CN1443777A - 一种能识别肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能识别体内肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体及制备方法及其在制药领域的用途。本发明公开的单克隆抗体是一种以人或动物肿瘤组织经获取的总蛋白为抗原进行免疫，同时利用培养后的肿瘤细胞对得到的单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行筛选，使得筛选出的细胞株产生体针对于肿瘤细胞表面蛋白的单克隆抗体。本发明还公开了该抗体的制备方法。本发明公开的单克隆抗体对肿瘤细胞针对性强，不损伤其他正常细胞，在开发抗肿瘤的靶向药物方面前景广阔，具有极大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种能识别肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体及其制备和应用。
背景技术
抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂已有上百年的发展历史。早期制备抗体的方法是将某种天然抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。多克隆抗体是人类有目的利用抗体第一步。多克隆抗体的不均一性，限制了对抗体结构和功能的进一步研究和应用。
1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性的单克隆抗体。杂交瘤技术的诞生被认为是抗体工程发展的第一次质的飞跃，也是现代生物技术发展的一个里程碑。利用这种技术制备的单克隆抗体在疾病诊断、治疗和科学研究中得到广泛的应用。其产生的杂交瘤细胞具有双重特性：既能无限生长，又能产生B淋巴细胞的抗体。单克隆抗体应用十分广泛，被人们誉为对付癌症的“生物导弹”。如采用抗癌细胞的单克隆抗体与放射性同位素、化学药物或毒素相结合，注入体内同癌细胞结合，能在原位杀死癌细胞，而不损伤其它正常细胞。
21世纪，生物技术将与信息技术一道为全球经济发展提供强大的动力，“成为全社会最重要并可能改变未来工业和经济格局的技术”。抗体工程技术随着现代生物技术的发展而不断完善，并且是生物技术产业化的主力军，尤其在生物技术制药领域占有重要地位。至2000年底为止，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种；正处于临床研究阶段的369种生物技术药物中，抗体药物有70种。我国自1986年实施“国家高技术研究与发展(863)计划”以来，生物技术的研究和开发都取得了非常大的进展，而抗体工程项目一直得到“863”计划的重点支持，已经具备了一定的科研基础和出现了产业化的良好发展势头。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能识别肿瘤细胞表面抗原的鼠源性单克隆抗体，该抗体对肿瘤抗原的选择性强，抑瘤效果显著。
本发明公开的能识别肿瘤细胞表面抗原的鼠源性单克隆抗体是一种以人或动物肿瘤组织提取获取的总蛋白为抗原，同时用培养后的肿瘤细胞铺板，对得到的抗体进行筛选而得的抗体。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述单克隆抗体的制备方法。
本发明公开的单克隆抗体的制备方法包括下列步骤：
一、单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备：
(1)取患肿瘤的人或动物的肿瘤组织，用高速组织破碎机切碎后离心，获取总蛋白；将肿瘤细胞破碎后离心，获取细胞总蛋白。总蛋白作为制备单克隆抗体的抗原。
(2)将抗原注入小鼠腹腔进行免疫，免疫方式为短程免疫，必要时可加强免疫。短程免疫的步骤为：
(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐剂等体积混合)；
(b)约一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐剂等体积混合)；
(c)约一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；
(d)一天后，向小鼠尾静脉注射5μg抗原；
