CN108472362A

CN108472362A - 新颖醣类抗体、医药组成物及其用途

Info

Publication number: CN108472362A
Application number: CN201680056209.7A
Authority: CN
Inventors: 游丞德; 赖建勋; 陈怡如
Original assignee: OBI Pharma Inc
Current assignee: OBI Pharma Inc
Priority date: 2015-10-07
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2036-10-07
Also published as: AR106307A1; HK1256414A1; US10501532B2; JP2018536628A; KR20180077181A; CN108472362B; WO2017062792A1; TW201718658A; CA3000531A1; TWI704159B; EP3359193A1; AU2016335842A1; EP3359193A4; US20170101462A1; IL257956A; US11236154B2; US20200048334A1; BR112018006140A2

Abstract

本发明涉及一种提供针对肿瘤相关醣类抗原之抗体或其抗原结合部位。本文亦揭露抑制有需要的个体体内的癌细胞之医药组成物及其使用方法。医药组成物包含抗体或其抗原结合部位以及至少一药学上可接受之载体。

Description

新颖醣类抗体、医药组成物及其用途

相关申请案的交互参照

本申请案主张2015年10月7日所提出的美国临时案62/238,680号的优先权，其全部内容于此并入本文中作为参考。

技术领域

本发明是有关于针对与肿瘤相关的醣类抗原的经修饰抗体、相对未经修饰抗体具部份特定胺基酸取代的经修饰抗体、以及未修饰抗体。本发明亦有关于此些抗体于治疗、预防或管理像是癌症的疾病或病症或抑制癌细胞的用途。

背景技术

诸多表面醣类于恶性肿瘤细胞中表现。举例而言，已指出Globo H(Fuc α1-->2Galβ1-->3GalNAcβ1-->3Galα1-->4Galβ1-->4Glc)于各种上皮癌(epithelial cancer)上过度表现且其与乳癌(breast cancer)及小细胞型肺癌(small cell lung carcinoma)的肿瘤攻击性及不良的预后相关。

上述发现支持针对抑制肿瘤相关醣类的活性设计的治疗理论基础。特别是以与肿瘤相关醣类结合的抗体作为一种治疗或抑制癌细胞的手段，因其在血浆中具有较长的半生期及较少的不良反应而受到较多的关注。部分最早期的抗体是为小鼠单株抗体(mAbs)，其由免疫上述肿瘤相关醣类的小鼠淋巴细胞的融合瘤(hybridomas)所分泌。然而，将小鼠抗体用于人体仍存在相关的问题，例如无法触发某些人体效应功能(effector function)及包含细胞因子释放症候群的不良反应。源自非人类的动物物种的抗体通常被人源化(humanized)以提升效应功能的效用及/或降低不良反应。然而，人源化抗体不具有与未人源化的抗体相当的结合活性。

最佳化人源化抗体的结合亲和力的需求仍未被满足。本发明提供具有最佳化结合亲和力的抗体以满足上述及其他的需求。

发明内容

本发明提供抗体或其抗原结合部位，其包含结合至醣类抗原或其片段的变异区(variable region)。

在一实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合部位，其结合至醣类抗原或其片段且包含重链(heavy chain)变异区，其中所述重链变异区包含三个互补性决定区(complementarity determining regions，CDRs)，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列，其中CDR包含至少一个选自以下的胺基酸取代：(a)CDR1中的胺基酸残基28被碱性胺基酸、非丝氨酸(Serine)的中性胺基酸或疏水性胺基酸取代；(b)CDR1中的胺基酸残基31被碱性胺基酸取代；(c)CDR2中的胺基酸残基57被中性胺基酸、碱性胺基酸或疏水性胺基酸取代；(d)CDR2中的胺基酸残基63被中性胺基酸、碱性胺基酸或非脯氨酸(Proline)的疏水性胺基酸取代；或(e)CDR3中的胺基酸残基105被碱性胺基酸、疏水性胺基酸或中性胺基酸取代。

在另一实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合部位，其与醣类抗原或其片段结合且包含：轻链变异区(light chain variable region)，其中所述轻链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：7、8以及9所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列，其中CDR包含至少一个选自以下的胺基酸取代：(a)CDR1中的胺基酸残基24被中性胺基酸或疏水性胺基酸取代；(b)CDR1中的胺基酸残基32被中性胺基酸或非甲硫胺酸的疏水性胺基酸取代；(c)CDR2中的胺基酸残基49被中性胺基酸取代；(d)CDR2中的胺基酸残基53被中性胺基酸或碱性胺基酸取代；或(e)CDR3中的胺基酸残基93被碱性胺基酸、疏水性胺基酸或非天门冬酰胺酸(Asaparagine)的中性胺基酸取代。

在又一实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合部位，其包含：

(i)重链变异区，其中所述重链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列，其中重链包含至少一个选自以下的胺基酸取代：(a)CDR1中的胺基酸残基28被碱性胺基酸、非丝氨酸的中性胺基酸或疏水性胺基酸取代；(b)CDR1中的胺基酸残基31被碱性胺基酸取代；(c)CDR2中的胺基酸残基57被中性胺基酸、碱性胺基酸或疏水性胺基酸取代；(d)CDR2中的胺基酸残基63被中性胺基酸、碱性胺基酸或非脯氨酸(Proline)的疏水性胺基酸取代；或(e)CDR3中的胺基酸残基105被碱性胺基酸、疏水性胺基酸或中性胺基酸取代。

(ii)轻链变异区，其中所述轻链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：7、8以及9所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列，其中轻链包含至少一个选自以下的胺基酸取代：(a)CDR1中的胺基酸残基24被中性胺基酸或疏水性胺基酸取代；(b)CDR1中的胺基酸残基32被中性胺基酸或非甲硫胺酸的疏水性胺基酸取代；(c)CDR2中的胺基酸残基49被中性胺基酸取代；(d)CDR2中的胺基酸残基53被中性胺基酸或碱性胺基酸取代；或(e)CDR3中的胺基酸残基93被碱性胺基酸、疏水性胺基酸或非天门冬酰胺酸(Asaparagine)的中性胺基酸取代。

在第四实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合部位，其包含：(a)重链变异区，其中所述重链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列，以及/或(b)轻链变异区，其中所述轻链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：7、8以及9所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列。

部分实施例提供医药组成物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合部位及至少一个药学上可接受的载体。

部分实施例亦提供抑制癌细胞的方法，其包含：施予有效量的如本文所述的抗体或其抗原结合部位至需求个体。在一实施例中，所述癌细胞为表现Globo H的癌细胞。

附图说明

图1A显示例示性实施例的未经修饰的人源化抗体(SEQ ID NO：13)的重链变异区的胺基酸序列。图1B显示例示性实施例的未经修饰的人源化抗体(SEQ ID NO：14)的轻链变异区的胺基酸序列。

图2显示一例示性实施例的嵌合抗体(重链：SEQ ID NO：57及轻链：SEQ ID NO：58)及一例示性实施例的人源化抗体(重链：SEQ ID NO：13及轻链：SEQ ID NO：14)的光学密度(OD₄₅₀nm)：。

图3是示意性显示综合性定位演化(Comprehensive Positional Evolution)及组合蛋白合成(Combinatorial Protein Synthesis)的过程。

图4A至4E显示于人源化抗体及野生型(wild type，WT)嵌合抗体的重链变异区的残基28(图4A)、残基31(图4B)、残基57(图4C)、残基63(图4D)以及残基105(图4E)经胺基酸(AA)取代的经修饰抗体的光学密度(OD₄₅₀nm)。

图5A至5E显示人源化抗体及野生型嵌合抗体的轻链变异区的残基24(图5A)、残基32(图5B)、残基49(图5C)、残基53(图5D)以及残基93(图5E)经胺基酸取代的经修饰抗体的光学密度(OD₄₅₀nm)。

图6显示经至少两个胺基酸取代(组合蛋白合成突变(Combinatorial ProteinSynthesis mutants))的经修饰抗体的OD₄₅₀nm，其高于野生型嵌合抗体的OD₄₅₀nm。

图7显示具有不同浓度的Globo H的源自融合瘤VK9的嵌合抗体(源自纪念史隆·凯特琳癌症研究中心，Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSKCC)、源自融合瘤2C2的嵌合抗体(SEQ ID NOs：57及58)及例示性实施例的经修饰抗体(人源化R28mAbs，SEQID NOs：59及60)的解离常数(Kd)的比较。

