TWI223003B - Process for producing GDP-fucose - Google Patents

Description

1223003 發明之背景 1, 發明之領域： 本發明係關於鳥糞核糖苷5，-雙磷酸石衣藻糖（以下簡稱 為「GDP-石衣藻糖」）及鳥糞核糖誓5，—雙磷酸_4-酮—6_脫 氧甘露糖（以下簡稱為「GKDM」）之製造方法。GDp_石衣藻 糖有用於，例如，作為複雜碳水化合物之合成基質，此複 雜碳水化合物有用於，例如，應用於免疫療法以提供保護 使不受細菌、病毒等等之感染及應用於心血管疾病。此 外，GKDM有用作為，例如，製造GDP—石衣藻糖之中間體。

2. 背景技藝之簡單jgj 關於GDP-石衣藻糖之製造方法，已知一種化學合成方法 (Carbohyd· Res· ，242·· 6 9 ( 1 9 93 ));然而，其有在立體 選擇性及基質之供給方面的缺點。其中使用到酶的方法 (Agric. Biol· Chem· ，48:823 (1984) 、W0 93/08205 、

及WO 99/09180)，由於使用昂貴的物料，因而並不適用於 大規模的製造。此外，酶需要複雜的純化步驟。已發展出 一種使用微生物之活性的方法（W 0 9 8 / 1 2 3 4 3 )，且其係一 種有用的方法；然而，為使用作為工業製法，其需要作進 一步的修改。此外，已知GDP-甘露糖4, 6 -脫水酶在自GDP-甘露糖至GDP -石衣藻糖之生物合成中作為起始酶的活性會 受終產物-G D P -石衣藻糖-的抑制（B i 〇 c h i m · B i ο p h y s ·

Acta ， 117: 79 (1966); FEBS Lett· ，412: 126 (1997))。 發明之概述

89115987.ptd 第7頁 1223003 五、發明說明（2) + 之—目的在於提供製造GDP-石衣藻糖及G腦之有 效率的方法。 Θ 二：的及其他目的係由關於以下之⑴至(18)的本發明 所提供。 (1) 一種GDP-石衣藻糖之製造方法，包括： 使GKDM及酶源存在於太柹+立# 養基中，其中該酶源係可將 處理石衣藻糖之微生物的培養液或培養液之經 白藻糖生成及累積於水性培養基中；及 自水性培養基回收GDP—石衣藻糖。 (2) —種GDP-石衣藻糖之製造方法，包括： 使J糞核糖苔5’一三磷酸鹽（以下簡稱為「GTp」）前趨 ΓΤΡ-^ ^ a. &丨王*口養基中，其中該酶源係可自 趨物生㈣P之微生物的培養液或培養液之經處理產 物’及可自糖類及GTP生成GKDM之微生物的培養液或培養 液之經處理產物； 使GKDM生成及累積於水性培養其中· 使用可將GKDM轉變為GDP-石衣^糖之微生物之培養液或 培養液之經處理產物作為酶源1累積的gkdm轉變為GDp_ 石衣澡糖，而在水性培養基中生成及累積Gj)卜石衣藻糖； 及 自水性培養基回收GDP -石衣藻糖。 (3) —種GKDM之製造方法，包括： 使GTP前趨物、糖類及酶源存在於水性培養基中，其中

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該酶源係可自GTP前趨物生成GTP之微生物的培養液或培養 液之經處理產物，及可自糖類及GTP生成GKDM之微生物的 培養液或培養液之經處理產物； 使GKDM生成及累積於水性培養基中；及 自水性培養基回收GKDM。

(4)根據（1)、（2)或（3)之方法，其中該培養液之經處理 產物係選自包括培養液之濃縮產物、培養液之乾燥產物、 經由將培養液離心而得之細胞、細胞之乾燥產物、細胞之 冷凍乾爍產物、細胞之經表面活性劑處理的產物、細胞之 經超音波處理的產物、細胞之經機械研磨處理的產物、細 胞之經溶劑處理的產物、細胞之經酶處理的產物、 蛋白質料、細胞之固定化產物、及經由自細胞萃取而得 (5)根據（2)或（3)之方法，其中該GTp前趨物係選自包括 鳥糞嘌呤、黃嘌呤、6-羥基嘌呤、鳥糞核糖苷、黃嘌呤核 苔、肌苔、‘高糞核糖苔5, _單麟酸鹽、黃嗓吟核苔5, _單鱗 酸鹽、及肌苷5 ’ -單鱗酸鹽。 (6)根據（2)或（3)之方法 糖、果糖、及甘露糖。 其中该糖類係選自包括葡萄

(7) 根據（2)或（3)之方法，其中該可白 八丫必J自GTP丽趨物生成GTP 之微生物係選自屬於棒桿菌屬之微生物。 (8) 根據（7)之方法，其中該微生物係為產氨棒桿菌 (Corynebacterium ammoniagenes) 〇 (9) 根據（2)或（3)之方法’其中該可自糖類及GTp生成

1223003 五、發明說明（4) 之彳政生物係為至少一種微生物。 (=根據（9)之方法，其中該至少 ，希氏菌屬及棒桿菌屬之微生物 自屬於 係為大腸桿菌。 〃巾°亥屬於埃希氏菌屬之微生物

