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用
いることができた。
【００９０】Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体
５０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体
５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチル
グルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、
ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／
ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカ
ーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて
攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１１時間反応を行っ
た。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨ
を７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2
ＰＯ4を添加した。
５０ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体
５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−アセチル
グルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ／ｌ、
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、
ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０ｍｌ／
ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカ
ーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて
攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で１１時間反応を行っ
た。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨ
を７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、ＫＨ2
ＰＯ4を添加した。
【００９１】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
１．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
１．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
【００９２】実施例９．Ｎ−アセチルノイラミン酸の生
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および
実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施
例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心
分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて
−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用
いることができた。
産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および
実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施
例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心
分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて
−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用
いることができた。
【００９３】Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170
株を実施例５記載の方法により培養し、遠心分離により
湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で
保存することが可能で、使用前に解凍して用いることが
できた。Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿
菌体 １５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−ア
セチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ
／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０
ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容
ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラ
ーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応
を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
株を実施例５記載の方法により培養し、遠心分離により
湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で
保存することが可能で、使用前に解凍して用いることが
できた。Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿
菌体 １５０ｇ／ｌ、フラクトース ６５ｇ／ｌ、Ｎ−ア
セチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２５ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ
／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン １０
ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容
ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラ
ーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、３２℃で２４時間反応
を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液
のｐＨを７．２に維持し、必要に応じてフラクトース、
ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００９４】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
４．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に
４．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
【００９５】実施例１０．Ｎ−アセチルノイラミン酸の
生産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および
実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施
例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心
分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて
−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用
いることができた。
生産 実施例３で得たEscherichia coli NM522/pYP18株および
実施例６で得たEscherichia coli NM522/pYP16株を実施
例４および７記載の方法に準じてそれぞれ培養し、遠心
分離により湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて
−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用
いることができた。
【００９６】Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170
株を実施例５記載の方法により培養し、遠心分離により
湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で
保存することが可能で、使用前に解凍して用いることが
できた。Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿
菌体 １５０ｇ／ｌ、グルコース １００ｇ／ｌ、Ｎ−ア
セチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、アデニン ５ｇ／
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５ｇ
／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４
ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３
０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグ
ネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、
３２℃で２２時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯ
Ｈを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に
応じてグルコース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
株を実施例５記載の方法により培養し、遠心分離により
湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で
保存することが可能で、使用前に解凍して用いることが
できた。Escherichia coli NM522/pYP16株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Escherichia coli NM522/pYP18株湿菌体 ５０
ｇ／ｌ、Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170株湿
菌体 １５０ｇ／ｌ、グルコース １００ｇ／ｌ、Ｎ−ア