图8是描绘显示一般食盐水(载体)、源自融合瘤2C2的嵌合抗体(SEQ ID NO：57及58)、源自融合瘤2C2的人源化抗体(SEQ ID NO：13及14)以及例示性实施例的经修饰抗体(人源化R28mAbs，SEQ ID NO：59及60)对于小鼠乳癌(MCF7)肿瘤体积的效应的线性作图。

具体实施方式

本文中「一」乙词如用于本文中是代表文中其所指的物件的单数或复数型态。例如：「一元素」代表单一元素或复数种元素。

本文中「有效量」乙词如用于本文中是代表足以减轻癌症的症状或迹象的抗体或医药组成物的剂量，其中症状或迹象是例如：体重减轻、疼痛及可触肿块(palpable mass)的无论透过临床上(当为可触肿块时)或放射学上透过各种成像方法可测得的现象。本文中「有效量」乙词及「有效治疗量」乙词可交替使用。

本文中「个体」乙词可指患有癌症的脊椎动物或推定有癌症治疗需求的脊椎动物。个体包含所有温体动物，如哺乳动物，像是灵长类，更优选情形为人类。个体亦可为非人类的灵长类。「个体」乙词包含驯养动物，如猫、狗等、家畜(例如：牛、马、猪、绵羊、山羊等)及实验动物(例如：小鼠、兔子、大鼠、沙鼠、天竺鼠等)。因此，在本文中预期具有兽医领域的用途及医药制剂。

「抗体」乙词意图涵盖抗体、分解片段、特定部位及其变异体，其包含抗体拟物(antibody mimetics)或包含模拟抗体的结构及/或功能的抗体部位或其特定片段或部位，包含单链抗体及其片段，其各包含源自本发明的抗体的至少一个CDR。抗体包含抗体片段、抗体变异体、单株抗体(monoclonal antibodies)、多株抗体(polyclonal antibodies)以及重组抗体(recombinant antibodies)等。抗体可于小鼠、兔子或人类体内产生。

抗体可具有完整长度或可包含具抗原结合部位的抗体的一或多个片段，其包含但不限于：Fab(例如：由木瓜酵素(papain)分解)、Fab'(例如：由胃蛋白酶分解及部分还原)、F(ab')2(例如：由胃蛋白酶分解)、facb(例如：由血纤维蛋白溶酶分解)、pFc'(例如：由胃蛋白酶或血纤维蛋白溶酶分解)、Fd(例如：由胃蛋白酶、部分还原及再聚集)、Fv或scFv(例如：由分子生物技术)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段(例如：Ward等人.,Nature,341:544-546(1989))、经分离的CDR、二聚抗体(diabodies)、三聚抗体(tribodies)、线性抗体(linear antibodies)、单链抗体分子、由抗体片段组成的双特异性(bispecific)或多特异性(multispecific)抗体。

利用重组法(recombinant methods)或合成连结子(synthetic linker)透过加入抗体片段生成的单链抗体亦涵盖于于本发明中。(参照：Bird等人.,Science,1988,242:423-426.Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85:5879-5883)

多特异性或双特异性抗体或其片段可为对单一目标醣类(例如：Globo H)的不同表位具有特异性或可包含对多于一个目标醣类具有特异性的多个抗原结合域(antigen-binding domains)，(例如：对于Globo H、SSEA-3及SSEA-4具有特异性的抗原结合域)。在一实施例中，多特异性抗体或其抗原结合部位包含至少两种不同的变异域，其中各变异域皆可特异性地结合至个别的醣类抗原或至相同醣类抗原上的不同表位。(参照：Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69.Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22:238-244)。本发明中所述的抗体可连结至其他功能性分子(例如：另一胜肽或蛋白质)或与其共表现(co-expressed)。举例而言，抗体或其片段可功能性地连结(例如：利用化学耦合、基因融合、非共价性连结或其他)至一或多个其他分子实体(如另一抗体或另一抗体片段)以生成具有第二结合特异性(second binding specificity)的双特异性或多特异性抗体。

抗体或抗原结合部位可为胜肽。此种胜肽可包含胜肽的变异体(variants)、类似物(analogs)、异种同源物(orthologs)、同源物(homologs)及其衍生物，其展现生物活性(例如：与肿瘤相关醣类抗原结合)。胜肽可包含胺基酸的一或多种类似物(包含例如：非天然的胺基酸、仅于无关生物系统的天然生成的胺基酸、来自哺乳动物系统的修饰胺基酸等)、具取代的连结以及其他所属技术领域中公知的修饰的胜肽。

抗体或其抗原结合部位可为结合至或衍生为其他功能性分子。举例而言，抗体可功能性连结(藉化学耦合、基因融合、非共价性作用等)至一或多种其他分子实体，如另一抗体、检测试剂、细胞毒性试剂、药物试剂、可调控与另一分子的结合的蛋白质或胜肽(如链酶卵白素(streptavidin)中心区域或聚组胺酸标识物(polyhistidine tag)、胺基酸连结分子、讯号序列(signal sequence)、免疫基因载体(immunogenic carriers)、或可用于蛋白质纯化的配体，如谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase)、聚组胺酸标识物及葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A)。衍生蛋白质的其中一型是由两个或多个蛋白质(同型或不同型的蛋白质)交联生成。合适的交联剂包含异基双功能(heterobifunctional)交联剂或同基双功能(homobifunctional)交联剂(例如：双琥珀酰亚胺辛二酸酯，disuccinimidyl suberate)，其中异基双功能交联剂具有藉适当的分离剂(例如：3-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)分离的两分离反应基。此种交联剂可自Chemical Company,Rockford,Ill购得。利用其可衍生(或被标记)蛋白的检测试剂包含萤光化合物、各种酶类、酵素辅成基(prosthetic groups)、发光材料(luminescent materials)、生物发光材料(bioluminescent materials)以及放射性材料(radioactive materials)。例示的萤光检测试剂包含但不限于：萤光素(fluorescein)、萤光异硫氰酸盐(fluoresceinisothiocyanate)、碱性蕊香红(rhodamine)以及藻红素(phycoerythrin)。蛋白质或抗体亦可以检测酵素(detectable enzymes)，如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)及其类似物进行衍生。蛋白质亦可以酵素辅成基(例如：链酶卵白素/生物素及卵白素/生物素)进行衍生。

抗体的轻链或重链变异区包含架构区(framework region，FW)，其由三个高变区(hypervariable region)所阻断，高变区亦称作互补性决定区(complementaritydetermining regions)或CDRs。在本发明的一态样中，抗体或其抗原结合部位可具有以下结构：

前导序列-FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-

其中本发明的胺基酸序列FW1、FW2、FW3、CDR1、CDR2、CDR3揭露于表1。

本文提及的抗体或其抗原结合部位的重链变异区及轻链变异区可取自非人类或人类来源。本文提及的抗体或其抗原结合部位的架构可为人类、人源化、非人类(例如：被修饰过以降低人体内免疫反应的小鼠(murine)架构)、或合成架构(例如：共有序列(consensus sequence))。

本发明所述的抗体亦包含嵌合或人源化的单株抗体，其由融合瘤转殖的非人类(例如：小鼠)抗体生成。本发明亦涵盖包含如本文所揭露的一或两个变异区的抗体或其抗原结合部位，其中变异区的部分序列(如架构序列)，被来自至少一个不同物种的序列取代，物种包含但不限于：人类、兔子、绵羊、狗、猫、牛、马、山羊、猪、猴、人猿、大猩猩、黑猩猩、鸭、鹅、鸡、两栖类、爬虫类以及其他动物。