(1 2 )根據（1 〇 )之方、本 ^ M 為產氨棒桿菌。’、、中“屬於棒桿菌屬之微生物係 (13)根據（2)或（3) > 士、+ ^ ^ _ GKDM之微生物^有s Λ ’Λ 自糖類及GTP生成 「S1 k )、沐缺，、有k自包括匍糖激酶（以下簡稱為 」 H酉""甘露糖變位酶（以下簡稱為「ma Β Λ廿 露糖卜碌酸鹽鳥苔酸轉移酶(以下簡稱為“ηΒ」）：： 磷酸變位酶（以下簡箍 manC」）、葡糖 猱A「nflf ,間％為「PW」）、磷酸果糖激酶（以下簡 稱為 Pfk」）、及GDP-甘霞播4 R股 甘路糖4, 6-脫水酶（以下簡稱為 g 至夕一種酶之強活性的微生物。 (1 4 )根據（1 3 )之方、本 /ώ/ L L/ , (vector)及人！ 6去，其中该被生物係具有包括載體 包括gik-表現基因、manB-表現基因、 manC-表現基因、pgm〜表現基因、pfk—表現基因、及_d- 表現基因之至少™基因之DNA片段之重組DNA的至少一種微 生物。 (15) 根據（14)之方法，其中該glk 一表現基因、_ηΒ—表現 基因manC表現基因、pgm_表現基因、k一表現基因戋 gmd-表現基因係衍生自大腸桿菌之基因。 (16) j艮據（1)或（2)之方法，其中該可將GKM轉變成GDp — 石衣澡糖之微生物係具有強GKDM表異構酶/還原酶（以下

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簡稱為「wcaG」）活性之微生物。 (17) 根據（16)之方法，其中 含表現基因之DNA片、/ 5亥=係具有包括載艘及 0Λ , 乃奴之重組dna的微生物。 (18) 根據（17)之方法，1 φ兮 Γ主^ ^ u 腸桿菌。 其中该wcaG-表現基因係衍生自大 羊細說明 本申請案係以1 999年8 Hei 11-225889 為基礎， 料0 月10日提出申請之日本申請案Ν〇· 將其全體内容併入本文為參考資 為達成以上目的及 究，並路招^ I丄、八他目的，本發明人進行密集的硏 物），、紗五至-成及累積GKDM (GDP—石衣藻糖之前趨 可立相、、W 將經如此累積的GKDM轉變成GDP-石衣萍糠， 萍：：：Γί腑—甘露糖4,6—脫水 :ΐ=:因此可有效率地生臟-石衣藻糖。 培養液之=户：趨物生成GTP之微生物的培養液或 只要i ΐ μ物中進行較佳。可使用任何的微生物， 趨物力的微生物即可。熟知適當的GTP前 屬將說明者。此種微生物 、布氏囷屬及棒桿菌屬之微生物。 於：：:矣：氏菌屬之微生物的例子包括大腸桿菌等等。屬 例4囷屬之微生物的例子包括產氨棒桿菌等等。明確的 例子包括產氨棒桿菌ATCC 21170等等。 捭此方法以在可自糖類及GTP生成GKDM之微生物的 <液或培養液之經處理產物中進行較佳。亦熟知適當的

1223003 五、發明說明（6) 後即將說明者。此種微生物的例子包括 、manB、manC、Pgm、pf k 及gmd 之至少— 生物。以上之具有強酶活性的微生物係 例如’經自母菌種之活性改良之g 1 k、 P f k及g m d之至少一種酶之活性的微生 構k受異體、細胞融合菌種、轉導物或 作為起源的微生物。具有經自母菌種之 上酶之至少一種酶之活性的微生物可為 胞融合菌種、轉導物及重組菌種。 埃希氏菌屬及棒桿菌屬之微生物。較佳 菌及產氨棒桿菌。 括gl k 性的微 包括， Λ Pgm 係指在 ’使用 選自以 體、細 括屬於 大腸桿 糖類，且其 具有選自包 種酶之強活 指具有選自 manB 、 manC 物。母菌種 重組菌種時 活性改良之 任何的變異 其例子包 的例子包括 另外，亦可使用利用重組DNA技術改良選自glk、隱"、 manC pgm Mk及gmd之至少一種酶之活性的變性體。其 例子包括具有含衍生自大腸桿菌之glk基因之重組 /、 DNA(pNKll)之大腸桿 _NM522 (J· Bacteri〇1·，i79: km (1997))、具有含衍生自大腸桿菌之基因之重组 DNA(pNKll)之大腸桿菌關522 (J. Bacteri〇1· ，ΐ78· “π (1996))、具有含衍生自大腸桿菌之·η(：基因之重组 DNA(pNKll)之大腸桿菌 NM522 (J. Bacteri〇1·，1 78: 4885 ( 1 9 9 6 ))、具有含衍生自大腸桿菌之pgm基因之重组 DNA(PNT55)之大腸桿菌關522 (J· Bacteri〇1· ，1 76: 1 2 98 (1 994 ))(W0 98/ 1 2343 )、具有含衍生自大腸桿菌之“⑽基 因之重組MA(PNT55)之大腸桿菌NM522 (Gene，28: 337 (1 984 ))(W0 9 8/ 1 2 343 )、具有含衍生自大腸桿菌之gmd基 1223003 五、發明說明（7) -------- 因之重組DNA(pGE19)之大腸桿菌NM5 22 (J. Bacte 178·· 4885 ( 1 99 6 ))等等。 丄·’ 當微生物可自GTP前趨物生成GTp，且同時亦可 GTP生成GKDM時，接著可利用微生物自GTp前趨物及糖 成GKDM。此外，在微生物在一菌種中僅具有自糖類及生 生成GKDM所需之一部分活性的情況中，可經由適當地結人 至少兩微生物而生成GKDM。 σ

可使用任何微生物作為使用於本發明之可將“關轉變 GDP-石衣澡糖之微生物，只要其具有此一轉變活性即可。 舉例來說’可使用具有強wcaG活性之微生物。 明確a之’可舉屬於埃希氏菌屬或棒桿菌屬之微生物， 諸如大腸桿菌、產氨棒桿菌等等為例。 再者，亦可使用利用重組DNA技術改良GKDM表異構酶/ 還原酶之活性的變性體。其例子包括具有含大腸桿gwcaG 基因之重組DNA(pGE8)之大腸桿菌NM522 ( J. Bacteriol.， 178: 4885 (1996))。 在使用重組DNA技術之GDP-石衣藻糖及GKDM的以上製造 中，可根據已知之方法（例如，分子選殖，實驗室手冊

