KR101311571B1 - 시티딘이인산 콜린의 정제 방법 - Google Patents

시티딘이인산 콜린의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 유연 물질을 포함하는, pH가 0.5 이상 5.0 이하의 시티딘이인산 콜린 용액을 H형 강산성 양이온 교환 수지와 접촉시켜, 상기 수지에 흡착된 시티딘이인산 콜린을 물 또는 이온 농도 0.1 mol/ℓ 이하의 수용액으로 용출시킴으로써, 시티딘이인산 콜린을 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 시티딘이인산 콜린의 정제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

Description

시티딘이인산 콜린의 정제 방법{METHOD FOR PURIFICATION OF CYTIDINEDIPHOSPHORIC CHOLINE}
본 발명은 의약품 원료, 영양식품 원료로서 유용한 시티딘이인산 콜린의 정제 방법에 관한 것이다.
시티딘이인산 콜린(이하, CDP-콜린이라 약기함)의 제조 방법으로는, 화학적 합성 방법(특허 문헌 1, 특허 문헌 2), 미생물의 배양물 또는 효소를 이용하는 방법(특허 문헌 3, 특허 문헌 4)이 알려져 있다. 화학합성법으로 제조된 CDP-콜린의 정제 방법으로는, 음이온 교환 수지를 이용하는 방법(특허 문헌 1), 강산성 이온 교환 수지 및 약염기성 이온 교환 수지를 조합하여 이용하는 정제 방법(특허 문헌 2)이 알려져 있으나, 후자의 방법으로는 2종의 이온 교환 수지를 사용한 후, CDP-콜린 용액 중에 함유된 포스포릴콜린, 시티딘-5'-일인산(이하, CMP라 약기함)은 분리할 수 있지만, 우라실 또는 우리딘-5'-삼인산(이하, UTP라 약기함)을 효율적으로 분리할 수는 없다.
특허 문헌 1: 일본 특허공고 소 63-6558호
특허 문헌 2: 일본 특허공고 평 6-31306호
특허 문헌 3: 일본 특허 제3369236호
특허 문헌 4: 국제공개 제99/49073호 팜플렛
본 발명의 목적은 CDP-콜린과 핵산 유연 물질을 간편하게 분리할 수 있는, CDP-콜린의 정제 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 이하의 (1)∼(6)에 관한 것이다.
(1) 핵산 유연 물질을 함유하고, 또한 pH가 0.5 이상 5.0 이하인 CDP-콜린 용액을, H형 강산성 양이온 교환 수지와 접촉시켜, 상기 수지에 흡착한 CDP-콜린을 물 또는 이온 농도가 0.1 mol/ℓ 이하인 수용액으로 용출시켜, CDP-콜린을 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 CDP-콜린의 정제 방법.
(2) CDP-콜린 용액은, UTP 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 활성을 갖는 생체 촉매를, UTP 전구체 및 콜린 혹은 포스포릴콜린 또는 이의 염과 수성 매체 중에서 공존시켜, 상기 매체 중에 CDP-콜린을 생성 축적시킴으로써 얻어지는 상기 매체로 조제되는 용액인, 상기 (1)에 기재한 CDP-콜린의 정제 방법.
(3) 생체 촉매는 UTP 전구체로부터 UTP를 생성할 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물, 및 UTP와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성할 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물을 함유하는 생체 촉매인, 상기 (2)에 기재한 CDP-콜린의 정제 방법.
(4) 생체 촉매는 UTP 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소를 함유하는 생체 촉매인, 상기 (2)에 기재한 CDP-콜린의 정제 방법.
(5) CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소는 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라제, 오로티딘-5'-일인산 데카르복실라제, 우리딘 포스포릴라제, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제, 우리딘 키나제, 우리딜산·시티딜산 키나제, 뉴클레오시드 이인산 키나제, 시티딘-5'-삼인산 신타제, 콜린 포스페이트 시티딜 트랜스퍼라제 및 콜린 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소인, 상기 (4)에 기재한 CDP-콜린의 정제 방법.
(6) 핵산 유연 물질은 우라실 및 UTP에서 선택되는 물질인, 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재한 CDP-콜린의 정제 방법.
본 발명에 의해, CDP-콜린 및 그 염이 저렴하게 제공된다.
본 발명에 이용되는 CDP-콜린 용액이, 핵산 유연 물질을 함유하고, 또한 pH가 0.5 이상 5.0 이하인 용액이라면 어떠한 방법으로 조제된 용액이라도 좋고, 조제된 CDP-콜린 용액의 pH가 0.5∼5.0이라면 그대로, pH가 5.0보다 큰 경우에는, 염산, 황산, 질산, 인산 등의 산을 첨가하고, pH가 0.5보다 작은 경우에는, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리를 첨가하고, pH를 0.5 이상 5.0 이하, 바람직하게는 1.0 이상∼3.5 이하로 조정하여 이용할 수 있다.
H형 강산성 양이온 교환 수지는, H형 강산성 양이온 교환 수지라면 겔형이어도 다공형이어도 좋고, 구체적으로 다우케미컬사 제조의 다우 웩스시리즈(예를 들면, HCR-S, HCR-W2, 마라톤 C, 모노스피어 650C, MSC-1, 모노스피어 88, 50W× 2, 50W × 4, 50W × 8 등), 미쓰비시 화학사 제조의 다이아이온 SK시리즈(예를 들면, SK1B, SK104, SK110, SK112 등), 미쓰비시 화학사 제조의 다이아이온 PK시리즈(예를 들면, PK208, PK212, PK220, PK228 등), 롬·앤드·하스사 제조의 앰버라이트시리즈(예를 들면, IR120B, IR124 등) 등이 있다.
H형 강산성 양이온 교환 수지의 가교도는 CDP-콜린과 핵산 유연 물질을 분리할 수 있는 가교도라면 별다른 제한은 없지만, 2∼10%가 바람직하고, 더욱 바람직하게는, 4∼6%이다.
H형 강산성 양이온 교환 수지는 컬럼에 충전된 형태로 본 발명에 이용하는 것이 바람직하지만, 본 발명에 이용되는 컬럼은 어떠한 것이라도 좋다.
핵산 유연 물질을 함유하고, 또한 pH가 0.5 이상 5.0 이하인 CDP-콜린 용액을, H형 강산성 양이온 교환 수지가 충전된 컬럼에 통탑(通塔) 등을 함으로써 상기 수지에 접촉시켜 CDP-콜린을 상기 수지에 흡착시키지만, 예를 들어, 가교도 2∼10%의 H형 강산성 양이온 교환 수지의 충전된 컬럼에 통탑할 때의 통탑 속도는 SV=0.1∼5.0, 바람직하게는 SV=0.2∼3.0이다.