「人源化抗体」乙词是代表包含至少一个人类架构及至少一个(优选为全部)来自非人类抗体的CDR，且其中存在的任何恒定区与人类抗体的恒定区(constant region)实质上同源，例如：大约85-90％、至少大约90％、至少大约95％同源。因此，人源化抗体的所有部分(其中CDR可能为例外)为与一或多个人类抗体序列的对应部分实质上同源。人源化抗体可藉以下方式生成：以源自人类变异区的等效序列取代未直接参与抗原结合的部位(例如：架构)的变异区序列。取得人源化抗体的技术对于本领域技术人员而言为公知的技术手段，所述技术被描述于以下文献，特别是美国专利第5,225,539号；美国专利第6,548,640号；以及美国专利第6,982,321号。上述技术于所述领域中为习知，包含分离、操作及表现一核酸序列，所述序列编码来自至少一个重链或轻链的全部或部分变异区。举例而言，若取得非人类(例如：小鼠)抗体，则可定序其变异区，且可定义其CDR及架构残基的位置(参照：Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication NO：91-3242。Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.,196:901-917)。选择性地，编码所述轻链及重链变异区的DNA可黏合(ligated)至对应恒定区并接着次选殖(subclone)至适当的表现载体(expression vector)。CDR接枝抗体(CDR-grafted antibody)分子可藉CDR接枝或CDR取代生成。免疫球蛋白链的一、二或全部的CDR可被取代。举例而言，特定抗体的全部CDR可来自至少一部分非人类动物(例如：如表1所呈现的CDR的小鼠)或仅部分CDR可被取代。仅需留存用以结合抗体至预定的醣类抗原(例如Globo H)所需的CDR(参照：Morrison,S.L.,1985,Science,229:1202-1207。Oi等人,1986,BioTechniques,4:214.美国专利第5,585,089号；第5,225,539号；第5,693,761号及第5,693,762号。欧洲专利第519596号。Jones等人,1986,Nature,321:552-525。Verhoeyan等人,1988,Science,239:1534。Beidler等人,1988,J.Immunol.,141:4053-4060。)。

嵌合抗体为其中不同部位自不同动物物种衍生的分子。举例而言，嵌合抗体可包含自小鼠mAb衍生的变异区及人类免疫球蛋白恒定区。人类恒定区DNA序列可根据习知流程自各种人类细胞分离(参照：Kabat等人,1991；及WO 87/02671)。嵌合抗体可藉DNA重组技术生成(参照Morrison,等人,Proc Natl Acad Sci,81:6851-6855(1984))。举例而言，编码小鼠(或其他物种)抗体分子的基因被限制酶(restriction enzymes)分解以移除编码小鼠Fc的区域，并接着将编码人类Fc恒定区编码的基因的等效部分取代进重组的DNA分子。嵌合抗体亦可由DNA重组技术生成，其中编码小鼠V区的DNA可被黏合至编码人类恒定区的DNA(参照：Better等人,Science,1988,240:1041-1043。Liu等人PNAS,1987 84:3439-3443。Liu等人,J.Immunol.,1987,139:3521-3526。Sun等人PNAS,1987,84:214-218。Nishimura等人,Canc.Res.,1987,47:999-1005。Wood等人Nature,1985,314:446-449。Shaw等人,J.Natl.Cancer Inst.,1988,80:1553-1559。国际专利第WO1987002671号及第WO 86/01533号.欧洲专利申请案：184,187；171,496；125,023；及173,494。美国专利第4,816,567号)。

本发明涵盖所有同型抗体，包含IgG(例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE(本发明涵盖所有分类及子类)。抗体或其抗原结合部位可为哺乳动物(例如：老鼠、人类)抗体或其抗原结合部位。抗体的轻链可为κ(kappa)或λ(lambda)型。

本文中「野生型抗体」乙词及「未修饰抗体」乙词可交替使用，且是指包含无本发明揭露的一或多个胺基酸取代的胺基酸序列的抗体。

「取代」乙词可指以另一胺基酸取代未修饰或野生型胺基酸序列中特定部位的胺基酸。举例而言，取代S28K是代表在位置28(使用卡贝特编号系统(Kabat numberingsystem))的丝胺酸被离胺酸取代。

特定胺基酸被取代、删除或加入的抗体或其抗原结合部位亦涵盖于本发明的范围内。在一例示性实施例，上述修改(即保留性取代(conservative substitution)、保留性删除(conservative deletion)或保留性加入(conservative addition))对胜肽的生物特性(如效应功能或结合亲和力)不具实质影响。为了将胺基酸修改分类为保留性或非保留性，胺基酸可被分为以下群组：疏水性、中性、酸性、碱性(详见表2)。保留性取代涉及同一群组中胺基酸间的取代。非保留性取代即以此些群组中的一群组的胺基酸置换另一群组的胺基酸。Ng等人(参照Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on ProteinFunction,Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2006.7:61–80)提供各种胺基酸取代(AAS)预测方法的概述，以供本领域的技术人员在不改变蛋白质功能的前提下进行胺基酸的预测及选用。

在另一例示性实施例中，抗体可具CDR中的胺基酸取代藉以例如：提升抗体对抗原的结合亲和力。在又一例示性实施例中，选定且少数的受体(acceptor)架构残基可被其对应供体(donor)胺基酸取代。供体架构可为成熟或生殖细胞人类抗体架构序列或共有序列。关于如何进行表型沉默胺基酸取代的教学可参照Bowie等人,Science,247:1306-1310(1990)。Cunningham等人,Science,244:1081-1085(1989)。Ausubel(ed.),CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)。T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。Gonnet等人,Science 256:1443-45(1992)。

根据本发明中的一态样，本文中所述的胺基酸取代发生的位置对应于卡贝特编号表(例如：Kabat等人,Sequences of Immunological Interest。第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。

本发明揭露的抗体或其抗原结合片段、其变异体或其衍生物亦可就其对抗原的结合亲和力进行描述或特定。本文中「亲和性」乙词是指分子(例如：抗体)的单一结合位置及其结合对象(例如：肿瘤相关醣类)之间的所有非共价作用的总和强度。除非另有表示，否则「结合亲和力」乙词用本文中时是指反映结合对的对象(例如：抗体及抗原)之间1:1的相互作用的固有结合亲和力。分子X与其结合对象Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可藉所述领域习知的常用方法测量，其包含本文中所述的方法。抗体对醣类抗原的亲和力可用任何适合的方法(例如：Berzofsky等人.,“Antibody-Antigen Interactions,”InFundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992))或酵素免疫分析法(ELISA)实验确定。

本发明所述的抗体及其抗原结合部位可透过以编码所需抗体的轻链及重链(或其部分)的DNA转型至宿主细胞而生成。抗体可藉标准技术由此些培养物上清液及/或细胞分离并纯化。举例而言，可将编码抗体的轻链、重链或其两者的DNA转型至宿主细胞。DNA重组技术亦可用于移除结合中非必要的编码轻链及重链中的任一个或其两者的DNA(例如：恒定区)的部分或全部。DNA可表现于各种适合的细胞中，包含原核及真核细胞，例如：细菌细胞(例如：大肠杆菌)、酵母菌、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞。若干哺乳动物细胞株于本领域中为公知且包含可购于美国菌种中心(American Type Culture Collection，ATCC)的永生化细胞株(immortalized cell lines)。细胞的非限制实例包含所有哺乳动物来源或类哺乳动物特性的细胞株，其包含但不限于猴肾脏细胞的未修饰细胞、衍生细胞及/或经改造的变异体(COS，例如：COS-1、COS-7)、HEK293、幼仓鼠肾脏细胞(BHK，例如：BHK21)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NS0、PerC6、BSC-1、人类肝癌细胞(例如：Hep G2)、SP2/0、HeLa、马-达氏牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)、骨髓瘤(myeloma)细胞及淋巴瘤细胞。经改造的变异体包含：例如：醣链分布修饰(glycan profile modified)及/或位点-特异性整合位点衍生物(site-specific integration site derivatives)。

本文所述的所有数量皆为约略值且可以「大约」修饰。

未修饰抗体

本发明提供不含本文所揭露的至少一个胺基酸取代的抗体或其抗原结合部位(未修饰抗体或野生型抗体)。

在本发明的一态样中，未修饰抗体或其抗原结合部位包含重链变异区，其中所述重链变异区包含三个CDR(CDR1、CDR2以及CDR3)，其分别具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列。

在部分实施例中，未修饰抗体或其抗原结合部位的重链变异区还包含至少一个选自以下的架构：(i)于前导序列及重链的CDR1之间的架构，其具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：4同源的胺基酸序列；(ii)于重链的CDR1及CDR2之间的架构，其具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：5同源的胺基酸序列；(iii)于重链的CDR2及CDR3之间的架构，其具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：6同源的胺基酸序列。

在另一实施例中，重链变异区的架构2(SEQ ID NO：5)中的胺基酸残基46(或由架构2的C端算起第6个胺基酸残基)为甘胺酸且未经取代。SEQ ID NO：5的胺基酸残基位置呈现如下：

胺基酸残基	W*	I	R	Q	P	S	G	K	G	L	E	W	L	A**
															位置编号	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48	49	50	51