(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版， 冷泉港貫驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press) ( 1 989 )(以下簡稱為「分子選殖，第二版」）及分 子生物學中之現行方案（Current Protocols in Molecular Biology) ^ John Wiley & Sons (1987-1997)(以下簡稱為「分子生物學中之現行方案」））

89115987.ptd 第13頁 1223003 五、發明說明（8) 進行與基因重組相關的夂 化質體MA、利用限制^種方，諸如自微生物分離及純 -每刀剔負體D N A、分離及純化經切割 片段DNA片段的酵素性連接、使組麗的 寺等。此外，可根據已知方法（PCR方案（PCR Protocols)，學4衧出肱紅〆λ Ί · ^(AcademicPress)(1990))進行 4合酶鏈反應（以下簡稱為「MR」）。 MGDP石衣/喿糖或GKDM之生成相關的基因可經由利用限 :或:j用PCR使含有基因的DNA片段成為含有基因且具有 f當長度的應片段，將所產生之片段插入至適當表現載 豆之啟動，的下游，然後再將經插入謝的表現載體引入 至適合於该表現載體的宿主細胞中。 可使用任何的細菌、酵母等等作為宿主細胞，只要其可 表現所要基因即可。 表現載體之例子包括可在前述的宿主細胞中自主複製或 可嵌入至染色體’且在可轉錄所要基因之位置動 的表現載體。 當使用原核生物，諸如細菌等等，作為宿主細胞時，基 因表現載體可於原核生物中自主複製，且其係、由啟動子、 核糖體結合序列、所要DNA及轉錄終止序列所構成的重組 MA較佳。其可包含控制啟動子的基因。 表現載體的例子包括PKK2 23-3及pGEX-2T(兩者皆係由

Amersham Pharmacia Biotech Co·製造）、pSE280 (Invitrogen Co·製造）、pGEMEX-l(Promega C〇·製造）、 p Q E 3 0 (Q u i a g e n C o ·製造）、p E T - 3 ( N o v a g e n C 〇 ·製造）、

1223003 五、發明說明（9)

pKYP10(日本公告未審查專利申請案No. 1 1 0 60 0/83 )、 pKYP200(Agric· Biol· Chem. ， 48: 669 (1984))、 pLSAl(Agric· Biol· Chem. ， 53: 277 (1989))、 pGELl(Proc. Natl· Acad· Sci·， USA ， 82: 4306 ( 1 9 9 5 ))、pBluescript II SK + (Stratagene Co·製造）、 pBluescript II SK- (Stratagene Co.製造）、pTrS30(由 大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP- 540 7 )製備得）、 pTrS32(由大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408 )製備 得）、pUC19(Gene，33: 1 0 3 ( 1 98 5 ))、pSTV28(Takara Shuzo Co·， Ltd.製造）、pUC118(Takara Shuzo Co·，

Ltd·製造）、PPAC3 1( WO 98/12343)等等。 可使用任何啟動子，只要其可在宿主細胞，諸如大腸桿 囟等等中作用即可。其例子包括衍生自細菌或嗟菌體之啟 動子，諸如trp啟動子（Ptrp)、lac啟動子（Plac)、PL啟動 子（PL)、PR啟動子、PSE啟動子等等、SP01啟動子、SP02啟 動子、p e η P啟動子等等。其他的例子包括經人工設計及改 造的啟動子，諸如經由串聯連接兩p t r ρ而製備得之啟動 子、tac啟動子、lac T7啟動子、及let I啟動子。

使用在賽恩-達加諾（Shine-Dal gar no)序列（其係核糖體 結合序列）與起始密碼子之間之空間經控制於適當距離（^ 如，6至1 8個鹼基）的質體較佳。 在本發明之重組DNA中，對於所要DNA的表現，並非都φ 要轉錄終止序列；然而，將轉錄終止序列接於結構基因2 後較佳。 <

短=生：：：子：；屬菌於y氏f、沙雷氏菌、桿菌、 確的例子包括大腸桿菌XL1J早^屬等等的微生物。明 菌_、大腸桿菌關困二1，腸，藍、大腸桿 MU, 00 人物杯囷W1485、大腸椁gj M5 22、大腸桿菌頂1〇9、大腸 49、*鸱护并WQ11H · 1 υ 1 穴細才干囷No. “二=7 腸桿菌NY49、無花果沙雷氏菌 icaria)、小凑沙雷氏菌（Serratia f〇ntlcola)、溶膠沙雷氏菌、黏質沙雷氏菌、枯草桿菌、 解澱粉牙孢桿菌、引馬利歐費林短桿菌(計⑼化如…㈣ lmm^arioph^ilum) ATCC 1 40 68、解糖短桿菌 ATCC 14〇66、 產氨棒柃菌、谷胺酸（glutamicum)棒桿菌ATCC 13〇32、谷 胺酸棒桿菌ATCC 1 4067、谷胺酸棒桿菌ATCC 1 38 6 9、嗜乙 醯乙酸棒桿菌ATCC 1 3870、嗜氨微桿菌ATCC 1 53 54、假單 胞菌sp· D-0110等等。 關於引入重組DNA之方法，可使用任何方法，只要其係 用於將DNA引入至宿主細胞内之方法即可，其諸如使用鈣 離子之方法（Proc. Natl. Acad. Sci«，USA H 2110 (1 9 7 2 ))、原生質體方法（曰本公告未審查專利申請案N〇.

