JPH03210190A - チアミンリン酸類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はチアミン−リン酸（以下ＴＭＰと略記する）お
よびチアミンピロリン酸く以下ＴＰＰと略記する）など
のチアミンリン酸類の製造方法に関する。ＴＰＰはチア
ミン（ビタミンＢ＋）の補酵素型であり、またＴＭＰは
ＴＰＰの中間代謝産物である。従って、栄養剤原料、各
種医薬品原料としてのみならず、生化学試薬としても重
要な物質である。

従来の技術 チアミンリン酸類の製造方法としては、チアミンを化学
的にリン酸化する方法が多数知られている〔英国特許６
８７６７３号、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　ｔｈｅ　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ
）　６０　、２２６３（１９３８）、同誌　６３　　、
１１６０　（１９４１）、特公昭４９１４７５１号公報
など〕。

発明が解決しようとする課題 化学的な合成法では、目的物以外の各種リン酸エステル
の混合物が生成し、複雑な精製工程を必要としたり、収
率がきわめて低いなどの問題点がある。したがって、Ｔ
ＭＰ、ＴＰＰを高収率で経済的に製造するための製法の
開発が望まれている。

課題を解決するための手段 本発明は、チアミンとＡＴＰとからＴＭＰおよび／また
はＴＰＰを生成する反応を触媒する酵素活性を有する酵
素源の存在下、水性媒体中でチアミンとＡＴＰとを反応
させてＴＭＰおよび／またはＴＰＰを生成させ、反応液
から生成したＴＭＰおよび／またはＴＰＰを採取するこ
とを特徴とするチアミンリン酸類の製造法を提供する。

以下に、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いる酵素源としては、チアミンとＡＴＰとか
らチアミンリン酸類を生成する反応を触媒する活性を有
する酵素であればいずれでもよいが、具体的には、チア
ミンキナーゼ［Ｔｈｉａｍｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ＥＣ２
，７，１，８９）　］および／またはチアミン−リン酸
キナーゼ［Ｔｈｉａｍｉｎｅ　　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅｋｉｎａｓｅ（ＥＣ２，７，４，１６）　）があ
げられる。好適には、チアミンとＡＴＰとからＴＭＰお
よび／またはＴＰＰを生成する活性を有する微生物の菌
体、培養液またはそれらの処理物が用いられる。

酵素源に用いる微生物としては、チアミンとＡＴＰとか
らチアミンリン酸類を生成する活性を有する微生物であ
ればいずれでもよいが、具体的には、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４株
（ＡＴＣＣ３３６２５）があげられる。また、ＴＭＰお
よび／またはＴＰＰの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを保有させることにより
、チアミンとＡＴＰとからチアミンリン酸類を生成する
活性を強めた菌株を用いることにより、さらに収率よく
チアミンリン酸類を製造することができる。

ＴＭＰおよび／またはＴＰＰの合成に関与する遺伝情報
を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡは、チアミンと
ＡＴＰとからチアミンリン酸類を生成する活性を有する
微生物の染色体ＤＮＡを供給源とし、通常の組換えＤＮ
Ａ技法により作製することができる。

ＴＭＰおよびＴＰＰの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片としては、具体的にはチアミンキナーゼ（以下
ＴＭＫと略記する）をコードする遺伝子（以下ｔｈｉに
と略記する）、チアミン−リン酸キナーゼ（以下ＴＰＳ
と略記する）をコードする遺伝子（以下ｔｈｉＬと略記
する）などを含むＤＮＡ断片があげられる。

ＴＭＫおよび／またはＴＰＳをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の供給源としては、真核生物、原核生物、バ
タテリオファージまたはプラスミドなどに由来するもの
があげられるが、なかでもエシェリヒア属に属し、ＴＭ
Ｋおよび／またはＴＰＳ活性を有する菌株が好適である
。具体的には、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０株（Ａ
ＴＣＣ２７３２５）や、クラークらにより作成されたエ
シェリヒア・コリの遺伝子ライブラリーを含有するＪ＾
２００株〔セル（Ｃｅｌｌ）　９　、９Ｈ１９７６）　
〕などを例示することができる。染色体ＤＮＡはザ・イ
ーエムビーオー・ジャーナル（Ｔｈｅ　ＢＭＢＯＪｏｕ
ｒｎａｌ）、　４．１８７５（１９８５）記載の方法に
より調製できる。

該ＤＮＡ断片と接続するベクターとしては、エシェリヒ
ア属菌種中で自律複製できるものであればファージ・ベ
クター、プラスミド・ベクターなどいずれでも使用でき
る。好適にはＰＢＲ３２２Ｃジーン（Ｇｅｎｅ）、　２
　　、９５（１９７７）　）、ｐＵｃ１９　［ジーン（
Ｇｅｎｅ）、　３３　、１０３（１９８５）Ｅなどを例
示することができる。

ｔｈｉＫおよび／またはｔｈｉＬを含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡの組換え体ＤＮＡの作製は、試験管内でｔ
ｈｉＫおよび／またはｔｈｉＬの供給源となるエシェリ
ヒア・コリの染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとを、適当
な制限酵素、例えば［：ｌａＩ、　Ｐｓｔｌ。

Ｈｉｎｄ■などで切断したのち混合しＴ　４　ＤＮＡ　
！Ｊガーゼの作用により両ＤＮＡ断片を結合させること
により、種々の組換え体混成物とともに得ることができ
る。

目的の酵素をコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡは
、上記の組換え体混成物を用いて、該遺伝子を欠損する
変異株を受容菌として形質転換を行い、欠損形質が相補
された形質転換株を選択し、該形質転換株の保有する組
換え体ＤＮＡを分離することにより得ることができる。

受容菌としてｔｈｉＫのクローニングに用いられるＴＭ
Ｋ欠損変異株としては、エシェリヒア・コリＮ　Ｉ　５
１０（ｔｈｉに１゜ｔｈｉＤｌ）株［ジャーナル・オブ
・バタテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１
５１　、７０８（１９Ｂ２）］を、またｔｈｉＬをクロ
ーニングするためのＴＰＳ欠損変異株としては、エシェ
リヒア・コリＮ　１４２０（ｔｈｉＢｌ、　ｔｈｉＬ２
）株〔ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１５１　．７０８（１９８２
）　〕を例示することができる。形質転換は、コーエン
らの方法（Ｃｏｈｅｎｅｔ　　ａｌ、　；プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ、Ｓ、＾、　６９．２１１０
（１９７９）’］で行う。

得られた形質転換株からＴＭＰおよび／またはＴＰＰの
合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え
体ＤＮＡを分離し、該組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導
入することにより、チアミンとＡＴＰとからチアミンリ
ン酸類を生成する活性を強めた菌株を得ることができる
。

具体的には、エシェリヒア・コリ由来のｔｈｉＫを組み
込んだ組換え体ＤＮＡ保有株エシェリヒア・コリＭＨ１
０１、エシェリヒア・コリ由来のｔｈｉＬを組み込んだ
組換え体ＤＮＡ保有株エシェリヒア・コリＭＨ３０１お
よびエシェリヒア・コリＭＩ１３０２、エシェリヒア・
コリ由来のｔｈｉＫおよびｔｈｉＬを組み込んだ組換え
体ＤＮＡ保有株エシェリヒア・コリＭＭ２９４／ｐＴに
Ｌｉ２などがあげられる。

チアミンとＡＴＰとからチアミンリン酸類を生成する活
性を有する微生物の培養は、通常の細菌の培養方法に従
って行う。すなわち該微生物を、炭素源、窒素源、無機
物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中に
おいて、好気的条件下にて温度、ｐＨなどを調節しつつ
培養を行えばよい。

培地に用いる炭素源としては、例えばグルコース、フラ
クトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分
解物などの炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビ
トールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸な
どの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アス
パラギン酸などのアミノ酸など、該微生物が資化可能な
ものであればいずれでも使用できる。これらの使用濃度
は５〜３０％が好ましい。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機
および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、ＮＺアミ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、
カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその消化
物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸など
の各種アミノ酸など種々のものが使用できる。その使用
濃度は通常０．１〜ｌＯ％である。

無機物としては、リン酸第−カリウム、リン酸第二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸
カルシウムなどを用いることができる。用いる微生物が
アミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄養物質を生育に
要求する場合には、培地にこれらの物質を適当量添加す
る。

培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適であ
る。培養期間は、通常１〜７２時間である。培地のｐＨ
はアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中性
に保つことが望ましい。

このようにして得られる微生物の培養液は、そのままで
も反応に用いることができるし、さらに該培養液を種々
処理して得られる処理物を反応に用いてもよい。処理物
としては、培養物の濃縮物、乾燥物、界面活性剤および
／または有機溶剤処理物もしくは溶菌酵素処理物、さら
に培養物を遠心分離して得られる菌体、菌体の乾燥物、
アセトン処理物、界面活性剤および／または有機溶剤処
理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体、あるいは菌体から
の抽出酵素標品などがあげられる。