상기 흡착 처리에 의해, CDP-콜린과, 용액 중에 포함되는 핵산 유연 물질, 특히, 오로트산, 오로티딘-5'-일인산(이하, OMP라 약기함), 우리딘-5'-일인산(이하, UMP라 약기함), 우리딘-5'-이인산(이하, UDP라 약기함), UTP, CMP, 시티딘-5'-이인산(이하, CDP라 약기함), 시티딘-5'-삼인산(이하, CTP라 약기함) 등의 피리미딘계 핵산 물질을 적합하게 분리, 제거할 수 있다. 핵산 유연 물질 중, 우라실 또는 UTP는, 이들을 함유하는 CDP-콜린 용액을 pH 0.5 이상 5.0 이하로 상기 수지에 접촉시켜도, 상기 수지에는 거의, 또는 전혀 흡착되지 않기 때문에, 우라실 또는 UTP를 특히 적합하게 분리, 제거할 수 있다.
H형 강산성 양이온 교환 수지에 흡착되어 있는 CDP-콜린은, 이온 농도 0.1 mol/ℓ 이하, 바람직하게는, 0.03 mol/ℓ 이하의 수용액, 더욱 바람직하게는 물을 통탑하는 등에 의해 용출함으로써, CDP-콜린을 수지로부터 용리하고, CDP-콜린을 분리 정제할 수 있다.
상기 용출 공정에 의해, 채취한 CDP-콜린 함유액은, 필요에 따라 활성탄 처리하거나, 비극성 다공질 합성 흡착제, 예컨대 미쓰비시 화학사 제조의 다이아이온 HP시리즈(예를 들면, HP20, HP21 등), 미쓰비시 화학사 제조의 다이아이온 SP800시리즈(예를 들면, SP825, SP850 등), 미쓰비시 화학사 제조의 다이아이온 SP200시리즈(예를 들면, SP207 등), 롬·앤드·하스사가 제조한 앰버라이트 XAD시리즈(예를 들면, XAD4, XAD7HP, XAD16HP, XAD1180, XAD2000 등) 등을 이용하여 탈색 처리하여도 좋다.
상기 CDP-콜린 함유액 또는 탈색액을, 산 또는 알칼리로 pH 2.0∼4.0로 조정하고, 필요에 따라 농축 후, CDP-콜린의 농도를 50∼800 g/ℓ, 바람직하게는 100∼700 g/ℓ로 조정하고, 유기 용매, 바람직하게는 아세톤, 에탄올, 메탄올, 프로판올 등의 친수성 유기 용매를 이용하여 CDP-콜린 결정을 취득할 수 있다.
또한, 상기한 CDP-콜린 함유액 또는 탈색액을 수산화나트륨으로 pH 5.0∼9.5으로 조정하고, 필요에 따라 농축 후, CDP-콜린 농도를 50∼800 g/ℓ, 바람직하게는 100∼700 g/ℓ로 조정하고, 유기 용매, 바람직하게는 아세톤, 에탄올, 메탄올, 프로판올 등의 친수성 유기 용매를 이용하여, CDP-콜린 나트륨염 결정을 취득할 수 있다.
유기 용매를 이용하여 CDP-콜린 결정을 취득하는 방법으로는, 예를 들면, CDP-콜린 용액에 유기 용매를 첨가하여 결정을 석출시키는 방법, 또는 대량의 유기 용매 속에 CDP-콜린 용액을 적하하여 결정을 석출시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 핵산 유연 물질을 함유하는 CDP-콜린 용액으로는, CDP-콜린과 핵산 유연 물질을 함유하는 용액이라면 어떠한 것이라도 좋지만, 화학합성법, UTP 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 활성(이하, CDP-콜린 생성 활성이라 약기함)을 갖는 생체 촉매를 이용한 방법에 의해 제조되는 용액을 들 수 있다.
상기 생체 촉매로는, CDP-콜린 생성 활성을 갖는 미생물의 배양물, 이 배양물의 처리물, CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소 등을 들 수 있다.
상기 미생물로는, CDP-콜린 생성 활성을 갖는 미생물이라면 어떤 미생물이라도 좋고, 원래 CDP-콜린 생성 활성을 갖는 미생물은 그대로 CDP-콜린의 생산에 이용될 수 있으며, 원래 CDP-콜린 생성 활성을 갖지 않는 미생물은, UTP 전구체와 콜린 또는 포스포콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소를 코딩하는 DNA를 도입함으로써, CDP-콜린의 생산에 이용할 수 있다. 이 미생물로는, 바람직하게는, 에셰리키아(Escherichia)속, 세라티아(Serratia)속, 바실러스(Bacillus)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 시노리조비움(Sinorhizobium)속, 헤모필루스(Haemophilus)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 오레오박테리움(Aureobacterium)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속, 클라비박터(Clavibacter)속, 쿠르토박테리움(Curtobacterium)속, 피멜로박터(Pimerobacter)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces)속, 피치아(Pichia)속, 및 칸디다(Candida)속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다.
에셰리키아속에 속하는 미생물로는, 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) MM294, 에셰리키아 콜라이 XL1-Blue, 에셰리키아 콜라이 XL2-Blue, 에셰리키아 콜라이 DH1, 에셰리키아 콜라이 MC1000, 에셰리키아 콜라이 KY3276, 에셰리키아 콜라이 W1485, 에셰리키아 콜라이 JM109, 에셰리키아 콜라이 HB101, 에셰리키아 콜라이 No.49, 에셰리키아 콜라이 W3110, 에셰리키아 콜라이 NY49, 에셰리키아 콜라이 GI698, 및 에셰리키아 콜라이 TB1 등의 에셰리키아 콜라이에 속하는 미생물을 들 수 있다. 세라티아속에 속하는 미생물로는, 예컨대, 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아 리퀘파시엔스(Serratia liquefaciens) 및 세라티아 마르세신스(Serratia marcescens) 등을 들 수 있다. 바실러스속에 속하는 미생물로서는, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메카테리움(Bacillus megaterium) 및 바실러스 아밀롤리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 등을 들 수 있다. 브레비박테리움속에 속하는 미생물로는, 브레비박테리움 이마리오필룸(Brevibacterium immariophilum), 브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 등을 들 수 있다. 코리네박테리움속에 속하는 미생물로는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 등의 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 미생물, 코리네박테리움 암모니아진스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6872, 및 코리네박테리움 암모니아진스 ATCC21170 등의 코리네박테리움 암모니아진스에 속하는 미생물, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870 등의 코리네박테리움 아세토아시도필룸에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 마이크로박테리움속에 속하는 미생물로는, 마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354 등의 마이크로박테리움 암모니아필룸에 속하는 미생물, 마이크로박테리움 락티움(Microbacterium lactium) 및 마이크로박테리움 임페리알(Microbacterium imperiale)레 등을 들 수 있다. 슈도모나스속에 속하는 미생물로는, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 들 수 있다. 스트렙토코커스속에 속하는 미생물로는, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 등을 들 수 있다. 시노리조비움속에 속하는 미생물로는, 시노리조비움 멜릴로티(Sinorhizobium meliloti) 등을 들 수 있다. 헤모필루스속에 속하는 미생물로서는, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 등을 들 수 있다. 아스로박터속에 속하는 미생물로는, 아스로박터 시트루스(Arthrobacter citreus), 아스로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) 등을 들 수 있다. 오레오박테리움속에 속하는 미생물로는, 오레오박테리움 플라베센스(Aureobacterium flavescens), 오레오박테리움 사페르다(Aureobacterium saperdae) 및 오레오박테리움 테스타슘(Aureobacterium testaceum) 등을 들 수 있다. 셀룰로모나스속에 속하는 미생물로서는, 셀룰로모나스 플라비제나(Cellulomonas flavigena) 및 셀룰로모나스 카르타(Cellulomonas carta) 등을 들 수 있다. 클라비박터속에 속하는 미생물로서는, 클라비박터 미키가넨시스(Clavibacter michiganensis) 및 클라비박터 라타이(Clavibacter rathayi) 등을 들 수 있다. 쿠르토박테리움속에 속하는 미생물로서는, 쿠르토박테리움 알비둠(Curtobacterium albidum), 쿠르토박테리움 시트륨(Curtobacterium citreum) 및 쿠르토박테리움 루튬(Curtobacterium luteum) 등을 들 수 있다. 피멜로박터속에 속하는 미생물로서는, 피멜로박터 심플렉스(Pimerobacter simplex) 등을 들 수 있다.
