KR100819398B1

KR100819398B1 - Ｎ-아세틸뉴라민산의 제조법

Info

Publication number: KR100819398B1
Application number: KR1020000050828A
Authority: KR
Inventors: 고이즈미사또시; 다바따가즈히꼬; 엔도데쯔오; 오자끼아끼오
Original assignee: 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 1999-08-30
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2008-04-04
Also published as: JP2001136982A; CA2317118C; ES2352669T3; US20030109007A1; KR20010050270A; DE60045176D1; CN1286308A; US7579175B2; JP3946423B2; EP1081230A3; US6846656B1; ATE486949T1; CA2317118A1; EP1081230B1; CN1172003C; EP1081230A2

Abstract

본 발명은 피루브산, 포스포에놀피루브산 등의 고가의 원료를 첨가하지 않고, 저렴하게 N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 수성매체 중에, ① N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성 또는 N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물의 배양액 또는 그 배양액의 처리물, ② 피루브산의 생성능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 그 배양액의 처리물, 또는 포스포에놀피루브산의 생성능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 그 배양액의 처리물, ③ N-아세틸만노사민, 및 ④ 피루브산 또는 포스포에놀피루브산의 생성에 필요한 에너지원을 존재시키고, 그 수성매체 중에서 N-아세틸뉴라민산을 생성 축적시키고, 그 수성매체 중으로부터 N-아세틸뉴라민산을 채취하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸뉴라민산의 제조법에 관한 것이다.

Description

Ｎ-아세틸뉴라민산의 제조법{A METHOD FOR PRODUCING N-ACETYLNEURAMINIC ACID}

도 1 은 N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 발현 플라스미드 pTA3 의 조성공정을 나타낸다.

도 2 는 N-아세틸뉴라민산 신세타아제 발현 플라스미드 pYP18 의 조성공정을 나타낸다.

도 3 은 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 발현 플라스미드 pYP16 의 조성공정을 나타낸다.

[부호에 대한 간단한 설명]

Amp^r : 암피실린 내성 유전자

P_L : P_L 프로모터

cI857 : cI857 리프레서

P_lac : lac 프로모터

slr 1975 : N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자

nanA : N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 유전자

neuB : N-아세틸뉴라민산 신세타아제 유전자

본 발명은, N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성 또는 N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물을 사용한 N-아세틸뉴라민산의 제조법에 관한 것이다.

N-아세틸뉴라민산의 제조법으로서, 추출법, 분해법, 효소를 이용한 방법 등이 알려져 있다.

추출법으로서는, 바다제비의 집 등으로부터 추출하는 방법 [Carbohydrate Research, 56, 423 (1997)] 등이 알려져 있다.

분해법으로서는, 대장균 등이 생산하는 N-아세틸뉴라민산 중합체인 콜로민산을 분해하는 방법 [J. Biochem., 82, 1425 (1977)] 등이 알려져 있다.

효소를 이용한 방법으로서는, N-아세틸뉴라민산 알돌라아제, 피루브산 및 N-아세틸만노사민을 사용하여 제조하는 방법 [J. Am. Chem. Soc., 110, 6481 (1998), J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (1988)], 알칼리 조건하에서, N-아세틸뉴라민산 알돌라아제, 피루브산 및 N-아세틸글루코사민을 사용하여 제조하는 방법 (미국 특허 제 5,665,574 호), N-아세틸뉴라민산 알돌라아제, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제, 피루브산 및 N-아세틸글루코사민을 사용하여 제조하는 방법 [Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 30, 827 (1991), Carbohydrate Research, 306, 575 (1998)], N-아세틸뉴라민산 신세타아제, 포스포에놀피루브산 및 N-아세틸만노사민을 사용하여 제조하는 방법 [일본 공개특허공보 평 10-4961 호, Glycobiology, 7, 697 (1997)] 이 알려져 있다.

상기 N-아세틸뉴라민산의 제조법 중 어느 방법에 있어서도, 조작이 번잡하거나 또는 고가의 원료인 피루브산 또는 포스포에놀피루브산을 필요로 하기 때문에, N-아세틸뉴라민산의 저렴한 제조법은 확립되어 있지 않다.

지금까지, 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 이용하여 N-아세틸뉴라민산을 제조하는 것이 가능한 것에 관한 기재 혹은 시사되는 것은 없다.

N-아세틸뉴라민산 알돌라아제에 관해서는, 동식물 유래인 것이 알려져 있고, 미생물에서는 에쉐리히아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물에 그 활성이 있음이 알려져 있다. 에쉐리히아속에 속하는 미생물인 에쉐리히아 콜리 (에쉐리히아 콜리)에 있어서는, 그 효소를 코딩하는 유전자 nanA 도 알려져 있다 [Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985)].

N-아세틸뉴라민산 신세타아제에 관해서는, 에쉐리히아속, 나이세리아속, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속에 속하는 미생물 등에 있어서 존재가 알려져 있고, 에쉐리히아ㆍ콜리에 있어서 그 효소를 코딩하는 유전자 neuB 가 알려져 있다 [J. Bacteriol., 177, 312 (1995)].

N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제에 관해서는, 돼지 및 쥐에서 그 효소의 존재가 알려져 있고, 돼지 유래의 상기 효소에 관해서는 성질이 조사되어져 있고 [Biochemistry, 17, 3363 (1970)], 상기 효소를 코딩하는 유전자 [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)] 가 취득되고 있다. 지금까지, 상기 효소의 활성을 갖는 미생물은 알려져 있지 않다.

피루브산의 제조법으로서는, 에쉐리히아ㆍ콜리의 변이주를 사용한 피루브산의 제조법이 알려져 있다 [Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164 (1994)].

포스포에놀피루브산의 제조법으로서는, 사카로마이세스속 등에 속하는 미생물을 사용한 포스포에놀피루브산의 제조법이 알려져 있다 (일본 공개특허공보 평 6-197778 호).

본 발명의 목적은, 피루브산, 포스포에놀피루브산 등의 고가의 원료를 첨가하지 않고, 저렴하게 N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다. 또, 본 발명의 목적은, 고가의 N-아세틸만노사민을 사용하지 않고 N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위해 예의 연구를 실시하여, 피루브산 또는 포스포에놀피루브산의 생성능력을 갖는 미생물을 이용함으로써, 저렴한 원료로부터 효율적으로 N-아세틸뉴라민산을 생성하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 (1) ∼ (11) 에 관한 것이다.

(1) 수성매체 중에, ① N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성 또는 N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, ② 상기 ① 에 있어서 N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성을 갖는 미생물을 사용한 경우에는 피루브산의 생성능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, 상기 ① 에 있어서 N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물을 사용한 경우에는 포스포에놀피루브산의 생성능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, ③ N-아세틸만노사민, 및 ④ 피루브산 또는 포스포에놀피루브산의 생성에 필요한 에너지원을 존재시키고, 그 수성매체 중에서 N-아세틸뉴라민산을 생성 축적시키고, 그 수성매체 중으로부터 N-아세틸뉴라민산을 채취하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸뉴라민산의 제조법.

