JPH104961A - Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びこれを用いるｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規なＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、
及び該酵素を用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルノ
イラミン酸の効率的な製造方法を提供する。 【解決手段】マンガン、カルシウムもしくはそれらのイ
オン、グルタチオンまたはＥＤＴＡによって触媒活性が
影響されないことを特徴とするＮ−アセチルノイラミン
酸シンターゼ。大腸菌に由来する上記Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼ。上記Ｎ−アセチルノイラミン酸シ
ンターゼを触媒として用いることを特徴とする、Ｎ−ア
セチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸から
Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＮ−アセチ
ルノイラミン酸シンターゼ、及びそれを用いることを特
徴とするＮ−アセチルノイラミン酸の製造方法に関す
る。

【０００２】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼは、その触媒活性がマンガン、カルシウムもしくは
それらのイオン、またはグルタチオンによって影響され
ず、またその活性がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）によって阻害されないことを特徴とする新規な酵素
である。

【０００３】

【従来の技術】Ｎ−アセチルノイラミン酸は、その誘導
体及び重合体を含めて、近年医薬品の原料として注目さ
れている。このため、従来からこのＮ−アセチルノイラ
ミン酸を大量生産するための技術開発が行われてきてお
り、現在、更に経済的な製造法の確立が求められている
状況である。

【０００４】かかるＮ−アセチルノイラミン酸を酵素的
に製造する従来の方法として、Ｎ−アセチルノイラミン
酸リアーゼ及びエピメラーゼを用いて、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン及びピルビン酸を反応させる方法〔Angew. C
hem. Int. Ed. Engl., 30, 827-828 (1991)〕、及びＮ
−アセチルノイラミン酸リアーゼを用いて、強アルカリ
の条件下でＮ−アセチルグルコサミン及びピルビン酸を
反応させる方法等が挙げられるが、前者の方法は、Ｎ−
アセチルグルコサミンからＮ−アセチルノイラミン酸へ
の転換率が２８％と低く、また後者の方法は、比較的強
いアルカリ条件下を使用するため、作業上の安全性、反
応後の排水処理、機器の耐性等の観点からまだまだ改良
の余地があった。

【０００５】ところで、以前より、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸の合成に関与する酵素としてＮ−アセチルノイラ
ミン酸シンターゼ（EC 4.1.3.19）の存在が知られてい
る。このＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、Ｎ−
アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸とか
らＮ−アセチルノイラミン酸を合成する反応を触媒する
酵素である。

【０００６】かかる酵素は、中性領域でこの反応を触媒
するため、少なくとも従来法による問題はなく、Ｎ−ア
セチルノイラミン酸の酵素的製造に有用であると考えら
れる。

【０００７】しかしながら、現在まで見つけられたＮ−
アセチルノイラミン酸シンターゼは、病原菌の一種であ
る髄膜炎菌に由来するものであり、その取得・調製の困
難性から未だ単離精製されておらず、その工業的利用は
難しいと考えられる〔ブラックロウ（Blacklow)ら、ザ
・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry) 237, 3520-3
526 (1962)〕。一方で、大腸菌の粗抽出物にＮ−アセチ
ルノイラミン酸シンターゼ活性の存在が報告されている
〔Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 371, 1101-1106 (1990);
Glycobiology.1,93-100 (1990)〕が、これらの報告で
は、被検物として細胞抽出物（粗精製物）を用いている
点、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性を該酵素
に対する非特異的測定法を使用して測っている点等か
ら、測定している活性がＮ−アセチルノイラミン酸シン
ターゼによるものであるという信憑性は低い。また、更
に加えて、最近、大腸菌中のＮ−アセチルノイラミン酸
シンターゼの存在を否定する文献が発表されており〔Bi
ochem. J. (1995) 308, 501-505〕、この中で、大腸菌
中でのＮ−アセチルノイラミン酸合成はＮ−アセチルノ
イラミン酸シンターゼではなく、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼが担っていると報告されている。

【０００８】このような状況のもと、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸を酵素を用いて工業的に製造するにあたって、
有用な特性（理化学的、酵素的性質）を有する新規なＮ
−アセチルノイラミン酸シンターゼを発見し、該酵素を
用いてＮ−アセチルノイラミン酸を効率的に製造する反
応系を確立することが求められている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｎ−アセチ
ルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸を基質とし
てＮ−アセチルノイラミン酸を産生する反応を触媒する
酵素であって、新規な特性を有するＮ−アセチルノイラ
ミン酸シンターゼを提供することを目的とする。