사카로마이세스속에 속하는 미생물로는, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 등을 들 수 있다. 시조사카로마이세스속에 속하는 미생물로서는, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등을 들 수 있다. 클루이베로마이세스속에 속하는 미생물로서는, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 등을 들 수 있다. 트리코스포론속에 속하는 미생물로서는, 트리코스포론 풀룰란스(Trichosporon pullulans) 등을 들 수 있다. 슈완니오마이세스속에 속하는 미생물로서는, 슈완니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다. 피치아속에 속하는 미생물로서는, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 등을 들 수 있다. 칸디다속에 속하는 미생물로서는, 칸디다 우틸리스(Candida utilis) 등을 들 수 있다.
또한, 해당 미생물로서, 보다 바람직하게는, 에셰리키아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속 및 사카로마이세스속에 속하는 미생물을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 에셰리키아속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속에 속하는 미생물을 들 수 있다.
상기 미생물 중, 원래 CDP-콜린 생성 활성을 갖는 미생물이라도 CDP-콜린 생성 활성이 충분히 강하지 않은 경우에는, 상기 미생물에, UTP 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소를 코딩하는 DNA를 갖는 재조합체 DNA를 통상적인 방법에 의해 도입하거나, 이 활성을 갖는 다른 미생물 세포를 융합시킴으로써, 이 활성의 강화된 미생물을 제작하여 이용해도 좋다.
상기 활성이 강화된 미생물 및 상기 활성이 부여된 미생물로는, 상기 반응을 담당하는 효소를 코딩하는 DNA를, 이하에 나타내는 방법에 의해 미생물에 도입하여 얻어지는 형질 전환체가 바람직하게 이용된다.
UTP 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소(이하, CDP-콜린 생성 효소라 약기함)를 코딩하는 DNA로는, 예를 들면, 오로트산으로부터 OMP를 생성하는 활성을 갖는 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라제[EC 2.4.2.10], OMP로부터 UMP를 생성하는 활성을 갖는 오로티딘-5'-일인산 데카르복실라제[EC 4.1.1.23], 우라실로부터 우리딘을 생성하는 활성을 갖는 우리딘 포스포릴라제[EC 2.4.2.3], 우라실로부터 UMP를 생성하는 활성을 갖는 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제[EC 2.4.2.9], 우리딘으로부터 UMP를 생성하는 활성을 갖는 우리딘 키나제[EC 2.7.1.48], UMP로부터 UDP를 생성하는 활성을 갖는 우리딜산·시티딜산 키나제[EC 2.7.1.48], UDP로부터 UTP를 생성하는 활성을 갖는 뉴클레오시드 이인산 키나제[EC 2.7.4.6], UTP로부터 CTP를 생성하는 활성을 갖는 시티딘-5'-삼인산 신타제[EC 6.3.4.2](이하, PyrG라 약기함), 콜린으로부터 포스포릴콜린을 생성하는 활성을 갖는 콜린 키나제[EC 2.7.1.32](이하, CKI라 약기함)를 코딩하는 DNA 및 CTP와 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 활성을 갖는 콜린인산시티딜 트랜스퍼라제[EC 2.7.7.15](이하, CCT라 약기함)를 각각 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.
CDP-콜린 생성 효소를 코딩하는 DNA로는, 바람직하게는, PyrG, CKI 및 CCT를 코딩하는 DNA를 들 수 있다.
PyrG를 코딩하는 DNA는, 에셰리키아 콜라이의 염색체로부터 클로닝되고, 그 전체 염기 서열이 결정되어 있다[J. Biol. Chem., 261, 5568(1986)]. PyrG를 코딩하는 DNA를 갖는 재조합체로는, 에셰리키아 콜라이의 벡터 pUC8[Gene, 19, 259(1982)]의 다중 클로닝 부위의 SmaI-PstI 부위에 에셰리키아 콜라이 유래의 PyrG를 코딩하는 DNA를 포함한 2426 bp의 NruI-PstI 단편이 삽입된 플라스미드인 pMW6[Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 956 (1997)] 등을 들 수 있다.
CCT를 코딩하는 DNA는, 그 전염기 서열이 결정되어 있다[Eur. J. Biochem., 169, 477(1987)]. CCT를 코딩하는 DNA를 갖는 재조합체 DNA로는, 에셰리키아 콜라이의 벡터 pUC18[Gene, 33, 103(1985)]의 다중 클로닝 부위의 SmaI 부위에 효모 유래의 CCT를 코딩하는 DNA를 포함한 1296 bp의 DraI 단편이 삽입된 플라스미드 pCC41[생화학, 60, 701(1988)] 등을 들 수 있다.
CKI를 코딩하는 DNA도 마찬가지로 효모 염색체로부터 클로닝되고, 그 전염기 서열이 결정되어 있다[J. Biol. Chem., 264, 2053(1989)]. CKI를 코딩하는 DNA를 갖는 재조합체 DNA로는, 효모와 에셰리키아 콜라이의 셔틀 벡터 YEpM4[Mol. Cell. Biol., 7, 29(1987)]에 효모 유래의 CKI를 코딩하는 DNA를 포함한 2692 bp의 PstI-HindIII 단편이 삽입된 플라스미드 pCK1D[J. Biol. Chem., 264, 2053(1989)] 등을 들 수 있다.
상기 플라스미드는, 이들 플라스미드를 유지한 대장균으로부터 공지의 방법[Nuc. Acids Res., 7, 1513(1979)]에 따라 단리 정제할 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 플라스미드로부터, 예컨대, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrook 지음, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)]에 따라, CDP-콜린 생성 효소를 코딩하는 DNA를 취득하고, 상기 DNA를 발현 벡터에 조합해 넣으며, 재조합체 DNA를 제작하고, 상기 미생물을 숙주 세포로서 형질 전환함으로써, CDP-콜린 생성 활성을 갖는 생체 촉매를 취득할 수 있다.