248394/88 )、電穿孔（eiectroporati〇n)方法（核酸研究 (Nucleic Acids Research) ， 16: 6127 (1988))等等。 當使用酵母菌種作為宿主細胞時，使用表現載體的例子 包括YEpl3 (ATCC 37115)、YEp24 (ATCC 370 5 1 )、YEp50 (ATCC 37419) 、pHS19 、pHS15 等等。 可使用任何啟動子，只要其可在酵母菌種中作用即可。

89115987.ptd 第16頁 1223003 五·、發明說明 (11)

其例子包括PH05啟動子、PGK啟動子、gap啟動子、ADH啟 動子、ga 1 1啟動子、ga 1 1 0啟動子、熱驟變多肽啟動 子、MF αΐ啟動子、CUP 1啟動子等等。 宿主細胞之例子包括屬於酵母菌、裂殖酵母菌、克魯維 若^菌（Kluyveromyces)、毛孢子菌（1^以〇叩(^〇11)、許"旺 尼菌（Schwann iomyces)、畢赤氏酵母（Plchla)、假絲酵 菌屬等等之酵母菌種。明確的例子包括啤酒酵母、稷列 殖酵母菌、乳酸克魯維若菌、聚麥芽三糖毛孢子菌久衣 (Trichosporon pullulans)、；巳濫許旺尼菌 (Schwanniomyces aiiuvius)、巴斯德畢赤氏酵母、 假絲酵母菌等等。 ^ 關於引入重組DNA之方法，可使用任何方法，只要其係 用於將DNA引入至酵母内之方法即可。直 ^MMeth〇ds lnEnzymo, ,194： 球狀體方法（proc_ Natl· Acad· Sci· USA，8 1: 4889 ( 1 984 ))、醋酸鋰方法（J· Bacteri〇i ，153. 163

( 1 9 8 3 ))等等。 ’么 1 W 在=養基中培養本發明之變性體可根據一般用於培養宿 主之方法進行。 :於：於培養以原核生物’諸如大腸桿菌"，或真核 梓用/ #酵母等等，作為宿主所得之轉形株的培養基， = :::種天然培養基及合成培養基，只要其包含可 " 同化，且可有效率地進行變性體之培養的碳 /原、亂源、無機鹽等等即可。

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可使用 包括碳水 蜜、澱粉 等）、醇（ 氮源之 銨、硫酸 腺、肉類 豆粉、水 使用於 酸氫二钟 猛、硫酸 可利用微生物同化之你 於人私? r& 何材料作為碳源。豆例子 化合物（例如，匍萄糖、 人/ 、水解澱粉等等）、有機〃 ，、、、；、、§其之糖 例如，乙醇、丙醇等等j(等例如’醋酸、丙酸等 例子包括4、無機或有機酸之胺鹽(例如

銨、醋酸銨、磷酸銨箄辇、使 Z ..^ L/ ^ 文寻寺）、其他含氮化合物、 U物、酵母萃取物、玉米t、水料蛋白、黃 解頁且粉、各種發酵細胞及其水解液等等 培養基中之無機材料的例子包括磷酸二氫鉀、磷 、鱗酸鎭、硫酸鎂、氯化納、硫酸亞鐵、硫酸 銅及碳酸$弓。 一般係在曝氣狀態之下進行培養，諸如振搖培養，浸沒 曝氣稅拌培養專專。培養溫度係自1 5至4 0 °C較佳，及彡立養 時間一般係自5小時至7天。在培養過程中，將培養基pH控 制於自3· 〇至9· 0。pH係藉由無機或有機酸、鹼溶液:脲、 碳酸奶、氣專等調整。 此外’在培養過程中視需要可將抗生素，諸如氨比西林 (ampic ill in)及氯霉素等等，加至培養基中。 當培養轉形具可誘導啟動子作為啟動子之表現載體之微 生物時，視需要可將誘導物加至培養基。舉例來說^當將 培養轉形具1 a c啟動子之表現載體之微生物時，可將異丙 基一 A -D-硫半乳糖哌喃糖苷加至培養基；及當培養轉形含 t r ρ啟動子之表現載體之微生物時，可加入叫丨啼丙稀酸 酯0

89115987.ptd 第18頁 1223003 五、發明說明（13) 當在本發明之方法中使用至 生物分開培養以使用各別的谇養、物日”可將此等微 單-的培養容器中以進二；；：Ϊ:將其同時接種至 培養液。或者，在任何一種彳物一後再使用所產生的 成後，將殘留微生物接種；=物：：養過程中或培養完 液。 安裡及土口養，亚使用所產生的培養 可將經由培養而得的微生物培養液或於其之各種處理德 培養基中㈣源。使用作為在本發明之方法中在水性

春ΐ f理產物的例子包括培養液之濃縮產物、培 ϊίΐϊ 經由將培養液離心而得之細⑽、細胞之 庫乙知產物、細胞之冷庚兹@πΑ / . 7 ^ ^秌產物、細胞之經表面活性劑處 王^產物、細胞之經超音波處理的產物、細胞之經 磨處理的產物、細胞之經溶劑處理的產物、細胞之經酶： 理的產物二細胞之蛋白質部分、細胞之固定化產物、及經 由自細胞萃取而得的I每製劑等等。 在本發明之方法中的微生物係以濕細胞計為自1至5 〇 0克 /公升之夏使用，以自5至3 〇 〇克/公升較佳。此外，當使 用至少兩種彳政生物同時進行生成反應時，水性培養基中之 微生物之總濕細胞的量係自2至5 〇 〇克/公升，以自丨〇至 4 0 0克/公升較佳。 使用於本發明方法中之GTp前趨物的例子包括鳥糞嘌 1、黃嗓吟、6—經基嘌呤、鳥糞核糖苷、黃嘌呤核苷、肌 苷、鳥糞核糖苷5 ’ -單磷酸鹽、黃嘌呤核苷5，—單磷酸鹽、 1 1 1 I 1 1 11 1 I 1 Ϊ 1 89115987.ptd _ ---—--— 第19頁 1223003 五、發明說明（14) 肌苔5’ -單磷酸鹽等等。可使用的前趨物 物、前趨物之鹽、及含有經由微生物 、、屯化化口 之培養液或自培養液部分純化而G”：製得之前趨物 不會抑制反應即可。GTP前趨物係以 ：= 度使用，以自0· 01至0_ 5 Μ較佳。 · 至^^之/辰 甘ϊ:於ί發！ ΓΠ之糖類的例子包括葡萄•、果糖、 ::糖、其衍生物專專。糖類可以純化產物或含豆之 時--:ΓΓ亏ί物不I抑制反應即可。糖類可於反應開始 自〇二：” ' 中分開或連續加入。糖類係以 自υ· 1 mM至2· ο Μ之濃度使用。 在本务明之方法中，視需要可加入 酸根離子、鎂離子、螯合劑(例里:體 劑及有機溶劑。 值馱4 # )、表面活性 可將任何化合物使用作為能量供體，只豆 (例如，夕牙糖、甘露糖醇、山梨糖醇等等）、有機酸 酸、丙胺酸Λ、Λ酸：醋Λ'等)：胺基酸（例如，甘胺 等等。能旦报、H合胺酸等等）、糖蜜、水解殿粉 、、 里七、體係以自1 · 0 πιΜ至2 · 0 Μ之澧产你雨。 酸根離子之例子包括正鱗酸、焦餐、又三μ酸、取 : ίί酸、無機填酸鹽(例如，鱗酸二氫鉀、構酸氫" 传以自ΓΓ—虱鈉、磷酸氫二鈉等等）等等。磷酸根離子 係以，10 mM至1.0 Μ之濃度使用。