(e)一天后，向小鼠尾静脉注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成细胞悬液，与骨髓瘤细胞按一定的比例(细胞数量比0.5-1.5∶10)混合，并在融合剂(PEG1450)作用下进行细胞融合，产生杂交瘤细胞。然后细胞培养至少一周，取其上清。
(4)在96孔板内用完全培养液培养肿瘤细胞，每孔细胞数以8,000-10,000。CO2孵箱培养24～48小时，待细胞长成单层。弃去培养液，向各孔内加0.05％戊二醛(PBS为溶剂)100μl，室温固定15分钟。PBS洗三次后，每孔加封闭液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室温封闭1小时后，-20℃贮存备用。
(5)从-20℃取出细胞板，于37℃融化后，弃去原来的封闭液，重新加封闭液至满孔，37℃放置1小时。用PBS-Tween洗三次，并吸干液体。
(6)向96孔板中加入杂交瘤细胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小时后，用PBS-Tween洗三次。加入已标记HRP的羊抗鼠单抗(每孔100ul)，37℃放置1小时后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分钟后，加入2M H2SO4(每孔50ul)终止反应。
(7)测96孔板上各孔内的O.D.450。选择该值大于1.0者为阳性克隆的标准。
(8)重复步骤4-7，继续筛选至阳性率为100％，复核一次后，扩大培养。
二、单克隆抗体蛋白的纯化：
1)用一定量(细胞数1,000,000-5,000,000)的细胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蜡一周后)，等待一周左右的时间，然后取小鼠腹水；在细胞培养瓶中培养细胞直至数量达到10,000,000后，取其上清液。
2)将腹水或上清过Protein G柱，进行亲和层析，其步骤如下：
a)取腹水1ml，3000-5000rpm离心至少10分钟，取上清用PBS稀释至10倍体积，再用0.45um的微孔滤膜过滤；细胞上清直接用0.45um的微孔滤膜过滤。
b)用10倍体积的PBS过柱，使柱处于中性状态，控制流速在1-2ml/min。
c)样品上柱并收集最后1-2ml溶液(用以检测是否达到饱和)。
d)用10倍体积的PBS过柱洗杂蛋白。
e)用3-4ml甘氨酸洗脱并收集约1ml/管。
f)取50-100ul的管中溶液，测定O.D.280和O.D.260，计算出其中单克隆抗体蛋白的浓度。
本发明所述的人或动物肿瘤组织、肿瘤细胞包括肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他实体瘤的组织、细胞。
本发明单克隆抗体的制备使用了肿瘤组织或肿瘤细胞中的总蛋白作为抗原进行免疫，使得产生的单克隆抗体可识别肿瘤细胞相关蛋白。此外，本发明利用培养后的肿瘤细胞对单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行筛选，使得筛选出的细胞株产生的单克隆抗体针对于肿瘤细胞表面蛋白。所以，本发明获得的单克隆抗体和肿瘤具有密切的相关性，经过严格的鉴定方法后，可作为治疗相关肿瘤的临床药物的原料。
本发明的单克隆抗体蛋白一般经过以下三种方法的鉴定，可认为其具有用于肿瘤临床治疗的潜在价值：
a)单克隆抗体蛋白与肿瘤组织抗原进行WESTERN实验。
又称免疫印迹法，通过电泳鉴定单克隆抗体蛋白的纯度以及交叉反应的程度。
b)免疫组织化学实验。
利用免疫学中的抗原抗体反应，借助可见的标记物，在组织原位显示抗原或抗体的方法。常见的免疫组织化学方法有荧光免疫和酶免疫组化技术、金标免疫组化技术和免疫电镜，该技术特点是对细胞涂片、印片、组织切片进行处理和染色镜检。
c)动物抑瘤实验。
利用接种相应肿瘤细胞并已致瘤的裸鼠作为动物模型，研究不同浓度的单克隆抗体动物体内对肿瘤抑制的效果，按下式计算抑瘤率。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述单克隆抗体作为制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明公开的单克隆抗体可直接作为治疗各种相应肿瘤的靶向药物，如肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他实体癌。
本发明公开的单克隆抗体可以用来分子制备人源化抗体。