セチルグルコサミン １８０ｇ／ｌ、アデニン ５ｇ／
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５ｇ
／ｌ、フィチン酸 ５ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４
ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３
０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグ
ネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、
３２℃で２２時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯ
Ｈを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持し、必要に
応じてグルコース、ＫＨ2ＰＯ4を添加した。
【００９７】反応終了後、反応生成物をダイオネックス
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に１
２．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
社製糖分析装置(DX-500)を用いて分析し、反応液中に１
２．３ｇ／ｌのＮ−アセチルノイラミン酸が生成蓄積し
ていることを確認した。
【００９８】
【発明の効果】本発明により、ピルビン酸などの高価な
原料を添加することなくＮ−アセチルノイラミン酸を効
率的に製造できる。
原料を添加することなくＮ−アセチルノイラミン酸を効
率的に製造できる。
【００９９】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０１００】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Process for producing N-acetylneuraminic acid <130> H12-1281J4 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 391 <212> PRT <213> Synechocystis sp.(PCC6803) <400> 1 Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg 20 25 30 Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe 35 40 45 Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe 50 55 60 Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile 65 70 75 80 Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp 85 90 95 Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln 100 105 110 Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln 115 120 125 Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln 130 135 140 Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr 145 150 155 160 Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro 165 170 175 Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro 180 185 190 Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr 195 200 205 Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro 210 215 220 Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly 225 230 235 240 His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser 245 250 255 Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr 260 265 270 Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu 275 280 285 Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu 290 295 300 Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln 305 310 315 320 Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp 325 330 335 Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly 340 345 350 Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys 355 360 365 Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu 370 375 380 Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser 385 390 <210> 2 <211> 1173 <212> DNA <213> Synechocystis sp.(PCC6803) <400> 2 atg att gcc cat cgc cgt cag gag tta gcc cag caa tat tac cag gct 48 Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala 1 5 10 15 tta cac cag gac gta ttg ccc ttt tgg gaa aaa tat tcc ctc gat cgc 96 Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg 20 25 30 cag ggg ggc ggt tac ttt acc tgc tta gac cgt aaa ggc cag gtt ttt 144 Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe 35 40 45 gac aca gat aaa ttc att tgg tta caa aac cgt cag gta tgg cag ttt 192 Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe 50 55 60 gcc gtt ttc tac aac cgt ttg gaa cca aaa ccc caa tgg tta gaa att 240 Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile 65 70 75 80 gcc cgc cat ggt gct gat ttt tta gct cgc cac ggc cga gat caa gac 288 Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp 85 90 95 ggt aat tgg tat ttt gct ttg gat cag gaa ggc aaa ccc ctg cgt caa 336 Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln 100 105 110 ccc tat aac gtt ttt tcc gat tgc ttc gcc gcc atg gcc ttt agt caa 384 Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln 115 120 125 tat gcc tta gcc agt ggg gcg cag gaa gct aaa gcc att gcc ctg cag 432 Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln 130 135 140 gcc tac aat aac gtc cta cgc cgt cag cac aat ccc aaa ggt caa tac 480 Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr 145 150 155 160 gag aag tcc tat cca ggt act aga ccc ctc aaa tcc ctg gcg gtg ccg 528 Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro 165 170 175 atg att tta gcc aac ctc acc ctg gag atg gaa tgg tta tta ccg cct 576 Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro 180 185 190 act acc gtg gaa gag gtg ttg gcc caa acc gtc aga gaa gtg atg acg 624 Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr 195 200 205 gat ttc ctc gac cca gaa ata gga tta atg cgg gaa gcg gtg acc ccc 672 Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro 210 215 220 aca gga gaa ttt gtt gat agt ttt gaa ggg cgg ttg ctc aac cca gga 720 Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly 225 230 235 240 cac ggc att gaa gcc atg tgg ttc atg atg gac att gcc caa cgc tcc 768 His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser 245 250 255 ggc gat cgc cag tta cag gag caa gcc att gca gtg gtg ttg aac acc 816 Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr 260 265 270 ctg gaa tat gcc tgg gat gaa gaa ttt ggt ggc ata ttt tat ttc ctt 864 Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu 275 280 285 gat cgc cag ggc cac cct ccc caa caa ctg gaa tgg gac caa aag ctc 912 Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu 290 295 300 tgg tgg gta cat ttg gaa acc ctg gtt gcc cta gcc aag ggc cac caa 960 Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln 305 310 315 320 gcc act ggc caa gaa aaa tgt tgg caa tgg ttt gag cgg gtc cat gat 1008 Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp 325 330 335 tac gcc tgg agt cat ttc gcc gat cct gag tat ggg gaa tgg ttt ggc 1056 Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly 340 345 350 tac ctg aat cgc cgg gga gag gtg tta ctc aac cta aaa ggg ggg aaa 1104 Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys 355 360 365 tgg aaa ggg tgc ttc cac gtg ccc cga gct ctg tgg ctc tgt gcg gaa 1152 Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu 370 375 380 act ctc caa ctt ccg gtt agt 1173 Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser 385 390 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gtgtaagctt tctgtatggg gtgt 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 gcagggatcc caaccaggca gcggaa 26 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 tttatcgata ttaattaggg ggaatgaatg ag 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 tttggatcct cattattccc cctgattttt gaa 33 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 taaatcgata tttgtatgat tgcccatcgc cgtcag 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 aaaggatcct taactaaccg gaagttggag agtttc 36
【図１】はＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ発現
プラスミドｐＴＡ３の造成工程を示す。
プラスミドｐＴＡ３の造成工程を示す。
【図２】はＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ発現
プラスミドｐＹＰ１８の造成工程を示す。
プラスミドｐＹＰ１８の造成工程を示す。
【図３】はＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ
発現プラスミドｐＹＰ１６の造成工程を示す。
発現プラスミドｐＹＰ１６の造成工程を示す。
Ａｍｐr：アンピシリン耐性遺伝子 ＰL：ＰLプロモーター ｃＩ８５７：ｃＩ８５７リプレッサー Ｐlac：ｌａｃプロモーター ｓｌｒ１９７５：Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメ
ラーゼ遺伝子 ｎａｎＡ：Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝
子 ｎｅｕＢ：Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝
子
ラーゼ遺伝子 ｎａｎＡ：Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝
子 ｎｅｕＢ：Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ遺伝
子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:15） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:31） Ｃ１２Ｒ 1:15） 1:46） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:31） 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:31） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:31） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:31） (Ｃ１２Ｐ 19/26 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 19/26 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 19/26 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:31） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 19/26 1:31） Ｃ１２Ｒ 1:85） 1:46） (Ｃ１２Ｐ 19/26 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:01） 1:01） (72)発明者 尾崎 明夫 山口県防府市協和町１番１号 協和醗酵工 業株式会社技術研究所内
Claims (11)
- 【請求項１】 水性媒体中に、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸アルドラーゼ活性またはＮ−アセチルノイラミン酸
シンセターゼ活性を有する微生物の培養物または該培養
物の処理物、上記においてＮ−アセチルノイラミン
酸アルドラーゼ活性を有する微生物を用いた場合にはピ
ルビン酸の生成能を有する微生物の培養物または該培養
物の処理物、上記においてＮ−アセチルノイラミン酸
シンセターゼ活性を有する微生物を用いた場合にはホス
ホエノールピルビン酸の生成能を有する微生物の培養物
または該培養物の処理物、Ｎ−アセチルマンノサミ
ン、およびピルビン酸またはホスホエノールピルビン
酸の生成に必要なエネルギー源、を存在せしめ、該水性
媒体中でＮ−アセチルノイラミン酸を生成蓄積させ、該
水性媒体中からＮ−アセチルノイラミン酸を採取するこ
とを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造法。 - 【請求項２】 Ｎ−アセチルマンノサミンが、Ｎ−アセ
チルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する微生物
の培養物または該培養物の処理物、およびＮ−アセチル
グルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中
でＮ−アセチルマンノサミンを生成蓄積させることによ
り得られるＮ−アセチルマンノサミンである、請求項１
記載の製造法。 - 【請求項３】 Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラ
ーゼ活性を有する微生物が、Ｎ−アセチルグルコサミン
２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片
とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物であ
る、請求項２記載の製造法。 - 【請求項４】 Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラ
ーゼをコードするＤＮＡがシネコシスティス(Synechocy
stis)属に属する微生物由来のＤＮＡである、請求項３
記載の製造法。 - 【請求項５】 Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラ
ーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）
のＤＮＡである、請求項３または４記載の製造法。 （ａ） 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
をコードするＤＮＡ （ｂ） 配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ - 【請求項６】 Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ
活性を有する微生物がエシェリヒア属またはコリネバク
テリウム属に属する微生物である、請求項１〜５のいず
れか一項に記載の製造法。 - 【請求項７】 Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ
活性を有する微生物がエシェリヒア属、ナイセリア属お
よびストレプトコッカス属から選ばれる属に属する微生
物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造
法。 - 【請求項８】 ピルビン酸の生成能を有する微生物が、
エシェリヒア属、コリネバクテリウム属およびサッカロ
マイセス属から選ばれる属に属する微生物である、請求
項１〜７のいずれか一項に記載の製造法。 - 【請求項９】 ホスホエノールピルビン酸の生成能を有
する微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属
およびサッカロマイセス属から選ばれる属に属する微生
物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造
法。 - 【請求項１０】 エシェリヒア属に属する微生物がエシ
ェリヒア・コリである、請求項６〜９のいずれか一項に
記載の製造法。 - 【請求項１１】 コリネバクテリウム属に属する微生物
が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバ
クテリウム・グルタミクムおよび、コリネバクテリウム
・アセトアシドフィラムである、請求項６、８または９
記載の製造法。
Priority Applications (1)
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