チアミンとＡＴＰとからチアミンリン酸類を生成させる
反応は、水性媒体中であればいずれでも行うことができ
る。好適には微生物の培養中もしくは培養終了後に、培
養液に基質となるチアミンおよびＡＴＰとを添加し、さ
らに必要に応じて界面活性剤および／または有機溶剤を
同時に存在させる。

基質として用いるＡＴＰを、ＡＴＰ前駆体、リン酸基供
与体およびエネルギー供与体とからＡＴＰを生合成する
活性を有する微生物を用いて供給する場合には、前記反
応液組成においてＡＴＰの代わりにＡＴＰ前駆体、ＡＴ
Ｐ再生エネルギー供与体、リン酸基供与体およびＡＴＰ
生合成活性を有する微生物を反応液中に存在させる。

このようにして調製した反応液を、２０〜５０℃にて１
〜４８時間反応させることによりＴＭＰおよび／または
ＴＰＰを反応液中に蓄積させることができる。反応中は
、ｐＨを６〜９に調節することが望ましい。

反応に用いるチアミンとしては、化学的に合成されたも
のでも天然物由来のものでも、また精製品でも粗精製品
でも、チアミン含有組成物であって、ＴＭＰおよびＴＰ
Ｐ生成反応を阻害するものを含まないものであればいず
れでも使用できる。

その濃度は０．１〜５０ｇ／ｆが好適である。

ＴＰＰを製造する場合は、チアミンの代わりにＴＭＰを
基質として用いることができる。その際のＴＭＰは、精
製品でも粗精製品でも、ＴＭＰ含有組成物であって、Ｔ
ＰＰ生成反応を阻害するものを含まないものであればい
ずれでも使用できる。

その濃度は、０．１〜５０ｇ／Ｉｔが好適である。

ＡＴＰとしては、精製品でも粗精製品でも、ＡＴＰ含有
物であって、反応を阻害するものを含まないものであれ
ばいずれでも用いることができる。

ＡＴＰを反応基質として添加する場合は、通常０．１〜
１００ｇ／ｊ！の濃度範囲で用いる。一方、ＡＴＰ生合
成系との共役反応系を用いる場合には、触媒量（１，０
ｇ／ｊ！以下）のＡＴＰで十分であり、菌体や培養液か
ら反応系中に持ち込まれる量によって必要量が満たされ
る場合には、とくに添加する必要はない。

ＡＴＰ前駆体は必要があれば反応系中に添加する。その
場合、５′−アデノシン−ニーリン酸、５′アデノシン
ーーーリン酸、アデノシン、アデニンなどの精製品、粗
精製品、またはそれらの含有物など、反応に用いる微生
物によってＡＴＰに変換され得るものであって、かつリ
ン酸化反応を阻害するものを含まないものであればいず
れでも使用できる。使用する濃度は、通常１ｇ／ｆ以下
で十分である。なお、菌体や培養液などから反応系中に
持ち込まれる量が十分であれば、とくに添加する必要は
ない。

ＡＴＰ前駆体、リン酸基供与体およびエネルギー供与体
とからＡＴＰを生合成する活性を有する微生物としては
、エシェリヒア属、ブレビバクテリウム属またはコリネ
バクテリウム属に属する微生物で、該ＡＴＰ生合成活性
を有するものであればいずれでもよい。具体的には、エ
シェリヒア・コリ　ＭＭ２９４　（＾ＴＣＣ３３６２５
）　、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス＾ＴＣＣ
６８７２、コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣ［
：　１３０３２などがあげられる。

ＡＴＰ再生エネルギー供与体としては、使用する微生物
により資化されるものであれば、グルコース、アラビノ
ース、フラクトース、ラクトース、マルトース、シュー
クロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース
、糖蜜、廃糖蜜、ソノ他の糖質、澱粉加水分解物などの
炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸、α−ケトゲルター
ル酸などの有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、グルタミンなどのアミノ酸などいず
れでもよい。また、アセチルリン酸、カルバミルリン酸
、クレアチンリン酸などのリン酸化化合物も使用できる
。その濃度は、１〜２００ｇ／ｊ！の範囲を保つことが
望ましい。

リン酸基供与体としては、オルソリン酸、ピロリン酸、
ポリリン酸、ポリメタリン酸などの無機リン酸のナトリ
ウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などいずれでも使
用できる。また、アセチルリン酸、カルバミルリン酸、
タレ了チンリン酸、フラクトース−１，６−二リン酸な
どの有機リン酸化化合物も用いることができる。その濃
度は、１０〜４００ｍＭの範囲を保つことが望ましい。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレンステアリルア
ミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製、以
下同じ）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、
カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅなどのカチオン性
界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニューレ
ックスＴＡＢ、ラピゾール８０などのアニオン系界面活
性剤、ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアレー
ト（例えばノニオン５Ｔ２２１）などの両面活性剤、そ
の他三級アミンＰＢ、ヘキサデシルジメチルアミンなど
、リン酸化を促進するものであればいずれでも使用でき
る。これらは通常０，１〜５０ｍｇ／ａｙ、好ましくは
１〜２０ｍｇ／ｍ＆の濃度で用いられる。

また、有機溶剤としては、トルエン、キシレン、脂肪族
アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられ、そ
の濃度は０．１〜５０ｄ／ｒｄ！、好ましくは１〜２０
頭／ｍｌがよい。

反応液中に生成したＴＭＰおよび／またはＴＰＰの採取
は、公知のイオン交換樹脂法、活性炭吸着法、溶媒抽出
沈澱法などを適宜選択し組み合せることにより行うこと
ができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１　エシェリヒア・コリ由来のｔｈｉＫ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミドの取得 （１）　　ｔｈｉＫ遺伝子のクローニングｔｈｉＫ遺伝
子は、受容菌としてｔｈｉＫ欠損変異によるＴＭＰ要求
要求性用いてクローニングした。要求性株への遺伝子の
導入は、選択寒天平板上でＦ″の供与菌からＦ−の受容
菌へのＦ因子の移行に伴うプラスミドの移行（接合伝達
）を行わせるレプリカタイティング法［Ｌ、Ｃ１ａｒｋ
ｅら；メソツズ・インーエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）。

６８　、３９６（’１９７９）］で行った。ＤＮＡの供
与菌としては、クラークらにより作成されたエシェリヒ
ア・コリの遺伝子ライ°ブラリーを含有するＪＡ２００
株（Ｆ＋）を用いた。受容菌としては、申出らにより造
成されたＴＭＰ要求性変異株Ｎｌ５１０（ｔｈｉｎ、　
ｔｈｉＫ、　ＦＣ，Ｈ，Ｎａｋａｙａｍａら；ジャーナ
ル・オブ・バタテリオロジ−（Ｊ、８ａｃｔｅｒｉｏ１
．）、　１５１　、７０８（１９Ｂ２）　〕を用いた。

受容菌のストレプトマイシン（以下Ｓｔｍと略記する）
耐性を示すと同時に、遺伝子の導入によりＴＭＰ非要求
性となった株を選択した。

すなわち、エシェリヒア・コリ　Ｎｌ５１０株を、１ｍ
ｇ／ｊ！のＴＰＰを含むＬ培地〔バタトトリブトン（デ
イフコ社製）１０ｇ／Ｃ酵母エキス　（デイフコ社製）
５ｇ／ｉ、Ｎａ１Ｊ　　５ｇ／ｌを含みｐ）Ｉを７．２
に調整した培地〕で３０℃、１８時間培養した。

得られた培養菌体を、生理食塩水で充分洗浄し適宜希釈
した後、ＭＭ培地［ＮａＪＰＯｓ　４ｇ、　ＫＨ２ＰＯ
４２，５ｇ、　（ＮＨ４）２５０．１ｇ、　Ｍｇ５Ｏ，
・７Ｌ０　０．１　ｇ　。

） ＣａＣ１２・２Ｌ０５ｍｇ、　Ｆｅ５Ｌ　・７Ｈ２００
，２５ｍｇ、ヒスチジン２５ｍｇ、メチオニン２５■、
トリプトファン２５ｍｇ５アルギニン５０■を水１１に
溶解した培地、ｐａｌは無調整〕に５０ｍｇ／　Ｉ　Ｓ
ｔｍ、　　１　ｍｇ／　Ｉｔチアミン及び寒天１．５％
を添加して作った選択用のＭＭＳ　ｔｍＢ　＋平板培地
に塗布した。供与菌は、Ｌ培地に１．５％寒天を添加し
た平板培地にて３０℃、１８時間培養したものを、受容
菌を塗布した選択培地上にレプリカした。この平板培地
を３０℃で１８時間培養し、供与菌からのプラスミドの
導入により受容菌のＴＭＰ要求性が相補された株（Ｎ［
５１０／ｐＬｃ１８−２）を選択した。