89115987.ptd 第20頁 1 例子包括無機鎮鹽（例如’硫酸錤、硝酸鎖、 1223003 五、發明說明（15) ----- ，化鎂等等）、有機鎂鹽（例如，擰檬酸鎂等等）等等。鎂 離子一般係以自1至i 〇 〇 mM之濃度使用。 可使用任何表面活性劑，只要其可促進生成即可。其例 子包括非離子型表面活性劑（例如，聚氧伸乙基十八基胺 (例如，Nymeen S-215，N0F CORPORATION 製造）等等）、陽 離子表面活性劑（例如，鯨躐基三甲基溴化銨、烧基二曱 基 + 基氯化銨（例如，Cati〇n F2-40E，N0F CORPORATION ‘ k )專專）、陰離子表面活性劑（例如，月桂酸基肌胺酸 酉旨鹽等等）、第三胺（例如，烷基二甲基胺（例如，

Tertiary Amine FB，N0F Corporation 製造）等等）等等， 其可單獨使用或以其至少兩者之混合物使用。表面活性劑 一般係以自〇 · 1至5 〇克/公升之濃度使用。 有機溶劑之例子包括二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、乙 酸乙酯等等。有機溶劑一般係以自0 · 1至5 0毫升/公升之 濃度使用。 使用於本發明方法中之水性培養基的例子包括水、緩衝 劑（例如，磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、擰檬酸 鹽、Tr is之緩衝劑等等）、醇（例如，甲醇、乙醇等等）、

醋（例如，乙酸乙酯等等）、酮（例如，丙酮等等）、醯胺 (例如，乙醯胺等等）等等。或者，可使用微生物之培養基 作為水性培養基。 本發明之方法係在水性培養基中在pH 5至1 〇下進行1至 96小時，以PH 6至8及在2 0至50 °C之溫度下較佳。 可根據說明於W0 98/ 1 2343中之方法，使用HPLC等等測

第21頁 1223003 五、發明說明（16) 定在水性培養基中生成之GDP-石衣藻糖及GKDM。 在水性培養基中生成之GDP-石衣藻糖及GKDM可根據通常 之方法使用活性破或離子交換樹脂回收（C a r b 〇 h y d .

Res. ， 242: 69 (1993))。 以下實施例顯示本發明之較佳具體例。然而，本發明並 不限定於此。 實施例1 表現glk、manB及manC、pgm及pfkB之菌種製備： 使用ώ感知生物糸統公司（Perceptive Biosystems Co·)製造之890 5型DNA合成器合成具有SEQ ID N0:1之核苷 酸序列的DNA引子及具有SEQ ID 1^0:2之核苔酸序列的0^ 引子。 使用此等合成DNA引子，以含有glk基因之質體pNT46 (W0 98/ 1 2343 ) DNA作為模板，進行PCR cPCR係使用40微 升之含有1毫微克PNT46 DNA、〇· 5 //Μ之各引子、2· 5單位 之Pfu DNA聚合酶（Stratagene Co.製造）、4微升之供Pfu DNA聚合酶用之X 10緩衝劑（Stratagene Co.製造）及200 // Μ之各去氧NTP之反應溶液，經由重複94 °C 1分鐘，42 °C 2分鐘及72 °C 3分鐘之循環30次而進行。 取1 /1 0體積的反應溶液進行瓊脂糖膠體電泳，以證實所 要片段的放大，然後將其餘的反應溶液與相同體積之TE (10 mM Tris-HC1 (pH 8·0)及 1 mM EDTA)飽和朌 / 氯仿（1 體積/1體積）混合。 於將混合物離心後，將如此製得的上層與兩倍體積的冷

89115987.ptd 第22頁 1223003 五、發明說明（17) 乙醇混合，及使混合物在-8 0 °C下靜置3 0分鐘。將所產生 之溶液離心而得D N A之沈澱物。 將DNA之沈澱物溶解於20微升之TE中。使用5微升所產生 之溶液，利用限制酶Bgl I I及Sal I切該DNA，利用瓊脂糖膠 體電泳分離所產生之DNA片段，然後使用基因清潔丨丨套組 (Gene Clean II Kit)回收1.3 kb之片段。

利用限制酶BamHI及Sal I切manB及manC表現質體pNK7 (WO 98/ 1 2 343 )( 0.2微克），利用瓊脂糖膠體電泳分離DNA 片段，然後以相同的方式回收8· 2 kb之片段。

使用接合套組（ligation kit)，使1.3kb及8.2 kb之片 段在1 6 °C下進行接合反應1 6小時。使用接合反應溶液，根 據說明於上的已知方法將大腸桿菌NM522轉形，及將所產 生之轉开> 株散佈於含有5 0微克/毫升氨比西林之l B瓊脂培 養基上，隨後在3 0 X：下培養隔夜。 經如此成長的轉形株菌落，以根據說明於上的已知方法 自其中萃取質體，而得可表現glk、manB及manC之質體 PNK 1 1。此質體之結構係經限制酶消化確認（圖丨）。在圖 1 ’符號「Ampr」及「c I 8 5 7」係分別代表抗氨比西林基因 及c I 8 5 7抑制物。