本发明公开的单克隆抗体或人源化抗体也可与放射性核素、药物或毒素形成单抗偶联物，作为更有效的抗肿瘤药物。
本发明公开的单克隆抗体或人源化抗体与放射性核素、药物或毒素形成的单抗偶联物，可通过口服、注射、滴注等方式使单抗药物与发生肿瘤的部位接触，单抗药物与肿瘤细胞表面抗原结合，阻碍或消除肿瘤细胞的繁殖，起到治疗肿瘤的作用。
本发明公开的单克隆抗体对肿瘤细胞针对性强，不损伤其他正常细胞，在开发抗肿瘤靶向药物前景广阔，具有极大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1单克隆抗体蛋白与肝癌组织及相应的正常肝组织总蛋白的Western实验结果。
其中1为蛋白Marker，2为正常肝组织的总蛋白，3为肝癌组织的总蛋白
图2肝癌组织的免疫组化结果
图3正常组织的免疫组化结果
图4单克隆抗体蛋白与食道癌组织及相应的正常食道组织总蛋白的Western实验结果。
其中1为蛋白Marker，2为正常食道组织的总蛋白，3为食道癌组织的总蛋白
图5食道癌组织的免疫组化结果
图6正常组织的免疫组化结果
实施例1 可识别肝癌细胞表面抗原的单克隆抗体的制备、纯化和鉴定
一、可识别肝癌细胞表面抗原的单克隆抗体的制备
(1)取人的肝癌组织，用高速组织破碎机切碎后离心，获取总蛋白；总蛋白作为制备单克隆抗体的抗原。
(2)将抗原注入小鼠腹腔进行免疫，免疫方式为短程免疫，必要时可加强免疫。短程免疫的步骤为：
(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐剂等体积混合)；
(b)约一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐剂等体积混合)；
(c)约一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；
(d)一天后，向小鼠尾静脉注射5μg抗原；
(e)一天后，向小鼠尾静脉注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成细胞悬液，与骨髓瘤细胞按细胞数量比1∶10的比例混合，并在融合剂(PEG 1450)作用下进行细胞融合，产生杂交瘤细胞。然后细胞培养至少一周，取其上清。
(4)在96孔板内用完全培养液培养肿瘤细胞，每孔细胞数为10,000。CO2孵箱培养24～48小时，待细胞长成单层。弃去培养液，向各孔内加0.05％戊二醛(PBS为溶剂)100μl，室温固定15分钟。PBS洗三次后，每孔加封闭液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室温封闭1小时后，-20℃贮存备用。
(5)从-20℃取出细胞板，于37℃融化后，弃去原来的封闭液，重新加封闭液至满孔，37℃放置1小时。用PBS-Tween洗三次，并吸于液体。
(6)向96孔板中加入杂交瘤细胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小时后，用PBS-Tween洗三次。加入已标记HRP的羊抗鼠单抗(每孔100ul)，37℃放置1小时后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分钟后，加入2M H2SO4(每孔50ul)终止反应。
(7)测96孔板上各孔内的O.D.450。选择该值大于1.0者为阳性克隆的标准。
(8)重复步骤4-7一次，阳性率达到100％，复核一次。
二、可识别肝癌细胞表面抗原的单克隆抗体蛋白的纯化：1)用一定量(细胞数1,000,000-5,000,000)的细胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蜡一周后)，等待一周左右的时间，然后取小鼠腹水；在细胞培养瓶中培养细胞直至数量达到10,000,000以上，取其上清液。2)腹水或上清过Protein G柱，进行亲和层析，其步骤如下：a)取腹水1ml，4000rpm离心10分钟，取上清用PBS稀释至10倍体积，再用0.45um的微孔滤膜过滤；细胞上清直接用0.45um的微孔滤膜过滤。b)用10倍体积的PBS过柱，使柱处于中性状态，控制流速在1-2ml/min。c)样品上柱并收集最后2ml溶液(用以检测是否达到饱和)。d)用10倍体积的PBS过柱洗杂蛋白。e)用3-4ml甘氨酸洗脱并收集约1ml/管。f)取50-100ul的管中溶液，测定其O.D.280为2.41，按公式计算单克隆抗体蛋白的浓度为1.67mg/ml。
三、可识别肝癌细胞表面抗原的单克隆抗体的鉴定