(2) 상기 (1) 에 있어서, N-아세틸만노사민이, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, 및 N-아세틸글루코사민을 수성매체 중에 존재시키고, 그 수성매체 중에서 N-아세틸만노사민을 생성 축적시킴으로써 얻어지는 N-아세틸만노사민인 제조법.

(3) 상기 (2) 에 있어서, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 미생물이, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 단편과 벡터와의 재조합 DNA 를 보유하는 미생물인 제조법.

(4) 상기 (3) 에 있어서, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 코딩하는 DNA 가 시네코시스티스 (Synechocystis) 속에 속하는 미생물 유래의 DNA 인 제조법.

(5) 상기 (3) 또는 (4) 에 있어서, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 코딩하는 DNA 가, 이하의 (a) 또는 (b) 의 DNA 인 제조법:

(a) 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 DNA; 또는

(b) 서열번호 1 에 기재된 염기서열을 갖는 DNA.

(6) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 있어서, N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성을 갖는 미생물이 에쉐리히아속 또는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속에 속하는 미생물인 제조법.

(7) 상기 (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 있어서, N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물이 에쉐리히아속, 나이세리아속 및 스트렙토코커스속으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물인 제조법.

(8) 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 있어서, 피루브산의 생성능력을 갖는 미생물이, 에쉐리히아속, 코리네박테리움속 및 사카로마이세스속으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물인 제조법.

(9) 상기 (1) ∼ (8) 중 어느 하나에 있어서, 포스포에놀피루브산의 생성능력을 갖는 미생물이, 에쉐리히아속, 코리네박테리움속 및 사카로마이세스속으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물인 제조법.

(10) 상기 (6) ∼ (9) 중 어느 하나에 있어서, 에쉐리히아속에 속하는 미생물이 에쉐리히아ㆍ콜리인 제조법.

(11) 상기 (6), (8) 또는 (9) 에 있어서, 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움ㆍ암모니아게네스, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 및, 코리네박테리움ㆍ아세토아시드필룸인 제조법.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

발명의 실시형태

본 발명에서 사용되는 N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성을 갖는 미생물로서는, 상기 효소 활성을 갖는 미생물이라면 어떤 미생물이라도 사용할 수 있고, 예를 들면 에쉐리히아속 또는 코리네박테리움속에 속하는 미생물을 들 수 있다.

에쉐리히아속에 속하는 미생물로서는 에쉐리히아ㆍ콜리 등을 들 수 있다. 코리네박테리움속에 속하는 미생물로서는 코리네박테리움ㆍ암모니아게네스, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰, 코리네박테리움ㆍ아세토아시드필룸 등을 들 수 있다.

또, 상기 효소의 활성을 유전자 재조합 기술에 의해 증강시킨 형질전환체를 사용할 수도 있다. 상기 형질전환체로서는, 에쉐리히아ㆍ콜리 유래의 nanA 유전자 [Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985)] 를 포함하는 재조합 DNA 를 갖는 미생물을 들 수 있고, 구체적인 예로서는, 에쉐리히아ㆍ콜리 NM522/pTA3 주 등을 들 수 있다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pTA3 주는 2000년 8월 28일자로 일본 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소 (일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1쵸메 3고 (우편번호 305-8566))에 수탁번호 FERM BP-7284로 기탁되어 있다.

본 발명에서 사용되는 N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물로서는, 상기 효소 활성을 갖는 미생물이라면 어떤 미생물이라도 사용할 수 있고, 예를 들면 에쉐리히아속, 나이세리아속, 스트렙토코커스속에 속하는 미생물을 들 수 있다.

에쉐리히아속에 속하는 미생물로서는 에쉐리히아ㆍ콜리 등을 들 수 있다.

또, 상기 효소의 활성을 유전자 재조합 기술에 의해 증강시킨 형질전환체를 사용할 수도 있다. 상기 형질전환체로서는, 에쉐리히아ㆍ콜리 유래의 neuB 유전자 [J. Bacteriol., 177, 312 (1995)] 를 포함하는 재조합 DNA 를 갖는 미생물을 들 수 있고, 구체적인 예로서는, 에쉐리히아ㆍ콜리 NM522/pYP18 주 등을 들 수 있다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주는 2000년 8월 28일자로 일본 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁번호 FERM BP-7283으로 기탁되어 있다.

피루브산 생성능력을 갖는 미생물로서는, 상기 생성 활성을 갖는 미생물이라면 어떤 미생물이라도 사용할 수 있고, 에쉐리히아ㆍ콜리, 코리네박테리움ㆍ암모니아게네스, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰, 코리네박테리움ㆍ아세토아시드필룸, 사카로마이세스ㆍ세레비시에 등을 예시할 수 있다. 또, 변이수법 혹은 유전자 재조합 수법에 의해, 상기 활성을 증강시킨 미생물을 사용할 수도 있다. 에쉐리히아ㆍ콜리의 변이주로서는, Biosci. Biotech. Biochem., 58, 2164 (1994) 에 기재된 주를 들 수 있다.

포스포에놀피루브산 생성능력을 갖는 미생물로서는, 상기 생성 활성을 갖는 미생물이라면 어떤 미생물이라도 사용할 수 있고, 에쉐리히아ㆍ콜리, 코리네박테리움ㆍ암모니아게네스, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰, 코리네박테리움ㆍ아세토아시드필룸, 사카로마이세스ㆍ세레비시에 등을 예시할 수 있다. 사카로마이세스ㆍ세레비시에로서는, 일본 공개특허공보 평 6-197778 호에 기재된 주를 들 수 있다. 또, 변이수법 혹은 유전자 재조합 수법에 의해, 상기 활성을 증강시킨 미생물을 사용할 수도 있다.

N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 미생물로서는, 상기 효소 활성을 갖는 미생물이라면 어떤 미생물이라도 사용할 수 있고, 예를 들면 상기 효소의 활성을 유전자 재조합 수법에 의해 증강시킨 형질전환체를 들 수 있다. 상기 형질전환체의 구체예로서는, 돼지 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자를 포함하는 재조합 DNA (pEPI1) 를 보유하는 에쉐리히아ㆍ콜리 (FERM BP-4602 : 미국 특허 제 5,795,767 호) 또는 시네코시스티스속에 속하는 미생물 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자를 포함하는 재조합 DNA 를 보유하는 에쉐리히아ㆍ콜리 NM522/pYP16 주 등을 들 수 있다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 주는 2000년 8월 28일자로 일본 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁번호 FERM BP-7282로 기탁되어 있다.