【００１０】また、本発明は、この新規Ｎ−アセチルノ
イラミン酸シンターゼを用いて、Ｎ−アセチルマンノサ
ミン及びホスホエノールピルビン酸から、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸を効率的に製造する方法を提供することを
目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
の下で鋭意検討を重ねた結果、大腸菌に、従来公知のＮ
−アセチルノイラミン酸シンターゼとは異なる有用な特
性を有する新規なＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
が存在することを見いだして、これを単離・精製するこ
とに成功した。そして、該酵素が、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸の合成に有用であることを確認して、本発明を完
成するに至った。

【００１２】すなわち、本発明は、マンガン、カルシウ
ムまたはそれらのイオン（以下、これらを総称して金属
類ともいう。）によって触媒活性が影響されないことを
特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼであ
る。

【００１３】また、本発明は、上記金属類の他、グルタ
チオンによっても触媒活性が影響されないことを特徴と
するＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼである。

【００１４】更に、本発明は、エチレンジアミン四酢酸
（以下、ＥＤＴＡという。）によりその活性が阻害され
ないことを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼである。

【００１５】更にまた、本発明は大腸菌に由来する上記
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼである。

【００１６】さらに本発明は、上記のいずれかのＮ−ア
セチルノイラミン酸シンターゼを触媒として用いること
を特徴とする、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエ
ノールピルビン酸からＮ−アセチルノイラミン酸を製造
する方法である。

【００１７】

【発明の実施の形態】Ｎ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼは、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノー
ルピルビン酸を基質として、Ｎ−アセチルノイラミン酸
を産生する反応を触媒する酵素である。その反応は、具
体的には下記の式で表すことができる。

【００１８】

【化１】 本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、上記
反応を触媒する酵素であって、マンガン、カルシウムま
たはそれらのイオンによって触媒活性が影響されないこ
とを特徴とするものである。言い換えれば、本発明のＮ
−アセチルノイラミン酸シンターゼは、Ｎ−アセチルマ
ンノサミン及びホスホエノールピルビン酸を含む反応系
に、マンガン、カルシウムまたはそれらのイオンのいず
れか少なくとも一種が適当量存在するとしないとに関わ
らず、触媒活性が殆ど変化せず、これらの金属類が反応
系に存在していなくても上記の反応を触媒する能力を十
分発揮する酵素である。なお、ここで適当量とは、一般
的に補因子（金属）要求性酵素において、触媒活性に必
要とされる補因子（金属）の量を広く意味するが、具体
的には〜５０ｍＭの濃度が例示される。

【００１９】また、別の表現で言い換えると、本発明の
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、活性化物質と
して、マンガン、カルシウムまたはそれらのイオンを必
要としないことを特徴とするものである。ここで活性化
物質とは、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼに直接
的または間接的に作用することにより、反応速度や平衡
等を変化させて触媒活性（酵素活性）を高めるような物
質を意味し、それがないと反応が進行しない「必須活性
化物質」、なくても反応は進行するがあればさらに活性
化される「非必須活性化物質」の両者を包含するもので
ある。また、このような活性化物質として、他にマグネ
シウム、コバルト、カリウム、ナトリウム、銀、鉄また
はそれらのイオンを含めることもできる。

【００２０】従来公知の髄膜炎菌由来のＮ−アセチルノ
イラミン酸シンターゼは、活性化物質として、マンガン
またはそれらのイオン等を必要とするものであり〔The
Journal of Biological Chemistry. Vol.237, No.11, p
p.3520-3526 (1962)等〕、この点で本発明のＮ−アセチ
ルノイラミン酸シンターゼと相違するものである。ま
た、大腸菌に由来すると報告されているＮ−アセチルノ
イラミン酸シンターゼは、活性化物質としてカルシウム
またはそのイオンを必要としており〔Glycobiology Vo
l. 1, no.1, pp.93-100 (1990)等〕、この点で本発明の
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼと相違するもので
ある。

【００２１】また、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸
シンターゼは、その触媒活性がグルタチオンによって影
響されないことを特徴とするものである。言い換える
と、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、
Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン
酸を基質とする反応系に、グルタチオンが適当量存在す
るとしないとに関わらず、その触媒活性が変化しないこ
とを特徴とするものである。ここで適当量とは、一般的
にＳＨ化合物要求性酵素において、触媒活性に必要とさ
れるＳＨ化合物の量を広く意味するが、具体的には〜１
０ｍＭの濃度を例示することができる。