使用如此製得的質體pNK 11，根據已知方法轉形至大腸 桿菌NM522/PNT55 (W0 98/ 1 2343 )，及將所產生之轉形株 散佈於含有5 0微克/毫升氨比西林及丨〇微克/毫升氯霉素 之LB瓊脂培養基上，隨後在3〇它下培養隔夜。經由選擇如 此成長的轉形株，而製得作為可同時表現glk、manB、

89115987.ptd 第23頁 1223003 五、發明說明（18) manC、Pgm及pfkB之菌種的大腸桿菌ΝΜ522/ρΝκη τ55。 實施例2 表現大腸桿菌g m d之菌種製備： ^用說明於分子生物學中之現行方案中之方法培養大腸 桿囷W3110 (ATCC 273 25 )，然後將微生物的染色體ΜΑ分 離並純化。 分別將利用感知生物系統公司製造之89〇5型⑽人合成哭 合成得之具有SEQ ID N〇s:3及4之核苔酸序列的⑽人使用^ 為引子，根據說明於實施例丨中之方法，使用〇·〗微克之大 腸桿菌W311 0 (ATCC 27325 )的染色體DNA作為模板，而進 行PCR。 取1 /1 0體積的反應溶液進行瓊脂糖膠體電泳，以證實所 要片段的放大，然後將其餘的反應溶液與相同體積之TE飽 和酚/氯仿混合。 將混合物離心後，將如此製得的上層與兩倍體積的冷乙 醇混合’並使混合物在-8 Q °C下靜置3 0分鐘。將所產生之 〉谷液離心而得D N A之沈殿物。 將DNA之沈澱物溶解於20微升之TE中。使用5微升所產生 之溶液，利用限制酶Hindi I I及Xbal切該DNA，利用壤脂糖 膠體電泳分離所產生之D N A片段’然後使用基因清潔I I套 、组回收1. 1 kb之DNA片段。 分別將利用感知生物糸統公司製造之8 9 0 5型D N A合成哭 a成彳于之具有S E Q I D N 0 s ·· 5及6之核普酸序列的])n A製劑使 用作為引子，根據說明於實施例1中之方法，以含有t ^啟

89115987.ptd 第24頁 1223003 五、發明說明（19) 動子之質體PNT54之DNA(W0 98/ 1 23 43 )作為模板，進行 PCR ° 取1 /1 0體積的反應溶液進行瓊脂糖膠體電泳，以證實所 要片段的放大，然後將其餘的反應溶液與相同體g tTE名包 和盼/氯仿混合。 將混合物離心後，將如此製得的上層與兩倍體積的冷乙 醇混合，及使混合物在-80 °C下靜置30分鐘。將產生7之 溶液離心而得DNA之沈殿物，及將DNA之沈澱物溶解於2〇微 升之TE中。 ' Λ 使用5微升所產生之溶液，利用限制酶Ec〇IU及乂^丨切該 DNA，利用瓊脂糖膠體電泳分離所產生之ΜΑ片段，缺後= 相同的方式回收0· 4 kb之DNA片段。 ” 於利用限制酶EcoRI及Hindi I I將〇· 2微克之 Mluescr^ptn SK+ DNA切割後，利用壤脂糖膠體電泳分 離DNA片&，然後以相同的方式回收3. Q心之磁片段。 使用接合套組，使1· lkb、〇· 4 kbn u 。(：下進行接合反應16小時。心3』以之片段在16 使用接合反應溶液，根據說明於 菌NM522轉形，及將所產生之轉 、已知方法將大腸桿 ^ ^ , .LB ^ ^ # Λ ^ ^ 夜。 1現後在30 C下培養隔 根據說明於上的 取質體，而得表現 切割確認（圖2 )。

1223003 五、發明說明（20) 實施例3 表現大腸桿菌wcaG之菌種製備： 分別將利用感知生物系統公司製造之8 9 〇 5型DNA合成器 合成得之具有SEQ ID N0s:7及8之核苔酸序列的DNA製劑使 用作為引子’根據說明於實施例1中之方法，以大腸桿菌 W31 10 (ATCC 2 732 5 )的染色體DNA作為模板，進行PCr。 取1 /1 0體積的反應溶液進行瓊脂糖膠體電泳，以證實所 要片又的放大，然後將其餘的反應溶液與相同體積之飽 和紛/氯仿混合。

將混合物離心後，將如此製得的上層與兩倍體積的冷乙 醇混合，及使混合物在-80 °c下靜置30分鐘。將所產生之 溶液離心而得DNA之沈澱物，及將DNA之沈澱物溶解於2〇微 升之TE中。使用5微升所產生之溶液，利用限制酶c丨a j及 X h ο I切D N A，利用瓊脂糖膠體電泳分離所產生之d n a片段， 然後使用基因清潔I I套組回收丨· 〇 kb之DNA片段。 於利用限制酶Clal及Sal I將〇· 2微克之PPAC31 DNA切割 後’利用瓊脂糖膠體電泳分離MA片段，然後以相同的^ 式回收5. 2 kb之DNA片段。

使用接合套組，使l.Okb及5.2 kb之片段在16 °c下進行 接合反應1 6小時。 #使用接合反應溶液，根據說明於上的已知方法將大腸桿 囷NM522轉形，及將所產生之轉形株散佈於含有5〇微克/ 毛升氨比西林之LB瓊脂培養基上，隨後在3〇它下培養隔 夜。 <