*架构2的胺基酸残基38(W)为与CDR1相邻的残基或由架构2的N端起算的第1个胺基酸残基。

**架构2的胺基酸残基51(A)为与CDR2相邻的残基或由架构2的C端起算的第1个胺基酸残基。

在本发明的另一态样中，未修饰抗体或其抗原结合部位包含轻链变异区，其中轻链变异区包含三个CDR(CDR1、CDR2以及CDR3)，其分别具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：7、8以及9中所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列。

在部分实施例中，未修饰抗体或其抗原结合部位的轻链变异区还包含至少一个选自以下的架构：(a)于前导序列及轻链的CDR1之间的架构，其具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：10同源的胺基酸序列；(b)于轻链的CDR1及CDR2之间的架构，其具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：11同源的胺基酸序列；(c)于轻链的CDR2及CDR3之间的架构，其具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：12同源的胺基酸序列。

在其他实施例中，在胺基酸残基45及/或胺基酸残基46未被取代的前提下，轻链的架构2(SEQ ID NO：11)中的胺基酸残基45(或由架构2的C端算起第4个胺基酸残基)为脯胺酸及/或轻链的架构2中的胺基酸残基46(或由架构2的C端算起第3个胺基酸残基)为色胺酸。SEQ ID NO：11的胺基酸的位置呈现如下：

胺基酸残基	W^*	Y	Q	Q	K	P	G	S	S	P	K	P	W	I	Y^**
																位置编号	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48

*在架构2的位置34的胺基酸(W)为与CDR1相邻的残基或由架构2的N端起算的第1个胺基酸残基。

**在架构2的位置48的胺基酸(Y)为与CDR2相邻的残基或由架构2的C端起算的第1个胺基酸残基。

本发明所述的未修饰抗体亦包含与肿瘤醣类或其片段结合的人源化抗体。在一实施例中，人源化抗体包含具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：13同源的胺基酸序列的重链变异区；及/或轻链变异区包含具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：14同源的胺基酸序列的轻链。

本发明所述的未修饰抗体亦包含与肿瘤醣类或其片段结合的嵌合抗体。在一实施例中，所述嵌合抗体包含具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：57同源的胺基酸序列的重链变异区；及/或轻链变异区包含具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：58同源的胺基酸序列的轻链。

在部分实施例中，未修饰抗体或其抗原结合部位是由命名为2C2的融合瘤(寄存于ATCC Accession NO：:PTA-121138)所得的非人类抗体生成。见PCT/US15/25305，其全部内容于此并入本文中作为参考。

表1是呈现未修饰抗体及经修饰抗体的一例示性实施例的重链变异区、轻链变异区、CDR以及FW的胺基酸序列。

表1

经修饰抗体

根据其于本领域的描述及教导，可以设想在部分实施例中，相较于野生型对应抗体，本发明所述的经修饰抗体可包含一或多种修改(例如：于一或多个CDR中)。经修饰抗体相较于其未修饰野生型对应抗体将留存与用于治疗的应用所需的特性实质上相同的特性。然而认为相较于自其生成经修饰抗体的未修饰野生型抗体，于本文所述的一些胺基酸残基中的位置的修改将生成对肿瘤相关醣类具有提升或最佳化结合亲和力的经修饰抗体。在一实施例中，本发明所述的经修饰抗体为「亲和性成熟」抗体。

修改的一个类型包含取代野生型/未修饰抗体的CDR的一或多个胺基酸残基以生成经修饰抗体。此种经修饰抗体可利用以噬菌体呈现为基础的亲和力增进技术(phagedisplay-based affinity maturation techniques)而便利的生成。简言的，将数个高变区位(例如：6-7位)突变以在每个位置产生所有可能的胺基酸取代。因此生成的抗体于融合至包覆于每个粒子中至少一部份的噬菌体外膜蛋白(例如：M13的基因III产物)时，自花丝状噬菌体粒子(filamentous phage particles)呈现。其后，筛选所述噬菌体-呈现的变异体的生物活性(例如结合亲和力)。为确认用以修饰的候选高变区位，可执行扫描式突变(scanning mutagenesis)(例如：丙胺酸扫描)以确认对抗原结合有显着贡献的高变区残基。替代性地，或另外，其可有助于分析抗原-抗体复合物(antigen-antibody complex)的晶体结构以确认抗体及抗原间的接触位点。根据包含本文中所详述的本领域的公知技术，接触残基及相邻残基为取代的候选残基。一旦生成经修饰抗体，则利用包含本文中所详述的本领域公知的技术对变异体体群进行筛选，且在一或多个相关分析中可选定具优异特性的经修饰抗体以进行进一步的开发。

经修饰抗体亦可由描述于，例如：Mark等人,1992,(affinity maturation byvariable heavy chain(VH)and variable light chain(VL)domain shuffling)或Barbas,等人,1994；Shier等人,1995；Yelton等人,1995；Jackson等人,1995；及Hawkins等人,1992(random mutagenesis of CDR and/or framework residues)的方法生成。

在本发明的一态样中，本发明所述的经修饰抗体或其抗原结合部位包含重链变异区，其中所述重链变异区包含三个CDR(CDR1、CDR2以及CDR3)，其分别具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列；其中选自胺基酸残基28、31、57、63或105中的至少一个胺基酸残基被与存在于所述未修饰抗体中的胺基酸不同的另一胺基酸取代，进而提升未修饰抗体的结合亲和力大约5％、大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约100％、大约150％、大约200％、大约300％、大约400％、大约500％、大约600％或大约700％。

在一实施例中，经修饰抗体的重链变异区包含至少一种以下胺基酸取代：

(a)CDR1中的胺基酸残基28(丝氨酸)被碱性胺基酸、非丝氨酸的中性胺基酸或疏水性胺基酸取代；

(b)CDR1中的胺基酸残基31(苏胺酸)被碱性胺基酸取代；

(c)CDR2中的胺基酸残基57(天门冬胺酸)被中性胺基酸、碱性胺基酸或疏水性胺基酸取代；

(d)CDR2中的胺基酸残基63(脯胺酸)被中性胺基酸、碱性胺基酸或非脯氨酸的疏水性胺基酸取代；以及/或

(e)CDR3中的胺基酸残基105(天门冬胺酸)被碱性胺基酸、疏水性胺基酸或中性胺基酸取代。

二十种胺基酸根据其侧链被分成四个类别(碱性、中性、疏水性以及酸性)。表2列出四个类别的胺基酸。

表2

实施例包含在重链区具有至少一个以下胺基酸取代的经修饰抗体：(a)CDR1中的胺基酸残基28(或由CDR1的N端起算的第3个胺基酸残基)被碱性胺基酸；非丝氨酸、甘胺酸或麸酰胺酸的中性胺基酸；或非异白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸或色胺酸的疏水性胺基酸取代，(b)CDR1中的胺基酸残基31(或由CDR1的N端起算的第6个胺基酸残基)被非组胺酸的碱性胺基酸取代，(c)CDR2中的胺基酸残基57(或由CDR2的N端起算的第6个胺基酸残基)被非天门冬酰胺酸或苏胺酸的中性胺基酸；碱性胺基酸或非异白胺酸、脯胺酸或缬胺酸的疏水性胺基酸取代，(d)CDR2中的胺基酸残基63(或由CDR2的C端起算的第5个胺基酸残基)被非天门冬酰胺酸、麸酰胺酸或苏胺酸的中性胺基酸；碱性胺基酸或非脯氨酸或甲硫胺酸的疏水性胺基酸取代或，(e)CDR3中的胺基酸残基105(或由CDR3的N端起算的第6个胺基酸残基)被碱性胺基酸、中性胺基酸或非白胺酸的疏水性胺基酸取代。

表3提供经修饰抗体的重链变异区的胺基酸取代的实例。对于各取代而言，其第一字母表示未修饰抗体的胺基酸，其数字代表其根据卡贝特编号表的位置，且其第二字母代表经修饰抗体的胺基酸。例如：在胺基酸残基28的丝胺酸被离胺酸(S028K)、精胺酸(S028R)、酪胺酸(S028Y)或苯丙胺酸(S028F)取代，在胺基酸残基31的苏胺酸被离胺酸(T031K)或精胺酸(T031R)取代，在胺基酸残基57的天门冬胺酸被甘胺酸(D057G)、丝胺酸(D057S)、麸酰胺酸(D057Q)、组胺酸(D057H)或色胺酸(D057W)取代，在胺基酸残基63的脯胺酸被组胺酸(P063H)、精胺酸(P063R)、酪胺酸(P063Y)、丙胺酸(P063A)、白胺酸(P063L)或缬胺酸(P063V)取代，在胺基酸残基105的天门冬胺酸被精胺酸(D105R)、甘胺酸(D105G)、苏胺酸(D105T)、甲硫胺酸(D105M)、丙胺酸(D105A)、异白胺酸(D105I)、离胺酸(D105K)或缬胺酸(D105V)取代。表3