시네코시스티스속에 속하는 미생물 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자로서는, 시네코시스티스 sp. PCC6803 주의 염색체에 존재하는, 서열번호 2 로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 유전자를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 1 로 나타내어지는 염기서열을 갖는 유전자 (slr1975) 를 들 수 있다. 서열번호 2 로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열번호 1 로 나타내어지는 염기서열을 갖는 DNA 는, 후술하는 실시예에 의해, 본 발명자들이 처음으로 취득한 것이다.

N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성 및 피루브산 생성능력을 갖는 미생물에 있어서는, 상기 미생물 1 종만을 사용하여, N-아세틸만노사민으로부터 N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다. 상기 활성 혹은 생산능력 중 어느 한쪽이 약하거나 결실(缺失)되어 있는 미생물에 있어서는, 약하거나 결실되어 있는 활성 혹은 생산능력을 보강할 수 있는 미생물과 적절히 조합시킴으로써, N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다.

N-아세틸뉴라민산의 제조에 있어서 사용할 수 있는 N-아세틸만노사민으로서는, 시판품 등의 표품(標品)을 들 수 있다. 또, N-아세틸글루코사민으로부터, 알칼리 조건하에서 화학적으로, 혹은 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 사용하여 효소적으로 변환시킴으로써 얻어지는 N-아세틸만노사민을 사용할 수 있다. 또한, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물, 및 N-아세틸글루코사민을 수성매체 중에 존재시키고, 생성 축적된 N-아세틸만노사민을 포함하는 표품, 또는 상기 표품으로부터 정제된 N-아세틸만노사민을 사용할 수 있다.

N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 활성 및 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성, 그리고 피루브산 생성능력을 갖는 미생물에 있어서는, 상기 미생물 1 종만을 사용하여, N-아세틸글루코사민으로부터 N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다. 상기 활성 혹은 생산능력 중 어느 한쪽이 약하거나 결실되어 있는 미생물에 있어서는, 약하거나 결실되어 있는 활성 혹은 생산능력을 보강할 수 있는 미생물과 적절히 조합시킴으로써, N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다.

N-아세틸뉴라민산의 제조에 있어서 사용할 수 있는 N-아세틸글루코사민으로서는, 시판품 등의 표품을 들 수 있다.

N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성 및 포스포에놀피루브산 생성능력을 갖는 미생물에 있어서는, 상기 미생물 1 종만을 사용하여, N-아세틸만노사민으로부터 N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다. 상기 활성 혹은 생산능력 중 어느 한쪽이 약하거나 결실되어 있는 미생물에 있어서는, 약하거나 결실되어 있는 활성 혹은 생산능력을 보강할 수 있는 미생물과 적절히 조합시킴으로써, N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다.

N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성 및 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 활성, 그리고 포스포에놀피루브산 생성능력을 갖는 미생물에 있어서는, 상기 미생물 1 종만을 사용하고, N-아세틸글루코사민으로부터 N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다. 상기 활성 혹은 생산능력 중 어느 한쪽이 약하거나 결실되어 있는 미생물에 있어서는, 약하거나 결실되어 있는 활성 혹은 생산능력을 보강할 수 있는 미생물과 적절히 조합시킴으로써, N-아세틸뉴라민산을 제조할 수 있다.

또, N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민을 생성할 때에 사용하는 미생물은, 증식을 수반한 상태에서 생성반응에 제공해도 되고, 배양종료 후의 미생물의 배양물 또는 그 처리물을 생성반응에 제공해도 된다.

상술한 바와 같이, N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 제조에 있어서, 유전자 재조합 미생물을 이용하는 것도 가능하지만, 그 유전자를 포함하는 플라스미드를 보유하는 미생물로부터의 플라스미드 DNA 의 단리정제, 플라스미드 DNA 의 제한효소에 의한 절단, 절단한 DNA 단편의 단리정제, DNA 단편의 효소적 결합, 재조합 DNA 를 사용한 형질전환 등, 유전자 재조합에 관한 각종 조작은 공지의 방법 [예를 들면, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (이하, 몰레큘러ㆍ클로닝 제 2 판이라 함), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (이하, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지라 함)] 에 준하여 실시할 수 있다. 또, 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하 PCR 이라 함) 은 공지의 방법 [PCR Protocols, Academic Press (1990)] 에 따라 실시할 수 있다.

N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 제조에 관여하는 유전자를 숙주 내에서 발현시키기 위해서는, 그 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 제한효소류 혹은 PCR 로 그 유전자를 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편으로 한 후에, 적당한 발현벡터의 프로모터의 하류에 삽입하고, 이어서 상기 DNA를 삽입한 발현벡터를, 발현벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써 달성할 수 있다.

숙주세포로서는, 세균, 효모 등 목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 사용할 수 있다.

발현벡터로서는, 상기 숙주세포에 있어서 자립복제가능 내지는 염색체로의 삽입이 가능하고, 목적하는 DNA 를 전사시킬 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용할 경우에는, 유전자의 발현벡터는 원핵생물 중에서 자립복제가 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합서열, 목적하는 DNA, 전사종결서열로 구성된 재조합 DNA 인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 된다.

발현벡터로서는, pBTrp2, pBTac1, pBTac2-pHelix1 (모두 로슈·다이아그노스 틱스사 제품), pKK233-2, pKK223-3, pGEX-2T (모두 애머샴ㆍ파마시아ㆍ바이오테크사 제조), pSE280 (인비트로젠사 제조), pGEMEX-1 (프로메가사 제조), pQE-8, pQE-30 (모두 키아겐사 제조), pET-3 (노바젠사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소 58-110600 호), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK+ (STRATAGENE 사 제조), pBluescript II SK- (STRATAGENE 사 제조), pTrS30 [대장균 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 로부터 조제], pTrS32 [대장균 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 로부터 조제], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (다까라슈우조사 제조), pUC118 (다까라슈우조사 제조), pPAC31 (WO98/12343), pPA1 (일본 공개 특허 공보 (소)63-233798) 등을 예시할 수 있다.

프로모터로서는, 대장균 등의 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 된다. 예를 들면, trp 프로모터 (Ptrp), lac 프로모터 (Plac), P_L 프로모터, P_R 프로모터, P_SE 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또 Ptrp 를 2 개 직열시킨 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계개편된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

리보솜 결합서열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈과의 사이를 적당한 거리 (예를 들면 6 ∼ 18개의 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 DNA 에 있어서는, 목적하는 DNA 의 발현에 전사종결서열이 반드시 필요하지는 않지만, 구조유전자의 바로 밑에 전사종결서열을 배치하는 것이 바람직하다.