우선, PyrG, CCT 또는 CKI를 코딩하는 DNA를 상기 플라스미드 pMW6, 플라스미드 pCC41 또는 플라스미드 pCK1D로부터 취득하여, 얻어진 DNA를 바탕으로 하여, 필요에 따라 상기 폴리펩티드를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
또한, 필요에 따라 CDP-콜린 생성 효소를 코딩하는 부분의 염기 서열을, 숙주 세포의 발현에 최적의 코돈이 되도록 염기를 치환한 DNA를 조제한다. 상기 DNA는 CDP-콜린 생성 효소를 효율적으로 제조하는 데 유용하다.
상기 DNA 단편, 또는 전체 길이 DNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 이 때, CDP-콜린 생성 효소를 코딩하는 DNA를, 각각 별개로 발현 벡터에 삽입하여도 좋고, 복수의 DNA를 동일한 발현 벡터에 삽입하여도 좋다.
이 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입한다.
숙주 세포로는, 상기 미생물을 들 수 있다.
발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능하거나, 염색체 내로 조합해 넣을 수 있고, CDP-콜린 생성 효소를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다.
숙주 세포로서, 세균 등의 원핵 생물을 이용하는 경우는, CDP-콜린 생성 효소를 코딩하는 DNA를 함유하여 이루어지는 재조합 벡터가 원핵 생물 내에서 자립 복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 상기 DNA, 전사 종결 서열로 구성된 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 좋다.
발현 벡터로는, 예컨대, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 베링거인겔하임사 시판), pKK233-2[파마시아(Pharmacia)사 제조], pSE280[인비트로젠(Invitrogen)사 제조], pGEMEX-1[프로메가(Promega)사 제조], pQE-8[키아젠사 제조], pKYP10(일본 특허 공개 소58-110600호), pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(-)[스트라타진(Stratagene)사 제조], pTrs30[에셰리키아 콜라이 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)에 의해 조제], pTrs32[에셰리키아 콜라이 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)에 의해 조제], pGHA2[에셰리키아 콜라이 IGHA2(FERM BP-400)에 의해 조제, 일본 특허 공개 소60-221091호], pGKA2[에셰리키아 콜라이 IGKA2(FERM BP-6798)에 의해 조제, 일본 특허 공개 소60-221091호], pTerm2(미국 특허 4686191호, 미국 특허 4939094호, 미국 특허 5160735호), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX[파마시아(Pharmacia)사 제조], pET 시스템[노바젠(Novagen)사 제조] 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 숙주 세포 내에서 기능하는 것이라면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, T7 프로모터 등의, 에셰리키아 콜라이나 파지(phage) 등에서 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 프로모터(Ptrp × 2), tac 프로모터, lac T7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계가 개량 변경된 프로모터 등도 이용할 수 있다.
리보솜 결합 서열인 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예를 들면, 6∼18 염기)로 조절한 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, CDP-콜린 생성 효소를 코딩하는 DNA의 발현에 전사 종결 서열이 반드시 필요한 것은 아니지만, 구조 유전자 바로 밑에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
재조합 벡터의 도입 방법으로는, 상기 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 어느 것이라도 이용할 수 있고, 예를 들어, 칼슘 이온을 이용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트(protoplast)법(일본 특허 공개 소63-248394호), 또는 문헌[Gene, 17, 107 (1982)이나 Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서 효모를 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들면, YEp13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 효모 균주 중에서 발현되는 것이면 어느 것을 이용하여도 좋고, 예를 들어, 헥소스 키나제 등의 해당계(glycolytic system) 유전자 프로모터, PHO5 프로모터, PGK프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 폴리펩티드 프로모터, MFα 1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이라면 어느 것이라도 이용할 수 있고, 예를 들면, 일렉트로포레이션(electroporation)법[Methods Enzymol., 194, 182 (1990)], 스페로플라스트(spheroplast)법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978), 아세트산리튬법[J. Bacteriology, 153, 163 (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]등의 방법을 들 수 있다.
미생물이 CDP-콜린 생성 활성의 일부밖에 갖고 있지 않는 경우, CDP-콜린 생성 활성을 얻을 수 있도록, 적절히 2종 이상의 미생물을 조합하여 CDP-콜린 생성 활성을 갖는 생체 촉매로 이용하여도 좋다. 또한, 미생물이 CDP-콜린 생성 활성을 갖고 있는 경우라도, 2종 이상의 미생물을 조합할 수 있다.
2종 이상 미생물의 조합으로는, 상기 미생물 중 어느 것으로부터 선택되어도 좋고, 에셰리키아속, 세라티아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 마이크로박테리움속, 슈도모나스속, 스트렙토코커스속, 시노리조비움속, 헤모필루스속, 아스로박터속, 오레오박테리움속, 셀룰로모나스속, 클라비박터속, 쿠르토박테리움속, 피멜로박터속, 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 클루이베로마이세스속, 트리코스포론속, 슈완니오마이세스속, 피치아속 및 칸디다속에 속하는 미생물 등으로부터 선택되는, 동일한 속에 속하는 미생물, 혹은 다른 속에 속하는 미생물의 조합을 들 수 있다.
예를 들면, 코리네박테리움속에 속하는 미생물과 에셰리키아속에 속하는 미생물의 조합 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 코리네박테리움 암모니아진스 ATCC 21170과 에셰리키아 콜라이 MM294/pCKG55주(FERM BP-3717)의 조합(일본 특허 제3369236호, 미국 특허 제6387667호) 등을 들 수 있다.
CDP-콜린 생성 활성을 갖는 생체 촉매의 하나인, CDP-콜린 생성 활성을 갖는 미생물의 배양물로는, 상기 방법으로 얻어지는 미생물을 통상적인 방법에 따라 배양하여 얻어지는 배양물을 들 수 있다.
상기 미생물이 세균 등의 원핵 생물 혹은 효모 등의 진핵 생물인 경우는, 상기 미생물을 배양하는 배지로서, 상기 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 상기 미생물의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지라면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 이용하여도 좋다.
탄소원으로는, 상기 미생물이 자화할 수 있는 것이라면 좋고, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 혹은 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류 등을 이용할 수 있다.
질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 혹은 유기산의 암모늄염, 그 밖의 질소 함유 화합물 및 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 이용할 수 있다.
무기염으로는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 이용할 수 있다.
배양은 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양 온도는 15∼50℃가 좋고, 배양 시간은, 통상 16시간∼7일간이다. 배양 중 pH는 3∼9로 유지하는 것이 바람직하다. pH 조정은 무기산 또는 유기산, 알칼리성 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 이용하여 행한다.
상기 미생물이 형질 전환체이고, 또한, 상기 미생물을 형질 전환하기 위해서 이용한 재조합체 DNA가 항생 물질 내성 유전자를 보유하고 있는 경우는, 상기 미생물을 배양하는 배지에, 상기 재조합체 DNA가 보유하는 항생 물질 내성 유전자에 대응하는 항생 물질을 첨가하여도 좋다.