在本发明的另一态样中，本发明所述的经修饰抗体或其抗原结合部位包含轻链变异区，其中轻链变异区包含三个CDR(CDR1、CDR2以及CDR3)，其分别具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：7、8以及9所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列；其中选自胺基酸残基24、32、49、53或93中的至少一个的胺基酸残基被与存在于未修饰抗体中的胺基酸不同的另一胺基酸取代，进而提升未修饰抗体的结合亲和力大约5％、大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约100％、大约150％、大约200％、大约300％、大约400％、大约500％、大约600％或大约700％。

在一实施例中，经修饰抗体的轻链变异区包含至少一种以下胺基酸取代：

(a)CDR1中的胺基酸残基24(精胺酸)(或由CDR1的N端起算的第1个胺基酸残基)被中性胺基酸或疏水性胺基酸取代，

(b)CDR1中的胺基酸残基32(甲硫胺酸)(或由CDR1的C端起算的第2个胺基酸残基)被中性胺基酸或非甲硫胺酸的疏水性胺基酸取代，

(c)CDR2中的胺基酸残基49(丙胺酸)(或由CDR2的N端起算的第1个胺基酸残基)被中性胺基酸取代，

(d)CDR2中的胺基酸残基53(白胺酸)(或由CDR2的N端起算的第5个胺基酸残基)被中性胺基酸或碱性胺基酸取代，或

(e)CDR3中的胺基酸残基93(天门冬酰胺酸)(或由CDR3的N端起算的第6个胺基酸残基)被非天门冬酰胺酸的中性胺基酸、碱性胺基酸或疏水性胺基酸取代。

实施例包含在轻链区具有至少一个以下胺基酸取代的经修饰抗体的：(a)CDR1中的胺基酸残基24被非苏胺酸的中性胺基酸或非甲硫胺酸、脯胺酸或缬胺酸的疏水性胺基酸取代，(b)CDR1中的胺基酸残基32被非丝胺酸或苏胺酸的中性胺基酸或非甲硫胺酸、白胺酸或色胺酸的疏水性胺基酸取代，(c)CDR2中的胺基酸残基49被非天门冬酰胺酸或苏胺酸的中性胺基酸取代，(d)CDR2中的胺基酸残基53被非天门冬酰胺酸或丝胺酸的中性胺基酸或非精胺酸的碱性胺基酸取代，或(e)CDR3中的胺基酸残基93被非天门冬酰胺酸的中性胺基酸；碱性胺基酸或非缬胺酸的疏水性胺基酸取代。

表4提供经修饰抗体的轻链变异区的所述胺基酸取代的实例。举例而言，使用卡贝特编号表，在位置24的胺基酸残基被甘胺酸(R024G)、丝胺酸(R024S)或色胺酸(R024W)取代，在位置32的胺基酸残基被甘胺酸(M032G)、麸酰胺酸(M032Q)或缬胺酸(M032V)取代，在位置49的胺基酸残基被甘胺酸(A049G)取代，在位置53的胺基酸残基被离胺酸(L053K)、甘胺酸(L053G)或苏胺酸(L053T)取代，在位置93的胺基酸残基被精胺酸(N093R)、麸酰胺酸(N093Q)、丝胺酸(N093S)、苏胺酸(N093T)、苯丙胺酸(N0936F)、白胺酸(N093L)或甲硫胺酸(N093M)取代。

表4

在一实施例中，经修饰抗体包含：

(a)重链变异区，其包含三个CDR(CDR1、CDR2以及CDR3)，其分别具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列，且包含至少一个的以下胺基酸取代：

(i)CDR1中的胺基酸残基28被离胺酸(S028K)、精胺酸(S028R)、酪胺酸(S028Y)或苯丙胺酸(S028F)取代，

(ii)CDR1中的胺基酸残基31被离胺酸(T031K)或精胺酸(T031R)取代，

(iii)CDR2中的胺基酸残基57被组胺酸(D057H)、甘胺酸(D057G)、丝胺酸(D057S)、麸酰胺酸(D057Q)或色胺酸(D057W)取代，

(iv)CDR2中的胺基酸残基63被组胺酸(P063H)、精胺酸(P063R)、酪胺酸(P063Y)、丙胺酸(P063A)、白胺酸(P063L)或缬胺酸(P063V)取代，

(v)CDR3中的胺基酸残基105被精胺酸(D105R)、甘胺酸(D105G)、苏胺酸(D105T)、甲硫胺酸(D105M)、丙胺酸(D105A)、异白胺酸(D105I)、离胺酸(D105K)或缬胺酸(D105V)取代，以及/或

(b)轻链变异区，其包含三个CDR(CDR1、CDR2以及CDR3)，其分别具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：7、8以及9所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列且包含至少一个以下胺基酸取代：

(i)CDR1中的胺基酸残基24被甘胺酸(R024G)、丝胺酸(R024S)或色胺酸(R024W)取代，

(ii)CDR1中的胺基酸残基32被甘胺酸(M032G)、麸酰胺酸(M032Q)或缬胺酸(M032V)取代，

(iii)CDR2中的胺基酸残基49被甘胺酸(A049G)取代，

(iv)CDR2中的胺基酸残基53被离胺酸(L053K)、甘胺酸(L053G)或苏胺酸(L053T)取代，

(v)CDR3中的胺基酸残基93被精胺酸(N093R)、麸酰胺酸(N093Q)、丝胺酸(N093S)、苏胺酸(N093T)、苯丙胺酸(N093F)、白胺酸(N093L)或甲硫胺酸(N093M)。

在另一实施例中，经修饰抗体包含：

(a)重链变异区，其包含三个CDR(CDR1、CDR2以及CDR3)，其分别具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列且包含至少一个以下胺基酸取代：

(i)CDR1中的胺基酸残基28被精胺酸(S028R)取代，

(ii)CDR1中的胺基酸残基31被精胺酸(T031R)取代，

(iii)CDR2中的胺基酸残基57被甘胺酸(D057G)取代

(iv)CDR2中的胺基酸残基63被酪胺酸(P063Y)取代，

(v)CDR3中的胺基酸残基105被精胺酸取代(D105R)取代，以及/或

(i)CDR1中的胺基酸残基24被色胺酸(R024W)取代，

(ii)CDR1中的胺基酸残基32被麸酰胺酸(M032Q)取代，

(iii)CDR2中的胺基酸残基49被甘胺酸(A049G)取代，

(iv)CDR2中的胺基酸残基53被离胺酸取代(L053K)，

(v)CDR3中的胺基酸残基93被精胺酸取代(N093R)。

在又一实施例中，本发明提供经修饰抗体或其抗原结合部位，其包含：

(a)重链及轻链，其中重链具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与选自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39的胺基酸序列同源的胺基酸序列，以及/或

(b)轻链，其中轻链具有大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或大约100％与选自SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56同源的胺基酸序列。

在另一实施例中，本文所述的经修饰抗体或其抗原结合部位的变异区不包含图5所列的胺基酸取代。

各种与肿瘤相关醣类抗原中的任一种，特别是Globo H，可被用于实施本发明。肿瘤相关醣类抗原的例子包含但不限于：Globo抗原(如Globo H、阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3，亦称为Gb5)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、Gb4及Gb3)、路易士抗原(如sLe^x、Le^x、sLe^a、Le^a及Le^y)、黏蛋白多醣体(mucin glycans)(如sTn、Tn及Thomsen-Friedenreich抗原)、神经节苷脂(如GD1a、GT1b、A2B5、GD2、GD3、岩藻醣基(Fucosyl)GM1、GM1、GM2、GM、Neu5GcGM3及聚唾液酸(polysialic acid，PSA))、硫脂抗原(sulfitide antigen)(如6Gal-HSO₃-SiaLex及6GluNAc-HSO₃-SiaLex)。其他醣类抗原包含但不限于：α-半乳糖(α-Galactose)、α-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(α-Man-6-phosphate)、α-L-鼠李醣(α-L-Rhamnose)、α-GalNAc(Tn)、α-NeuAc-OCH₂C₆H₄-p-NHCOOCH₂、Fucα1-2Galβ1-4GalNAcβ(H类型3)、NeuAcα2-8NeuAcα、(NeuAcα2-8)2聚唾液酸、NeuAca2-6Galb、NeuAcb2-6Gala(STn)、Gala1-3Galb1-4GlaNAcb(NeuAca2-8)3、GalNAcαa-3(Fucα1-2)Galβ(血液群组A)、Galα1-3(Fucα1-2)Galβ(血液群组B)、6Gal-HSO₃-SiaLex、6GluNAc-HSO₃-SiaLex及α2-6唾液酸二天线型N-聚糖(α2-6sialylated diantennary N-glycans)。