원핵생물로서는, 에쉐리히아속, 세라티아(Serratia)속, 바실루스(Bacillus)속, 브레비박테리움 (Brevibacterium)속, 코리네박테리움 (Corynebacterium)속, 미크로박테리움 (Microbacterium)속, 슈도모나스 (Pseudomonas)속 등에 속하는 미생물, 예를 들면, 에쉐리히아 콜리 XL1-Blue, 에쉐리히아 콜리 XL2-Blue, 에쉐리히아 콜리 DH1, 에쉐리히아 콜리 MC1000, 에쉐리히아 콜리 W1485, 에쉐리히아 콜리 NM522, 에쉐리히아 콜리 JM109, 에쉐리히아 콜리 HB101, 에쉐리히아 콜리 No. 49, 에쉐리히아 콜리 W3110, 에쉐리히아 콜리 NY49, 세라티아 피카리아 (Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아 리케파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르센스 (Serratia marcescens), 바실루스 서틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테리움 임마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카로리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, 코리네박테 리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 슈도모나스 (Pseudomonas) sp. D-0110 등을 들 수 있다.

재조합 DNA 의 도입방법으로서는, 상기 숙주세포로 DNA 를 도입하는 방법이라면 어떤 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면 칼슘이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], 원형질체 (protoplast)법 (일본 공개특허공보 소 63-248394), 전기천공법 [Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] 등을 들 수 있다.

효모균주를 숙주세포로서 사용할 경우에는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 사용할 수 있다.

프로모터로서는, 효모균주 중에서 발현시킬 수 있는 것이라면 어떤 것을 사용해도 되고, 예를 들면, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크폴리펩티드프로모터, MF α1 프로모터, CUP 1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.

숙주세포로서는, 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 클루이베로미세스속, 트리코스포론속, 시와니오미세스속, 피치아속, 캔디다속 등에 속하는 효모균주를 들 수 있고, 구체적으로는, 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀룰란스 (Trichosporon pullulans), 시와니오미세스 알루비우스 (Schwanniomyces alluvius), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 캔디다 유틸리스 (Candida utilis) 등을 들 수 있다.

재조합 DNA 의 도입방법으로서는, 효모에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어떤 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면, 전기천공법 [Methods in Enzymol., 194, 182 (1990)], 스페로플라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], 아세트산리튬법 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] 등을 들 수 있다.

본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.

대장균 등의 원핵생물 혹은 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 상기 생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기물 등을 포함하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지 중 어느 것을 사용해도 된다.

탄소원으로서는, 상기 생물이 자화할 수 있는 것이라면 되고, 글루코오스, 프룩토오스, 슈크로오스, 이들을 함유하는 당밀(糖蜜), 전분 혹은 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 기타 질소 함유 화합물, 그리고, 펩톤, 고기 추출물(extract), 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두 깻묵 및 대두 깻묵 가수분해물, 각종 발효균체, 및 그 절단물 등을 사용할 수 있 다.

무기물로서는, 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

배양은, 통상 진탕배양 또는 심부 통기 교반배양 등의 적합한 조건하에서 실시한다. 배양온도는 15 ∼ 40 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 5 시간 ∼ 7 일간이다. 배양 중 pH 는 3.0 ∼ 9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은, 무기 또는 유기의 산, 알칼리용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.

또, 배양 중 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 유도물질을 배지에 첨가해도 된다. 예를 들면, lac 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

배양물의 처리물로서는, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물, 배양물을 원심분리하여 얻어지는 균체, 그 균체의 건조물, 그 균체의 동결건조물, 그 균체의 계면활성제 처리물, 그 균체의 초음파 처리물, 그 균체의 기계적 마쇄 처리물, 그 균체의 용매 처리물, 그 균체의 효소 처리물, 그 균체의 단백질 분획물, 그 균체의 고정화물 혹은 그 균체로부터 추출하여 얻어지는 효소 표품 등을 들 수 있다.

N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 생성에 있어서 사용되는 미생물의 양은, 사용하는 각 미생물 각각에 대해 습균체로서 1 ∼ 500 g/ℓ이며, 바람직하게는 1 ∼ 300 g/ℓ이다.

피루브산 또는 포스포에놀피루브산의 생성에 필요한 에너지원으로서는, 생성을 촉진시키는 것이라면 어떤 것을 사용해도 되지만, 바람직하게는 글루코오스나 프룩토오스 등을 사용할 수 있다. 이들 에너지원은 통상 10 ∼ 300 g/ℓ의 농도로 사용된다.

N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 생성에 있어서 사용되는 수성매체로서는, 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 구연산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알코올류, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 들 수 있다. 또, N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 생성에 있어서 사용되는 미생물의 배지, 배양물 등을 수성매체로서 사용할 수 있다.

N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 생성에 있어서, 필요에 따라 피틴산 등의 킬레이트제, 계면활성제 혹은 유기용매를 첨가해도 된다.

계면활성제로서는, 폴리옥시에틸렌ㆍ옥타데실아민 (예를 들면 나이민 S-215, 니혼유시사 제조) 등의 비이온 계면활성제, 세틸트리메틸암모늄ㆍ브로마이드나 알킬디메틸ㆍ벤질암모늄클로라이드 (예를 들면 양이온 F2-40E, 니혼유시사 제조) 등의 양이온계 계면활성제, 라울로일ㆍ사르코시네이트 등의 음이온계 계면활성제, 알킬디메틸아민 (예를 들면 3 급 아민 FB, 니혼유시사 제조) 등의 3 급 아민류 등, N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 생성을 촉진시키는 것이라면 어떤 것이라도 되고, 1 종 또는 수종류를 혼합하여 사용할 수도 있다. 계면활성제는, 통상 0.1 ∼ 50 g/ℓ의 농도로 사용된다.

유기용제로서는, 크실렌, 톨루엔, 지방족 알코올, 아세톤, 아세트산 에틸 등을 들 수 있고, 통상 0.1 ∼ 50 ㎖/ℓ의 농도로 사용된다.

N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 생성반응은, 수성매체 중, pH 5 ∼ 10, 바람직하게는 pH 6 ∼ 8, 20 ∼ 50 ℃ 의 조건에서 1 ∼ 96 시간 실시한다.

상기 생성반응을 촉진시키기 위해, 아데닌, 아데노신-5'-1인산 (AMP), 아데노신-5'-3인산 (ATP), 황산마그네슘, 염화마그네슘 등을 첨가할 수 있다. 아데닌, AMP, ATP 는, 통상 0.01 ∼ 100 m㏖/ℓ의 농도로 사용된다.

수성매체 중에 생성된 N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 정량은 Dionex 사 제조의 당분석장치 등을 사용하여 실시할 수 있다 [Anal. Biochem., 189, 151 (1990)].

반응액 중에 생성된 N-아세틸뉴라민산 또는 N-아세틸만노사민의 채취는, 활성탄이나 이온 교환수지 등을 사용하는 통상의 방법에 의해 실시할 수 있다.