【００２２】また、別の表現で言い換えると、本発明の
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、活性化物質
（「必須活性化物質」、「非必須活性化物質」の両者を
含む）としてグルタチオンを必要としないことを特徴と
するものである。さらに、本発明のＮ−アセチルノイラ
ミン酸シンターゼは、グルタチオンの他、β−メルカプ
トエタノール、システイン、ホモシステインによっても
その触媒活性は影響されない。

【００２３】この点、酵素の最適な活性化に、すなわち
「非必須活性化物質」としてグルタチオン等が必要とさ
れる髄膜菌由来のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
と相違するところである〔The Journal of Biological
Chemistry. Vol.237, No.11,pp.3520-3526 (1962)
等〕。

【００２４】また、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸
シンターゼは、ＥＤＴＡの存在によってもその触媒活性
が阻害されないという特性を有する。この特性もまた、
ＥＤＴＡの存在によってその活性が阻害される、従来公
知の髄膜炎菌由来のＮ−アセチルノイラミン酸シンター
ゼと著しく相違するところである〔The Journal of Bio
logical Chemistry. Vol.237, No.11, pp.3520-3526,
(1962)等〕。

【００２５】このことは、本発明のＮ−アセチルノイラ
ミン酸シンターゼは、Ｍｎ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃ
ｏ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｆｅ²⁺などの金属イオンが酵素の触媒部
位もしくは活性部位に結合等して活性の発現に関与する
といった金属酵素ではないことを示唆している。

【００２６】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼには、上記特性を有する全ての酵素が包含される
が、さらに下記の表１に示される理化学的性質を有して
いることが好ましい。

【００２７】

【表１】 かかる理化学的性質の測定条件の詳細については、後の
実施例に記載する。なお、表１のうち、ｐＨ安定性につ
いて、ｐＨ４〜１２とは、最大活性を１００％とした場
合に、その４０％以上の活性を維持しているｐＨ範囲を
意味し、またｐＨ７〜１０とは、同様に９０％以上の活
性を維持しているｐＨ範囲を意味する（図８参照）。

【００２８】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼは、前述するように、触媒活性がマンガン、カルシ
ウムまたはそれらのイオンにより影響されないという性
質、好ましくは、さらに加えて触媒活性がグルタチオン
により影響されないという性質、より好ましくはこれら
の性質に加えて表１に記載する各種の理化学的性質を有
するものであればよく、その由来等によって何ら制限さ
れるものではない。

【００２９】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼとして、通常、ラット、ウシ、ヒトなどの哺乳類、
微生物等に由来するものが挙げられるが、好ましくは、
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis)以外の細菌に由来
するものであり、さらに好ましくは大腸菌、とりわけ大
腸菌Ｋ１に由来するものである。

【００３０】また、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸
シンターゼは、同様に上記特性を有するものである限
り、その取得方法によって何ら限定されるものではな
い。

【００３１】取得方法の一例としては、例えば、Ｎ−ア
セチルノイラミン酸シンターゼを発現・産生する菌株を
適当な培地で培養し、その培養菌体の細胞抽出液に含ま
れるＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを適当な方法
で単離・精製する方法等が挙げられる。

【００３２】この場合、用いられる菌株は、Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸シンターゼを発現・産生し得るものであ
れば特に制限されることなく、また野生菌、変異株、組
換体等の別も問わない。好ましくは大腸菌、より好まし
くは大腸菌Ｋ１（Escherichia coli K1)（ＡＴＣＣ ２
３５１１）等が例示される。

【００３３】培養は、微生物、好ましくは大腸菌の培養
に通常用いられる栄養源を含む各種の培地で行うことが
できる。スケールアップが可能である等の点から好まし
くは液体培地であり、より好ましくは硫酸アンモニウム
０．５％、リン酸水素二カリウム１．４％、酵母エキス
０．０５％、ソルビトール２％、硫酸マグネシウム０．
１％を有する液体培地等が例示される。培養は、通常２
０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で、１〜１００時間、
好ましくは５〜２０時間程度行うことができ、必要によ
り通気や撹拌を加えることもできる。好適な培養方法と
しては、振盪培養や通気撹拌培養等が挙げられる。

【００３４】培養後は、自体公知の方法、例えば分画
法、各種クロマトグラフィー法（イオン交換法、クロマ
トフォーカシング法、ゲル濾過法等）等を用いて、各工
程のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性を有する
画分を分離取得することにより、順次Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼを単離・精製することができる。