a)WESTERN鉴定。
取人的肝癌组织和相应的正常肝组织，分别用高速组织破碎机切碎后离心，获取总蛋白。用单克隆抗体蛋白与上述总蛋白进行免疫印迹实验，证实仅在分子量为6.5kd处出现一条带。说明用肝癌组织总蛋白为抗原制备的单克隆抗体能与肝癌组织中某一特定蛋白有特异性结合能力(见图1)。
b)免疫组织化学实验。
按常规方法进行免疫组化实验，结果(图2、图3)表明，该抗体可结合在肝癌组织的多个部位，而不会与正常肝组织的蛋白相结合。
c)小鼠体内抑瘤实验。
无菌操作，取人体肝癌组织，以生理盐水制成匀浆，接种于裸鼠腋窝皮下，接种次日将小鼠随机分为3组：阴性对照组，腹腔注射等体积生理盐水组；阳性对照组，腹腔注射阿霉素20mg/m2；治疗组，腹腔注射单克隆抗体50mg/m2、。隔日给药1次，共6次。第14天处死动物，称瘤重，计算抑瘤率。
| 组别 | 剂量 | 瘤重 | 抑瘤率 |
| 生理盐水组(阴性对照) | 0.2ml | 1.59±0.22 | |
| 治疗组(单克隆抗体组) | 50mg/m2 | 0.84±0.13 | 47.1％ |
| 阿霉素组(阳性对照) | 20mg/m2 | 0.52±0.16 | 67.3％ |
实验结果表明，单克隆抗体的抑瘤率为47.1％。
实施例2 可识别食道癌细胞表面抗原的单克隆抗体的制备、纯化和鉴定
一、可识别食道癌细胞表面抗原的单克隆抗体的制备
(1)取人的食道癌细胞，破碎后离心，获取细胞总蛋白；总蛋白作为制备单克隆抗体的抗原。
(2)将抗原注入小鼠腹腔进行免疫，免疫方式为短程免疫，必要时可加强免疫。短程免疫的步骤为：
(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐剂等体积混合)；
(b)约一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐剂等体积混合)；
(c)约一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；
(d)一天后，向小鼠尾静脉注射5μg抗原；
(e)一天后，向小鼠尾静脉注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成细胞悬液，与骨髓瘤细胞按细胞数量比1∶10的比例混合，并在融合剂(PEG 1450)作用下进行细胞融合，产生杂交瘤细胞。然后细胞培养至少一周，取其上清。
(4)在96孔板内用完全培养液培养肿瘤细胞，每孔细胞数为10,000。CO2孵箱培养24～48小时，待细胞长成单层。弃去培养液，向各孔内加0.05％戊二醛(PBS为溶剂)100μl，室温固定15分钟。PBS洗三次后，每孔加封闭液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室温封闭1小时后，-20℃贮存备用。
(5)从-20℃取出细胞板，于37℃融化后，弃去原来的封闭液，重新加封闭液至满孔，37℃放置1小时。用PBS-Tween洗三次，并吸干液体。
(6)向96孔板中加入杂交瘤细胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小时后，用PBS-Tween洗三次。加入已标记HRP的羊抗鼠单抗(每孔100ul)，37℃放置1小时后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分钟后，加入2M H2SO4(每孔50ul)终止反应。
(7)测96孔板上各孔内的O.D.450。选择该值大于1.0者为阳性克隆的标准。
(8)重复步骤4-7二次，阳性率为100％，复核一次。
二、可识别食道癌细胞表面抗原的单克隆抗体蛋白的纯化：1)用一定量(细胞数1,000,000-5,000,000)的细胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蜡一周后)，等待一周左右的时间，然后取小鼠腹水；在细胞培养瓶中培养细胞直至数量达到10,000,000以上，取其上清液。3)腹水或上清过Protein G柱，进行亲和层析，其步骤如下：a)取腹水1ml，4000rpm离心10分钟，取上清用PBS稀释至10倍体积，再用0.45um的微孔滤膜过滤；细胞上清直接用0.45um的微孔滤膜过滤。b)用10倍体积的PBS过柱，使柱处于中性状态，控制流速在1-2ml/min。c)样品上柱并收集最后2ml溶液(用以检测是否达到饱和)。d)用10倍体积的PBS过柱洗杂蛋白。e)用3-4ml甘氨酸洗脱并收集约1ml/管。f)取50-100ul的管中溶液，测定其O.D.280为2.78，按公式计算单克隆抗体蛋白的浓度为1.93mg/ml。三、可识别食道癌细胞表面抗原的单克隆抗体的鉴定a)WESTERN鉴定