이하에 본 발명의 실시예를 들지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 에쉐리히아ㆍ콜리 유래의 N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 유전자 발현주의 조성

에쉐리히아 콜리 W3110 (ATCC27325) 주를 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지에 기재된 방법으로 배양 후, 상기 미생물의 염색체 DNA 를 단리정제하였다.

서열번호 3 에 기재된 DNA 프라이머와 서열번호 4 에 기재된 DNA 프라이머를 퍼셉티브ㆍ바이오시스템즈사 제조의 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.

상기 합성 DNA 를 프라이머로서 사용하고, 에쉐리히아 콜리 W3110 (ATCC27325) 주의 염색체 DNA 를 주형(鑄型)으로 하여 PCR 을 실시하였다. PCR 은 염색체 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 각 0.5 ㎛ol/ℓ, Pfu DNA 폴리머라아제 (STRATAGENE 사 제조) 2.5 유닛, Pfu DNA 폴리머라아제용 ×10 완충액 (STRATAGENE 사 제조) 4 ㎕, 데옥시 NTP 각 200 ㎛ol/ℓ을 포함하는 반응액 40 ㎕ 를 사용하고, 94 ℃ - 1 분간, 42 ℃ - 2 분간, 72 ℃ - 3 분간의 공정을 1 사이클로 하여 30 사이클 반복함으로써 실시하였다.

상기 반응액의 1/10 양을 아가로오스겔 전기영동하고, 목적하는 단편이 증폭되어 있는 것을 확인 후, 남은 반응액과 등량의 TE [10 m㏖/ℓTris-HCl (pH 8.0), 1 m㏖/ℓEDTA] 포화페놀/클로로포름 (1 부피 / 1 부피) 을 첨가하여 혼합하였다. 그 혼합액을 원심분리 후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, -80 ℃ 에 30 분간 방치하였다. 그 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻었다.

상기 DNA 의 침전을 20 ㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 그 용해액 5 ㎕ 을 사용하고, DNA 를 제한효소 HindIII 및 BamHI 로 절단하고, 아가로오스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 II 키트 (바이오 101 사 제조) 에 의해 1.2 kb 의 단편을 회수하였다. pUC 19 DNA [Gene, 33, 103 (1985)] 0.2 ㎍ 를 제한효소 HindIII 및 BamHI 로 절단 후, 아가로오스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 2.7 kb 의 단편을 회수하였다.

그 1.2 kb 및 2.7 kb 의 단편을 라이게이션키트를 사용하여, 16 ℃, 16 시간, 연결반응을 실시하였다. 그 연결반응액을 사용하여 피루브산 생산능력을 갖는 에쉐리히아 콜리 NM522 주를 전술한 공지의 방법에 따라 형질전환시키고, 그 형질전환체를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 한천배지에 도포 후, 30 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다.

생육한 형질전환체의 콜로니로부터, N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 유전자 nanA 를 보유하는 형질전환체 에쉐리히아 콜리 NM522/pTA3 을 취득하였다. 그 균주로부터 공지의 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, N-아세틸뉴라민산 알돌라아제 유전자 발현 플라스미드인 pTA3 를 얻었다. 그 플라스미드의 구조를 제한효소 절단에 의해 확인하였다 (도 1).

실시예 2. N-아세틸뉴라민산의 생산

실시예 1 에서 얻은 에쉐리히아 콜리 NM522/pTA3 주를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 한천배지 125 ㎖ 가 들어 있는 1 L 용(容) 배플(baffle)이 딸린 삼각 프라스코에 접종하고, 28 ℃ 에서 220 rpm 의 조건으로 17 시간 배양하였다. 그 배양액 125 ㎖ 를 글루코오스 10 g/ℓ, 박토트립톤 (디프코사 제조) 12 g/ℓ, 효모 추출물 (디프코사 제조) 24 g/ℓ, KH₂PO₄ 2.3 g/ℓ, K₂HPO₄ 12.5 g/ℓ, 암피실린 50 ㎍/㎖ 의 조성으로 이루어진 액체배지 (pH 무조정) 2.5 L 가 들어 있는 5 L 용 배양조에 접종하고, 37 ℃ 에서 6 시간, 600 rpm, 통기량 2.5 L/분의 조건으로 배양을 실시하였다. 배양 중, 28 % 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 7.0 으로 유지하였다. 또, 배양 도중에 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다. 그 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pTA3 주 습균체 50 g/ℓ, 프룩토오스 65 g/ℓ, N-아세틸만노사민 40 g/ℓ, KH₂PO₄ 25 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ, 피틴산 5 g/ℓ, 나이민 S-215 4 g/ℓ, 크실렌 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30 ㎖ 를 200 ㎖ 용 비커에 넣고, 그 반응액을 자성 교반기로 교반 (900 rpm) 하고, 32 ℃ 에서 25 시간 반응을 실시하였다. 반응 중, 4N NaOH 를 사용하여 그 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 프룩토오스, KH₂PO₄를 첨가하였다.

반응종료 후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조의 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 0.34 g/ℓ의 N-아세틸뉴라민산이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 3. 에쉐리히아ㆍ콜리 유래의 N-아세틸뉴라민산 신세타아제 유전자 발현주의 조성

에쉐리히아 콜리 K235 (ATCC13027) 주를 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러 ㆍ바이올로지에 기재된 방법으로 배양 후, 상기 미생물의 염색체 DNA 를 단리정제하였다.

서열번호 5 에 기재된 DNA 프라이머와 서열번호 6 에 기재된 DNA 프라이머를 퍼셉티브ㆍ바이오시스템즈사 제조의 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.

상기 합성 DNA 를 프라이머로서 사용하고, 에쉐리히아 콜리 K235 (ATCC13027) 주의 염색체 DNA 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하였다. PCR 은 염색체 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 각 0.5 ㎛ol/ℓ, Pfu DNA 폴리머라아제 (STRATAGENE 사 제조) 2.5 유닛, Pfu DNA 폴리머라아제용 ×10 완충액 (STRATAGENE 사 제조) 4 ㎕, 데옥시 NTP 각 200 ㎛ol/ℓ을 포함하는 반응액 40 ㎕ 를 사용하고, 94 ℃ - 1 분간, 42 ℃ - 2 분간, 72 ℃ - 3 분간의 공정을 1 사이클로 하여 30 사이클 반복함으로써 실시하였다.

그 반응액의 1/10 양을 아가로오스겔 전기영동하고, 목적하는 단편이 증폭되어 있는 것을 확인 후, 남은 반응액과 등량의 TE 포화페놀/클로로포름 (1 부피 / 1 부피) 을 첨가하여 혼합하였다. 그 혼합액을 원심분리 후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, -80 ℃ 에 30 분간 방치하였다. 그 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻었다.

그 DNA 의 침전을 20 ㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 그 용해액 5 ㎕ 을 사용하고, DNA 를 제한효소 ClaI 및 BamHI 로 절단하고, 아가로오스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 II 키트 (바이오 101 사 제조) 에 의해 1.1 kb 의 단편을 회수하였다. pPAC 31 DNA (WO98/12343) 0.2 ㎍ 를 제한효소 ClaI 및 BamHI 로 절단 후, 아가로오스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5 kb 의 단편을 회수하였다.

상기 1.1 kb 및 5.5 kb 의 단편을 라이게이션키트를 사용하여, 16 ℃, 16 시간, 연결반응을 실시하였다. 그 연결반응액을 사용하여 포스포에놀피루브산 생산능력을 갖는 에쉐리히아 콜리 NM522 주를 전술한 공지의 방법에 따라 형질전환시키고, 그 형질전환체를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 한천배지에 도포 후, 30 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다.

생육한 형질전환체의 콜로니로부터, N-아세틸뉴라민산 신세타아제 유전자 neuB 를 보유하는 형질전환체 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 을 취득하였다. 그 균주로부터 공지의 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, N-아세틸뉴라민산 신세타아제 유전자 발현 플라스미드인 pYP18 를 얻었다. 그 플라스미드의 구조를 제한효소 절단에 의해 확인하였다 (도 2).

실시예 4. N-아세틸뉴라민산의 생산

실시예 3 에서 얻은 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 한천배지 125 ㎖ 가 들어 있는 1 L 용 배플이 딸린 삼각 프라스코에 접종하고, 28 ℃ 에서 220 rpm 의 조건으로 17 시간 배양하였다. 그 배양액 125 ㎖ 를 글루코오스 10 g/ℓ, 박토트립톤 (디프코사 제조) 12 g/ℓ, 효모 추출물 (디프코사 제조) 24 g/ℓ, KH₂PO₄ 2.3 g/ℓ, K₂HPO₄ 12.5 g/ℓ, 암피실린 50 ㎍/㎖ 의 조성으로 이루어진 액체배지 (pH 무조정) 2.5 L 가 들어 있는 5 L 용 배양조에 접종하고, 37 ℃ 에서 4 시간 배양한 후, 40 ℃ 에서 3 시간, 600 rpm, 통기량 2.5 L/분의 조건으로 배양을 실시하였다. 배양 중, 28 % 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 7.0 으로 유지하였다. 또, 배양 도중에 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다. 그 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주 습균체 50 g/ℓ, 프룩토오스 65 g/ℓ, N-아세틸만노사민 40 g/ℓ, KH₂PO₄ 25 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ, 피틴산 5 g/ℓ, 나이민 S-215 4 g/ℓ, 크실렌 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30 ㎖ 를 200 ㎖ 용 비커에 넣고, 그 반응액을 자성 교반기로 교반 (900 rpm) 하고, 32 ℃ 에서 19 시간 반응을 실시하였다. 반응 중, 4N NaOH 를 사용하여 그 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 프룩토오스, KH₂PO₄를 첨가하였다.

반응종료 후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조의 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 1.4 g/ℓ의 N-아세틸뉴라민산이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 5. N-아세틸뉴라민산의 생산

실시예 3 에서 얻은 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주를 실시예 2 에 기재된 방법으로 배양하고, 원심분리에 의해 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었 다.

Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 주를 글루코오스 50 g/ℓ, 폴리펩톤 (니혼세이야꾸사 제조) 10 g/ℓ, 효모 추출물 (오리엔탈코오보사 제조) 10 g/ℓ, 우레아 5 g/ℓ, (NH₄)₂SO₄ 5 g/ℓ, KH₂PO₄ 1 g/ℓ, K₂HPO₄ 3 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 1 g/ℓ, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.1 g/ℓ, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎/ℓ, ZnSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎/ℓ, MgSO₄ㆍ4∼6H₂O 20 ㎎/ℓ, L-시스틴 20 ㎎/ℓ, D-판테토산 칼슘 10 ㎎/ℓ, 비타민 B₁ 5 ㎎/ℓ, 니코틴산 5 ㎎/ℓ, 및 비오틴산 30 ㎍/ℓ(10N NaOH 로 pH 7.2 로 조정) 조성으로 이루어진 액체배지 25 ㎖ 가 들어 있는 300 ㎖ 용 배플이 딸린 삼각 프라스코에 접종하고, 28 ℃ 에서 220 rpm 의 조건으로 24 시간 배양하였다.

그 배양액 20 ㎖ 를 상기와 동일한 조성의 액체배지 250 ㎖ 가 들어 있는 2 L 용 배플이 딸린 삼각 프라스코에 접종하고, 28 ℃ 에서 220 rpm 의 조건으로 24 시간 배양하였다. 얻어진 배양액을 종배양액으로서 사용하였다.

그 종배양액 250 ㎖ 를, 글루코오스 150 g/ℓ, 고기 추출물 (교꾸또세이야꾸사 제조) 5 g/ℓ, KH₂PO₄ 10 g/ℓ, K₂HPO₄ 10 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 10 g/ℓ, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.1 g/ℓ, FeSO₄ㆍ7H₂O 20 ㎎/ℓ, ZnSO₄ㆍ7H ₂O 10 ㎎/ℓ, MgSO₄ㆍ4∼6H₂O 20 ㎎/ℓ(별도 살균), β-알라닌 15 ㎎/ℓ(별도 살균), L-시스틴 20 ㎎/ℓ, 비오틴 100 ㎍/ℓ, 우레아 2 g/ℓ, 및 비타민 B 15 ㎎/ℓ(별도 살균) (10N NaOH 로 pH 7.2 로 조정) 조성으로 이루어진 액체배지 2.25 L 가 들어 있는 5 L 용 배양조에 접종 하고, 32 ℃, 600 rpm, 통기량 2.5 L/분의 조건으로 24 시간 배양을 실시하였다. 배양 중, 28 % 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 6.8 로 유지하였다.

그 배양액을 원심분리하고, 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주 습균체 50 g/ℓ, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC21170 주 습균주 150 g/ℓ, 프룩토오스 65 g/ℓ, N-아세틸만노사민 40 g/ℓ, KH₂PO₄ 25 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ, 피틴산 5 g/ℓ, 나이민 S-215 4 g/ℓ, 크실렌 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30 ㎖ 를 200 ㎖ 용 비커에 넣고, 그 반응액을 자성 교반기로 교반 (900 rpm) 하고, 32 ℃ 에서 6 시간 반응을 실시하였다. 반응 중, 4N NaOH 를 사용하여 그 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 프룩토오스, KH₂PO₄를 첨가하였다.

반응종료 후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조의 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 3.1 g/ℓ의 N-아세틸뉴라민산이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 6. 시네코시스티스 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제 유전자 발현주의 조성

돼지 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제의 아미노산 서열 [J. Biol. Chem., 271, 16294 (1996)] 을 Query 로서, Genbank 의 Blast Search 및 시네코시스티스 sp. (PCC6803) 주의 게놈 서열의 데이터베이스인 CyanoBase (http://www.kazusa.or.jp/cyano/) 에 있어서 상동성 검색 (Similarity Search) 을 실시한 결과, 상기 아미노산 서열은 레닌 결합 단백질 이라는 기재가 있는 시네코시스티스 sp. (PCC6803) 유래의 서열 (slr1975) 과 높은 상동성을 나타내었다.

시네코시스티스 sp. (PCC6803) 주를 J. Gen. Microbiol., 111, 1 (1979) 에 기재된 방법으로 배양 후, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지에 기재된 방법으로, 상기 미생물의 염색체 DNA 를 단리정제하였다.

퍼셉티브ㆍ바이오시스템즈사 제조의 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성한 서열번호 7 및 8 에 기재된 DNA 를 프라이머로서 사용하고, 시네코시스티스 sp. (PCC6803) 주의 염색체 DNA 를 주형으로 하여 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 PCR 반응을 실시하였다.

그 반응액의 1/10 양을 아가로오스겔 전기영동하고, 목적하는 단편이 증폭되어 있는 것을 확인 후, 남은 반응액과 등량의 TE 포화페놀/클로로포름 (1 부피 / 1 부피) 을 첨가하여 혼합하였다.

그 혼합액을 원심분리 후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, -80 ℃ 에 30 분간 방치하였다. 그 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻었다.

그 DNA 의 침전을 20 ㎕ 의 TE 에 용해시켰다.

그 용해액 5 ㎕ 을 사용하고, DNA 를 제한효소 ClaI 및 BamHI 로 절단하고, 아가로오스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진클린 II 키트 (바이오 101 사 제조) 에 의해 1.2 kb 의 단편을 회수하였다.

pPAC 31 DNA 0.2 ㎍ 를 제한효소 ClaI 및 BamHI 로 절단 후, 아가로오스겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5 kb 의 단편을 회수하였다.

그 1.2 kb 및 5.5 kb 의 단편을 라이게이션키트를 사용하고, 16 ℃, 16 시간, 연결반응을 실시하였다.

그 연결반응액을 사용하여 에쉐리히아 콜리 NM522 주를 전술한 공지의 방법에 따라 형질전환시키고, 그 형질전환체를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 한천배지에 도포 후, 30 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다.

생육한 형질전환체의 콜로니로부터, 시네코시스티스 sp. 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 코딩하는 DNA 를 보유하는 형질전환체 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 을 취득하였다. 그 균주로부터 공지의 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 발현 플라스미드인 pYP16 을 얻었다. 그 플라스미드의 구조를 제한효소 절단에 의해 확인하였다 (도 3).

실시예 7. N-아세틸뉴라민산의 생산

실시예 1 에서 얻은 에쉐리히아 콜리 NM522/pTA3 주를 실시예 2 에 기재된 방법으로 배양하고, 원심분리에 의해 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었다.

실시예 6 에서 얻은 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 주를 암피실린 50 ㎍/㎖ 를 포함하는 LB 한천배지 125 ㎖ 가 들어 있는 1 L 용 배플이 딸린 삼각 프라스코에 접종하고, 28 ℃ 에서 220 rpm 의 조건으로 17 시간 배양하였다. 그 배양액 125 ㎖ 를 글루코오스 10 g/ℓ, 박토트립톤 (디프코사 제조) 12 g/ℓ, 효모 추출물 (디프코사 제조) 24 g/ℓ, KH₂PO₄ 2.3 g/ℓ, K₂HPO₄ 12.5 g/ℓ, 암피실린 50 ㎍/㎖ 의 조성으로 이루어진 액체배지 (pH 무조정) 2.5 L 가 들어 있는 5 L 용 배양조에 접종하고, 30 ℃ 에서 4 시간 배양한 후, 40 ℃ 에서 3 시간, 600 rpm, 통기량 2.5 L/분의 조건으로 배양을 실시하였다. 배양 중, 28 % 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 7.0 으로 유지하였다. 또, 배양 도중에 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다.

그 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었다.

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC21170 주를, 실시예 5 에 기재된 방법으로 배양하고, 원심분리에 의해 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pTA3 주 습균체 50 g/ℓ, 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 주 습균체 50 g/ℓ, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC21170 주 습균주 150 g/ℓ, 프룩토오스 65 g/ℓ, N-아세틸글루코사민 180 g/ℓ, KH₂PO₄ 25 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ, 피틴산 5 g/ℓ, 나이민 S-215 4 g/ℓ, 크실렌 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30 ㎖ 를 200 ㎖ 용 비커에 넣고, 그 반응액을 자성 교반기로 교반 (900 rpm) 하고, 32 ℃ 에서 24 시간 반응을 실시하였다. 반응 중, 4N NaOH 를 사용하여 그 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 프룩토 오스, KH₂PO₄를 첨가하였다.

반응종료 후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조의 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 1.0 g/ℓ의 N-아세틸뉴라민산이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 8. N-아세틸뉴라민산의 생산

실시예 3 에서 얻은 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주 및 실시예 6 에서 얻은 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 주를 실시예 4 및 7 에 기재된 방법에 준하여 각각 배양하고, 원심분리에 의해 습균체를 취득하였다. 그 습균체는 필요에 따라 -20 ℃ 에서 보존하는 것이 가능하며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있었다.

에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 주 습균체 50 g/ℓ, 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주 습균체 50 g/ℓ, 프룩토오스 65 g/ℓ, N-아세틸글루코사민 180 g/ℓ, KH₂PO₄ 25 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ, 피틴산 5 g/ℓ, 나이민 S-215 4 g/ℓ, 크실렌 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30 ㎖ 를 200 ㎖ 용 비커에 넣고, 그 반응액을 자성 교반기로 교반 (900 rpm) 하고, 32 ℃ 에서 24 시간 반응을 실시하였다. 반응 중, 4N NaOH 를 사용하여 그 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 프룩토오스, KH₂PO₄를 첨가하였다.

반응종료 후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조의 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 1.3 g/ℓ의 N-아세틸뉴라민산이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 9. N-아세틸뉴라민산의 생산

에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 주 습균체 50 g/ℓ, 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주 습균체 50 g/ℓ, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC21170 주 습균주 150 g/ℓ, 프룩토오스 65 g/ℓ, N-아세틸글루코사민 180 g/ℓ, KH₂PO₄ 25 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ, 피틴산 5 g/ℓ, 나이민 S-215 4 g/ℓ, 크실렌 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30 ㎖ 를 200 ㎖ 용 비커에 넣고, 그 반응액을 자성 교반기로 교반 (900 rpm) 하고, 32 ℃ 에서 24 시간 반응을 실시하였다. 반응 중, 4N NaOH 를 사용하여 그 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 프룩토오스, KH₂PO₄를 첨가하였다.