【００３５】Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活
性は、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピ
ルビン酸を基質とする反応系で、ｐＨ７〜８、好ましく
はｐＨ７．５、２５〜３７℃、好ましくは３５℃の条件
で、１０〜６０分間、好ましくは３０分間反応させた
後、生成したＮ−アセチルノイラミン酸の量を適当な方
法で測定することにより行うことができる。

【００３６】Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量は、当業
界で公知の方法で行うことができ、例えばレゾルシノー
ル塩酸法〔Acta Chem. Scand., 13, 856 (1959)〕、チ
オバルビツール酸法（ＴＢＡ法）〔J. Biol. Chem., 23
4, 1971 (1959)、Biochem. J., 81, 384 (1961)、J. Bi
ochem., 82, 1425 (1977)〕等を用いて、反応生成物
（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を比色定量する方法が例
示される。好ましくは、チオバルビツール酸法である。

【００３７】特に精製過程において、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼの活性を求める場合には、上記の反
応系にリン酸塩を添加して行うことが好ましい。大腸菌
の粗酵素にはフォスファターゼが含まれており、それに
より反応系中の基質の一つであるホスホエノールピルビ
ン酸がピルビン酸に変換されるため、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼの活性を正確に評価することが困難
だからである。これに対して反応液にリン酸塩を添加し
ておくと、リン酸塩がフォスファターゼの阻害剤として
機能するため、正確にＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼの活性を測定、評価することができる。尚、リン酸
塩の塩は特に制限されず、通常使用される塩、具体的に
はリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウ
ム、リン酸マグネシウム等が例示される。反応条件の具
体的な一例を図１に示す。

【００３８】また、本発明は、上記の本発明のＮ−アセ
チルノイラミン酸シンターゼを触媒として用いることを
特徴とする、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノ
ールピルビン酸からＮ−アセチルノイラミン酸を製造す
る方法である。

【００３９】Ｎ−アセチルノイラミン酸は、従来、Ｎ−
アセチルノイラミン酸リアーゼ及びエピメラーゼの存在
下で、Ｎ−アセチルグルコサミンとピルビン酸を反応さ
せる方法、コロミン酸の加水分解、卵黄や牛乳（ミルク
ホエー）等に含まれる糖タンパク質の加水分解等によっ
て製造されているが、前述の本発明のＮ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼを触媒として、下記の反応を行うこ
とによって製造する本発明の方法によると、前述するよ
うに反応系に金属類、ＳＨ化合物等の添加を必要としな
いことに加えて、収率及び純度に関して有利に製造する
ことができる。

【００４０】

【化２】 すなわち、本発明の製造方法は、Ｎ−アセチルマンノサ
ミンとホスホエノールピルビン酸とを基質として、前述
する本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを触
媒として用いるものである。製造条件（反応条件）は、
適宜選択・調整することができ、具体的には、温度は通
常２５〜５０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度、よ
り好ましくは３５℃程度、ｐＨは通常５．５〜９程度、
好ましくは７〜８程度、より好ましくはｐＨ７．５程
度、インキュベーション時間は通常０．５〜２４時間程
度、好ましくは５〜１０時間程度、より好ましくは６時
間程度が例示される。

【００４１】製造に際して、Ｎ−アセチルノイラミン酸
シンターゼは、粗製品、精製品のいずれをも用いること
ができる。粗製品を用いる場合、特にＮ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼにフォスファターゼが含まれる場合
は、リン酸塩を存在させた反応系を用いてＮ−アセチル
ノイラミン酸を製造することが好ましい。

【００４２】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼを用いた本発明の製造法によれば、高純度のＮ−ア
セチルノイラミン酸を高い収率で得ることができる。本
発明の方法によれば反応効率が９５〜１００％程度、純
度が９８〜１００％であり、従来のＮ−アセチルノイラ
ミン酸リアーゼを用いる製造方法が反応効率が約５０％
程度、純度９９％であるのに比較して、著しく有意な効
果を有する。また、反応系に金属類やＳＨ化合物を添加
する必要がなく、またこのため最終反応物からこれらの
金属類等を排除・精製する必要もない点でも有利であ
る。

【００４３】

【実施例】以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定される
ものではない。

【００４４】−実施例１−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの調製方法 Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを産生する大腸菌
Ｋ１（ＡＴＣＣ ２３５１１）を、液体培地（組成：硫
酸アンモニウム０．５％、リン酸水素二カリウム１．４
％、酵母エキス０．０５％、ソルビトール２％、硫酸マ
グネシウム０．１％：ｐＨ８．５）中で３７℃の条件下
で振盪培養した。８時間後に培養を止め、得られた培養
物を遠心分離（９，０００rpm, ２０分間）にかけて、
菌体を集めた。この菌体をさらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）に懸濁・溶解した後、菌体を超音
波で破砕し、再度遠心することにより、その上清である
細胞抽出液を得た。