Ｎｌ５１０／ｐＬｃ１８−２株の平板上での生育を調べ
たところ、Ｍ　Ｍ　Ｓ　ｔ　ｍ　Ｂ　＋平板培地上では
生育し、ＭＭＳｔｒｎ平板培地（ＭＭ培地に５０ｍｇ／
ｆ！　Ｓｔｍ及び寒天１．５％を添加した培地）上では
生育しなかった。このことから、該プラスミドはＮｌ５
１０株のｔｈｉＤ欠損によるチアミン要求性は相補せず
、ｔｈｉＫ欠損によるＴＭＰ要求性を相補することが確
認され、ｐＬｃ１８−２上にはエシェリヒア・コリ由来
のｔｈｉＫ遺伝子が存在することが示唆された。

（２）　　ｔ　ｈ　ｉ　ＫのｐＢＲ３２２へのサブクロ
ーニング選択された株より公知の方法〔モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）
　：　　コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ
ーズ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ａｂｏｒ　Ｌａｂ、　
＞、　（１９８２）　：以下プラスミドの取得にはこの
方法を用いた〕によりプラスミドＤＮＡを分離精製し、
該ＤＮＡ　　１■をＹ−５０緩衝液〔１０ｍＭ　）リス
緩衝液（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ　ＮａＣＲ１７ｍＭ　
ＭｇＣｊ！　２１ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴ
と略記する）〕５０μｇに溶かし、５単位の制限酵素Ｃ
βａＩ　　（全酒造社製、以下特記しないかぎり制限酵
素は全酒造社製を用いた）を加え、３７℃で２時間消化
反応を行い、消化物を解析した。該プラスミドは、大き
さが２８キロベース　（以下ｋｂと略記する）で、４ケ
所のＣＡａｌ切断部位を有することがわかった。

そこで、ｐＬｃＩＬ２の［ｊ２ａｌ断片をｐＢＲ３２２
のＣ１１ａＩ切断部位にクローニングすることにした。

ｐＬｃｌＢ−２１ラスミドＤＮＡ　　５■をＹ−５０緩
衝液５０頭に溶かし、２０単位の１ＪａＩを加え、３７
℃で２時間消化反応を行ったのち、６５℃、１０分間の
熱処理により反応を停止した。この消化物に蒸留水１３
０頭、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｆ１５．６）　２０ｕｌ
を添加後、２倍量の水冷エタノールを加え、−８０℃で
２０分間静置した。遠心分離後上清を捨て、ＤＮＡの沈
澱を取得したく以下、この方法を「エタノール沈澱法」
と称す）。一方ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ’（全酒
造社製）２■をＹ−５０緩衝液５０４に溶かし、１０単
位のＣｌ１ａｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た後、６５℃、１０分間の熱処理により反応を停止した
。

エタノール沈澱法によりＤＮＡの沈澱を得た。このよう
にして得た約０．２ＡｇのｐＬｃｌＢ−２のＣｆａＩ消
化断片と、約０．０５．のｐＢＲ３２２ＣＲａ　Ｉ消化
断片をＴ４リガーゼ緩衝液１：２０ｍＭ）！Ｊス・塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６）　、７ｍＭ　Ｍｇ１Ｊ　−，１０
ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５ｍＭ　ＡＴＰ　〕５０４に溶解
して、２単位の７４ＤＮＡリガーゼ（全酒造社製）を加
えて、１６℃にて１８時間静置した。得られた組換え体
ＤＮＡ混合物を用い、エシェリヒア・コリ　Ｎｌ５１０
株をコーエンらの方法〔プロシーテ゛イング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｌｌ、Ｓ、
Ａ、　６９　　、２１１０（１９７９）　）により形質
転換し、ＭＭ培地に７５■／ｌアンピシリン（以下Ａｐ
と略記する）と１■／ｌチアミンを添加したＭＭＡｐＢ
　＋平板培地上で生育した形質転換株を選択した。この
形質転換株から公知の方法でプラスミドＤＮＡを分離精
製し、該ＤＮＡをＣ１’ａｌで消化することにより、構
造解析を行った。その結果、ｐＢＲ３２２のＣＪａＩ切
断部位に、約１１ｋｂのｐＬｃｌＢ−２由来のＤＮＡ断
片が挿入された組換え体プラスミドであることを確認し
、ｐＨＫ１と名付けた。ｐＨＫｌを用いてエシェリヒア
・コリＭＭ２９４　（ＡＴＣＣ３３６２５）株を形質転
換し、菌株ＭＭ２９４／ｐＨＫ１を得た。

（３）　　ｔ　ｈ　ｉ　ＫのｐＵｃ１９へのサブクロー
ニングｐＨＫＩ　Ｄ　Ｎ　Ａを分離精製し、種々の制限
酵素で消化することにより構造解析を行った結果、ｐＨ
に１はＣｆａｌで２ケ所、Ｐｓｔ　Ｉで３ケ所、Ｓｍａ
　Ｉで１ケ所、Ｎｒｕ　Ｉで少なくとも２ケ所切断され
た。そのうち、約２．６ｋｂのＩＪ　ａ　Ｉ　−Ｎｒｕ
　Ｉ断片上にｔｈｉＫが存在すると予想された。

上記で調製したｐＨＫ１プラスミドＤＮＡ　５■をＹ５
０緩衝液５０４に溶かし、２０単位のＣｆａｌを加え、
３７℃で２時間消化反応を行い６５℃、１０分間の熱処
理後、エタノール沈澱法によりＤＮＡの沈澱を得た。Ｄ
ＮＡ断片を全量５０頭のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液
［：６７ｍＭ）リス・塩酸（ｐＨ８，８）、６．７ｍＭ
ＭｇＣｊ’ｚ、６．６ｍＭ　（ＮＨ−）　２ＳＯ４，１
０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、６．７　、！ＪＭ
　ＥＤＴＡ、　０．３３ｍＭ　ｄＣＴＰ　、　ＯＪ３ｍ
ＭｄＡＴＰ　、　０．３３ｍＭ　ｄＧＴＰ　、　０．３
３ｍＭ　ｄＴＴＰ　〕に溶かし、５単位のＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼ（全酒造社製）を加え、３７℃で１時間反応
させ、１ＪａＩ消化によって生じた５′−突出末端を平
滑末端に変えた。

反応液と等量のフェノール：クロロフォルム（容量比で
１：１）を添加し、十分攪拌して反応停止後、遠心分離
土浦を取得（以下フェノール：クロロフォルム抽出法と
称す）した後、エタノール沈澱法によりＤＮＡの沈澱を
得た。該ＤＮＡ沈澱をＮｒｕ　Ｉ緩衝液Ｃ１０ｍＭ　）
リス・塩酸（ｐ）１７．５）　、７ｍＭＭｇＣ１２，１
５０ｍＭ　ＫＣＩ、１ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．０１％ウ
シ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記する）　〕５０ｍ
に溶かし、２０単位の１ｌｒｕ　Ｉを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、
約２．６ｋｔｌのＣｊ！　ａ　Ｉ　−Ｎｒｕ　Ｉ断片を
精製した。

一方、ベクターは、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株〔
ジー’Ｊ　（Ｇｅｎｅ）、３３．１０３（１９８５＞　
）から分離精製したＰＵＣ１９を用いた。ｐｌＪｃ１９
　ＤＮＡ２ｕｇを１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８，０）
　、７ｍＭ　Ｍｇｌ　２．１ｍＭ　ＤＴＴ　。

０、Ｏ１％ＢＳＡの組成の緩衝液５０頭に溶かし、２０
単位のＳｍａ　ｒを加えて３７℃で２時間消化反応し、
６５℃、１０分間の熱処理後エタノール沈澱法によりＤ
ＮＡ沈澱を取得した。得られた約０．２■のｐＨＫ１由
来のＤＮＡ断片と、約０．１ｇノｐＨＣ１９由由来ＤＮ
Ａ片を５０μａの７４ＤＮＡＩＪガーゼ緩衝液中で、２
単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加えて、１６℃で１８時
間結合反応を行った。このようにして得られた組換え体
プラスミドを用い、エシェリヒア・コリｌ１１５１０株
を形質転換し、ＭＭＡｐＢ、平板培地で生育した、Ａｐ
耐性でＴＭＰ要求性が相補された形質転換株を得た。こ
れら形質転換株からプラスミドＤＮＡを分離精製し、制
限酵素消化により構造解析を行ったところ、２．６ｋｂ
のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドであることをｎＩ
ｚ忍し、ｐＨＫ１１と名付けた。ｐＨＫＩＩを用いてエ
シェリヒア・コリＭＭ２９４株を形質転換し、エシェリ
ヒア・コリＭＭ２９４／　ｐＨＫ１１を得た。