생체 촉매로서 2종 이상의 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물을 이용하는 경우는, 각각의 미생물을 상기 방법에 따라 별개로 혹은 동일한 배지 중에서 배양하여 얻어지는 것을 이용할 수 있다.
2종 이상의 미생물을 동일한 배지 내에서 배양하는 경우, 이들의 미생물을 동시에 배양하여도, 하나의 미생물의 배양 중, 혹은 배양 종료 후에 나머지의 미생물을 상기 배지 내에 배양하여도 좋다.
미생물의 배양물의 처리물로는, 상기 방법으로 얻어지는 미생물의 배양물을 계면활성제, 유기 용제 또는 리소자임 등의 세포용해 효소로 처리하여 얻어지는 계면활성제, 유기 용제 또는 세포용해 효소 처리 배양물을 들 수 있다. 계면활성제, 유기 용제 또는 세포용해 효소를 각각 단독으로 이용하여 상기 미생물의 배양물을 처리하여도 좋고, 이들을 조합하여 상기 미생물의 배양물을 처리하여도 좋다. 또한, 상기 방법으로 얻어지는 미생물의 배양물을 농축기 혹은 건조기 등으로 농축 혹은 건조 처리하여 얻어지는 상기 미생물의 배양물의 농축물 혹은 건조물, 상기 미생물의 배양물을 여과 혹은 원심분리 등으로 고액분리하여 얻어지는 균체, 상기 균체를 건조기 등으로 건조 처리하여 얻어지는 상기 균체의 건조물을 들 수 있다. 또한, 상기 균체를 계면활성제, 유기 용제, 혹은 리소자임 등의 세포용해효소, 또는 이들을 조합 처리하여 얻어지는 상기 균체의 계면활성제 처리물 또는 유기 용제 처리물, 세포용해효소 처리물 등을 언급할 수 있다.
2종 이상의 미생물을 이용하는 경우, 2종 이상의 배양물의 처리물을 별개로 CDP-콜린 생성 활성을 갖는 생체 촉매로서 이용하여도 좋고, 이들 배양물의 처리물을 혼합하여 얻어지는 혼합물을 CDP-콜린 생성 활성을 갖는 생체 촉매로 이용하여도 좋다.
CDP-콜린은, 상기 생체 촉매와 UTP 전구체 및 콜린 혹은 포스포릴콜린 또는 이의 염을 매체 중에서 접촉시킴으로써, 상기 매체 중에 CDP-콜린을 생성 축적시켜, 상기 매체로부터 CDP-콜린을 채취함으로써 제조할 수 있다.
UTP 전구체로는, 오로트산, OMP, 우라실, 우리딘, UMP 및 UDP 등을 들 수 있고, 바람직하게는 오로트산과 우라실을 들 수 있다.
구체적인 CDP-콜린을 생성 축적시키는 방법으로는, 상기 생체 촉매와 UTP 전구체 및 콜린 혹은 포스포릴콜린 또는 이의 염을 매체 중에서 혼합하여 얻어지는 혼합물에, 필요에 따라 다른 성분을 첨가하여, pH를 5∼11, 보다 바람직하게는 6∼10으로 유지하고, 20∼50℃로 2∼48시간 유지하는 것이 있다.
생체 촉매의 사용량은, 상기 생체 촉매의 비활성 등에 의해 달라진다. 예를 들어, 생체 촉매로서 미생물의 배양물 혹은 상기 배양물의 처리물을 이용하는 경우는, 상기 배양물 혹은 상기 배양물의 처리물을 원심 분리하여 얻어지는 습균체로서, 염화콜린 1 ㎎에 대하여, 5∼500 ㎎, 바람직하게는 10∼300 ㎎ 이용하는 것이 바람직하다.
콜린, 포스포릴콜린 및 이의 염으로는, 예를 들면, 콜린, 염화콜린, 브롬화콜린, 요오드화콜린 등의 할로겐화콜린, 중탄산콜린, 황산메틸콜린, 시트르산이수소콜린, 중타르타르산콜린, 포스포릴콜린, 염화포스포릴콜린 등의 포스포릴콜린의 할로겐화물 등을 들 수 있지만, 콜린 혹은 포스포릴콜린의 할로겐화물이 바람직하게 이용되고, 염화콜린, 염화포스포릴콜린이 보다 바람직하게 이용된다.
UTP 전구체, 콜린, 포스포릴콜린 및 이의 염은, 화학 합성하여 얻어도 좋고, 발효법 등에 의해 생물로부터 얻어도 좋다. 또한, 반드시 순수하게 정제된 것이 아니어도 좋다. 또한, 모든 기질도 시판되고 있어, 용이하게 입수할 수 있다.
UTP 전구체, 콜린, 포스포릴콜린 및 이의 염의 농도는, 1 mmol/ℓ∼1 mol/ℓ가 바람직하고, 10∼100 mmol/ℓ가 보다 바람직하다.
필요한 다른 성분으로는, CDP-콜린 생성에 필요한 에너지 공여체, 인산 이온, 마그네슘 이온, 암모늄 이온, 계면활성제 및 유기 용제 등을 들 수 있다. 이들 성분은, 생체 촉매 등으로부터 필요량이 반입되는 경우에는 첨가할 필요는 없다.
에너지 공여체로는 글루코스, 프럭토스, 수크로스 등의 당, 당밀, 전분 가수분해물 등, 글리신, 알라닌 등의 아미노산이 이용된다. 이들은 0.02∼2.0 mol/ℓ의 농도로 이용되는 것이 바람직하다.
인산 이온으로서는 정인산, 피로인산, 트리폴리인산, 테트라폴리인산 등의 폴리인산, 폴리메타인산, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 인산일나트륨, 인산이나트륨 등의 무기인산염 등을 이용할 수 있다. 이들의 인산 이온은, 10∼500 mmol/ℓ의 농도로 이용되는 것이 바람직하다.
마그네슘 이온으로는 황산마그네슘, 질산마그네슘, 염화마그네슘 등의 무기 마그네슘염, 시트르산마그네슘 등의 유기 마그네슘염을 이용할 수 있다. 마그네슘 이온은 5∼200 mmol/ℓ의 농도로 이용되는 것이 바람직하다.
암모늄 이온으로는 암모니아수, 암모니아 가스, 각종 무기 혹은 유기 암모니아염, 효모 추출물, 옥수수 침지액 등을 이용할 수 있다. 또한, 암모늄 이온 대신 글루타민이나 글루타민을 함유하는 펩티드나 카사미노산 등의 유기영양원을 이용하는 것도 가능하다. 이들 암모늄 이온의 농도는 10 mmol/ℓ∼2 mol/ℓ의 농도로 이용되는 것이 바람직하다.