【００４５】この抽出液を透析後、陰イオン交換クロマ
トグラフィー〔ＤＥＡＥ−セルロース：ワットマン社
製、条件；緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液
（ｐＨ８）、流速：４０ｍｌ／分〕、陽イオン交換クロ
マトグラフィー〔ＣＭ−セルロース：ワットマン社製、
条件；緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ
７）、流速：２ｍｌ／分〕、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー〔ULTROGEL AcA44、条件；緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）−１００ｍＭ ＮａＣｌ、流
速：１．５ｍｌ／分〕、陰イオン交換クロマトグラフィ
ー〔RESOURCE Q:ファルマシア社製、条件；緩衝液：
Ａ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）、Ｂ）
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９）−３００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、グラジエント：０−３００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、流速３ｍｌ／分〕、クロマトフォーカシング〔Ｍｏ
ｎｏ Ｐ:ファルマシア社製、条件；緩衝液：Ａ）７５
ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．３）−ＣＨ₃ＣＯＯＨ、Ｂ）
１０倍希釈 Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６−ＣＨ₃ＣＯＯ
Ｈ（ｐＨ９）；流速１ｍｌ／分〕及びゲル濾過クロマト
グラフィー〔セファデックスＧ−１００：ファルマシア
社製、条件；緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液
（ｐＨ９）−１５０ｍＭ ＮａＣｌ、流速：０．４ｍｌ
／分〕にかけて、順次Ｎ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼの活性画分を取得して、精製した。

【００４６】尚、各画分に含まれるＮ−アセチルノイラ
ミン酸シンターゼの活性は、図１に示す手順で行った。
まず、リン酸カリウムの存在下でＮ−アセチルマンノミ
ン及びホスホエノールピルビン酸とともに、ｐＨ７．
５、３５℃で３０分間インキュベーションした。その
後、反応総量の約１／１０容量の０．１Ｎ 塩酸を添加
することにより反応を停止し、次いでチオバルビツール
酸法を用いて、生成されたＮ−アセチルノイラミン酸の
比色を５４０ｎｍの波長で測定する方法で求めた。

【００４７】なお、チオバルビツール酸法は、以下の方
法に従って行った。

【００４８】−チオバルビツール酸法− 試料０．２ｍｌに０．１ｍｌの過ヨウ素酸試薬を加え、
３７℃で３０分間放置する。これに亜硫酸ソーダ液を加
えて過ヨウ素酸を消去してから、チオバルビツール酸液
を１．０ｍｌ加える。栓をして沸騰湯浴中に７．５分間
保ち、発色させる。氷水中で冷やし、２−メトキシエタ
ノール２．０ｍｌを加えて混和し、色素を転溶して比色
する。

【００４９】表２に各精製段階で得られたＮ−アセチル
ノイラミン酸シンターゼの精製度及び収率を記載する。

【００５０】

【表２】 なお、ここでＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活
性単位（１Ｕ）とは、１分間に１μmolのＮ−アセチル
マンノサミンをＮ−アセチルノイラミン酸に転換する酵
素量を意味する。また、蛋白質の量は、ローリー法（Lo
wry method)によって〔J. Biol. Chem., 193 265 (195
1)〕、測定した。

【００５１】この方法により、最終的に、比活性４８７
Ｕ／ｍｇ蛋白の精製標品３０μｇを得ることができた。

【００５２】この精製標品をドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
という。１２．５％ポリアクリルアミドゲル）にかけた
結果、分子量約５０ｋＤの単一のバンドが得られた（図
２）。

【００５３】一方、セファデックスＧ-100を用いたゲル
濾過法では、本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンタ
ーゼは分子量１０６ｋＤを示し、このことから本発明の
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、約５０ｋＤの
サブユニットからなるホモダイマーであることが示唆さ
れた。

【００５４】−実施例２− Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの理化学的性質 実施例１で精製したＮ−アセチルノイラミン酸シンター
ゼを用いて下記の実験を行い、その理化学的性質を調べ
た。なお、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの活性
は、図１に示す方法に準じて測定した。

【００５５】（１）金属類の要求性 実施例１で得られた精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シン
ターゼについて、Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成にお
ける金属類（金属類のイオン）の要求性を調べた。