（４）　　ｔｈｉに上流へのｔｒｐプロモーター（以下
Ｐｔｒｐと略記する）の連結 （３）で得られたｐＨＫ１１　ＤＮＡ　３■をＹ−０緩
衝液（Ｙ−５０緩衝液からＮａＣｌを除いたもの）４０
頭に溶かし、２０単位のＳａｃ　Ｉを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。これに２．５４の２Ｍ　ＮａＣ
Ｊ、　１５単位の１３ａｍＨＩ、Ｓａｃ　Ｉを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ｔｈｉＫを含む２、７ｋｂのＳａｃ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を精製した。

一方、ベクターはＰｔｒｐをもつＡＴＧベクターのｐＴ
ｒｓ３１を用いた。ｐＴｒｓ３１の造成法については参
考例に示す。ｐＴｒｓ３１プラスミドにはＰｔｒｐの下
流に、Ｓａｃ　Ｉ切断部位が２ケ所、Ｂａｍｆｌ　Ｉ切
断部位が１ケ所ある　（第４図参照）。分離精製したｐ
Ｔｒｓ３１プラスミドＤＮＡ２Ｎを上記と同様にＳａｃ
　Ｉ　ｓ　ＢａｍＨＩで消化し、エタノール沈澱法によ
りＤＮＡの沈澱を得た。得られた約０．２ｇのｐＨＫ１
１由来のＤＮＡ断片と約０．１ｕｇのｐＴｒｓ３１由来
のＤＮＡ断片を、５０ρのＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼ
緩衝液中で２単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、１６
℃で１８時間結合反応を行った。このようにして得られ
た組換え体プラスミドを用い、エシェリヒア・コリＭＭ
２９４株を形質転換してＡｐ耐性の形質転換株を得た。

これらの形質転換株よりプラスミドＤＮＡを分離精製し
、その構造解析を行ったところ、ｐＴｒｓ３１由来のＰ
ｔｒｐの下流にｐＨＫＩＩ由来のｔｈｉにを含むＤＮＡ
断片が挿入されていることを確認し、該プラスミドをｐ
ＨＴＫｌｌｌと名付けた（第１図参照）。ｐＨＴＫｌｌ
ｌを用いてエシェリヒア・コリＭＭ２９４株を形質転換
し、エシェリヒア・コリＭＭ２９４／Ｉ）ＨＴＫＩＩＩ
を得た。該菌株は、平成元年７月３日付で工業技術院微
生物工業技術研究所（微工研）に、エシェリヒア・コリ
ＭＨＩＯＩ（ＦＯＲＭ　０Ｐ−２５００）として寄託さ
れている。

実施例２　エシェリヒア・コリ由来噴ｈ　ｉ　Ｌ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミドの取
得 （１）　　ｔ　ｈ　ｉ　Ｌ遺伝子のクローニングエシェ
リヒア・コリＴＰＰ要求性変異株ＮＩ４２０（ｔｈｉｎ
、　ｔｈｉＬ、　Ｆｌ　　［Ｈ，Ｎａｋａｙａｍａら；
ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、）、　１５１　。

７０８（１９８２）　）を受容菌として用いた以外は、
実施例１と同様にしてｔｈｉＬ遺伝子のクローニングを
行った。Ｍ　Ｍ　Ｓ　ｔ　ｍ　Ｂ　＋選択平板培地上で
生育し、受容菌のＳｔｍ耐性を持つと同時にＴＰＰ非要
求性となった株（Ｎ１４２０／ｐＬｃ３０−６）を選択
した。ＮＩ４２０株はｔｈｉＢ遺伝子の導入ではＭＭＳ
　ｔｍＢｔ選択培地で生育できないことから、ｐＬｃ３
０−６にはＮＩ４２０のｔｈｉＬ欠損によるＴＰＰ要求
性を相補する、エシェリヒア・コリ由来のｔｈｉＬ遺伝
子が存在すると考えられた。

（２）ｐＢＲ３２２へのサブクローニング選択された株
より、公知の方法でプラスミドＤＮＡを分離精製した。

Ｃ１ａＩにより切断し構造解析した結果、大きさが２０
ｋｂで、２ケ所のＣ１ａ■切断部位を有することがわか
った。

そこで、ｐＬｃ３０−６のＩＪａＩ断片をｐＢＲ３２２
のｉａＩ切断部位にクローニングすることにした。

ｐＬｃ３０−６ブラスミドＤＮＡ　　５ＪＬｇをＹ−５
０緩衝液５０４に溶かし、２０単位のＩＪａｌを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った後、６５℃、１０分間
の熱処理により反応を停止した。この消化物からエタノ
ール沈澱法によりＤＮＡの沈澱を取得した。一方ｐＢＲ
３２２プラスミドＤＮＡ２ｕｇをＹ−５０緩衝液５０４
に溶かし、１０単位の（：ｌ１ａＩを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った後６５℃、１０分間の熱処理によ
り反応を停止し、エタノール沈澱法によりＤＮＡを取得
した。このようにして得られた約０．２ＪＪＪｇのｐＬ
ｃ３０−６のＣＡａｌ断片と、約０．０５．のｐＢＲ３
２２Ｃｊ！ａＩ断片をＴ４リガーゼ緩衝液５０〃に溶解
して、２単位のＴ　４　ＤＮＡ　！Ｉガーゼを加えて、
１６℃にて１８時間静置した。得られた組換え体ＤＮＡ
混合物を用い、エシェリヒア・コ！Ｉ　　Ｎ１４２０株
を形質転換し、Ｍ　Ｍ　Ａ　ｐ　Ｂ　＋平板培地で生育
した形質転換株を選択した。この形質転換株から公知の
方法でプラスミドＤＮＡを分離精製し、該ＤＮＡを［Ｊ
ａＩで消化することにより構造解析を行った。その結果
、ｐＢＲ３２２のＣ１！ａＩ切断部位にｐＬｃ３０−６
由来の約１４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された組換え体プ
ラスミドであることを確認し、ｐＨＬ３と名付けた。

ｐ）ＩＬ３を用いてエシェリヒア・コ’Ｊ　ＭＭ２９４
株を形質転換し、菌株ＭＭ２９４／ｐｆｌＬ３を得た。

（３）　　ｔ　ｈ　ｉ　Ｌ上流へのＰｔｒｐの連結ｐｔ
ｌＬ３Ｄ　Ｎ　Ａを分離精製し、種々の制限酵素で消化
することにより構造解析を行った結果、ｐＨＬ３はＰｓ
ｔ　Ｉで４ケ所、ＨｉｎｄＩ［［で３ケ所、Ｈｐａ　Ｉ
で２ケ所切断された。そのうち約２．８ｋｂのＰｓｔ　
Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉ断片上にｔｈｉＬが存在すると予想さ
れた。

上記で調製したｐ）ＩＬ３プラスミドＤＮＡ５ｇをＹ５
０緩衝液５０４に溶かし、２０単位のＰｓｔＩを加え、
３７℃で２時間消化反応を行い、６５℃、１０分間の熱
処理後、エタノール沈澱法によりＤＮＡ沈澱を得た。Ｄ
ＮＡ断片を全量５０４のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液
に溶かし、５単位の７４ＤＮＡポリメラーゼを加え、３
７℃で１時間反応させ、ｐｓｔ　Ｉ消化によって生じた
３′−突出末端を平滑末端に変えた。フェノール：クロ
ロフォルム抽出後、エタノール沈澱法によりＤＮＡの沈
澱を得た。該ＤＮＡ沈澱を１０ｍＭ）リス・塩酸（ｐＨ
７，５）、７ｍＭ　ＭｇＣＡ　２．１００＋ｎＭ　ＫＣ
Ｉ、１ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．０１％ＢＳＡの組成の緩
衝液５０戚に溶かし、２０単位のＨｐａ　Ｉを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後約２．８ｋｂのＰｓｔ　Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉ断片を
精製した。

一方、ベクターとしては、実施例１と同様にｐＴｒｓ３
１を用いた。分離精製したｐＴｒｓ３１プラスミドＤＮ
Ａ２ｕｇを５０ｄのＮｒｕ　Ｉ　＠衝液に溶かし、１５
単位のＮｒｕ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行
い、６５℃、１０分間の熱処理後、エタノール沈澱法に
よりＤＮＡの沈澱を得た。得られた約０．２■のｐＨ１
３由来のＤＮＡ断片（２，８ｋｂ）と約０．１■のｐＴ
ｒｓ３１由来ＤＮＡを５０ｄのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝
液中で、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃で
１８時間結合反応を行った。このようにして得られた組
換え体プラスミドを用い、エシェリヒア・コリＭＭ２９
４を形質転換して、Ａｐ耐性の形質転換株を得た。

これらの形質転換株よりプラスミドＤＮＡを分離精製し
、その構造解析を行ったところ、ｐＴｒｓ３１由来のＰ
ｔｒｐの下流にｐ）ｉＬ３由来のｔｈｉＬを含むＤＮＡ
断片が挿入された構造であることを確認し、ｐＨＴＬ３
１と名付けた。