取人的食道癌组织和相应的正常食道组织，分别用高速组织破碎机切碎后离心，获取总蛋白。用单克隆抗体蛋白与上述总蛋白进行免疫印迹实验，证实仅在分子量20.5kd处出现一条带。说明用食道癌细胞总蛋白为抗原制备的单克隆抗体能与食道癌组织中某一特定蛋白有特异性结合能力(见图4)。b)免疫组织化学实验
按常规方法进行免疫组化实验，免疫组织化学实验结果(如图5、图6所示)表明：该抗体可结合在食道癌组织的多个部位，而不会结合正常食道组织中的蛋白。c)小鼠体内抑瘤实验
无菌操作，取人体食道癌组织，以生理盐水制成匀浆，接种于裸鼠腋窝皮下，接种次日将小鼠随机分为3组：阴性对照组，腹腔注射等体积生理盐水组；阳性对照组，腹腔注射阿霉素20mg/m2；治疗组，腹腔注射单克隆抗体60mg/m2、。隔日给药1次，共6次。第14天处死动物，称瘤重，计算抑瘤率。
抗食道癌单克隆抗体的小鼠体内抑瘤实验结果(如下表所示)
实验结果表明，抗食道癌单克隆抗体的抑瘤率为45.3％。
| 组别 | 剂量 | 瘤重 | 抑瘤率 |
| 生理盐水组(阴性对照) | 0.2ml | 1.72±0.15 | |
| 治疗组(单克隆抗体组) | 60mg/m2 | 0.94±0.27 | 45.3％ |
| 阿霉素组(阳性对照) | 20mg/m2 | 0.49±0.22 | 71.5％ |
Claims (6)
1、一种能识别肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体，其特征在于该抗体是一种以人或动物肿瘤组织提取的总蛋白为抗原免疫小鼠，同时用培养后的肿瘤细胞铺板，对得到的抗体进行筛选而得的抗体。
2、一种如权利要求1所述的能识别肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体的制备方法，其特征在于该抗体杂交瘤细胞株的制备方法包括下列步骤：
a)取患肿瘤的人或动物的肿瘤组织，用高速组织破碎机切碎后离心，获取总蛋白；将肿瘤细胞破碎后离心，获取细胞总蛋白。总蛋白作为制备单克隆抗体的抗原。
b)将抗原注入小鼠腹腔进行免疫，免疫方式为短程免疫，必要时可加强免疫；
c)取小鼠的脾脏制成细胞悬液，与骨髓瘤细胞按一定的比例混合，并在融合剂作用下进行细胞融合，产生杂交瘤细胞；进行细胞培养数日，获得细胞上清；
d)用肿瘤细胞铺在96孔板底部进行培养，使其长成单层；将杂交瘤细胞的上清加入96孔板的各孔，用此96孔板对杂交瘤细胞进行筛选直至阳性率为100％，获得具有稳定分泌单克隆抗体能力的杂交瘤细胞系；
e)将上法制备的杂交瘤细胞在细胞培养瓶中进行培养，取细胞数为1,000,000-5,000,000的细胞注射到Balb/C小鼠，等待一周左右后取小鼠腹水；将上法制备的杂交瘤细胞在细胞培养瓶中进行培养直至数量达到10,000,000以上，取细胞上清；
f)用Protein G的亲和层析柱对小鼠腹水或细胞上清进行纯化，得到纯的单克隆抗体蛋白；
g)测定单克隆抗体蛋白的O.D.280和O.D.260，计算出单克隆抗体蛋白的浓度。
3、一种如权利要求1所述的单克隆抗体在作为制备抗肿瘤药物中的应用。
4、一种如权利要求3所述的单克隆抗体在作为制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于可以以该单克隆抗体为模式分子制备人源化抗体。
5、一种如权利要求3或4所述的单克隆抗体或人源化抗体在作为制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于该单克隆抗体或人源化抗体可单独作为抗肿瘤药物，也可与放射性核素、药物或毒素形成单抗偶联物作为抗肿瘤药物。
6、一种如权利要求3或4所述的单克隆抗体或人源化抗体在作为制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于其中所述的肿瘤为肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他实体瘤。
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2002
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |