KR100721692B1 - Ｇｄｐ-푸코즈의 제조방법 - Google Patents

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교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 GKDM, 및 GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킬 수 있는 미생물의 배양액을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계, GDP-푸코즈를 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계, 및 GDP-푸코즈를 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하거나; GTP 전구체, 당, 및 GTP 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액, 및 당과 GTP로부터 GKDM를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계, GKDM을 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계, GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킬 수 있는 미생물의 배양액을 효소원으로서 사용하여, 축적된 GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킴으로써, GDP-푸코즈를 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계, 및 GDP-푸코즈를 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하는, GDP-푸코즈의 제조방법; 및 GTP 전구체, 당, GTP 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액, 및 당과 GTP로부터 GKDM를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계, GKDM을 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계, 및 GKDM을 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하는, GKDM의 제조방법을 제공한다.
구아노신 5'-디포스포-푸코즈, 구아노신 5'-디포스포-4-케토-6-데옥시만노즈, 구아노신 5'-트리포스페이트, 효소원, 수성 매질, 당, 미생물

Description

ＧＤＰ-푸코즈의 제조방법{Process for producing GDP-fucose}
도 1은 glk, manB 및 manC를 발현시킬 수 있는 플라스미드 pNK11의 작제 단계를 도시한다.
도 2는 gmd를 발현시킬 수 있는 플라스미드 pGE19의 작제 단계를 도시한다.
도 3은 wcaG를 발현시킬 수 있는 플라스미드 pGE8의 작제 단계를 도시한다.
본 발명은 구아노신 5'-디포스포-푸코즈(이하, "GDP-푸코즈"로 약기한다) 및 구아노신 5'-디포스포-4-케토-6-데옥시만노즈(이하, "GKDM"으로 약기한다)의 제조방법에 관한 것이다. GDP-푸코즈는, 예를 들어, 세균, 바이러스 등의 감염 방어 및 심혈관 장해에의 적용에 유용한 면역 치료 등에 유용한 복합 탄수화물의 합성 기질로서 유용하다. 또한, GKDM은, 예를 들어, GDP-푸코즈의 제조를 위한 중간체로서 유용하다.
GDP-푸코즈를 제조하기 위한 방법으로서, 화학적 합성 방법[참고문헌: Carbohyd. Res., 242: 69(1993)]이 공지되어 있지만, 입체선택성 및 기질의 공급에 난점이 있다. 효소를 사용하는 방법[참고문헌: Agric. Biol. Chem., 48: 823(1984), WO 93/08205, 및 WO 99/09180]에서는, 고가의 원료를 사용하기 때문에, 대규모 생산에 적당하지 않다. 또한, 이러한 효소는 복잡한 정제 단계를 필요로 한다. 미생물의 활성을 이용하는 방법[참고문헌: WO 98/12343]도 개발되어 있는 유용한 방법이지만, 공업적 제법으로서 사용되기 위해서는 추가의 개선이 요구된다. 또한, GDP-만노즈로부터 GDP-푸코즈의 생합성 과정에서 출발 효소인 GDP-만노즈 4,6-데하이드라타제의 활성이 최종 산물인 GDP-푸코즈에 의해 저해된다는 것이 공지되어 있다[참고문헌: Biochim. Biophys. Acta, 117: 79(1996); FEBS Lett., 412: 126(1997)].
본 발명의 목적은 GDP-푸코즈 및 GKDM의 효율적인 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적 및 기타 목적이 본 발명에 의해 제공되며, 이는 이하의 (1) 내지 (18)에 관한 것이다.
(1) GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물인 효소원과 GKDM을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계;
GDP-푸코즈를 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계; 및
GDP-푸코즈를 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하는, GDP-푸코즈의 제조방법.
(2) 구아노신 5'-트리포스페이트(이하, "GTP"로 약기한다) 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물, 및 당과 GTP로부터 GKDM를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물인 효소원과 GTP 전구체와 당을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계;
GKDM을 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계;
GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여, 축적된 GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킴으로써, GDP-푸코즈를 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계; 및
GDP-푸코즈를 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하는, GDP-푸코즈의 제조방법.
(3) GTP 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물, 및 당과 GTP로부터 GKDM을 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물인 효소원과 GTP 전구체와 당을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계;
GKDM을 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계; 및
GKDM을 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하는, GKDM의 제조방법.
(4) 배양액의 처리물이 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분 리함으로써 수득된 균체, 당해 균체의 건조물, 당해 균체의 동결-건조물, 당해 균체의 계면활성제-처리물, 당해 균체의 초음파-처리물, 당해 균체의 기계적 연마-처리물, 당해 균체의 용매-처리물, 당해 균체의 효소-처리물, 당해 균체의 단백질 분획물, 당해 균체의 고정화물 및 당해 균체로부터 추출함으로써 수득된 효소 조제품으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 (1), (2) 또는 (3)에 따르는 방법.
(5) GTP 전구체가 구아닌, 크산틴, 하이포크산틴, 구아노신, 크산토신, 이노신, 구아노신 5'-모노포스페이트, 크산토신 5'-모노포스페이트 및 이노신 5'-모노포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 (2) 또는 (3)에 따르는 방법.
(6) 당이 글루코즈, 프럭토즈 및 만노즈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 (2) 또는 (3)에 따르는 방법.
(7) GTP 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물이 코리네박테륨(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물로부터 선택되는, 상기 (2) 또는 (3)에 따르는 방법.
(8) 미생물이 코리네박테륨 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)인, 상기 (7)에 따르는 방법.
(9) 당과 GTP로부터 GKDM를 생성시킬 수 있는 미생물이 1종 이상의 미생물로 구성되는, 상기 (2) 또는 (3)에 따르는 방법.
(10) 1종 이상의 미생물이 에스케리키아(Escherichia) 속 및 코리네박테륨 속에 속하는 미생물로부터 선택된 1종 이상의 미생물인, 상기 (9)에 따르는 방법.
(11) 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 상기 (10)에 따르는 방법.
(12) 코리네박테륨 속에 속하는 미생물이 코리네박테륨 암모니아게네스인, 상기 (10)에 따르는 방법.
(13) 당과 GTP로부터 GKDM를 생성시킬 수 있는 미생물이 글루코키나제(이하, "glk"로 약기한다), 포스포만노뮤타제(이하, "manB"로 약기한다), 만노즈 1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제(이하, "manC"로 약기한다), 포스포글루코뮤타제(이하, "pgm"으로 약기한다), 포스포프럭토키나제(이하, "pfk"로 약기한다) 및 GDP-만노즈 4,6-데하이드라타제(이하, "gmd"로 약기한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 강한 미생물인, 상기 (2) 또는 (3)에 따르는 방법.
(14) 미생물이 glk-암호화 유전자, manB-암호화 유전자, manC-암호화 유전자, pgm-암호화 유전자, pfk-암호화 유전자 및 gmd-암호화 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터를 포함하는 재조합 DNA를 보유하는 1종 이상의 미생물로 구성되는, 상기 (13)에 따르는 방법.
(15) glk-암호화 유전자, manB-암호화 유전자, manC-암호화 유전자, pgm-암호화 유전자, pfk-암호화 유전자 또는 gmd-암호화 유전자가 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 유전자인, 상기 (14)에 따르는 방법.
(16) GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킬 수 있는 미생물이, GKDM 에피머라제/리덕타제(이하, "wcaG"로 약기한다) 활성이 강한 미생물인, 상기 (1) 또는 (2)에 따르는 방법.
(17) 미생물이 wcaG-암호화 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터를 포함하는 재조합 DNA를 보유하는 미생물인, 상기 (16)에 따른 방법.
(18) wcaG-암호화 유전자가 에스케리키아 콜라이로부터 유래되는, 상기 (17)에 따르는 방법.
본원은 일본 특허원 제(평)11-225889호(1999년 8월 10일 출원)에 기초하고, 이의 전체 내용이 본원에서 인용된다.
본 발명자들은 상기 목적 및 기타 목적을 달성하기 위해 예의 연구하여, GKDM(GDP-푸코즈의 전구체)을 생성시켜 축적시킨 다음, 이와 같이 축적된 GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킴으로써, GDP-푸코즈에 의한 GDP-만노즈 4,6-데하이드라타제 활성의 저해를 예기치 않게 회피할 수 있어, GDP-푸코즈를 효율적으로 생성시킬 수 있음을 밝혀내었다.
이러한 방법은 바람직하게는 GTP 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물내에서 수행한다. 이러한 능력을 갖는 미생물인 한, 모든 미생물을 사용할 수 있다. 적당한 GTP 전구체는 잘 알려져 있고, 이후에 기술된 것을 포함한다. 이러한 미생물의 예는 에스케리키아 속 및 코리네박테륨 속에 속하는 것을 포함한다.
에스케리키아 속에 속하는 미생물의 예는 에스케리키아 콜라이 등을 포함한다. 코리네박테륨 속에 속하는 미생물의 예는 코리네박테륨 암모니아게네스 등을 포함한다. 구체적인 예는 코리네박테륨 암모니아게네스 ATCC 21170 등을 포함한다.
또한, 이러한 방법은 바람직하게는 당과 GTP로부터 GKDM을 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물내에서 수행한다. 적당한 당은 잘 알려져 있고, 이후에 기술된 것을 포함한다. 이러한 미생물의 예는 glk, manB, manC, pgm, pfk 및 gmd로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 강한 미생물을 포함한다. 효소의 활성이 강한 상기의 미생물은 모(母) 균주 활성보다 증강된, 예를 들어, glk, manB, manC, pgm, pfk 및 gmd로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 강한 미생물을 의미한다. 모 균주는 변이체, 세포 융합 균주, 형질도입균주 또는 재조합 균주의 작제에서 원래 사용된 미생물을 의미한다. 상기 효소로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 모 균주의 활성보다 증강된 미생물은 임의의 변이체, 세포 융합 균주, 형질도입균주 또는 재조합 균주일 수 있다.
이의 예는 에스케리키아 속 및 코리네박테륨 속에 속하는 것을 포함한다. 바람직한 예는 에스케리키아 콜라이 및 코리네박테륨 암모니아게네스 등을 포함한다.
또한, glk, manB, manC, pgm, pfk 및 gmd로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 재조합 DNA 기술에 의해 증강된 형질전환체를 사용할 수도 있다. 이의 예는 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 glk 유전자[J. Bacteriol., 179: 1298(1997)]를 함유하는 재조합 DNA(pNK11)를 보유하는 에스케리키아 콜라이 NM522, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 manB 유전자[J. Bacteriol., 178: 4885(1996)]를 함유하는 재조합 DNA(pNK11)를 보유하는 에스케리키아 콜라이 NM522, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 manC 유전자[J. Bacteriol., 178: 4885(1996)]를 함유하는 재조합 DNA(pNK11)를 보유하는 에스케리키아 콜라이 NM522, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 pgm 유전자[J. Bacteriol., 176: 1298(1994)]를 함유하는 재조합 DNA(pNT55)를 보유하는 에스케리키아 콜라이 NM522(WO 98/12343), 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 pfkB 유전자[Gene, 28: 337(1984)]를 함유하는 재조합 DNA(pNT55)를 보유하는 에스케리키아 콜라이 NM522(WO 98/12343), 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 gmd 유전자[J. Bacteriol., 178: 4885(1996)]를 함유하는 재조합 DNA(pGE19)를 보유하는 에스케리키아 콜라이 NM522 등을 포함한다.
미생물이 GTP 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있고, 또한 동시에 당과 GTP로부터 GKDM을 생성시킬 수 있는 경우에는, GKDM을 이러한 미생물에 의해 GTP 전구체와 당으로부터 제조할 수 있다. 또한, 한 균주에서 당과 GTP로부터 GKDM을 생성시키는데 필요한 활성의 일부만을 갖는 미생물의 경우에, 2종 이상의 미생물을 적절히 조합함으로써 GKDM을 생성시킬 수 있다.
이러한 전환 능력을 갖는 한, 이러한 미생물 모두를 본 발명에 사용되는 GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킬 수 있는 미생물로서 사용할 수 있다. 예를 들어, wcaG 활성이 강한 미생물을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 에스케리키아 속 또는 코리네박테륨 속에 속하는 미생물, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 코리네박테륨 암모니아게네스 등을 예로 들 수 있다.
또한, GKDM 에피머라제/리덕타제의 활성이 재조합 DNA 기술에 의해 증강된 형질전환체를 사용할 수도 있다. 이의 예는 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 wcaG 유전자[J. Bacteriol., 178: 4885(1996)]를 함유하는 재조합 DNA(pGE8)를 보유하는 에스케리키아 콜라이 NM522를 포함한다.
재조합 DNA 기술을 사용한 상기와 같은 GDP-푸코즈 및 GKDM의 제조에서, 유전자 재조합, 예를 들어, 미생물로부터 플라스미드 DNA의 단리 및 정제, 제한 효소를 이용한 플라스미드 DNA의 절단, 절단된 DNA 단편의 단리 및 정제, DNA 단편의 효소적 결합, 재조합 DNA를 사용한 형질전환 등과 관련된 각종 조작은 공지된 방법[예를 들어, 참고문헌: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(이하, "Molecular Cloning, Second Edition"으로 약기한다) 및 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)(이하, "Current Protocols in Molecular Biology"로 약기한다)]에 따라서 수행할 수 있다. 또한, 폴리머라제 연쇄 반응(이하, "PCR"로 약기한다)은 공지된 방법[참고문헌: PCR Protocols, Academic Press(1990)]에 따라서 수행할 수 있다.
GDP-푸코즈 또는 GKDM의 생성에 관여하는 유전자는, 당해 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한 효소 또는 PCR에 의해 당해 유전자를 함유하는 적당한 길이의 DNA 단편으로 만든 후, 생성된 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입한 다음, DNA-삽입된 발현 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입시켜, 숙주내에서 발현시킬 수 있다.
목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 한, 모든 세균 및 효모 등을 숙주 세포로서 사용할 수 있다.
발현 벡터의 예는 상기의 숙주 세포에서 자율적으로 복제가능하거나 염색체내로 통합가능하고, 목적하는 유전자를 전사시킬 수 있는 위치에 프로모터를 함유하는 것을 포함한다.
원핵생물, 예를 들어, 세균 등을 숙주 세포로서 사용할 경우, 유전자 발현 벡터는 원핵생물에서 자율적으로 복제할 수 있고, 프로모터, 리보좀 결합 서열, 목적하는 DNA 및 전사 종결 서열로부터 작제되는 재조합 DNA인 것이 바람직하다. 이는 프로모터를 제어하는 유전자를 함유할 수 있다.
발현 벡터의 예는 pKK223-3 및 pGEX-2T[둘 다의 제조원: Amersham Pharmacia Biotech Co.], pSE280[제조원: Invitrogen Co.], pGEMEX-1[제조원: Promega Co.], pQE-30[제조원: Quigen Co.], pET-3[제조원: Novagen Co.], pKYP10[일본 미심사 공개특허공보 제110600/83호], pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48: 669(1984)], PLSA1[Agric. Biol. Chem., 53: 277(1995)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 4306(1995)], pBluescript II SK+[제조원: Stratagene Co.], pBluescript II SK-[제조원: Stratagene Co.], pTrS30[에스케리키아 콜라이 JM109/pTrS30으로부터 제조됨(FERM BP-5407)], pTrS32[에스케리키아 콜라이 JM109/pTrS32로부터 제조됨(FERM BP-5408)], pUC19[Gene, 33: 103(1985)], pSTV28[제조원: Takara Shuzo Co., Ltd.], pUC118[제조원: Takara Shuzo Co., Ltd.], pPAC31[WO 98/12343] 등을 포함한다.
숙주 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 등내에서 작용할 수 있는 한, 모든 프로모터를 사용할 수 있다. 이의 예로는 세균 또는 파아지로부터 유래된 프로모터, 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터(Plac), PL 프로모터(PL), PR 프로모터, PSE 프로모터 등, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 포함한다. 추가의 예는 인위적으로 설계되고 변형된 프로모터, 예를 들어, 2개의 Ptrp를 직렬시켜 제조된 프로모터, tac 프로모터, lac T7 프로모터 및 let I 프로모터를 포함한다.
리보좀 결합 서열인 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈과의 사이가 적당한 거리(예를 들어, 6 내지 18개의 염기)로 조절된 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 DNA에서, 전사 종결 서열은 목적하는 DNA의 발현을 위해 항상 필요한 것은 아니지만, 구조 유전자 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
원핵생물의 예는 에스케리키아 속, 세라티아(Serratia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레비박테륨(Brevibacterium) 속, 코리네박테륨 속, 마이크로박테륨(Microbacterium) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 등을 포함한다. 구체적인 예는 에스케리키아 콜라이 XL1-Blue, 에스케리키아 콜라이 XL2-Blue, 에스케리키아 콜라이 DH1, 에스케리키아 콜라이 MC1000, 에스케리키아 콜라이 W1485, 에스케리키아 콜라이 NM522, 에스케리키아 콜라이 JM109, 에스케리키아 콜라이 HB101, 에스케리키아 콜라이 No.49, 에스케리키아 콜라이 W3110, 에스케리키아 콜라이 NY49, 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola), 세라티아 리쿠에파시엔스(Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테륨 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC 14068, 브레비박테륨 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC 14066, 코리네박테륨 암모니아게네스, 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032, 코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 14067, 코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 13869, 코리네박테륨 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870, 마이크로박테륨 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC 15354, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 D-0110 등을 포함한다.
재조합 DNA의 도입 방법으로서, DNA를 숙주 세포에 도입시키기 위한 모든 방법, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용하는 방법[참고문헌: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110(1972)], 프로토플라스트(protoplast) 방법[참고문헌: 일본 미심사 공개특허공보 제248394/88호], 전기영동 방법[참고문헌: Nucleic Acids Research, 16: 6127(1998)] 등을 사용할 수 있다.
효모 균주를 숙주 세포로서 사용할 경우, 사용된 발현 벡터의 예는 YEp13(ATCC 37115), YEp24(ATCC 37051), YEp50(ATCC 37419), pHS19, pHS15 등을 포함한다.
효모 균주내에서 작용할 수 있는 한, 모든 프로모터를 사용할 수 있다. 이의 예는 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 열 충격 폴리펩타이드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 포함한다.
숙주 세포의 예는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 트리코스포론(Trichosporon) 속, 슈반니오마이세스(Schwanniomyces) 속, 피키아(Pichia) 속, 칸디다(Candida) 속 등을 포함한다. 구체적 예는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈반니오마이세스 알루비루스(Schwanniomyces alluvirus), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 우틸리스(Candida utilis) 등을 포함한다.
재조합 DNA의 도입 방법으로서, DNA를 효모내에 도입시키기 위한 모든 방법을 사용할 수 있다. 이의 예는 전기영동법[참고문헌: Methods in Enzymol., 194: 182(1990)], 스페로플라스트(spheroplast) 방법[참고문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4889(1984)], 아세트산리튬 방법[참고문헌: J. Bacteriol., 153: 163(1983)] 등을 포함한다.
본 발명의 형질전환체의 배지에서의 배양은 숙주를 배양하기 위해 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행할 수 있다.
숙주로서 원핵생물, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 등, 또는 진핵생물, 예를 들어, 효모 등을 사용하여 수득하는 형질전환체를 배양하기 위한 배지로서는, 유기체에 의해 동화될 수 있고, 형질전환체를 효율적으로 배양할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 함유하는 한, 모든 천연 배지 및 합성 배지를 사용할 수 있다.
유기체에 의해 동화될 수 있는 모든 물질을 탄소원으로서 사용할 수 있다. 이의 예는 탄수화물(예: 글루코즈, 프럭토즈, 수크로즈, 이를 함유하는 당밀, 전분, 전분 가수분해물 등), 유기산(예: 아세트산, 프로피온산 등), 알콜(예: 에탄올, 프로판올 등) 등을 포함한다.
질소원의 예는 암모니아, 무기산 또는 유기산의 암모니아 염(예: 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등), 기타 질소-함유 화합물, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 대두박, 대두박 가수분해물, 각종 발효된 균체 및 이의 소화물 등을 포함한다.
배지에서 사용되는 무기물의 예는 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산철, 황산망간, 황산구리 및 탄산칼슘을 포함한다.
배양은 일반적으로 진탕 배양, 심부 통기 교반 배양 등의 호기성 조건하에 수행한다. 배양 온도는 바람직하게는 15 내지 40℃이고, 배양 시간은 일반적으로 5시간 내지 7일이다. 배양 동안에, 배지 pH는 3.0 내지 9.0으로 조정한다. pH는 무기산 또는 유기산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 조정한다.
또한, 항생제, 예를 들어, 암피실린 및 클로르암페니콜 등을 배양 중에 임의로 배지에 첨가할 수 있다.
프로모터로서 유도성 프로모터를 사용하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 경우, 유도물질을 배지에 임의로 첨가할 수 있다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 경우, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 배지에 첨가할 수 있고; trp 프로모터를 사용하는 발현 벡 터로 형질전환된 미생물을 배양할 경우, 인돌 아크릴레이트를 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법에서 2종 이상의 미생물을 사용할 경우, 당해 미생물을 별개의 배양액을 이용하여 따로 배양하거나, 이들을 동시에 단일 배양조에 접종시켜, 혼합 배양을 수행한 다음, 생성된 배양액을 이용할 수 있다. 또한, 임의의 미생물의 배양 도중 또는 완료 후에, 잔류 미생물을 접종 및 배양하여, 생성된 배양액을 이용할 수 있다.
배양에 의해 수득된 미생물 배양액 또는 이의 각종 처리 후의 배양액의 처리물을 수성 매질 중에서 본 발명의 방법을 수행함에 있어 효소원으로서 사용할 수 있다.
배양액의 처리물의 예는 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리함으로써 수득된 균체, 균체의 건조물, 균체의 동결-건조물, 균체의 계면활성제-처리물, 균체의 초음파-처리물, 균체의 기계적 연마-처리물, 균체의 용매-처리물, 균체의 효소-처리물, 균체의 단백질 분획물, 균체의 고정화물, 균체로부터 추출함으로써 수득된 효소 조제품 등을 포함한다.
본 발명의 방법에서 미생물은 1 내지 500g/ℓ, 바람직하게는 5 내지 300g/ℓ의 양으로 습윤 균체로서 사용된다. 또한, 동시에 2종 이상의 미생물을 사용하여 생성 반응을 수행하는 경우에, 수성 매질 중의 미생물의 습윤 균체의 총량은 2 내지 500g/ℓ, 바람직하게는 10 내지 400g/ℓ이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 GTP 전구체의 예는 구아닌, 크산틴, 하이포크산틴, 구아노신, 크산토신, 이노신, 구아노신 5'-모노포스페이트, 크산토신 5'-모노포스페이트, 이노신 5'-모노포스페이트 등을 포함한다. 사용할 수 있는 전구체 는 정제된 화합물, 전구체의 염, 및 미생물의 발효에 의해 제조된 전구체 또는 배양액으로부터 부분 정제된 전구체를 함유하는 배양액을, 이러한 오염물이 반응을 억제하지 않는 한, 포함할 수 있다. GTP 전구체는 0.1mM 내지 1.0M, 바람직하게는 0.01 내지 0.5M의 농도로 사용한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 당의 예는 글루코즈, 프럭토즈, 만노즈, 이의 유도체 등을 포함한다. 당은 정제된 생성물 또는 이를 함유하는 물질로서, 이러한 오염물이 반응을 억제하지 않는 한, 사용할 수 있다. 당은 반응의 개시점에서 일괄하여, 또는 분할하여 또는 반응 동안에 연속적으로 첨가할 수 있다. 당은 0.1mM 내지 2.0M의 농도로 사용한다.
본 발명의 방법에서, 에너지 공여체, 조효소, 인산 이온, 마그네슘 이온, 킬레이트제(예: 피트산 등), 계면활성제 및 유기 용매를 임의로 첨가할 수 있다.
생성을 촉진시키는 한, 모든 화합물을 에너지 공여체로서 사용할 수 있다. 이의 예는 탄수화물(예: 글루코즈, 프럭토즈, 수크로즈, 락토즈, 말토즈, 만니톨, 솔비톨 등), 유기산(예: 피루브산, 락트산, 아세트산 등), 아미노산(예: 글리신, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산 등), 당밀, 전분 가수분해물 등을 포함한다. 에너지 공여체는 1.0mM 내지 2.0M의 농도로 사용한다.
인산 이온의 예는 오르토인산, 피로인산, 트리폴리인산, 폴리인산, 메타인산, 무기 인산염(예: 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 이수소인산나트륨, 수소인산이나트륨 등) 등을 포함한다. 인산 이온은 1.0mM 내지 1.0M의 농도로 사용한다.
마그네슘 이온의 예는 무기 마그네슘 염(예: 황산마그네슘, 질산마그네슘, 염화마그네슘 등), 유기 마그네슘 염(예: 시트르산마그네슘 등) 등을 포함한다. 마그네슘 이온은 일반적으로 1 내지 100 mM의 농도로 사용한다.
생성을 촉진시키는 한, 모든 계면활성제를 사용할 수 있다. 이의 예는 비이온성 계면활성제[예: 폴리옥시에틸렌 옥타데실아민(예: Nymeen S-215(제조원: NOF corporation) 등)], 양이온성 계면활성제[예: 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드(예: Cation F2-40E(제조원: NOF corporation) 등)], 음이온성 계면활성제[예: 라우로일 사르코시네이트 등], 3급 아민[예: 알킬디메틸아민(예: Tertiary Amine FB(제조원: NOF Corporation) 등)] 등을 포함하는데, 이는 단독으로 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물로서 사용할 수 있다. 계면활성제는 일반적으로 0.1 내지 50g/ℓ의 농도로 사용한다.
유기 용매의 예는 크실렌, 톨루엔, 지방족 알킬, 아세톤, 에틸 아세테이트 등을 포함한다. 이러한 유기 용매는 일반적으로 0.1 내지 50㎖/ℓ의 농도로 사용한다.
본 발명의 방법에 사용되는 수성 매질의 예는 물, 완충액(예: 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액), 알콜(예: 메탄올, 에탄올 등), 에스테르(예: 에틸 아세테이트 등), 케톤(예: 아세톤 등), 아미드(예: 아세트아미드 등) 등을 포함한다. 또한, 미생물의 배양 배지를 수성 매질로서 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 수성 매질에서 pH 5 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 8에서 20 내지 50℃의 온도에서 1 내지 96시간 동안 수행한다.
수성 매질 중에서 생성된 GDP-푸코즈와 GKDM은 HPLC 등을 사용하여 WO 98/12343에 따라서 정량할 수 있다.
수성 매질 중에서 생성된 GDP-푸코즈와 GKDM은 활성탄 또는 이온 교환 수지를 사용하는 일반적인 방법에 따라 회수할 수 있다[참고문헌: Carbohyd. Res., 242: 69(1993)].
본 발명의 바람직한 실시양태가 다음의 실시예에 기술된다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
glk, manB, manC, pgm 및 pfkB를 발현하는 균주의 작제:
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 프라이머를 8905형 DNA 합성기(제조원: Perceptive Biosystems Co.)를 사용하여 합성하였다.
상기 합성 DNA 프라이머를 사용하고, glk 유전자-함유 플라스미드 pNT46(WO 98/12343) DNA를 주형으로서 사용하여 PCR을 수행하였다. pNT46 DNA 1ng, 각각의 프라이머 0.5μM, Pfu DNA 폴리머라제[제조원: Stratagene Co.] 2.5단위, Pfu DNA 폴리머라제용 × 10 완충액[제조원: Stratagene Co.] 4㎕ 및 각각의 데옥시NTP 200μM를 함유하는 반응액 40㎕를 사용하여 94℃ 1분, 42℃ 2분 및 72℃ 3분의 사이클을 30회 반복하여, PCR을 수행하였다.
반응액의 1/10 용적을 아가로즈 겔 전기영동시켜, 목적하는 단편의 증폭을 확인한 다음, 잔류 반응액을 동일한 용적의 TE[10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 1mM EDTA]-포화된 페놀/클로로포름(1vol/1vol)과 혼합하였다.
혼합물을 원심분리한 다음, 이와 같이 수득된 상층에 2배 용적의 냉 에탄올을 가하여 혼합하고, 혼합물을 -80℃에서 30분 동안 방치하였다. 생성된 용액을 원심분리하여 DNA의 침전물을 수득하였다.
DNA의 침전물을 TE 20㎕에 용해시켰다. 생성된 용액 5㎕를 사용하여, DNA를 제한 효소 BglII 및 SalI로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, 진 클린 II 키트(Gene Clean II Kit)를 사용하여 1.3kb의 단편을 회수하였다.
manB 및 manC 발현 플라스미드 pNK7(WO 98/12343)(0.2㎍)를 제한 효소 BamHI 및 SalI를 사용하여 절단하고, DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, 동일한 방법으로 8.2kb의 단편을 회수하였다.
연결 키트를 사용하여, 1.3kb의 단편과 8.2kb의 단편을 16℃에서 16시간 동안 연결 반응시켰다. 연결 반응액을 사용하여, 에스케리키아 콜라이 NM522를 상기한 공지된 방법에 따라 형질전환시켜, 생성된 형질전환체를 암피실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB 한천 배지에 도포한 다음, 30℃에서 밤새 배양하였다.
상기한 공지된 방법에 따라 생육한 형질전환체 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여, glk, manB 및 manC를 발현할 수 있는 플라스미드 pNK11을 수득하였다. 이러한 플라스미드의 구조는 제한 효소 절단에 의해 확인하였다(도 1). 도 1에서, 기호 "Ampr" 및 "cI857"은 각각 암피실린-내성 유전자 및 cI857 억제인자(repressor)를 의미한다.
이와 같이 수득된 플라스미드 pNK11을 사용하여, 에스케리키아 콜라이 NM522/pNT55(WO 98/12343)를 공지된 방법에 따라 형질전환시켜, 생성된 형질전환체를 암피실린 50㎍/㎖ 및 클로르암페니콜 10㎍/㎖를 함유하는 LB 한천 배지에 도포한 다음, 30℃에서 밤새 배양하였다. 생육한 형질전환체를 선택함으로써, glk, manB, manC, pgm 및 pfkB를 동시에 발현할 수 있는 균주인 에스케리키아 콜라이 NM522/pNK11/pNT55를 수득하였다.
실시예 2
에스케리키아 콜라이 gmd를 발현하는 균주의 작제:
에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325)를 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology]에 기술된 방법에 의해 배양한 다음, 미생물의 염색체 DNA를 단리 및 정제하였다.
8905형 DNA 합성기(제조원: Perceptive Biosystems Co.)를 사용하여 합성한 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 프라이머로서 사용하고, 에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325)의 염색체 DNA 0.1㎍을 주형으로서 사용하여, 실시예 1에 기술된 방법에 따라 PCR을 수행하였다.
반응액의 1/10 용적을 아가로즈 겔 전기영동시켜, 목적하는 단편의 증폭을 확인한 다음, 잔류 반응액을 동일한 용적의 TE-포화된 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
혼합물을 원심분리한 다음, 이와 같이 수득된 상층에 2배 용적의 냉 에탄올을 가하여 혼합하고, 혼합물을 -80℃에서 30분 동안 방치하였다. 생성된 용액을 원심분리하여 DNA의 침전물을 수득하였다.
DNA 침전물을 TE 20㎕에 용해시켰다. 생성된 용액 5㎕를 사용하여, DNA를 제한 효소 HindIII 및 XbaI로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, 진 클린 II 키트(Gene Clean II Kit)를 사용하여 1.1kb의 DNA 단편을 회수하였다.
8905형 DNA 합성기(제조원: Perceptive Biosystems Co.)를 사용하여 합성한 서열번호 5 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA을 프라이머로서 사용하고, trp 프로모터-함유 플라스미드 pNT54(WO 98/12343)의 DNA를 주형으로서 사용하여, 실시예 1에 기술된 방법에 따라 PCR을 수행하였다.
반응액의 1/10 용적을 아가로즈 겔 전기영동시켜, 목적하는 단편의 증폭을 확인한 다음, 잔류 반응액을 동일한 용적의 TE-포화된 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
혼합물을 원심분리한 다음, 이와 같이 수득된 상층에 2배 용적의 냉 에탄올을 가하여 혼합하고, 혼합물을 -80℃에서 30분 동안 방치하였다. 생성된 용액을 원심분리하여, DNA의 침전물을 수득하고, DNA 침전물을 TE 20㎕에 용해시켰다.
생성된 용액 5㎕를 사용하여, DNA를 제한 효소 EcoRI 및 XbaI로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, 동일한 방법으로 0.4kb의 DNA 단편을 회수하였다.
pBluescriptII SK+ DNA 0.2㎍을 제한 효소 EcoRI 및 HindIII로 절단한 다음, DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, 동일한 방법으로 3.0kb의 DNA 단편을 회수하였다.
연결 키트를 사용하여, 1.1kb, 0.4kb 및 3.0kb의 단편을 16℃에서 16시간 동안 연결 반응시켰다.
연결 반응액을 사용하여, 에스케리키아 콜라이 NM522를 상기한 공지된 방법에 따라 형질전환시켜, 생성된 형질전환체를 암피실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB 한천 배지에 도포한 다음, 30℃에서 밤새 배양하였다.
상기한 공지된 방법에 따라 생육한 형질전환체 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여, 발현 플라스미드 pGE19를 수득하였다. 이러한 플라스미드의 구조는 제한 효소 절단에 의해 확인하였다(도 2).
실시예 3
에스케리키아 콜라이 wcaG를 발현하는 균주의 작제:
8905형 DNA 합성기(제조원: Perceptive Biosystems Co.)를 사용하여 합성한 서열번호 7 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 프라이머로서 사용하고, 에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325)의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여, 실시예 1에 기술된 방법에 따라 PCR을 수행하였다.
반응액의 1/10 용적을 아가로즈 겔 전기영동시켜, 목적하는 단편의 증폭을 확인한 다음, 잔류 반응액을 동일한 용적의 TE-포화된 페놀/클로로포름과 혼합하였다.
혼합물을 원심분리한 다음, 이와 같이 수득된 상층에 2배 용적의 냉 에탄올을 가하여 혼합하고, 혼합물을 -80℃에서 30분 동안 방치하였다. 생성된 용액을 원심분리하여, DNA의 침전물을 수득한 다음, DNA 침전물을 TE 20㎕에 용해시켰다. 생성된 용액 5㎕를 사용하여, DNA를 제한 효소 ClaI 및 XhoI로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, 진 클린 II 키트를 사용하여 1.0kb의 DNA 단편을 회수하였다.
pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 SalI로 절단한 후, DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, 동일한 방법으로 5.2kb의 DNA 단편을 회수하였다.
연결 키트를 사용하여, 1.0kb 및 5.2kb의 단편을 16℃에서 16시간 동안 연결 반응시켰다.
연결 반응액을 사용하여, 에스케리키아 콜라이 NM522를 상기한 공지된 방법에 따라 형질전환시켜, 생성된 형질전환체를 암피실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB 한천 배지에 도포한 다음, 30℃에서 밤새 배양하였다.
상기한 공지된 방법에 따라 생육한 형질전환체 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여, 발현 플라스미드 pGE8을 수득하였다. 이러한 플라스미드의 구조는 제한 효소 절단에 의해 확인하였다(도 3).
실시예 4
GKDM의 생산
실시예 1에서 수득한 에스케리키아 콜라이 NM522/pNK11/pNT55를, 암피실린 50㎍/㎖ 및 클로르암페니콜 10㎍/㎖가 보충된 LB 배지 125㎖를 함유하는 1ℓ 배플-장착 삼각 플라스크에 접종시킨 다음, 28℃에서 220rpm으로 17시간 동안 배양하였다. 생성된 배양액(125㎖)를 글루코즈 10g/ℓ, 박토트립톤(제조원: Difco Co.) 12g/ℓ, 효모 추출물(제조원: Difco Co.) 24g/ℓ, KH2PO4 2.3g/ℓ, K2HPO4 12.5g/ℓ 및 암피실린 50㎍/㎖로 이루어진 액체 배지 2.5ℓ(pH 무조정)를 함유하는 5ℓ 배양조에 접종시킨 다음, 600rpm 및 통기량 2.5ℓ/분의 조건하에 30℃에서 4시간 동안 배양한 후, 40℃에서 3시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 동안에, 배지 pH를 28% 암모니아수를 사용하여 7.0으로 유지시켰다. 또한, 글루코즈를 필요에 따라 배양 동안에 첨가하였다. 생성된 배양액을 원심분리하여, 습윤 균체를 수득하였다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보관할 수 있으므로, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있었다.
실시예 2에서 수득한 에스케리키아 콜라이 NM522/pGE19를, 암피실린 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 125㎖를 함유하는 1ℓ 배플-장착 삼각 플라스크에 접종시킨 다음, 28℃에서 220rpm으로 17시간 동안 배양하였다. 생성된 배양액(125㎖)를, 글루코즈 10g/ℓ, 박토트립톤(제조원: Difco Co.) 12g/ℓ, 효모 추출물(제조원: Difco Co.) 24g/ℓ, KH2PO4 2.3g/ℓ, K2HPO4 12.5g/ℓ 및 암피실린 50㎍/㎖로 이루어진 액체 배지 2.5ℓ(pH 무조정)를 함유하는 5ℓ 배양조에 접종시킨 다음, 600rpm 및 통기량 2.5ℓ/분의 조건하에 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 배양 동안에, 배지 pH를 28% 암모니아수를 사용하여 7.0으로 유지시켰다. 또한, 글루코즈를 필요에 따라 배양 동안에 첨가하였다. 생성된 배양액을 원심분리하여, 습윤 균체를 수득하였다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보관할 수 있으므로, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있었다.
코리네박테륨 암모니아게네스 ATCC 21170을, 글루코즈 50g/ℓ, 폴리펩톤[제조원: Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.] 10g/ℓ, 효모 추출물[제조원: Oriental Yeast Co., Ltd.] 10g/ℓ, 요소 5g/ℓ, (NH4)2SO4 5g/ℓ, KH2PO4 1g/ℓ, K2HPO4 3g/ℓ, MgSO4·7H2O 1g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1g/ℓ, FeSO4·7H2O 10㎎/ℓ, ZnSO4·7H20 10㎎/ℓ, MnSO4·4~6H2O 20㎎/ℓ, L-시스테인 20㎎/ℓ, D-판토텐산칼슘 10㎎/ℓ, 비타민 B1 5㎎/ℓ, 니코틴산 5㎎/ℓ 및 비오틴 30㎍/ℓ로 이루어진 액체 배지 25㎖(10N NaOH를 사용하여 pH 7.2로 조정)를 함유하는 300㎖ 배플-장착 삼각 플라스크에 접종시킨 다음, 28℃에서 220rpm으로 24시간 동안 배양하였다.
생성된 배양액(20㎖)을 동일한 조성의 액체 배지 250㎖를 함유하는 2ℓ 배플-장착 삼각 플라스크에 접종시킨 다음, 28℃에서 220rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 이와 같이 수득된 배양액을 종균(seed) 배양액으로서 사용하였다.
종균 배양액(250㎖)를, 글루코즈 150g/ℓ, 고기 추출물[제조원: Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.] 5g/ℓ, KH2PO4 10g/ℓ, K2HPO4 10g/ℓ, MgSO4·7H2O 10g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1g/ℓ, FeSO4·7H2O 20㎎/ℓ, ZnSO4·7H20 10㎎/ℓ, MnSO4·4~6H2O 20㎎/ℓ(별도 살균), β-알라닌 15㎎/ℓ(별도 살균), L-시스테인 20㎎/ℓ, 비오틴 100㎍/ℓ, 요소 2g/ℓ 및 비타민 B1 5㎎/ℓ(별도 살균)로 이루어진 액체 배지 2.25ℓ(10N NaOH를 사용하여 pH 7.2로 조정)를 함유하는 5ℓ 배양조에 접종시킨 다음, 600rpm 및 통기량 2.5ℓ/분의 조건하에 32℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 동안에, 배지 pH를 28% 암모니아수를 사용하여 6.8로 유지시켰다.
생성된 배양액을 원심분리하여, 습윤 균체를 수득하였다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보관할 수 있으므로, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있었다.
상기 에스케리키아 콜라이 NM522/pNK11/pNT55 습윤 균체 25g/ℓ, 상기 에스케리키아 콜라이 NM522/pGE19 습윤 균체 15g/ℓ, 상기 코리네박테륨 암모니아게네스 ATCC 21170 습윤 균체 150g/ℓ, 프럭토즈 60g/ℓ, 만노즈 30g/ℓ, GMP 20g/ℓ, KH2PO4 25g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피트산 5g/ℓ, Nymeen S-215 4g/ℓ 및 크실렌 10㎖/ℓ의 반응액 25g/ℓ를 200㎖ 비이커에 주입하고, 반응액을 자기 교반기로 교반(900rpm)하면서 32℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 동안에, 4N NaOH를 사용하여 반응액의 pH를 7.2로 유지시키고, 프럭토즈 및 KH2PO4를 필요에 따라 첨가하였다.
반응 종료 후, 반응 생성물을 HPLC로 분석하여, GKDM(2Na 염) 18.6g/ℓ(29.4mM)가 반응액 중에 생성되어 축적되었음을 확인하였다.
실시예 5
GDP-푸코즈의 생산
실시예 1에서 수득한 에스케리키아 콜라이 NM522/pNK11/pNT55를 실시예 4에 기재된 방법으로 배양한 다음, 원심분리하여 습윤 균체를 수득하였다.
실시예 2에서 수득한 에스케리키아 콜라이 NM522/pGE19를 실시예 4에 기재된 방법으로 배양한 다음, 원심분리하여 습윤 균체를 수득하였다.
실시예 3에서 수득한 에스케리키아 콜라이 NM522/pGE8을 실시예 4에 기재된 에스케리키아 콜라이 NM522/pNK11/pNT55의 경우와 유사한 방법으로 배양하되, 암피실린과 클로르암페니콜 대신에 암피실린만을 첨가한 다음, 원심분리하여 습윤 균체를 수득하였다.
코리네박테륨 암모니아게네스 ATCC 21170을 실시예 4에 기재된 방법으로 배양한 다음, 원심분리하여 습윤 균체를 수득하였다.
습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보관할 수 있으므로, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있었다.