【００５６】金属類（イオン）としては、マンガン（Ｍ
ｎＣｌ₂）、マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）、コバルト（Ｃ
ｏＣｌ₂）、カルシウム（ＣａＣｌ₂）、カリウム（ＫＣ
ｌ）、ナトリウム（ＮａＣｌ）、銀（ＡｇＮＯ₃）、鉄
（ＦｅＳＯ₄）を用いた。

【００５７】図１に示す反応系において、酵素として
０．００５ＵのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを
用いて、上記の金属類を一切加えない系、各種金属類を
様々な濃度で加えた系でのそれぞれについて生成される
Ｎ−アセチルノイラミン酸の量を求めた。マンガン（Ｍ
ｎＣｌ₂）及びカルシウム（ＣａＣｌ₂）についての結果
を図３に示す。

【００５８】マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）、コバルト
（ＣｏＣｌ₂）、カリウム（ＫＣｌ）、ナトリウム（Ｎ
ａＣｌ）、銀（ＡｇＮＯ₃）及び鉄（ＦｅＳＯ₄）につい
ても、この結果と同様に、少なくとも１０ｍＭの濃度で
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒活性に全く
影響を与えなかった。

【００５９】（２）ＳＨ化合物要求性 実施例１で得られた精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シン
ターゼについて、Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成にお
けるＳＨ化合物の要求性について調べた。

【００６０】尚、反応に使用するＮ−アセチルノイラミ
ン酸シンターゼは、予めＳＨ化合物を含まない緩衝液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で透析し
て調製した。

【００６１】ＳＨ化合物としては、グルタチオン、β−
メルカプトエタノール、システイン、ホモシステインを
用いた。

【００６２】図１に示す反応系において、酵素として
０．００５ＵのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを
用いて、上記のＳＨ化合物を一切加えない系、各種ＳＨ
化合物を様々な濃度で加えた系それぞれについて、生成
されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を求めた。グルタ
チオンについての結果を図４に示す。

【００６３】β−メルカプトエタノール、システイン及
びホモシステインについても、図４の結果と同様に、少
なくとも１０ｍＭの濃度までＮ−アセチルノイラミン酸
シンターゼ活性に何ら影響を与えなかった。

【００６４】（３）阻害剤 実施例１で得られた精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シン
ターゼによるＮ−アセチルノイラミン酸の生合成におけ
る阻害剤について調べた。

【００６５】阻害剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン四酢酸）、ＰＣＭＢ（ｐ−クロロメタクリ安息香
酸）、ＨｇＣｌ₂（塩化水銀）、ＭＩＡ（ヨード酢
酸）、Ｈ₄Ｐ₂Ｏ₇（ピロリン酸）を用いた。

【００６６】図１に示す反応系において、酵素として
０．００５ＵのＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを
用いて、上記の阻害剤を一切加えない系、各種阻害剤を
様々な濃度で加えた系それぞれにおいて、生成するＮ−
アセチルノイラミン酸の量を求めた。ＥＤＴＡ、ＰＣＭ
Ｂ及びＨｇＣｌ₂についての結果を図５に示す。

【００６７】ＭＩＡ及びＨ₄Ｐ₂Ｏ₇については、ＥＤＴ
Ａと同様に、少なくとも１ｍＭの濃度までＮ−アセチル
ノイラミン酸シンターゼの活性に何ら影響を与えなかっ
た。

【００６８】（４）基質特異性、反応生成物の同定 Ｎ−アセチルマンノサミンとホスホエノールピルビン酸
を基質とする系、Ｎ−アセチルマンノサミンとピルビン
酸を基質とする系で、それぞれ実施例１で得られた精製
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを反応させた。反
応は、図１に示す条件に準じて、０から３００分間の範
囲でインキュベーションして反応することにより行っ
た。結果を図６に示す。Ｎ−アセチルマンノサミンとホ
スホエノールピルビン酸を基質とした場合、インキュべ
ーション（反応）時間にほぼ比例して生成するシアル酸
量は増加したが、Ｎ−アセチルマンノサミンとピルビン
酸を基質とした場合は、シアル酸の増加は全く認められ
なかった。

【００６９】このことから、精製酵素が、Ｎ−アセチル
マンノサミンとホスホエノールピルビン酸に対して基質
特異性を示すこと、さらに該酵素が、シアル酸リアーゼ
活性を含まないシアル酸シンターゼの純品であることが
確認された。