本文所述的抗体或其抗原结合部位具体内(in vitro)及体外(in vivo)治疗、预防以及/或诊断功用。举例而言，抗体可被施予于培养的细胞(例如：体外或离体(ex vivo))或个体(例如：体内)，以治疗、抑制、预防复发以及/或诊断如癌症的疾病。

抗体或其抗原结合部位可被用于培养的细胞(例如：体外或离体)。举例而言，细胞可被体外培养于培养基中并与抗体或其抗原结合部位接触。方法可作为体内(例如：治疗或预防)方案的一部分于存在于个体内的细胞上执行。就体内实施例而言，在容许抗体或其抗原结合部位与在个体内的一或多个癌细胞上(例如：在乳癌细胞内)表现的肿瘤相关醣类抗原(例如：Globo H)结合的有效条件下，接触步骤是于个体实施且包含施予抗体或其抗原结合部位给个体。

抑制癌细胞的方法

本发明所述的抗体及其抗原结合部位可用于调节、降低、拮抗、减轻、缓解、阻断、抑制、免除、及/或干扰在体外、原位(in situ)以及/或体内的至少一肿瘤相关醣类抗原或其片段。

本发明亦提供抑制细胞于体外、离体或体内生长的方法，其中细胞(如癌细胞)与有效量的本文所述的抗体或其抗原结合部位接触。如过度增生细胞或组织的病理细胞(pathological cells)或组织可透过将所述细胞或组织与有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合部分接触来进行治疗。细胞(如癌细胞)可为原发性(primary)癌细胞或可为由如美国菌种中心(ATCC)的组织银行购得的培养细胞。病理细胞可为表现Globo H的癌症、神经胶瘤(gliomas)、脑脊髓膜瘤(meningioma)、脑下垂体瘤(pituitary adenomas)或全身性癌症(sysyrmic cancer)的中枢神经系统(CNS)转移、肺癌(lung cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、乳癌(breast cancer)、造血癌(hematopoietic cancer)或卵巢癌(ovarian cancer)的细胞。细胞可取自脊椎动物，优选情形为取自哺乳动物，更优选情形为人类(参照：美国专利第2004/0087651号。Balassiano等人(2002)Intern.J.Mol.Med.10:785-788。Thorne,等人(2004)Neuroscience 127:481-496。Fernandes,等人(2005)Oncology Reports 13:943-947。Da Fonseca,等人(2008)Surgical Neurology 70:259267。Da Fonseca,等人(2008)Arch.Immunol.Ther.Exp.56:267-276。Hashizume,等人(2008)Neuroncology 10:112-120)。在一实施例中，癌症为表现Globo H的癌症。在另一实施例中，癌症为表现SSEA-3的癌症。在又一实施例，癌症为表现SSEA-4的癌症。表现Globo H的癌症、表现SSEA-3的癌症以及表现SSEA-4的癌症包含肉瘤(sarcoma)、皮肤癌(skincancer)、白血病(leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、脑癌(brain cancer)、神经胶母细胞瘤(glioblastoma)、肺癌(lung cancer)、乳癌、口腔癌(oral cancer)、头颈部癌(head-and-neck cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、食道癌(esophageal cancer)、胃癌(stomach cancer)、肝癌(liver cancer)、胆道癌(bile duct cancer)、胆囊癌(gallbladder cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、胰脏癌(pancreatic cancer)、肠癌(intestinal cancer)、大肠癌(colorectal cancer)、肾脏癌(kidney cancer)、子宫颈癌(cervix cancer)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、卵巢癌、睪丸癌(testicularcancer)、颊癌(buccal cancer)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、喉癌(laryngealcancer)以及前列腺癌中的一或多种。在一态样中，所述方法包含分析选自由一或多种以下的样本：乳房、卵巢、肺脏、胰脏、胃、大肠、前列腺、肝脏、子宫颈、食道、脑、口腔以及/或肾脏癌。

本发明所述的抗体或其抗原结合部位的体外效用可藉本领域公知的方法进行检测。细胞存活率分析(MTT assay)是以代谢活性细胞的MTT(四唑(tetrazolium)盐类)摄取原理为基础，其中MTT被代谢成为可透过光谱法读取的蓝色甲(formazan)产物(参照：J.of Immunological Methods 65:55 63,1983.)。本发明所述的抗体或其抗原结合部位的细胞毒性可藉群落形成分析(Colony Formation Assay)进行探讨。结合Globo H抗原的功能性分析可藉酵素免疫分析法(ELISA)进行。藉抗体或其抗原结合部位阻断的细胞周期(cell cycle)可藉标准碘化丙啶(PI)染色及流式细胞仪进行探讨。侵入抑制可藉博登量测器(Boyden chambers)进行探讨。分析中重组基底膜Matrigel层被涂覆至趋向性过滤器(chemotaxis filters)上，并作为在博登量测器中细胞迁移的障壁。仅具侵入能力的细胞可越过Matrigel障壁。其余分析包含但不限于：细胞存活率分析、细胞自体凋亡分析(apoptosis assay)以及型态学分析(morphological assays)。分析亦可利用小鼠模型于体内完成(参照例如：B.Teicher,Tumor Models for Efficacy Determination.MolCancer Ther 2006；5:2435-2443)。

医药组成物

在部分实施例中，本发明提供包含本文中所述的抗体或其抗原结合部位以及药学上可接受的载体的医药组成物。药学上可接受的载体包含生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、等张剂及吸收延迟剂等。在一实施例中，所述医药组成物可有效抑制个体内的癌细胞。

施予本发明的医药组成物的途径包含但不限于：静脉注射(intravenous)、肌内注射(intramuscular)、鼻内(intranasal)、皮下(subcutaneous)、口服(oral)、局部(topical)、皮下、皮内(intradermal)、透皮(transdermal)、表皮下(subdermal)、注射(parenteral)、直肠(rectal)、脊髓(spinal)或表皮(epidermal)施予。

本发明所述的医药组成物可被制备成注射剂，其可为液体溶液或悬浮液，或适于在注射前可溶或悬浮于液体载体内的固体型态。医药组成物亦可被制备为固体型态、乳液或包覆在脂质体载体或其他用以持续递送(sustained delivery)的颗粒载体内的活性成分。举例而言，医药组成物可为能使所述医药组成物持续释出的以下型态：油乳液(oilemulsion)、油包水乳液(water-in-oil emulsion)、水包油包水乳(water-in-oil-in-water emulsion)、位置特异性乳液(site-specific emulsion)、长滞留乳液(long-residence emulsion)、黏性乳液(sticky emulsion)、微乳液(micro emulsion)、奈米乳液(nano emulsion)、脂质体(liposome)、微粒(microparticle)、微球(microsphere)、奈米小球(nanosphere)、奈米粒子(nanoparticle)、以及各种天然或人造的聚合物，如不可吸收的不透水聚合物(nonresorbable impermeable polymers)，如乙烯/醋酸乙烯酯共聚物(ethylenevinyl acetate copolymers)以及共聚物、可膨胀的共聚物，如水胶(hydrogels)、或可吸收聚合物，如胶原蛋白以及特定的多元酸(polyacids)或聚酯(polyesters)，如可被用以制造可吸收结构者。

用于体内施予的医药组成物自然必须为已灭菌的；灭菌可由公知技术完成(例如：经由灭菌过滤膜进行过滤)。其可用于增加抗体的浓度以达到俗称的高浓度液体组成(highconcentration liquid formulation，HCLF)；各种制造HCLF的方法皆已有记述。