（４）　　Ｐ　ｔ　ｒ　ｐとｔｈｉＬ間の距離の短縮後
述するように、ＰＨＴＬ３１保有株はｐＨＬ３保有株よ
り若干ＴＭＰキナーゼ活性が上昇したが、ｐＨＴＬ３１
の挿入断片上のｔｈｉＬの上流に余分な介在配列の存在
が考えられたので、以下に述べる方法でＰｔｒｐとｔｈ
ｉＬの間の距離を短縮したプラスミドρ）ｌＴＬ３１１
を造成した。

ｐＨ１３由来　Ｎ　Ａ約１０■をＹ−５０緩衝液６０顧
に溶解し、４０単位のＣｆａＩを加え、３７℃で２時間
消化反応を行った。このＣｊ！ａＩ消化反応液３０Ａ１
に５倍濃度のＢＡＬ３１緩衝液［１００ｍＭ　）リス・
塩酸（ｐＨ８，１）、６０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　、　、６
０ｍＭ　ＣａＣＪ　２．３Ｍ　ＮａＣｌ１〕２０ｍ、蒸
留水４０Ａ１および１．５単位のＢＡＬ３１　（宝酒造
社製）を加え、３０℃にて消化反応を行った。反応開始
後、５分から１０分の間、経時的に反応液１０頭ずつを
採取し、２０威のフェノール：り四〇フォルム（容量比
１；１）混合液中に入れ、十分に攪拌して反応を停止し
た。遠心分離後上清層を採取し、２倍量の水冷エタノー
ルを加え、−８０℃にて３０分間静置した。

各エタノール混合物を遠心分離後、上清を捨て、沈澱を
５０〃のＹ−５ＯＮ衝液に溶解した後、それぞれ３単位
のＰｓｔ　Ｉを加えて、３７℃にて２時間消化反応を行
った。該反応液を６５℃、１０分間熱処理後、３８８〜
５．０ｋｂの大きさの断片を精製した。一方ベクターと
してはｐＴｒｓ３１を用いた。ｐＴｒｓ３１Ｄ　Ｎ　Ａ
　３■をＮｒｕ　Ｉ緩衝液５０μＱに溶かし、１５単位
のＮｒｕ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
。反応後、エタノール沈澱法によりＤＮＡ断片を得た。

得られたＤＮＡ断片を５０μｐのＹ−５０緩衝液に溶か
し、１５単位のＰｓｔＩを加え、３７℃にて２時間消化
反応を行った。消化物より約１．１ｋｂのＰｔｒｐを含
む断片を精製した。

このようにして得られたｐＨＴＬ３１由来の各ＤＮＡ断
片約０．１■およびｐＴｒ３３１由来のＤＮＡ断片それ
ぞれ０．０５ｇｇを含む全量２０威のＴ４ＤＮＡリガー
ゼ緩衝液に、１単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、１
６℃で１８時間結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリＭＭ２９４
株を形質転換し、Ａｐ耐性の形質転換株を選択した。得
られたＡｐ耐性株をＭ９液体培地（ＮＨ４１Ｊ　　１　
ｇ、　Ｎａ２ＨＰＯ４６ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４３ｇ。

ＮａＣｊ！　　５ｇ、　ＭｇＳＯ４’７Ｈ２００，２５
ｇ、グルコース３ｇ、チアミン４ｍｇ、カザミノ酸２ｇ
を水１１に含む）に１００ｍｇ／ｊ！の＾ｐを添加した
Ｍ９Ａｐ液体培地で３０℃、１８時間培養し、後述する
方法でＴＭＰキナーゼ活性を調べ、ｐＨＴＬ３１を保有
しているＭＭ２９４株と比べて、高い活性を示す菌株を
選択した。

得られた形質転換株は、ＭＭ２９４／　ｐＨＴＬ３１株
の約１．８倍の活性を示した。この形質転換株よりプラ
スミドＤＮＡを分離精製し、ｐＨＴＬ３１１と名付けた
。ｐＨＴＬ３１１の構造解析を行ったところ、ｐＨＴＬ
３１１はｐＨＴＬ３１挿入断片のｔｈｉＬの上流的１ｋ
ｂが短縮されてＰｔｒｐの下流に連結した構造であるこ
とがわかった。ｐＨＴＬ３１１を用いてエシェリヒア・
コＵＭＭ２９４株を形質転換し、エシェリヒア・コリＭ
Ｍ２９４／　ｐＨＴＬ３１１を得た。該菌株は、平成元
年７年３日付で微工研にエシェリヒア・コリＭＨ３０１
（ＦＥＲＭ　ＯＰ’−２５０１）として寄託されている
。

（５）　　ｔｈｉ’Ｌ高発現プラスミドｐＨＴＬ３２の
造成プラスミドｐＨＴＬ３１１のｔｈｉＬ構造遺伝子の
Ｎ−末端付近のＤＮＡ塩基配列をマキサム・ギルバート
の方法〔＾、　Ｍ、　Ｍａｘａｍら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、　
７４　、５６０（１９７７）：］で決定したところ、Ｐ
ｔｒｐのＳＤ配列とｔｈｉＬ遺伝子の開始コドンとの間
にまだ約５００ｂｐの余分な配列があり、その中のｔｈ
ｉＬ遺伝子のすぐ上流にターミネータ−様の二次構造を
とると推定される配列が存在することを見出した。この
配列が、ｔｈｉＬの高発現を阻害している可能性が考え
られた。また、ＤＮＡ塩基配列の解析により、下記の通
りｔｈｉＬ遺伝子の開始コドンの直下にＮｓｐ　（７５
２４）　Ｉ切断部位があることがわかった。

Ｎ５ｐ（７５２４）　Ｉ 小 Ｍｅｔ＾１ａＣｙｓＧｌｙ・　・　・ そこで、このＮ５ｐ（７５２４）　Ｉ　８位を用いて余
分な配列を除去し、ＰｔｒｐのＳＯから適当な距離にｔ
ｈｉＬ構造遺伝子を接続することを目的に、下記のリン
カ−を合成した。

ＣＡａＩ　　　　　　　　　Ｎｓｐ（７５２４）　Ｉま
ず、−木調Ｄ　Ｎ　Ａ　１８ｍａｒと１２ｍａｒを通常
のトリエステル法ＣＲ，Ｃｒｅａら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、７５
　、５７６５（１９７８）　：］により合成した。−本
領Ｄ　Ｎ　Ａ　　１８ｍｅｒおよび１２ｍｅｒの各々２
．を５０ｍＭ　）リス・塩酸（ｐＨ７，５）　、１０ｍ
ＭＭｇＣ１２，５ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡおよび１ｍＭ　ＡＴＰを含む全量２０４の溶液に溶
かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・
マンノ１イム社製）３０単位を加えて、３７℃で６０分
間リン酸化反応を行った。リン酸化した１８ｍａｒと１
２ｍａｒの一重鎖ＤＮＡを２ＡＬｇずつ混合し、７０℃
で５分間加熱後、室温に放置してアニーリングを行うこ
とにより、上記構造を有するＤＮＡＩＪンカーを得た。

ｐＴｒｓ３１７’ラスミドＤＮＡ　　３μｇを、Ｋ−１
００ＩＩ衝液［’２０ｍＭ）リス・塩酸（ｐＨ８，５）
、１０ｍＭ　ｂｃｌ　２．１ｍＭ　ＤＴＴ　、　１００
ｍＭ　ＫｆＪ　１５０ｍに溶かし、制限酵素Ｃｆ　ａ　
Ｉ　、　ＥｃｏＴ１４１をそれぞれＴ５単位ずつ加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間熱
処理後、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

ｐＨＴＬ３１１プラスミドＤＮＡ　　３μｇを、０．０
１％のＢＳＡを添加したに一１００緩衝液５０μｇに溶
がし、制限酵素Ｎｓｐ　（７５２４）　ＩとＥｃｏＴ１
４１をそれぞれＴ５単位ずつ加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。６５℃、１０分間熱処理後、約１．６ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。

上記で得たｐＴｒｓ３１のＣ１ｌ　ａ　Ｉ　−ＥｃｏＴ
１４　Ｉ　　３．４ｋｂＤＮＡ断片と、ｐＨ几３１１の
Ｎ５ｐ（７５２４）　Ｉ　−ＥｃｏＴ１４１１．６ｋｂ
Ｄ　Ｎ　Ａ断片者０．５縄を、全量２５城のＴ４ＤＮＡ
リガーゼ緩衡液に溶かし、この混合溶液に上記ＤＮＡＩ
Ｊンカーを約０．１■加えた。さらにＴ４ＤＮＡＩＪガ
ーゼ４単位を加え、１６℃で１８時間結合反応を行った
。この組換え体プラスミドを用いて、常法通りエシェリ
ヒア・コＵ　ＭＭ２９４株を形質転換した。得られたＡ
ｐ耐性の形質転換株よりプラスミドを単離し、ｐＨＴＬ
３２と名付けた（第５図）。

プラスミドｐＨＴＬ３２のｔｈｉＬ遺伝子の開始コドン
（ＡＴＧ）周辺の塩基配列をマキサム・ギルバートらの
方法により確認したところ、下記に示す通りだった。

ｐＨＴＬ３２は、ＰｔｒｐのＳＤ配列の１４ｂｐ下流に
ｔｈ’ｉＬ構造遺伝子の開始コドンがリンカ−を介して
接続した、ｔｈｉＬ高発現タイプのプラスミドである。

ＭＭ２９４／ｐＨＴＬ３２株をＭ９Ａｐ液体培地で３０
℃、１６時間培養し、後述する方法でＴＰＳ活性を調べ
た上ころ、ＭＭ２９４／ｐＨＴＬ３１の約１５倍に活性
が上昇していた。

該菌株は、平成２年７月３１日付で微工研にエシェリヒ
ア・コリＭＨ３０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０３４）とし
て寄託されている。

実施例３　　エシェリヒア・コリ由来のｔｈｉＫおよび
ｔｈｉＬ遺伝子を含む組換え体プラスミドの造成エシェ
リヒア・コリ由来のｔｈｉＫを含むプラスミドとしてｐ
ＨＴＫｌｌｌ　、ｔｈｉＬを含むプラスミドとしてｐＨ
ＴＬ３１１を用いて、ｔｈｉＫとｔｈ此を同時に含む組
換え体プラスミドの造成を行った。

ｐＨＴＫｌｌｌおよびｐＨＴＬ３１１プラスミドＤＮＡ
を、それぞれ分離精製した。ｐＨＴＫ１１１ＤＮＡ３Ｊ
１ｇをＹ−１００緩衝液（Ｙ−５０緩衝液の〜ａＣ１濃
度を１００＋ｎＡｌに変えたもの）５０頭に溶かし、２
０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃、２時間消化反応を
行った。６５℃、１０分間熱処理後、エタノール沈澱法
によりＤＮＡの沈澱を得た。そのＤＮＡ断片の末端を実
施例１（２）と同様の方法によりＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ処理を行い平滑末端とした後、フェノール゛クロロフ
ォルム抽出後、エタノール沈澱法によりＤＮＡ断片を得
た。Ｙ−１００緩衝液５０４に溶かし、２０単位のＰｓ
ｔ　Ｉで３７℃、２時間消化反応を行った後、３．８ｋ
ｂの大きさの断片を精製した。

ｐＨＴＬ３１１　ＤＮＡ　　３ｇを９０ｍＭ　）リス・
塩酸（ｐ）Ｔ７．５）を加えたＹ−５０緩衝液５０ρに
溶かし、２０単位のＥｃａＲＩを加え、３７℃、２時間
消化反応後、６５℃、１０分間熱処理した後、エタノー
ル沈澱法によりＤＮＡの沈澱を得た。そのＤＮＡ断片の
末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端とし
た後、フェノール：クロロフォルム抽出し、エタノール
沈澱法によりＤＮＡ断片を得た。ｙ−ｉｏｏ緩衝液５０
頭に溶かし、２０単位のＰｓｔ　Ｉで３７℃、２時間消
化反応を行った後、４．８ｋｂの大きさの断片を精製し
た。

得らレタｐＨＴＫ１１１　由来（７）ＤＮＡ断片０．１
ｇおよびｐＨＴ１３１１由来のＤＮＡ断片０．１ＪＬｇ
を含む、全量２０４のＴ　４　ＤＮＡ　リガーゼ緩衝液
中に、２単位のＴ　４　ＤＮＡ　！Ｉガーゼを加え、１
６℃で１８時間結合反応を行った。得られた組換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いて、エシェリヒア・コリＮｌ５１
２株（ｔｈｉｅｆ。

ｔｈｉＫｌ、ｔｈｉＬｌ）　Ｃジャーナル・オブ・バタ
テリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１５１　
、７０８（１９８２）］を形質転換し、ＭＭＡρＢ、平
板培地上で生育した、Ａｐ耐性でｔｈｉＫ欠損によるＴ
ＭＰ要求性およびｔｈｉＬ欠損によるＴＰＰ要求性を相
補する株を選択した。得られた形質転換株よりプラスミ
ドを分離精製し、構造解析を行った結果、ｔｈｉＫを含
む断片とｔｈｉＬを含む断片が結合した組換え体プラス
ミドであることを確認し、ｐＴＫＬ１３と命名した。ｐ
ｒＫｔ、ｔ３を用いてエシェリヒア・コリＭＭ２９４株
を形質転換し、エシェリヒア・コリＭＭ２９４／ｐＴＫ
Ｌ１３株を得た。

実施例４　　　ｔｈｉＫを含む組換え体プラスミド保有
株のＴＭＫ活性 ＴＭＫ活性の測定は、公知の方法〔ジャーナル・オブ・
バタテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１１
２　。

１１１８　（１９７２）　］を下記のように若干改変し
て実施した。

活性測定実験に供するエシェリヒア・コリをＭ９Ａｐ液
体培地（ただしＭＭ２９４株は、Ｍ９液体培地）にそれ
ぞれ接種し、３０℃にて１８時間振盪培養した後、培養
液をＴＭＫ緩衝液Ｃ２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（
ＰＫ緩衝液と略記する）　（ｐｆ１７．２）、１ｍＭ　
ＭｇＣ１２゜１ｍＭ　２−メルカプトエタノール〕によ
り希釈した後もしくはそのまま遠心分離後、適当量のＴ
Ｍに緩衝液に懸濁することにより濃縮し、−２０℃にて
凍結後、融解して反応に供した。

この凍結融解菌体を、１００ｍＭ　ＰＫ緩衝液（ｐＨ７
，２）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　、　、１０ｍＭ　ＡＴ
Ｐ、　１ｍＭチアミン、１０ｄ／ｆキシレンからなる反
応液中に存在させ、３７℃にて静置反応し、チアミンか
らＴＭＰへの転換反応を行った。

ＴＭＰの生成は経時的に反応液を採取し、０．２Ｎ塩酸
でｐＨを４．５とした後、９０℃、５分間熱処理し、遠
心分離後上清中のＴＭＰを公知の方法〔アナリティカル
・バイオケミストリイ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅ＋ｙ＋＋５ｔｒｙ）　９７．１９１（１９７９）
　〕に準じて高速液体クロマトグラフィーで定量した。

第１表に本発明で使用もしくは取得した菌株のＴＭＫ活
性を示す。活性は、１分間に１μｍｏｌのＴＭＰを生成
する酵素の量を１単位とした。

第 表 Ｍ２９４ ＭＭ２９４／ｐＨＫＩ ＭＭ２９４／ｐＨＫＩＩ ＭＨｌｏｌ（ＭＭ２９４／ｐＨＴＫ１１１）０、００５
７　　　　　　　　１．０ ０、０５７７　　　　　　　１０．１ ０、０９０１　　　　　　　１５．８ ０、２０６６　　　　　　　３６．２ 実施例５　　ｔｈｉＬを含む組換え体プラスミド保有株
のＴＰＳ活性 ＴＰＳ活性の測定は、下記のように実施した。活性測定
に供するエシェリヒア・コリの培養は、実施例４と同様
に行った。

得られた培養液を、ＴＰＳ　！Ｉｆｆ液［１０ｍＭ）リ
ス・塩酸（ｐ）１７．５）　、１　ｄ　ＭｇＣ１２，１
ｍＭ　２−メルカプトエタノール〕により希釈した後も
しくはそのまま遠心分離後、適当量の同緩衝液に懸濁す
ることにより濃縮し、−２０℃にて凍結後、融解して反
応に供した。

この凍結融解菌体を、５０ｎ＋Ｍ）！Ｊス・塩酸（ｐＨ
７，５）５＋＋＋Ｍ　ＭｇＣｊ！　−，５ｍＭ　ＡＴＰ
　、　３３７ｍＭ　ＫＣｊ！　、　１ｍＭ　ＴＭＰ　。

１０ｍ＋２／ｉキシレンよりなる組成の反応液中に共存
させ、３７℃にて静置することによりＴＭＰからＴＰＰ
への転換反応を行った。

ＴＰＰの生成は実施例４でＴＭＰを定量したのと同様の
方法で定量を行った。

第２表に本発明で使用もしくは取得した菌株のＴＰＳ活
性を示す。活性は、１分間に１μｍｏｌのＴＰＰを生成
する酵素の量を１単位とした。

第　　　　２　　　　表 Ｍ２９４ ＭＭ２９４／ｐｆｌＬ３ ＭＭ２９４／ｐＨＴＬ３１ ＭＨ３０１（ＭＭ２９４／ｐ）ＩＴＬ３１１）ＭＭ２９
４／ｐＴにＬｉ２ ０、００２２　　　　　　　　１．０ ０、００３３　　　　　　　　１．５ ０、０１０４　　　　　　　　４．７ ０、０１９２　　　　　　　　　Ｂ、　７０、０５０９
　　　　　　　　２３．１実施例６　エシェリヒア・コ
リＭＨＩＯＨＦＢＲＭ　ＢＰ−２５００）株の菌体を酵
素源として用いたチアミンからＴＭＰの生産 実施例４と同様に培養した大腸菌ＭＩＩＩＯＩ株の凍結
保存菌体１００ｇ　　（湿菌体重量）／Ｌ５ｍＭチアミ
ン、１０ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１２および
１０ｄ／Ｉｌキシレンを１００ｍＭ　　ＰＫ緩衝液５ｍ
ｌに添加し、３７℃に３時間保った。反応液中に生成し
たＴＭＰは４．６ｍＭであった。対照として、大腸菌Ｍ
Ｍ２９４株を酵素源として用いて同様に反応を行った場
合のＴＭＰ生成量は０．２ｍＭであった。