89115987.ptd 第26頁 1223003 五、發明說明（21) 根據說明於上的已知方法自經如此成長的轉形株菌落萃 取質體’而得表現質體PGE8。此質體之結構係經限制酶: 割確認（圖3 )。 貫施例4 GKDM之製造 將於實施例1中製得之大腸桿菌NM522/pNKl 1/PNT55接種 至含有經補充5 0微克/毫升氨比西林及1 〇微克/毫升氯霉 素之1 2 5耄升LB培養基之1公升設有擋板的錐形瓶中，隨後 在28 C及220 rpm下培養17小時。將所產生之培養液（125 笔升）接種至含有2. 5公升包括1〇克/公升葡萄糖、12克/ 公升細菌胰腺（bactotryptone)(Difco Co·製造）、24 克/ 公升酵母萃取物（Difco Co·製造）、2·3克/公升ΚΗ2Ρ04、 12. 5克/公升Κ2ΗΡ〇4及5〇微克/毫升氨比西林之液體培養 基（pH未經調整）之5公升的培養容器中，隨後在3〇。〇在6〇() rpm及2. 5公升/分鐘曝氣的條件下培養4小時，及再在4〇 C下培養3小時。在培養過程中，使用28%的氨水溶液將培 養基之pH維持於7· 〇。此外，在培養過程中當有需要時， 加入葡萄糖。將所產生之培養液離心而得濕細胞。由於濕 細胞可視情況需要保存於-20 °C下，因而其可經由在使用 前解凍而使用。 將於實施例2中製得之大腸桿菌NM522/pGE19接種至含有 經補充50微克/毫升氨比西林之125毫升LB培養基之1公升 &有擒板的錐形瓶中，隨後在28 °C及220 rpm下培養17小 時°將所產生之培養液（125毫升）接種至含有2. 5公升包括

89115987.ptd 第27頁 1223003 五、發明說明（22)

10克/公升葡萄糖、12克/公升細菌胰腺（D if CO Co·製 造）、24克/公升酵母萃取物（Difc〇 c〇.製造）、2·3克/ 公升KHJO4、12· 5克/公升Κ2ΗΡ04及50微克/毫升氨比西林 之液體培養基（pH未經調整）之5公升的培養容器中，隨後 在3 7 °C在6 0 0 rpm及2, 5公升/分鐘曝氣的條件下培養6小 時。在培養過程中，使用28°/◦的氨水溶液將培養基之pH維 持於7· 0。此外，在培養過程中當有需要時，加入葡萄 糖。將所產生之培養液離心而得濕細胞。由於濕細胞可視 情況需要保存於-2 0 °C下，因而其可經由在使用前解床而 使用。 將產氨棒桿菌ATCC 21170接種至含有25毫升包括50克/ 公升葡萄糖、10克/公升多腺（Nihon Pharmaceutical Co·，Ltd.製造）、10克/公升酵母萃取物（東方酵母股份 有限公司（Oriental Yeast Co.， Ltd·)製造）、5克/公升 脲、5克/公升（NH4)2S04、1克/公升ΚΗ2Ρ04、3克/公升 MP04、1 克 / 公升MgS04 · 7H20、0· 1 克 / 公升CaCl2 ·

2H20、10 毫克 / 公升FeS04 ·7Η20、10 毫克 / 公升zns〇4 · 7H20、20毫克/公升MnS04 · 4〜6H20、20毫克/公升L_半 胱胺酸、1 0毫克/公升D -泛酸鈣、5毫克/公升維生素 Bi、5毫克/公升菸鹼酸及30微克/公升生物素（經利用1〇 N NaOH調整至pH 7· 2)之液體培養基之30 0毫升設有擋板的 錐形瓶中，隨後在28 °C及22 0 rpm下培養24小時。 將所產生之培養液（20毫升）接種至含有250毫升具有相 同組成物之液體培養基之2公升設有播板的錐形瓶中，隨

89115987.ptd 第28頁 1223003 五、發明說明（23) 後在28 °C及2 2 0 rpm下培養24小時。將如此製得的培養液 使用作為種培養液。 將種培養液（2 5 0毫升）接種至含有2 · 2 5公升包括1 5 0克/ 公升葡萄糖、5克/公升肉類萃取物（Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.，Ltd·製造）、10 克/公 升KH2P〇4、10 克 / 公升Κ2ΗΡ04、1〇 克 / 公升MgS04 · 7H20、

0· 1 克 / 公升CaCl2 · 2H20、20 毫克 / 公升FeS04 · 7H20、10 毫克/公升ZnS04 · 7H20、20毫克/公升MnS04 · 4〜6H20(個 別滅菌）、1 5毫克/毫升召-丙胺酸（個別滅菌）、20毫克/ 公升L-半胱胺酸、100微克/公升生物素、2克/公升脲及 5毫克/公升維生素比（個別滅菌）（經利用1 〇 N NaOH調整 至pH 7. 2)之液體培養基之5公升的培養容器中，隨後在32 °C在6 0 0 rpm及2. 5公升/分鐘曝氣的條件下培養24小時。 在培養過程中，使用28°/◦的氨水溶液將培養基之PH維持於 6.8〇 將所產生之培養液離心而得濕細胞。由於濕細胞可視情 況需要保存於-20 °C下，因而其可經由在使用前解凍而使 用。

將25克/公升之以上的大腸桿菌ΝΜ522/ρΝΚ11/ρΝΤ55濕 細胞、15克/公升之以上的大腸桿菌NM522/pGE 19濕細 胞、1 50克/公升之上述產氨棒桿菌ATCC 211 70濕細胞、 60克/公升果糖、30克/公升甘露糖、2〇克/公升GMP、 25克/公升ΚΗ2Ρ04、5克/公升MgS04 · 7H20、5克/公升植 酸、4克/公升Nymeen S-215及1〇毫升/公升二甲苯的反

89115987.ptd 第29頁 1223003 五、發明說明（24) 應溶液置於20 0毫升的燒杯中，及使用磁石攪拌器授掉反 應溶液（9 0 0 r pm )，以在3 2 °C下進行反應1 2小時。^反廉 過程中，使用4 N NaOH將反應溶液之pH維持於7 2，及: 需要時加入果糖和ΚΗ2Ρ04。 田 於反應完成後，利用HPLC分析反應產物，而證實有18 6 克/公升（29. 4 mM)之GKDM(2Na鹽）生成及累積應溶液 中0 實施例5 GDP -石衣藻糖之製造