医药组成物为单独施予，以及/或与另一治疗剂混合施予，另一治疗剂可为例如：二级单株抗体或多株抗体或其抗原结合部位或抗癌剂(如DNA损毁或微管蛋白结合(tubulin binding)剂)或可抑制血管新生(angiogenesis)、讯号传导途径(signaltransduction pathway)或有丝分裂检查点(mitotic checkpoint)的试剂。组成产物可为两种成分的混合物或两种成分可共价连接。在一例子中，与特异性地结合Globo H的抗体或其抗原结合部位与特异性地结合VEGF的抗体(单株抗体或多株抗体)或其抗原结合部位组合。在另一例子中，第二种试剂为化疗剂(例如：环磷酸酰胺(cyclophosphamide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)或放线菌素D(Actinomycin-D))。抗体亦可以与癌症疫苗组合施予，例如：与白喉毒素(Diphtheria Toxin)及皂素(saponin)佐剂复合的Globo H。添加的治疗剂亦可与本发明所述的抗体同时施予(选择性地作为同一药物制剂中的成分)或于本发明所述的抗体施予前或施予后进行施予。制备此种药剂型态的实际方法对领域中具通常知识者而言为习知或其会于未来进行改良。(参照例如：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,21st edition)。

医药组成物可依个体的年龄、体重及病症、所施用的特定组成物、施予途径、本医药组成物是否是用于预防或治疗的目的等因素，按日程以单一剂量治疗方案或多剂量治疗方案施予一定期间。例如，在一实施例中，本发明所述的医药组成物于以下频率施予：一个月一次、一个月两次、一个月三次、隔周(qow)、一周一次(qw)、一周两次(biw)、一周三次(tiw)、一周四次、一周六次、隔日(qod)、每日(qd)、一日两次(qid)或一日三次(tid)。

本发明所述的抗体的施予期间(例如：医药组成物被施予的时间周期期间)可依各种参数调整或改变(例如：个体反应等)。举例而言，医药组成物可于以下范围的时间周期期间被施予：一或数秒至一或数小时、一天至大约一周、从大约两周至大约四周、从大约一个月至大约两个月、从大约两个月至大约四个月、从大约四个月至大约六个月、从大约六个月至大约八个月、从大约八个月至大约一年、从大约一年至大约两年、从大约两年至大约四年或更多。

为使施予上的方便及剂量的一致性，可使用单位剂型的口服或注射型医药组成物。本文中所使用的单位剂型指对大治疗的个体而言适于作为单位剂量的物理性离散单位；每单位包含与所需的药物载体结合的预定量的活性化合物，其中预定量为被计算出可产生所需治疗效果的量。

由细胞培养分析及动物实验所取得的数据可用于配制用于人体的剂量范围。在一实施例中，此种化合物的剂量介于循环浓度范围内，其包含微小的毒性或无毒性的ED₅₀。在所述范围内，剂量可依剂型及施予方式进行调整。在另一实施例中，治疗有效剂量可藉细胞实验进行初步估算。剂量可配制于动物模型中以达到循环血浆浓度范围，其包含细胞培养所测定的IC₅₀(即所述受试化合物达到最大症状抑制效果的一半时的浓度)(参照：Sonderstrup,Springer,Sem.Immunopathol.25:35-45,2003.Nikula等人,Inhal.Toxicol.4(12):123-53,2000)。

例示性地，本发明所述的抗体或其抗原结合部位的治疗有效量或预防有效量并未受限制，其可为：从大约0.001至大约60mg/kg体重、从大约0.01至大约30mg/kg体重、从大约0.01至大约25mg/kg体重、从大约0.5至大约25mg/kg体重、从大约0.1至大约20mg/kg体重、从大约10至大约20mg/kg体重、从大约0.75至大约10mg/kg体重、从大约1至大约10mg/kg体重、从大约2至大约9mg/kg体重、从大约1至大约2mg/kg体重、从大约3至大约8mg/kg体重、从大约4至大约7mg/kg体重、从大约5至大约6mg/kg体重、从大约8至大约13mg/kg体重、从大约8.3至大约12.5mg/kg体重、从大约4至大约6mg/kg体重、从大约4.2至大约6.3mg/kg体重、从大约1.6至大约2.5mg/kg体重、从大约2至大约3mg/kg体重或大约10mg/kg体重。

将医药组成物配制成含有有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合部位，其中所述量是依待治疗的动物及待治疗的病症而定。在一实施例中，本发明所述的抗体或其抗原结合部位被依以下剂量范围施予：从大约0.01mg至大约10g、从大约0.1mg至大约9g、从大约1mg至大约8g、从大约2mg至大约7g、从大约3mg至大约6g、从大约10mg至大约5g、从大约20mg至大约1g、从大约50mg至大约800mg、从大约100mg至大约500mg、从大约0.01μg至大约10g、从大约0.05μg至大约1.5mg、从大约10μg至大约1mg蛋白质、从大约30μg至大约500μg、从大约40μg至大约300μg、从大约0.1μg至大约200μg、从大约0.1μg至大约5μg、从大约5μg至大约10μg、从大约10μg至大约25μg、从大约25μg至大约50μg、从大约50μg至大约100μg、从大约100μg至大约500μg、从大约500μg至大约1mg、从大约1mg至大约2mg。用于任一个特定个体的具体剂量取决于各种因素，包含特异性胜肽(specific peptide)的活性、年龄、体重、总体健康情况、性别、饮食、施予时间、施予途径及排泄速率、药物组成及进行治疗的具体疾病的严重性且本领域技术人员可在无需过度实验的下判定。

本发明所述的抗体或其抗原结合部位、医药组成物及其使用方法适于且可用于所有脊椎动物(例如：哺乳动物及非哺乳动物，包含人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、猪、猴、人猿、大猩猩、黑猩猩、兔、鸭、鹅、鸡、两栖类、爬虫类及其他动物)。

以下用于实施本发明的特定态样的实例仅用以说明，而不企图以任何形式限制本发明的范畴。

实例

例1：经修饰抗体的生成

带有包含SEQ ID NO：13的重链变异区及包含SEQ ID NO：14的轻链变异区的野生型人源化抗体，以及带有包含SEQ ID NO：57的重链变异区及包含SEQ ID NO：58的轻链变异区的野生型嵌合抗体是衍生自融合瘤2C2的非人类抗体。图1显示未修饰人源化抗体的重链变异区的胺基酸序列(图1A：112个胺基酸残基)及轻链变异区的胺基酸序列(图1B：96个胺基酸残基)。实验流程的细节请参照PCT国际专利申请(申请号：PCT/US15/25305)。

本发明所述的经修饰抗体以下列两步骤生成：(1)综合性定位演化(Comprehensive Positional Evolution)，接着(2)组合蛋白合成(CombinatorialProtein Synthesis)。

例2：嵌合抗体及人源化抗体的结合亲和力比较

透过ELISA进行得自例1的嵌合抗体及人源化抗体的结合亲和力的体外评估。图2显示嵌合抗体(重链：SEQ ID NO：57及轻链：SEQ ID NO：58)及人源化抗体(重链：SEQ IDNO：13及轻链：SEQ ID NO：14)的OD450nm。嵌合抗体(重链：SEQ ID NO：57及轻链：SEQ IDNO：58)的OD值为0.89而人源化抗体(重链：SEQ ID NO：13及轻链：SEQ ID NO：14)的OD值仅为0.34。人源化抗体的较低的OD值表示以下未修饰人源化抗体的CDR序列修饰/突变是必要的。

例3：综合性定位演化

参照图3，利用综合性定位演化技术(BioAtala，USA)，对于未修饰抗体(SEQ IDNO：1-3及7-8)的三个重链及三个轻链CDR的每个胺基酸残基至少产生10个胺基酸突变/取代。轻链CDR中的26个胺基酸残基及重链CDR中的41个胺基酸残基已被确认产生总量670个综合性定位演化突变，其中260个在轻链CDR且410个在重链CDR。

图4A至图4E显示经修饰抗体的OD₄₅₀nm，经修饰抗体于所述野生型嵌合抗体的重链变异区的残基28(图4A)、残基31(图4B)、残基57(图4C)、残基63(图4D部分)及残基105(图4E)具有单一综合性定位演化胺基酸突变取代。图5A至图5E显示经修饰抗体的O_D450nm，所述经修饰抗体于野生型嵌合抗体的轻链变异区的残基24(图5A)、残基32(图5B)、残基49(图5C)、残基53(图5D)及残基93(图5E)具有单一综合性定位演化胺基酸突变取代。