実施例７　エシェリヒア・コリＭ）１３０１（ＦＥＲＭ
　０Ｐ−２５０１）株の菌体を酵素源として用いたＴＭ
ＰからＴＰＰの生産実施例４と同様に培養した大腸菌Ｍ
）１３０１株の凍結保存菌体１００ｇ（湿菌体重量）　
／　ｊ！、　５ｍＭ　ＴＭＰ　。

５ｍＭ　ＡＴＰ、　３３７ｍＭ　ＫＩＪ　、　５ｍＭ　
ＭｇＣｌ１２および１０ｍｆｆ＃！キシレンを５０ｍＭ
　）リス・塩酸緩衝液（ｐ）１７．５）　５　ｍ１２に
添加し、３７℃に２４時間保った。反応液中に生成した
ＴＰＰはｌ、　５ｍＭであった。対照として、大腸菌Ｍ
Ｍ２９４株を酵素源として用いて同様に反応を行った場
合のＴＰＰ生成量は０．１ｍＭであった。

実施例８　エシェリヒア・コリＭＨ３０２（ＦＯＲＭ　
ＢＰ３０３４）株の菌体を酵素源として用いたＴＭＰか
らＴＰＰの生産 実施例４と同様に培養した大腸菌ＭＨ３０２株の凍結保
存菌体１００ｇ　　（湿菌体重量）／β、１０ｍＭ　Ｔ
ＭＰ。

５ｍＭ　ＡＴＰ　、　３３７ｍＭ　ＫＣ１！及びｌＯｄ
／　Ａキシレンを５０ｍＭ　）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）　５　ｍｌ！に添加し、３７℃に保った。３時
間後のＴＰＰ生成量は３．５ｍＭであった。対照として
、大腸菌ＭＭ２９４株を酵素源として用いた場合のＴＰ
Ｐ生成量は０．０７ｍＭであった。

実施例９　　　ｔｈｉＫを含むプラスミド保有株とｔｈ
ｉＬを含むプラスミド保有株の菌体を酵素源として用い
たチアミンからのＴＰＰの生産 実施例４と同様にして培養した大腸菌ＭＩＩＩＯＩ株と
ＭＨ３０２株の凍結保存菌体をそれぞれ１００ｇ　（湿
菌体重量）　／　Ｉｔ　、　２０ｍＭ　　チアミン、１
０ｍＭ　ＡＴＰおよび１０ｄ／　Ｊキシレンを１００ｍ
Ｍ　ＰＫ　！ｌ衝液５ｍｌに添加し、３７℃に保った。

８時間後のＴＭＰ生成量は５、ＯｍＭ　、　ＴＰＰ生成
量は２．５ｍＭであった。対照として大腸菌ＭＭ２９４
株を酵素源として用いた場合のＴＭＰ　、　ＴＰＰ生成
量はそれぞれ０．１ｍＭ　、　０．０６ｍＭであった。

実施例１０　　ｔｈｉＫ、　ｔｈｉＬを含む組換え体プ
ラスミド保有株によるチアミンからのＴＰＰの生産反応
に供するＭＭ２９４／ｐＴＫＬ１３株の培養および菌体
処理は実施例４と同様に行った。

１００ｍＭ　ＰＫ緩衝液（ｐ）１７．２）　、１０ｍＭ
　ＭｇＣｌ１２．５ｍＭ＾ＴＰ　、５ｍＭチアミン、１
０ｍｆｆ／ｊ！キシレンから成る反応液５ｍｌ中に、凍
結保存菌体を１００ｇ（ｆｆｌ菌体重量）／ｌで存在さ
せ、３７℃で静置反応し、チアミンからＴＭＰ　５ＴＰ
Ｐへの転換反応を行った。６時間の反応後ＭＭ２９４／
ｐＴにＬ１３株添加の反応液中には３、２ｍＭのＴＭＰ
　、　０．６ｍＭのＴＰＰが生成した。なお、ＭＭ２９
４／ｐＴにＬｉ２株に代えて宿主であるＭＭ２９４株を
用いた場合の生成量は、ＴＭＰ　０．０９ｍＭ、　ＴＰ
Ｐ　０．０２ｍＭであった。

実施例１１ 実施例６において、ＡＴＰに代えてグルコースとＮａ２
ＨＰＯ４を各々５０ｇ＃、　１０ｇ／ｌ添加し、６ＮＫ
ＯＨを逐次添加することにより反応のｐＨを７．２付近
に保ちつつ振盪反応する以外は、実施例６と同様に反応
を行った。反応１２時間で、反応液中に１．ＯｍＭのＴ
ＭＰが生成蓄積した。なお、大腸菌ＭＭ２９４株を用い
た対照実験におけるＴＭＰの生成量は０．１１ｍＭであ
った。

実施例１２ 実施例７において、ＡＴＰに代えてグルコースと１１ａ
２ＨＰＯａを各々５０ｇ／Ｃ１０ｇ＃！添加し、６ＮＫ
ＤＨを逐次添加することにより反応のｐＨを７，２付近
に保ちつつ振盪反応する以外は、実施例７と同様に反応
を行った。反応２４時間で、反応液中に１．３ｍＭのＴ
ＰＰが生成蓄積した。なお、大腸菌ＭＭ２９４株を用い
た対照実験におけるＴＰＰの生成量は０．１４ｍＭであ
った。

実施例１３ 実施例１０において、ＡＴＰに代えてグルコースとＮａ
ＪＰＯ＊を各々５０ｇ／１２．１０ｇ／ｌ添加し、６Ｎ
　ＫＯＩＩを逐次添加することにより反応のｐＮを７．
２付近に保ちつつ振盪反応する以外は、実施例１０と同
様に反応を行った。反応２４時間で、反応液中に３．５
ｍＭのＴＭＰと１．１ｍＭのＴＰＰとが生成蓄積した。

なお、大腸菌ＭＭ２９４株を用いた対照実験におけるＴ
ＭＰおよびＴＰＰの生成量は、それぞれ０．１ｍＭ　、
　０．１１ｍＭであった。

実施例１４ 実施例８においてＡＴＰに代えてグルコースとＮａ２８
ＰＯ＜各々５０ｇ／　ｉ　、　１０ｇ／　Ｉｔ不添加、
６ＮのＫＯＨを逐次添加することにより反応のｐＨを７
．２付近に保ちつつ振盪反応する以外は、実施例８と同
様に反応を行った。８時間後のＴＰＰ生成量は６．２ｍ
Ｍであった。対照として、大腸菌ＭＭ２９４株を酵素源
として用いた場合のＴＰＰ生成量は０．０７ｍＭであっ
た。

実施例１５ 実施例９においてＡＴＰに代えてグルコースとＮａ２Ｐ
Ｏ４を各々５０ｇ／Ｃ１０ｇ／ｌ添加し、６ＮのにＯＨ
を逐次添加することにより反応のｐＨを７．２付近に保
ちつつ振盪反応する以外は、実施例９と同様に反応を行
った。８時間後のＴＭＰ生成量は４．６ｍＭＴＰＰの生
成量は３．９ｍＭであった。対照として、大腸菌ＭＭ２
９４株を酵素源として用いた場合のＴＭＰ　。

ＴＰＰ生成量はそれぞれ０．１１ｍＭ、　０．０５ｍＭ
であった。

参考例　Ｐｔｒｐ−ＡＴＧベクターｐＴｒｓ３１の造成
Ｐｔｒｐを保有する公知の発現ベクタープラスミドｐＫ
ｙｐｔｏ　（特開昭５８−１１（１６Ｑｏ）はＰｔｒｐ
の下流に１（ｉｎｄ［［、ＥｃｏＲＶ切断部位を有する
。ｐＫＹＰ１０プラスミドＤＮＡ３縄をＹ−５０緩衝液
５０頭に溶かし、制限酵素旧ｎｄｌＩＩとＥｃｏＲＶを
それぞれ１５単位ずつ加え、３７℃で２時間消化反応を
行った。６５℃、１０分間熱処理後、エタノール沈澱法
によりＤＮＡ沈澱を得た。