계면활성제로는 디옥실설포호박산나트륨(예를 들면, 라비졸 B-80, 일본유지사 제조), 라우로일사르코시네이트 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌·세틸에테르(예를 들면, 비이온 P-208, 일본유지사 제조) 등의 비이온성 계면활성제, 알킬디메틸아민(예를 들면, 3차 아민 FB, 일본유시사 제조) 등의 3차 아민류 등, CDP-콜린의 생성을 촉진하는 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 이들은 통상 0.1∼100 g/ℓ, 바람직하게는 1∼50 g/ℓ의 범위에서 이용된다.
유기 용제로서는, 크실렌, 톨루엔, 지방족 알콜(메틸알콜, 에틸알콜, 부틸알콜 등), 아세톤, 아세트산에틸, 디메틸설폭시드 등을 들 수 있다. 이들은 통상, 0.1∼100 ㎖/ℓ, 바람직하게는 1∼50 ㎖/ℓ의 농도로 이용된다.
생체 촉매와 UTP 전구체 및 콜린 혹은 포스포릴콜린 또는 이의 염을 접촉시키는 매체로는, 생체 촉매로서 사용하는 미생물을 배양하기 위한 배지, 상기 미생물의 배양물, 배양물의 상청 등을 이용하여도 좋고, 수성 매체를 이용하여도 좋다.
수성 매체로는, 물, 인산 완충액, HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N-에탄설폰산)완충액, 트리스[트리스(히드록시메틸)아미노메탄]염산 완충액 등의 완충액을 들 수 있다.
반응을 저해하지 않는다면, 상기 매체에 유기 용매를 첨가하여도 좋다. 유기 용매로는, 아세톤, 아세트산에틸, 디메틸설폭시드, 크실렌, 메틸알콜, 에틸알콜, 부탄올 등을 들 수 있다.
이러한 CDP-콜린의 제법으로는, 코리네박테리움 암모니아진스 ATCC21170과 에셰리키아 콜라이 MM294/pCKG55주(FERM BP-3717)를 생체 촉매로서 이용하여 CDP-콜린을 생산하는 방법(일본 특허 제3369236호, 미국 특허 제6387667호)을 들 수 있다.
CDP-콜린 생성 효소로는, 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라제, 오로티딘-5'-일인산 데카르복실라제, 우리딘 포스포릴라제, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제, 우리딘 키나제, 우리딜산·시티딜산 키나제, 뉴클레오시드 이인산 키나제, PyrG, CCT 및 CKI로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 효소를 들 수 있다.
상기 효소활성을 갖는 미생물을 호모제나이저 등으로 파쇄한 후, 또한 염석처리, 등전점 침전처리, 유기 용매 침전 처리, 투석 처리, 각종 크로마토그래피 처리 등, 통상의 효소의 정제 수단을 실시하여 얻어지는 미정제 효소 또는 정제 효소를 CDP-콜린 생성 효소로서 이용할 수 있다. 또한, 상기 미생물의 파쇄물을 그대로 상기 효소로 이용할 수 있다.
또한, 상기 미생물 파쇄물, 미정제 효소 또는 정제 효소를 수불용성 담체나 겔 등에 고정화하고, 이것을 상기 효소로 이용하여도 좋다.
CDP-콜린은, 상기 효소와 UTP 전구체 및 콜린 혹은 포스포릴콜린 또는 이의 염을 매체 중에서 접촉시킴으로써, 매체 중에 CDP-콜린을 생성 축적시켜, 상기 매체로부터 CDP-콜린을 채취함으로써 제조할 수 있다.
구체적인 CDP-콜린을 생성 축적시키는 방법으로는, 상기 효소와 UTP 전구체 및 콜린 혹은 포스포릴콜린 또는 이의 염을 매체 중에서 혼합하여 얻어지는 혼합물에, 필요에 따라 다른 성분을 첨가하여, pH를 5∼11, 보다 바람직하게는 6∼10으로 유지하고, 20∼50℃로 2∼48시간 유지하는 것이 있다.
CDP-생성효소의 사용량은 상기 효소의 비활성 등에 의해 달라진다. 예를 들면, 상기 효소로서 미정제 효소를 이용하는 경우는, 염화콜린 1 ㎎에 대하여, 1 ㎍∼500 ㎎, 바람직하게는 10 ㎍∼300 ㎎ 이용하는 것이 바람직하다.
CDP-콜린 생성 효소를 이용하여 CDP-콜린을 생성 축적시킬 때에 첨가하는 UTP 전구체, 콜린, 포스포릴콜린, 이의 염 및 필요에 따라 첨가하는 다른 성분은, 상기 미생물의 배양물 등을 이용하여 CDP-콜린을 생성 축적시키는 경우와 마찬가지이나, 추가로 필요에 따라, 에너지 공여체로는 아데노신-5'-삼인산 등을 첨가하여도 좋고, 5-포스포리보실이인산을 첨가하여도 좋다.
CDP-콜린 생성 효소와 UTP 전구체 및 콜린 혹은 포스포릴콜린 또는 이의 염을 접촉시키는 매체로는, 생체 촉매로서 사용하는 미생물을 배양하기 위한 배지, 이 미생물의 배양액, 배양 상청 등을 이용하여도 좋고, 수성 매체를 이용하여도 좋다.
수성 매체로서는, 물, 인산 완충액, HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N-에탄설폰산) 완충액, 트리스[트리스(히드록시메틸)아미노메탄]염산 완충액 등의 완충액을 들 수 있다.
상기한 바와 같이 CDP-콜린을 생성 축적시킨 매체로부터 CDP-콜린 용액을 조제할 때는, 막분리, 여과, 원심분리 등의 수단을 이용하여, 상기 매체로부터 고형물을 분리 제거하면 좋다.
상기 방법에 의해 조제되는 CDP-콜린 용액에 함유되는 핵산 유연 물질로는, 우라실, UTP 등을 들 수 있다.
CDP-콜린이나 핵산 유연 물질은 고속 액체 크로마토그래피(UV 검출)를 이용한 통상적인 방법에 의해 분석할 수 있다.
이하의 실시예로서, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
강산성 양이온 교환 수지를 이용한 CDP-콜린의 정제
CDP-콜린(와코순약공업사 제조) 50 g, 우라실(나카라이테스크사 제조) 2 g, UTP(나카라이테스크사 제조) 1 g을 물에 용해하여 5 ℓ의 CDP-콜린 용액을 조제하였다. 그 용액을 황산으로 pH 3.0으로 조정하여, 가교도 4%의 강산성 양이온 교환 수지 다이아이온 PK208(H형) 10 ℓ를 충전한 컬럼에 통탑하였다. 계속하여 물을 통탑하고, 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 우라실, UTP의 각 농도가 CDP-콜린에 대하여 0.1%(w/w) 미만인 분획을 취득하였다. CDP-콜린 분획을 100 ㎖로 농축하 고, 에탄올 350 ㎖을 서서히 첨가하였다. 석출한 결정을 여과하여 취하여, 100% 에탄올 용액으로 세정한 후, 20℃로 3일간 감압 건조하였다. 그 결과, 우라실, UTP의 각 농도가, CDP-콜린에 대하여 0.1%(w/w) 미만인 CDP-콜린 결정을 40 g 취득하였다.