【００７０】また、反応生成物を、チオバルビツール酸
法、ＨＰＬＣによる分析、ＩＲによる分析をすることに
より、Ｎ−アセチルノイラミン酸であることを確認し
た。

【００７１】（５）酵素化学的性質（ｐＨ、温度の影
響） (i)至適ｐＨ、ｐＨによる安定性 ｐＨが４〜１２の範囲にある各種の反応液を調製して、
各ｐＨ条件下で反応を行い、本発明のＮ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼの至適ｐＨを求めた。反応条件は、
インキュベーション（反応）を２５℃で３０分間行い反
応液のｐＨを変える以外は、図１に示す方法に準じて行
った。結果を図７に示す。

【００７２】また、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンター
ゼを各種ｐＨ条件下（ｐＨ４〜１２）で一定時間インキ
ュベーションした後の酵素の安定性を調べた。具体的に
は、まずＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼだけを各
種ｐＨ条件下、２５℃で３０分間インキュベーションし
た。次いで、該酵素液をＮ−アセチルマンノサミンおよ
びホスホエノールピルビン酸と混合して、該反応液につ
いて酵素反応（ｐＨ７．５、２５℃、３０分間）して、
酵素の活性を調べた。結果を図８に示す。

【００７３】これらの結果、本発明のＮ−アセチルノイ
ラミン酸シンターゼの反応の至適ｐＨは７．５であり、
またｐＨ４〜１２の範囲で２５℃、３０分間のインキュ
ベーションしても最大活性１００％に対して４０％以上
の活性を維持しており、特にｐＨ７〜１０の範囲では最
大活性１００％に対して９０％以上の活性が維持され、
安定であることが判明した。

【００７４】(ii)作用適温の範囲 Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの触媒反応を、ｐ
Ｈ７．５の条件下で１５℃、２０℃、３０℃、３５℃、
４０℃、５０℃及び６０℃の各種温度で行った。その結
果、温度３５℃で最大の活性が得られた（図９）。

【００７５】また、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンター
ゼを各種温度条件下（０〜６０℃）で一定時間インキュ
ベーションした後の酵素の安定性を調べた。具体的に
は、まずＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼだけを各
種温度条件下、ｐＨ７．５で３０分間インキュベーショ
ンした。次いで該酵素液とＮ−アセチルマンノサミンお
よびホスホエノールピルビン酸を混合して、この反応液
について酵素反応（２５℃、ｐＨ７．５、３０分間）し
て、酵素の活性を調べた。結果を図１０に示す。

【００７６】これらの結果から、本発明のＮ−アセチル
ノイラミン酸シンターゼの触媒活性の至適温度は３５℃
であり、また温度安定性に関しては、ｐＨ７．５で３０
分間インキュベーションする条件下で０〜３０℃程度ま
で安定であることが判明した。

【００７７】（６）ミカエリス定数 Ｎ−アセチルノイラミン酸合成反応における初速度の、
両基質（Ｎ−アセチルマンノサミンおよびホスホエノー
ルピルビン酸）の濃度依存性について調べた。

【００７８】反応は、３０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（pH
7.5）、０．００５Ｕ Ｎ−アセチルノイラミン酸シン
ターゼ、各種濃度のＮ−アセチルマンノサミン、ホスホ
エノールピルビン酸を含む反応溶液（５００μｌ）を用
いて、３５℃で３０分間インキュベーションすることに
より行い、生成したＮ−アセチルノイラミン酸の量をチ
オバルビツール酸法で求めた。

【００７９】Ｎ−アセチルマンノサミンの濃度依存性を
調べる際は、ホスホエノールピルビン酸の濃度は、２０
ｍＭとし、ホスホエノールピルビン酸の濃度依存性を調
べる際は、Ｎ−アセチルマンノサミンの濃度は、２０ｍ
Ｍとした。

【００８０】ラインウィーバー・バーク式によって算出
した結果、ミカエリス定数は、Ｎ−アセチルマンノサミ
ンについては５．６ｍＭ、ホスホエノールピルビン酸に
ついては０．０４３ｍＭであった。

【００８１】−実施例３− Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼを用いるＮ−アセ
チルノイラミン酸の製造 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）にＮ−アセチルマンノサミ
ン７１７ｍｇ及びホスホエノールピルビン酸７０２ｍｇ
を溶解し、この溶液に実施例１で精製取得したＮ−アセ
チルノイラミン酸シンターゼを０．０６Ｕ加えて、全量
を３０ｍｌとし、３０℃で１０時間反応させた。