方、Ｐｔｒｐ、　ＳＤ配列、及びその適当な部位に１訳
開始コドンＡＴＧを含み、さらにこの翻訳コドンに続い
て３′−突出末端を切断形として残す制限酵素（Ｓｐｈ
　Ｉ　、　Ｓａｃ　Ｉ等）の認識部位が存在する発現ベ
クター（＾ＴＧベクター）造成を目的として、下記のＤ
ＮＡリンカ−を合成した。

まず１木調Ｄ　Ｎ　Ａ　　１４ｍｅｒと１０ｍａｒを通
常のトリエステル法［：Ｒ，Ｃｒｅａら：プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカテ゛ミイ・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）
、　７５　．５７６５（１９７８）］により合成した。

１４ｍｅｒおよび１０ｍｅｒの各々２Ｊ１ｇを５０ｍＭ
　）リス・塩酸（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｆ
　、、５ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡおよ
び１ｍＭ　ＡＴＰを含む全景２０頭の溶液に溶かし、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイ
ム社製）３０単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化
反応を行った。

リン酸化した１４ｍｅｒと１０ｍａｒを２ｇずつ混合し
、７０℃で５分間加熱後室温に放置してアニーリングを
行うことにより、上記構造を有するＤＮＡＩＪンカーを
得た。

上記で得たｐＫＹＰＩＯのＨｉｎｄＩＩ［−巳ｃｏＲＶ
　　Ｄ　Ｎ　Ａ断片０．５ｕｇを全量２５誠のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ緩衝液に溶かし、この混合溶液に上記ＤＮＡ
！ｊンカーを約０．１■加えた。さらにＴ　４　ＤＮＡ
　！Ｊガーゼ４単位を加え、１６℃で１８時間結合反応
を行った。得られた組換え体プラスミドを用いて、通常
通りエシェリヒア・コＩＪ　ＭＭ２９４株を形質転換し
、＾ｐ耐性の形質転換株よりプラスミドを分離し、構造
解析を行った結果、第４図に示したｐＴｒｓ３１である
ことを確認した。プラスミドｐＴｒｓ３１のＳＯ配列（
＾ＡＧＧ）から開始コドン（＾ＴＧ）周辺の塩基配列を
マキサム・ギルバートの方法［ＡｌＭｌＭａｘａｍら：
プロシーデイング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　）、　７４　、５６０　（１９７７）　
］で確認したところ下記に示す通りだった。

ｐＴｒｓ３１は５Ｄ−ＡＴＧ間の距離が１４ｂｐでＡＴ
Ｇコドンの直後に２つのＳａｃ　Ｉ切断部位と１つのＮ
ｒｕ　Ｉ切断部位を有するＡＴＧベクターであり、プラ
スミド造成の際に合成りＮＡが２個挿入されたプラスミ
ドであることがわかった。

発明の効果 本発明によれば、酵素的にチアミンとＡＴＰとからＴＭ
Ｐ　＃よびＴＰＰなどのチアミンリン酸類を、効率よく
製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図、第４図および第５図は、それ
ぞれプラスミドｐＨＴＫ１１１　、ｐＨＴＬ３１１、ｐ
ＴＫＬ１３、ｐＴｒｓ３１およびｐＨＴＬ３２の作製工
程を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）チアミンとアデノシン−３−リン酸（ＡＴＰ）と
   からチアミン−リン酸および／またはチアミンピロリン
   酸を生成する反応を触媒する酵素活性を有する酵素源の
   存在下、水性媒体中でチアミンとＡＴＰとを反応させて
   チアミン−リン酸および／またはチアミンピロリン酸を
   生成させ、反応液から生成したチアミン−リン酸および
   ／またはチアミンピロリン酸を採取することを特徴とす
   るチアミン−リン酸および／またはチアミンピロリン酸
   の製造法。 （２）該ＡＴＰが、ＡＴＰ前駆体、リン酸基供与体およ
   びエネルギー供与体とからＡＴＰを生合成する活性を有
   する微生物により供給されるＡＴＰである請求項１記載
   の方法。 （３）該微生物が、エシェリヒア属、ブレビバクテリウ
   ム属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である
   請求項２記載の方法。 （４）該酵素源が、チアミンキナーゼおよび／またはチ
   アミン−リン酸キナーゼである請求項１記載の方法。 （５）該酵素源が、チアミンとＡＴＰとからチアミン−
   リン酸および／またはチアミンピロリン酸を生成する活
   性を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物
   である請求項１記載の方法。 （６）該微生物が、エシェリヒア属に属する微生物であ
   る請求項５記載の方法。 （７）該微生物が、チアミン−リン酸および／またはチ
   アミンピロリン酸の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
   Ａ断片を含む組換え体ＤＮＡを保有する微生物である請
   求項５または６記載の方法。 （８）該ＤＮＡ断片が、エシェリヒア属に属する微生物
   由来である請求項７記載の方法。（９）該微生物が、Ａ
   ＴＰ前駆体、リン酸基供与体およびエネルギー供与体と
   からＡＴＰを生合成する活性を併せ持つ微生物である請
   求項５、６または７記載の方法。 （１０）エシェリヒア属に属する微生物由来のチアミン
   −リン酸および／またはチアミンピロリン酸の合成に関
   与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡ
   。 （１１）エシェリヒア属に属し、エシェリヒア属に属す
   る微生物由来のチアミン−リン酸および／またはチアミ
   ンピロリン酸の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断
   片を含む組換え体ＤＮＡを保有する微生物。 （１２）エシェリヒア属に属し、エシェリヒア属に属す
   る微生物由来のチアミン−リン酸および／またはチアミ
   ンピロリン酸の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断
   片を含む組換え体ＤＮＡを保有し、かつＡＴＰ前駆体、
   リン酸基供与体およびエネルギー供与体とからＡＴＰを
   生合成する活性を有する微生物の菌体、培養液またはそ
   れらの処理物の存在下、水性媒体中でチアミン、リン酸
   基供与体、触媒量のＡＴＰまたはその前駆体およびエネ
   ルギー供与体を反応させてチアミン−リン酸および／ま
   たはチアミンピロリン酸を生成させ、反応液から生成し
   たチアミン−リン酸および／またはチアミンピロリン酸
   を採取することを特徴とするチアミン−リン酸および／
   またはチアミンピロリン酸の製造法。 （１３）チアミン−リン酸とＡＴＰとからチアミンピロ
   リン酸を生成する反応を触媒する酵素活性を有する酵素
   源の存在下、水性媒体中でチアミン−リン酸とＡＴＰと
   を反応させてチアミンピロリン酸を生成させ、反応液か
   ら生成したチアミンピロリン酸を採取することを特徴と
   するチアミンピロリン酸の製造法。 （１４）該酵素源が、チアミン−リン酸合成酵素である
   請求項１３記載の方法。 （１５）該酵素源が、チアミン−リン酸とＡＴＰとから
   チアミンピロリン酸を生成する活性を有する微生物の菌
   体、培養液またはそれらの処理物である請求項１３記載
   の方法。 （１６）該微生物が、エシェリヒア属に属する微生物で
   ある請求項１５記載の方法。 （１７）該微生物が、チアミンピロリン酸の合成に関与
   する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを
   保有する微生物である請求項１５または１６記載の方法
   。 （１８）該ＤＮＡ断片が、エシェリヒア属に属する微生
   物由来である請求項１７記載の方法。 （１９）該微生物が、ＡＴＰ前駆体、リン酸基供与体お
   よびエネルギー供与体とからＡＴＰを生合成する活性を
   併せ持つ微生物である請求項１５、１６または１７記載
   の方法。 （２０）該ＡＴＰが、ＡＴＰ前駆体、リン酸基供与体お
   よびエネルギー供与体とからＡＴＰを生合成する活性を
   有する微生物により供給されるＡＴＰである請求項１３
   記載の方法。 （２１）該微生物が、エシェリヒア属、ブレビバクテリ
   ウム属またはコリネバクテリウム属に属する微生物であ
   る請求項２０記載の方法。 （２２）エシェリヒア属に属し、エシェリヒア属に属す
   る微生物由来のチアミンピロリン酸の合成に関与する遺
   伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを保有し
   、かつＡＴＰ前駆体、リン酸基供与体およびエネルギー
   供与体とからＡＴＰを生合成する活性を有する微生物の
   菌体、培養液またはそれらの処理物の存在下、水性媒体
   中でチアミン−リン酸、リン酸基供与体、触媒量のＡＴ
   Ｐまたはその前駆体およびエネルギー供与体を反応させ
   てチアミンピロリン酸を生成させ、反応液から生成した
   チアミンピロリン酸を採取することを特徴とするチアミ
   ンピロリン酸の製造法。