상기 에스케리키아 콜라이 NM522/pNK11/pNT55 습윤 균체 25g/ℓ, 상기 에스케리키아 콜라이 NM522/pGE19 습윤 균체 15g/ℓ, 상기 코리네박테륨 암모니아게네스 ATCC 21170 습윤 균체 150g/ℓ, 프럭토즈 60g/ℓ, 만노즈 30g/ℓ, GMP 30g/ℓ, KH2PO4 25g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피트산 5g/ℓ, Nymeen S-215 4g/ℓ 및 크실렌 10㎖/ℓ의 반응액(30㎖)을 200㎖ 비이커에 주입하고, 반응액을 자기 교반기로 교반(900rpm)하면서 32℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 12시간의 반응 후에, 에스케리키아 콜라이 NM522/pGE8 습윤 균체를 15g/ℓ의 농도가 되도록 첨가하여, 반응을 10시간 동안 지속하였다. 반응 동안에, 4N NaOH를 사용하여 반응액의 pH를 7.2로 유지시키고, 프럭토즈 및 KH2PO4를 필요에 따라 첨가하였다.
반응 종결 후, 반응 생성물을 HPLC로 분석하여, GDP-푸코즈 14.0g/ℓ가 반응액 중에 생성되어 축적되었음을 확인하였다.
반응의 개시점에서 에스케리키아 콜라이 NM522/pGE8(15g/ℓ) 습윤 균체를 첨가하여 반응을 수행한 경우에, GDP-푸코즈(2Na 염)의 축적량은 3.7g/ℓ(5.9mM)이였다.
본 발명은 이의 구체적 실시양태를 참조로 하여 상세히 기술되었으나, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 범위 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 명시된 양태를 변화 및 변형시킬 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
본 발명에 따라, GDP-푸코스 및 GKDM을 효율적으로 제조할 수 있다.
<110> Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. <120> Process for producing GDP-fucose <130> 5-1998-095796-6 <150> JP 99-225889 <151> 1999-08-10 <160> 8 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 ccgcaagatc tcgtaaaaag ggtatcgata agc 33 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gagctgactg ggttgaaggc 20 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gaatctagaa tgtcaaaagt cgctctc 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctcaagctta tgactccagc gcgat 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 caagaattct catgtttgac agct 24 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 cattctagac ctccttaatt cgcgaaaatg gatcgatacc ctttttac 48 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 gtcatcgata tgagtaaaca acgagtt 27 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 ataaactcga gagagacaag cggag 25

Claims (18)

  1. 삭제
  2. 구아노신 5'-디포스포-4-케토-6-데옥시만노즈("GKDM"), 및 GKDM을 구아노신 5'-디포스포-푸코즈("GDP-푸코즈")로 전환시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물인 효소원을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계;
    GDP-푸코즈를 수성 매질 중에서 생성시켜 축적시키는 단계; 및
    GDP-푸코즈를 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하는, 구아노신 5'-디포스포-푸코즈의 제조방법으로서,
    상기 방법에서, GKDM은, 당과 GTP로부터 GKDM을 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물인 효소원, GTP 및 당을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계; 및 GKDM을 수성 매질 중에서 생성시켜 축적시키는 단계를 포함하는 선행 단계에 의해 제공되며,
    배양액의 처리물은 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리함으로써 수득된 균체, 균체의 건조물, 균체의 동결-건조물, 균체의 계면활성제-처리물, 균체의 용매-처리물, 균체의 효소-처리물 및 균체의 고정화물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 구아노신 5'-디포스포-푸코즈의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 구아노신 5'-트리포스페이트("GTP") 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물의 배양액, 및 당과 GTP로부터 구아노신 5'-디포스포-4-케토-6-데옥시만노즈("GKDM")를 생성시킬 수 있는 하나 이상의 미생물의 배양액 또는 상기 배양액의 처리물인 효소원, GTP 전구체, 및 당을 수성 매질 중에 존재하도록 하는 단계(여기서, 배양액의 처리물은 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리함으로써 수득된 균체, 균체의 건조물, 균체의 동결-건조물, 균체의 계면활성제-처리물, 균체의 용매-처리물, 균체의 효소-처리물 및 균체의 고정화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
    GKDM을 수성 매질 중에 생성시켜 축적시키는 단계; 및
    GKDM을 수성 매질로부터 회수하는 단계를 포함하는, 구아노신 5'-디포스포-4-케토-6-데옥시만노즈의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제2항 또는 제4항에 있어서, 당이 글루코즈, 프럭토즈 및 만노즈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  7. 제2항 또는 제4항에 있어서, GTP 전구체로부터 GTP를 생성시킬 수 있는 미생물이 코리네박테륨(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물들로부터 선택되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 미생물이 코리네박테륨 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)인 방법.
  9. 제2항 또는 제4항에 있어서, 당과 GTP로부터 GKDM를 생성시킬 수 있는 미생물이 1종 이상의 미생물인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 1종 이상의 미생물이 에스케리키아(Escherichia) 속 및 코리네박테륨 속에 속하는 미생물들로부터 선택되는 하나 이상의 미생물인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 코리네박테륨 속에 속하는 미생물이 코리네박테륨 암모니아게네스인 방법.
  13. 제2항 또는 제4항에 있어서, 당과 GTP로부터 GKDM을 생성시킬 수 있는 미생물이 글루코키나제("glk"), 포스포만노뮤타제("manB"), 만노즈 1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제("manC"), 포스포글루코뮤타제("pgm"), 포스포프럭토키나제("pfk") 및 GDP-만노즈 4,6-데하이드라타제("gmd")로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 효소의 활성이 강한 미생물인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 미생물이 glk-암호화 유전자, manB-암호화 유전자, manC-암호화 유전자, pgm-암호화 유전자, pfk-암호화 유전자 및 gmd-암호화 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터를 포함하는 재조합 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물인 방법.
  15. 제14항에 있어서, glk-암호화 유전자, manB-암호화 유전자, manC-암호화 유전자, pgm-암호화 유전자, pfk-암호화 유전자 또는 gmd-암호화 유전자가 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 유전자인 방법.
  16. 제2항에 있어서, GKDM을 GDP-푸코즈로 전환시킬 수 있는 미생물이, GKDM 에피머라제/리덕타제("wcaG") 활성이 강한 미생물인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 미생물이 wcaG-암호화 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터를 포함하는 재조합 DNA를 보유하는 미생물인 방법.
  18. 제17항에 있어서, wcaG-암호화 유전자가 에스케리키아 콜라이로부터 유래되는 방법.
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