【００８２】反応後の、反応液中のＮ−アセチルノイラ
ミン酸の生成量をチオバルビツール酸法で測定して、Ｎ
−アセチルノイラミン酸への変換率を求めた。

【００８３】その結果、反応液中のＮ−アセチルノイラ
ミン酸の量は、９００ｍｇであり、使用したＮ−アセチ
ルマンノサミンに対する変換率は約９７％であった。

【００８４】Ｄｏｗｅｘ×１（登録商標、ダウケミカル
株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィーによ
り反応生成物を単離し、濃縮後、常法に従いＮ−アセチ
ルノイラミン酸の結晶８１０ｍｇを得た。

【００８５】参考例 Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ反応系に対するリ
ン酸塩の影響 Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの粗製品（実施例
１における細胞抽出液を使用）及び精製品（実施例１に
おけるセファデックスＧ−１００後の最終精製品を使
用）について、反応系にリン酸カリウムを入れた場合と
入れない場合とで、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンター
ゼの活性を測定した。反応は図１に示す条件に準じて行
った。結果を表３に示す。

【００８６】

【表３】 なお、反応液中のＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼの
活性は、基質（Ｎ−アセチルノイラミン酸、４０μｍｏ
ｌｓ／ｍｌ）５０μｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）５０μｌ、酵素液１００μｌからなる反応液を
３７℃にて３０分間反応して生成されるＮ−アセチルマ
ンノサミンをＭｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ（モルガン−エ
ルソン）変法で定量することにより測定した。

【００８７】このことから、精製過程の粗酵素の活性測
定には、リン酸塩を添加した反応系を用いることによ
り、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの正確な活性
を評価できることがわかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼの酵素反
応の条件を概説する図である。

【図２】精製Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた電気泳動像を示す図面に代わる
写真である。

【図３】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
の触媒活性に対する金属イオン（マンガンイオン、カル
シウムイオン）の影響を示す図である。なお、図面の縦
軸は、１分当たりに生じるＮ−アセチルノイラミン酸の
量（μｍｏｌ）を意味する。

【図４】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
の触媒活性に対するグルタチオンの影響を示す図であ
る。なお、図面の縦軸は、１分当たりに生じるＮ−アセ
チルノイラミン酸の量（μｍｏｌ）を意味する。

【図５】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
の触媒活性に対するＥＤＴＡ、ＰＣＭＢ（ｐ−クロロメ
ルクリ安息香酸）、塩化水銀の影響を示す図である。な
お、図面の縦軸は、１分当たりに生じるＮ−アセチルノ
イラミン酸の量（μｍｏｌ）を意味する。

【図６】Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノール
ピルビン酸（図中、○で示す）、またはＮ−アセチルマ
ンノサミン及びピルビン酸（図中、●で示す）を基質に
した場合におけるＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
によるＮ−アセチルノイラミン酸の生成量を経時的にみ
た図である。

【図７】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
の至適ｐＨを示す図である。なお、図の縦軸は、最大活
性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミン酸シ
ンターゼの相対活性を、横軸は反応液のｐＨを示す。

【図８】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
の安定ｐＨ範囲を示す図である。なお、図の縦軸は、最
大活性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミン
酸シンターゼの相対活性を、横軸は２５℃で３０分間イ
ンキュベーションした際のｐＨを示す。

【図９】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ
の至適温度を示す図である。なお、図の縦軸は、最大活
性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミン酸シ
ンターゼの相対活性を、横軸は反応液の温度を示す。

【図１０】本発明のＮ−アセチルノイラミン酸シンター
ゼの安定温度範囲を示す図である。なお、図の縦軸は、
最大活性を１００％とした場合のＮ−アセチルノイラミ
ン酸シンターゼの相対活性を、横軸はｐＨ７．５で３０
分間インキュベーションした際の温度を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マンガン、カルシウムまたはそれらのイオ
   ンによって触媒活性が影響されないことを特徴とするＮ
   −アセチルノイラミン酸シンターゼ。
2. 【請求項２】グルタチオンによって触媒活性が影響され
   ないことを特徴とする請求項１記載のＮ−アセチルノイ
   ラミン酸シンターゼ。
3. 【請求項３】エチレンジアミン四酢酸によって触媒活性
   が阻害されないことを特徴とする請求項１または２記載
   のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ。
4. 【請求項４】大腸菌に由来する請求項１乃至３のいずれ
   かに記載のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ。
5. 【請求項５】請求項１乃至４のいずれかに記載のＮ−ア
   セチルノイラミン酸シンターゼを触媒として用いること
   を特徴とする、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエ
   ノールピルビン酸からＮ−アセチルノイラミン酸を製造
   する方法。