실시예 2
CDP-콜린을 생성할 능력을 갖는 미생물 배양물로부터의 CDP-콜린의 정제
PyrG, CCT, CKI의 효소 활성을 갖는 대장균 MM294/pCKG55주(FERM BP-3717)를 암피실린 50 ㎍/㎖를 함유한 L 배지[박토트립톤(디프코사 제조) 10 g/ℓ, 효모 추출물(디프코사 제조) 5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ를 함유한, pH를 7.2로 조정한 액체배지] 10 ㎖가 들어간 시험관에 접종하고, 25℃로 24시간 300 rpm으로 진탕 배양하였다. 이 배양액 20 ㎖를 암피실린 50 ㎍/㎖를 함유하는 배지 400 ㎖가 들어있는 2 ℓ 배플(baffle) 부착 삼각플라스크에 접종하고, 25℃로 16시간, 190 rpm에서 회전 진탕 배양하였다. 이 배양액 125 ㎖를, 글루코스 5 g/ℓ(별도 살균), 펩톤(극동제약공업사 제조) 5 g/ℓ, Na2HPO4 6 g/ℓ, KH2PO4 3 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, NH4Cl 1 g/ℓ, MgSO4·7H2O 250 ㎎/ℓ(별도 살균) 및 비타민 B1 4 ㎍/ℓ(별도 살균)의 조성으로 이루어진 액체 배지(pH 무조정) 2.5 ℓ가 들어있는 5 ℓ짜리 배양조에 접종하고, 25℃로 11시간, 그 후 32℃로 13시간, 교반 600 rpm, 통기량 2.5 ℓ/분의 배양 조건하에, 14% 암모니아수로 pH 7.0으로 조정하면서 배양을 행하였다. 배양 중, 배양 개시 11시간째부터 24시간째까지, 글루코스 167 g/ℓ, 펩톤 167 g/ℓ의 조성으로 이루어진 공급액을 페리스타 펌프(peristaltic pump)에 의해 30 ㎖/시간의 속도로 공급하였다.
한편, 오로트산에서 UTP를 생성하는 활성을 갖는 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를, 글루코스 50 g/ℓ, 폴리펩톤(대오영양화학사 제조) 10 g/ℓ, 효모 추출물(대오영양화학사 제조) 10 g/ℓ, 요소 5 g/ℓ, (NH4)2SO4 5 g/ℓ, KH2PO4 1 g/ℓ, K2HPO4 3 g/ℓ, MgSO4·7H2O 1 g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1 g/ℓ, FeSO4·7H2O 10 ㎎/ℓ, ZnSO4·7H2O 10 ㎎/ℓ, MnSO4·4∼6H2O 20 ㎎/ℓ, L-시스테인 20 ㎎/ℓ, D-판토텐산 칼슘 10 ㎎/ℓ, 비타민 B1 5 ㎎/ℓ, 니코틴산 5 ㎎/ℓ 및 비오틴 30 ㎍/ℓ(수산화나트륨으로 pH 7.2로 조정)의 조성으로 이루어진 액체 배지 10 ㎖가 들어있는 시험관에 접종하고, 28℃로 24시간, 300 rpm으로 왕복 진탕 배양하였다. 이 배양액 20 ㎖를 상기와 동일한 조성의 액체 배지 230 ㎖가 들어있는 2 ℓ짜리 배플 부착 삼각플라스크에 접종하고, 28℃로 24시간 190 rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 이 배양액 250 ㎖를, 글루코스 100 g/ℓ, 육류 추출물 10 g/ℓ, 폴리펩톤 10 g/ℓ, KH2PO4 1 g/ℓ, K2HPO4 1 g/ℓ, MgSO4·7H2O 1 g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1 g/ℓ, FeSO4·7H2O 20 ㎎/ℓ, ZnSO4·7H2O 10 ㎎/ℓ, MnSO4·4∼6H2O 20 ㎎/ℓ, β-알라닌 15 ㎎/ℓ, L-시스테인 20 ㎎/ℓ, 비오틴 100 ㎍/ℓ, 요소 2 g/ℓ(별도 살균) 및 비타민 B1 5 ㎎/ℓ(별도 살균)(수산화나트륨으로 pH 7.2로 조정)의 조성으로 이루어진 액체 배지 2.5 ℓ가 들어있는 5 ℓ짜리 배양조에 접종하고, 32℃로 교반 600 rpm, 통기량 2.5 ℓ/분의 배양 조건하, 진한 암모니아수로 pH 6.8로 조정하면서 종배양을 행하였다. 상기 종배양액의 상청 중의 글루코스가 소비된 시점에서, 배양액을 350 ㎖ 무균적으로 채취하고, 글루코스 180 g/ℓ, KH2PO4 10 g/ℓ, K2HPO4 10 g/ℓ, MgSO4·7H2O 10 g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1 g/ℓ, FeSO4·7H2O 20 ㎎/ℓ, ZnSO4·7H2O 10 ㎎/ℓ, MnSO4·4∼6H2O 20 ㎎/ℓ(별도 살균), β-알라닌 15 ㎎/ℓ, L-시스테인 20 ㎎/ℓ, 글루타민산나트륨 1 g/ℓ, 비오틴 100 ㎍/ℓ, 요소 2 g/ℓ(별도 살균) 및 비타민 B1 5 ㎎/ℓ(별도 살균)(수산화나트륨으로 pH 7.2으로 조정)의 조성으로 이루어진 액체배지 2.5 ℓ가 들어있는 5 ℓ짜리 배양조에 접종하고, 32℃로 교반 600 rpm, 통기량 2.5 ℓ/분의 배양 조건하에, 진한 암모니아수로 pH 6.8로 조정하면서 본 배양을 행하였다. 배양액 상청중인 글루코스가 소비된 시점에서 배양을 종료하였다.
이와 같이 하여 얻어진 대장균 MM294/pCKG 55주의 배양액 360 ㎖과 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주의 배양액 360 ㎖을 2 ℓ짜리 배양조에 넣고, 이것에 글루코스 100 g/ℓ, 오로트산 10 g/ℓ, 염화콜린 8.4 g/ℓ, MgSO4·7H2O 5 g/ℓ, 크실렌 20 ㎖/ℓ를 첨가하고, 증류수를 첨가하여 전량을 800 ㎖로 하였다. 이 혼합액을, 32℃로 교반 800 rpm, 통기량 0.8 ℓ/분의 조건하에, 10규정 수산화나트륨으로 pH를 7.2로 조정하면서 반응을 행하였다. 반응 중, 반응액 상청 중의 인산 농도가 KH2PO4로서 1∼5 g/ℓ로 유지되도록 적절하게 KH2PO4를 도중에 첨가하였 다. 23시간 반응을 행한 결과, CDP-콜린이 11.0 g/ℓ 생성되었다.