利用實施例4所述之方法培養於實施例1中製得之大腸桿 菌N Μ 5 2 2 / p N K 1 1 / p N T 5 5，隨後離心而得濕細胞。 利用實施例4所述之方法培養於實施例2中製得之大腸桿 菌NM5 2 2/pGE19，隨後離心而得濕細胞。 利用類似實施例4所述培養大腸桿菌ΝΜ522/ρΝΚ1 1/ρΝΤ55 之方法培養於實施例3中製得之大腸桿菌NM522/pGE8，除 了僅加入氨比西林替代加入氨比西林及氯霉素，隨後離心 而得濕細胞。 利用實施例4所述之方法培養產氨棒桿菌ATCC 21 1 70，

隨後離心而得濕細胞。 由於濕細胞矸視情況需要保存於-20 °C下，因而其可經 由在使用前解凍而使用。 將25克/公升之以上的大腸桿菌ΝΜ522/ρΝΚ11/ρΝΤ55濕 細胞、15克/公升之以上的大腸桿菌NM522/pGE19濕細 胞、1 50克/公开之上述產氨棒桿菌ATCC 211 70濕細胞、

89115987.ptd 第30頁 !223〇〇3 五、發明說明（25) 6〇克/公升果糖、30克/公升甘露糖、3〇克/公升GMP、 25克/公升ΚΗ2Ρ04、5克/公升MgS04 · 7H20、5克/公升植 酸、4克/公升Nymeen S-215及10毫升/公升二甲苯的反 應溶液（30毫升）置於200毫升的燒杯中，及使用磁石攪拌 器攪拌反應溶液（ 9 0 0 rpm)，以在32 °C下進行反應12小 時。於反應12小時後，加入大腸桿菌隨522/pGE8濕細胞而 得1 5克/公升之濃度，並繼續反應1 〇小時。在反應過程 中，使用4 N NaOH將反應溶液之PH維持於7· 2，及當需要 時加入果糖和ΚΗ2Ρ04。

於反應完成後，利用Η P L C分析反應產物，而證實有1 4. 〇 克/公升之GDP-石衣藻糖生成及累積於反應溶液中。 當經由在開始反應時加入大腸桿菌NM522/pGE8(15克/ 公升）濕細胞而進行反應22小時時，累積GDP-石衣藻糖 (2Na鹽）之量為3.7克/公升（5.9 mM)。 雖然本發明已經詳細說明並參照其特定具體例，但熟悉 技藝人士當明白可不脫離其精神及範圍，而於其中進行各 種變化及修改。 '

89115987.ptd 第31頁 1223003

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Claims (1)

1 · 種鳥糞核糖苷5, _雙磷酸石衣藻糖（GDP-石衣藻糖） 之製造方法，其包含： 、利，屬於棒桿菌屬（Corynebacterium)之微生物的培養 /文或是該培養液的處理物，以及保有含有以下基因所 群組中％、眩， x 之於屬於ϋ之!：少一種基因之DN A片段和載體之重組DNA 、矣希氏菌屬（Escherichia)之微生物的培養液或 酶Γ "養液的處理物作為第一酵素源，上述基因為葡糠激 因之編碼基因、碌酸甘露糖變位酶（manB)之編碼基 播来Ί路糖1 —碟酸鹽鳥苔酸轉移酶（m a n C )之編碼基因、葡 ^ I ·臭位目每（p g m)之編碼基因、碌酸果糖激酶（p f k)之編 二口、、、f及⑶卜甘露糖4, 6一脫水酶（gmd)之編碼基因； 苗、i ί第一酵素源和黃嘌呤、羥基嘌呤、鳥糞核糠 it ^ "V令核苷、肌苷、鳥糞核糖苷5,—單磷酸鹽、以及 ❿早磷酸鹽所構成群組中選出之鳥糞核糖苷5,—三磷 酉夂（G Τ Ρ )的前驅物，乂 成群組中選出之糖類 萄糖、果糖以及甘露糖所構 於兮ρ ^出糖類，一起存在於水性培養基之中； 於该水性培養基之中生成 «廿#她rmu、 生成及累積鳥糞核糖苔-4-酮-6-脫 虱甘路糖（GKDM);其後 利用保有G K D Μ表異構酸/、罗店 H ^ t LDNA Z t I ί M ^ 0 ^DNA 液咬是兮i立盖、、存沾旁© ;矣希氏函屬之微生物的培養 履次疋忒培養液的處理物作為第二 使上述累積的GKDM與上μ & * 基之中； 述弟二酵素一起存在於水性培養 文成GDP〜石衣藻糖，以於該水性培養 將所累積的GKDM轉變成rnD

1223003 曰

案號891〗5⑽7 六、申請專利範圍 基之中生成及累積GDP-石衣藻糖； 再從該水性培養基之中採取GDP-石衣藻糖。 屬於棒桿 2 ·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中， 菌屬之微生物係產氨棒桿菌（Corynebacferiujjj ammon i agenes )。 保有含有 3 ·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，叩力兮 由glk之編碼基因、manB之編碼基因、manC之編碼基因、 pgm之編碼基因、pfk之編碼基因、以及gmd之編碼基 構成群組中選出之一種以上之基因的MA片段和載體 組DNA之屬於埃希氏菌屬之微生物，係由1種或2種以上^ 生物所構成。 械 4·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，屬於埃希 氏菌屬之微生物係大腸桿菌（Escherchia coli)。、 /·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，glk之編碼 土口 manB之編碼基因、manc之編碼基因、pgm之編碼基 口 之編碼基因、以及gmd之編碼基因係衍生自大腸桿 菌之基因。 6·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中wcaG之編碼 基因係衍生自大腸桿菌之基因。

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