반응종료 후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조의 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 4.3 g/ℓ의 N-아세틸뉴라민산이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 10. N-아세틸뉴라민산의 생산

에쉐리히아 콜리 NM522/pYP16 주 습균체 50 g/ℓ, 에쉐리히아 콜리 NM522/pYP18 주 습균체 50 g/ℓ, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC21170 주 습균주 150 g/ℓ, 글루코오스 100 g/ℓ, N-아세틸글루코사민 180 g/ℓ, 아데닌 5 g/ℓ, KH₂PO₄ 15 g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ, 피틴산 5 g/ℓ, 나이민 S-215 4 g/ℓ, 크실렌 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30 ㎖ 를 200 ㎖ 용 비커에 넣고, 그 반응액을 자성 교반기로 교반 (900 rpm) 하고, 32 ℃ 에서 22 시간 반응을 실시하였다. 반응 중, 4N NaOH 를 사용하여 그 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 글루코오스, KH₂PO₄를 첨가하였다.

반응종료 후, 반응생성물을 다이오넥스사 제조의 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 12.3 g/ℓ의 N-아세틸뉴라민산이 생성 축적되어 있는 것을 확인하였다.

본 발명에 의해, 피루브산 등의 고가의 원료를 첨가하지 않고 N-아세틸뉴라민산을 효율적으로 제조할 수 있다.

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> A METHOD FOR PRODUCING N-ACETYLNEURAMINIC ACID <150> JP1999-242670 <151> 1999-08-30 <160> 8 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 1173 <212> DNA <213> Synechocystis sp.(PCC6803) <220> <221> CDS <222> (1)..(1173) <400> 1 atg att gcc cat cgc cgt cag gag tta gcc cag caa tat tac cag gct 48 Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala 1 5 10 15 tta cac cag gac gta ttg ccc ttt tgg gaa aaa tat tcc ctc gat cgc 96 Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg 20 25 30 cag ggg ggc ggt tac ttt acc tgc tta gac cgt aaa ggc cag gtt ttt 144 Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe 35 40 45 gac aca gat aaa ttc att tgg tta caa aac cgt cag gta tgg cag ttt 192 Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe 50 55 60 gcc gtt ttc tac aac cgt ttg gaa cca aaa ccc caa tgg tta gaa att 240 Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile 65 70 75 80 gcc cgc cat ggt gct gat ttt tta gct 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gcc caa acc gtc aga gaa gtg atg acg 624 Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr 195 200 205 gat ttc ctc gac cca gaa ata gga tta atg cgg gaa gcg gtg acc ccc 672 Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro 210 215 220 aca gga gaa ttt gtt gat agt ttt gaa ggg cgg ttg ctc aac cca gga 720 Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly 225 230 235 240 cac ggc att gaa gcc atg tgg ttc atg atg gac att gcc caa cgc tcc 768 His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser 245 250 255 ggc gat cgc cag tta cag gag caa gcc att gca gtg gtg ttg aac acc 816 Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr 260 265 270 ctg gaa tat gcc tgg gat gaa gaa ttt ggt ggc ata ttt tat ttc ctt 864 Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu 275 280 285 gat cgc cag ggc cac cct ccc caa caa ctg gaa tgg gac caa aag ctc 912 Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu 290 295 300 tgg tgg gta cat ttg gaa acc ctg gtt gcc cta gcc aag ggc cac caa 960 Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln 305 310 315 320 gcc act ggc caa gaa aaa tgt tgg caa tgg ttt gag cgg gtc cat gat 1008 Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp 325 330 335 tac gcc tgg agt cat ttc gcc gat cct gag tat ggg gaa tgg ttt ggc 1056 Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly 340 345 350 tac ctg aat cgc cgg gga gag gtg tta ctc aac cta aaa ggg ggg aaa 1104 Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys 355 360 365 tgg aaa ggg tgc ttc cac gtg ccc cga gct ctg tgg ctc tgt gcg gaa 1152 Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu 370 375 380 act ctc caa ctt ccg gtt agt 1173 Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser 385 390 <210> 2 <211> 391 <212> PRT <213> Synechocystis sp.(PCC6803) <400> 2 Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg 20 25 30 Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe 35 40 45 Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe 50 55 60 Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile 65 70 75 80 Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp 85 90 95 Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln 100 105 110 Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln 115 120 125 Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln 130 135 140 Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr 145 150 155 160 Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro 165 170 175 Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro 180 185 190 Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr 195 200 205 Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro 210 215 220 Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly 225 230 235 240 His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser 245 250 255 Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr 260 265 270 Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu 275 280 285 Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu 290 295 300 Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln 305 310 315 320 Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp 325 330 335 Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly 340 345 350 Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys 355 360 365 Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu 370 375 380 Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser 385 390 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gtgtaagctt tctgtatggg gtgt 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 gcagggatcc caaccaggca gcggaa 26 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 tttatcgata ttaattaggg ggaatgaatg ag 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 tttggatcct cattattccc cctgattttt gaa 33 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 taaatcgata tttgtatgat tgcccatcgc cgtcag 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 aaaggatcct taactaaccg gaagttggag agtttc 36

Claims

수성매체 중에, ① N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, ② 포스포에놀피루브산의 생성능력을 갖는 에쉐리히아속 또는 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, ③ 시네코시스티스 (Synechocystis) 속에 속하는 미생물 유래의 N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 코딩하는 DNA 로 이루어지는 DNA 단편과 벡터와의 재조합 DNA 를 보유하는 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물, 및 N-아세틸글루코사민을 수성매체 중에 존재시키고, 그 수성매체 중에서 N-아세틸만노사민을 생성 축적시킴으로써 얻어지는 N-아세틸만노사민, 및 ④ 포스포에놀피루브산의 생성에 필요한 에너지원을 존재시키고, 그 수성매체 중에서 N-아세틸뉴라민산을 채취하는 것을 특징으로 하는 N-아세틸뉴라민산의 제조법.
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 코딩하는 DNA 가, 이하의 (a) 또는 (b) 의 DNA 인 제조법:

(a) 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA; 또는

(b) 서열번호 1 에 기재된 염기서열을 갖는 DNA.
삭제
제 1 항에 있어서, N-아세틸뉴라민산 신세타아제 활성을 갖는 미생물이 에쉐리히아속, 나이세리아속 및 스트렙토코커스 (Streptococcus)속으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물인 제조법.
삭제
삭제
제 1 항, 제 5 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 에쉐리히아속에 속하는 미생물이 에쉐리히아 콜리 (Escherichia coli)인 제조법.
제 1 항, 제 5 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움속에 속하는 미생물이, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 및 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 제조법.