상기 반응액 4회분을 황산으로 pH 1.0으로 조정하고, 원심분리(7000 rpm, 10분)로 균체를 분리하고, 얻어진 상청액에 물을 첨가하여 6 ℓ가 되도록 조제하였다(CDP-콜린 6.0 g/ℓ, 우라실 0.5 g/ℓ, UTP 1.0 g/ℓ). 이 시티딘이인산 콜린 용액을, 가교도 4%의 강산성 양이온 교환 수지 다이아이온 SK104(H형) 10 ℓ를 충전한 컬럼에 통탑하였다. 계속하여 물을 통탑하고, 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 우라실, UTP의 각 농도가 CDP-콜린에 대하여 0.1%(w/w) 미만인 분획을 취득하였다. 활성탄을 이용하여 CDP-콜린 분획을 탈색한 뒤, 100 ㎖가 될 때까지 농축하였다. 이 농축액에 에탄올 350 ㎖를 서서히 첨가하고, 석출한 결정을 여과하여 취하였다. 얻어진 결정을 100% 에탄올 용액으로 세정한 뒤, 20℃로 3일간 감압 건조하였다. 그 결과, 우라실, UTP의 각 농도가, CDP-콜린에 대하여 0.1%(w/w) 미만인 CDP-콜린 결정을 18 g 얻었다.
실시예 3
CDP-콜린을 생성할 능력을 갖는 미생물 배양물로부터의 CDP-콜린 나트륨염의 정제
실시예 2와 같이 하여 얻어진 반응액 4회분을 황산으로 pH 1.0으로 조정하고, 원심분리(7000 rpm, 10분)로 균체를 분리하고, 얻어진 상청액에 물을 첨가하여 6 ℓ가 되도록 조제하였다(CDP-콜린 6.0 g/ℓ, 우라실 0.5 g/ℓ, UTP 1.0 g/ℓ). 이 시티딘이인산 콜린 용액을, 가교도 4%의 강산성 양이온 교환 수지 다이아이온 SK104(H형) 10 ℓ를 충전한 컬럼에 통탑하였다. 계속하여 물을 통탑하고, 고속 액 체 크로마토그래피 분석에 의해 우라실, UTP의 각 농도가 CDP-콜린에 대하여 0.1%(w/w) 미만인 분획을 취득하였다. CDP-콜린 분획을 수산화나트륨으로 pH 7.5로 조정하고, 활성탄을 이용하여 탈색한 뒤, 100 ㎖가 될 때까지 농축하였다. 이 농축액에 에탄올 400 ㎖를 서서히 첨가하고, 석출한 결정을 여과하여 취하였다. 얻어진 결정을 100% 에탄올 용액으로 세정한 뒤, 20℃로 3일간 감압 건조하였다. 그 결과, 우라실, UTP의 각 농도가, CDP-콜린에 대하여 0.1%(w/w) 미만인 CDP-콜린 나트륨염 결정을 20 g 얻었다.
이상의 결과, 핵산 유연 물질을 함유하는 CDP-콜린 용액을, 강산성 양이온 교환 수지를 이용하여 1회 처리하는 것만으로, 불순물을 함유하지 않는 CDP-콜린 또는 그 염을 간편히 얻을 수 있다는 것이 분명해졌다.
본 발명에 따르면, CDP-콜린 및 그 염이 저렴하게 제공된다.

Claims (12)

  1. 핵산 유연 물질(a nucleic acid analogue)을 함유하고, 또한 pH가 0.5 이상 5.0 이하인 시티딘이인산 콜린(이하, CDP-콜린이라 약기함) 용액을, H형 강산성 양이온 교환 수지와 접촉시키고, 상기 수지에 흡착한 CDP-콜린을 물 또는 이온 농도가 0.1 mol/ℓ 이하인 수용액으로 용출시켜, CDP-콜린을 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 CDP-콜린의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CDP-콜린 용액은, 우리딘-5'-삼인산(이하, UTP라 약기함) 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 활성을 갖는 생체 촉매를 UTP 전구체 및 콜린 또는 포스포릴콜린 혹은 이의 염과 수성 매체 중에서 접촉시켜, 상기 매체 중에 CDP-콜린을 생성 축적시킴으로써 얻어지는 상기 매체로 조제되는 용액인, CDP-콜린의 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생체 촉매는 UTP 전구체로부터 UTP를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물을 계면활성제, 유기 용제, 세포용해 효소 단독 또는 이의 조합으로 처리한 처리물, 및 UTP와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물을 포함하는 생체 촉매인, CDP-콜린의 정제 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 생체 촉매는 UTP 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으 로부터 CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소를 포함하는 생체 촉매인, CDP-콜린의 정제 방법.
  5. 제4항에 있어서, CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소는 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라제, 오로티딘-5'-일인산 데카르복실라제, 우리딘 포스포릴라제, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제, 우리딘 키나제, 우리딜산·시티딜산 키나제, 뉴클레오시드 이인산 키나제, 시티딘-5'-삼인산 신타제, 콜린 포스페이트 시티딜 트랜스퍼라제 및 콜린 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소인, CDP-콜린의 정제 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 유연 물질은 우라실 및 UTP로부터 선택되는 물질인, CDP-콜린의 정제 방법.
  7. 핵산 유연 물질(a nucleic acid analogue)을 함유하고, 또한 pH가 0.5 이상 5.0 이하인 시티딘이인산 콜린(이하, CDP-콜린이라 약기함) 용액을, H형 강산성 양이온 교환 수지와 접촉시키고, 상기 수지에 흡착한 CDP-콜린을 물 또는 이온 농도가 0.1 mol/ℓ 이하인 수용액으로 용출시켜, CDP-콜린을 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 CDP-콜린의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CDP-콜린 용액은, 우리딘-5'-삼인산(이하, UTP라 약기함) 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 활성을 갖는 생체 촉매를 UTP 전구체 및 콜린 또는 포스포릴콜린 혹은 이의 염과 수성 매체 중에서 접촉시켜, 상기 매체 중에 CDP-콜린을 생성 축적시킴으로써 얻어지는 상기 매체로 조제되는 용액인, CDP-콜린의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생체 촉매는 UTP 전구체로부터 UTP를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물을 계면활성제, 유기 용제, 세포용해 효소 단독 또는 이의 조합으로 처리한 처리물, 및 UTP와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양물 또는 상기 배양물의 처리물을 포함하는 생체 촉매인, CDP-콜린의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 생체 촉매는 UTP 전구체와 콜린 또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소를 포함하는 생체 촉매인, CDP-콜린의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, CDP-콜린을 생성하는 반응을 담당하는 효소는 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라제, 오로티딘-5'-일인산 데카르복실라제, 우리딘 포스포릴라제, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제, 우리딘 키나제, 우리딜산·시티딜산 키나제, 뉴클레오시드 이인산 키나제, 시티딘-5'-삼인산 신타제, 콜린 포스페이트 시티딜 트랜스퍼라제 및 콜린 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소인, CDP-콜린의 제조 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 유연 물질은 우라실 및 UTP로부터 선택되는 물질인, CDP-콜린의 제조 방법.
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