以下选择10个综合性定位演化突变来进行组合蛋白合成，选择是基于其与Globo-H神经酰胺(ceramide)的结合活性及表现筛选(screening)：重链(HC)-S028R、HC-T031R、HC-D057G、HC-P063Y、HC-D105R、轻链(LC)-R024W、LC-M032Q、LC-A049G、LC-L053K及LC-N093R。

例4：组合蛋白合成

已建立例3中选出的10个综合性定位演化突变的组合蛋白合成库，其包含10个选出的综合性定位演化突变的所有组合(总量为930个组合蛋白合成突变)。

930个组合蛋白合成突变被转染(transfected)至96孔盘型式中的CHO-S细胞，其于37℃下在掺入10％血清的DMEM内培养，并表现为完整长度的IgG1分子。上清液于转染后48小时收集。上清液中IgG的浓度藉ELISA测定以定量人类IgGs。在细胞培养上清液的IgG藉抗人类IgG Fc抗体(anti-human-IgG Fc antibody)捕捉于盘上。结合的IgG藉与HRP复合的抗人类IgG(Promega，USA)进行侦测。IgG的浓度以市面上可购得的人类IgG作为标准品来计算。上清液被调整至50ng/mL并藉ELISA亲和性分析方法(affinity ELISA protocol)测试其与Globo-H神经酰胺的结合。未修饰嵌合抗体于ELISA盘中做为控制组使用。反应在TMB加入孔盘后藉加入1N的盐酸(HCl)停止，并立刻读取读值。反应的OD₄₅₀nm值藉SpectraMaxPlus(Molecular Devices、USA)测量。

图6显示669个组合蛋白合成突变，其相较于未修饰嵌合抗体(重链：SEQ ID NO：57及轻链：SEQ ID NO：58)具有较高的OD₄₅₀nm值。较高的OD值代表与Globo H的结合亲和力较强。

图7显示自融合瘤VK9(源自纪念史隆·凯特琳癌症研究中心，MSKCC)取得的嵌合抗体、自融合瘤2C2衍生嵌合抗体(重链的胺基酸为SEQ ID NO：57且轻链的胺基酸为SEQ IDNO：58)及例示性实施例的经修饰抗体(人类R28mAbs，其中重链的胺基酸为SEQ ID NO：59且轻链的胺基酸为SEQ ID NO：60)的解离常数(Kd)。其显示自融合瘤2C2衍生的嵌合抗体(8.60E-07)及人源化R28mAb(5.04E-07)相对于VK9(1.21E-05)抗体具有较佳的结合亲和力。

例5：抗Globo H抗体的体内抗癌评估

对体重27g的人类乳癌(MCF7)异种移植的裸鼠注射5mg/kg剂量的以下项：自融合瘤2C2衍生的嵌合抗体(SEQ ID NO：57及58)、融合瘤2C2的人源化抗体(SEQ ID NO：13及14)或人源化R28抗体(SEQ ID NO：59及60)。小鼠以18天为周期进行肿瘤体积的观察，并将结果记录并整理于图8。肿瘤体积由以下公式计算：(长度×宽度)²/2。如图8所示，自第8天起，经修饰抗体(融合瘤2C2、人源化2C2及人源化R28)的肿瘤体积相较于控制组(仅载体)(P<0.05)有显着的减少。

虽然描述并说明本发明的具体态样，此种态样应被认为仅用于说明本发明，而不限制本发明，本发明是根据所附的权利要求解释。如具体且个别地指出其全部内容透过参照整合于本文中的各出版物及专利申请案般地，本说明书中引用的所有出版物及专利申请案的全部内容透过参照整合于本文中。尽管为了清楚地理解本发明，上述发明已以说明及例示的方式揭露部分细节，然而鉴于本发明的教示，本领域技术人员对于不背离所附权利要求的精神及范畴下对于本发明进行的部分改变及修饰改为显而易见的。

序列表

<110> 台湾浩鼎生技股份有限公司

<120> 新颖醣类抗体、医药组成物及其用途

<130> OBI-15003-USP1, OBI-15003-TWI

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化重链框架1

<400> 4

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser

20 25

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化重链框架2

<400> 5

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化重链框架3

<400> 6

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr

1 5 10 15

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 7

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 8

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 9

Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 10

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化轻链框架1

<400> 10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化轻链框架2

<400> 11

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 12

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化轻链框架3

<400> 12

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长人源化重链

<400> 13

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe

20 25 30

Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

<210> 14

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长人源化轻链

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

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<213> 人工序列

<220>

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P063V

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Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D105A

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D105I

<400> 38

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100 105 110

<210> 39

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D105V

<400> 39

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe

20 25 30

Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

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Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> R024G

<400> 40

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

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<210> 41

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> R024S

<400> 41

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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<210> 42

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> R024W

<400> 42

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

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<210> 43

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> M032G

<400> 43

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Gly

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

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65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 44

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> M032Q

<400> 44

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Gln

20 25 30

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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 45

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> M032V

<400> 45

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 46

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A049G

<400> 46

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 47

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L053K

<400> 47

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Lys Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 48

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L053G

<400> 48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Gly Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 49

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L053T

<400> 49

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Thr Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 50

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N093R

<400> 50

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Arg Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 51

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N093Q

<400> 51

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Gln Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 52

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N093S

<400> 52

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Ser Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 53

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N093T

<400> 53

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Thr Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 54

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N093F

<400> 54

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Phe Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 55

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N093L

<400> 55

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Leu Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 56

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N093M

<400> 56

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Met Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 57

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体的重链可变区

<400> 57

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe

20 25 30

Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Pro Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

<210> 58

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体的轻链可变区

<400> 58

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Thr Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

85 90 95

<210> 59

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体 R28的重链可变区

<400> 59

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe

20 25 30

Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Arg Gly Leu His Arg Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 60

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体R28 (HC08)的轻链可变区

<400> 60

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Lys Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Arg Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种抗体或其抗原结合部位，其特征在于，其与醣类抗原结合且包含：重链变异区，其中所述重链变异区包含三个互补性决定区(CDRs)：CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％至100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列；

其中所述抗体或其抗原结合部位包含至少一个以下胺基酸取代：

(a)CDR1中的胺基酸残基28被碱性胺基酸、非丝氨酸的中性胺基酸或疏水性胺基酸取代；

(b)CDR1中的胺基酸残基31被碱性胺基酸取代；

(c)CDR2中的胺基酸残基57被中性胺基酸、碱性胺基酸或疏水性胺基酸取代；

(d)CDR2中的胺基酸残基63被中性胺基酸、碱性胺基酸或非脯氨酸的疏水性胺基酸取代；以及/或

(e)CDR3中的胺基酸残基105被碱性胺基酸、疏水性胺基酸或中性胺基酸取代。

2.如权利要求1所述的抗体及其抗原结合部位，其特征在于，还包含至少一个以下的架构：

(a)于重链的前导序列及CDR1之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：4同源的胺基酸序列的架构；

(b)于重链的CDR1及CDR2之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：5同源的胺基酸序列的架构；

(c)于重链的CDR1及CDR2之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：5同源的胺基酸序列的架构，其中所述架构中的胺基酸残基46为甘胺酸且未被取代；以及/或

(d)于重链的CDR2及CDR3之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：6同源的胺基酸序列的架构。

3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，其中CDR1中的胺基酸残基28被以下任一个所取代：

(a)选自离胺酸或精胺酸的碱性胺基酸；

(b)为酪胺酸的中性胺基酸；或

(c)为苯丙胺酸的疏水性胺基酸。

4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR1中的胺基酸残基31被选自离胺酸或精胺酸的碱性胺基酸取代。

5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR2中的胺基酸残基57被以下任一个所取代：

(a)选自麸酰胺酸、甘胺酸或丝胺酸的中性胺基酸；

(b)为组胺酸的碱性胺基酸；或

(c)为色胺酸的疏水性胺基酸。

6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR2的胺基酸残基63被以下任一个所取代：

(a)为酪胺酸的中性胺基酸；

(b)选自丙胺酸、白胺酸或缬胺酸的疏水性胺基酸；或

(c)选自组胺酸或精胺酸的碱性胺基酸。

7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR3中的胺基酸残基105被以下任一个所取代：

(a)选自精胺酸或离胺酸的碱性胺基酸；

(b)选自甘胺酸或苏胺酸的中性胺基酸；或

(c)选自甲硫胺酸、丙胺酸、异白胺酸或缬胺酸的疏水性胺基酸。

8.一种抗体或其抗原结合部位，其特征在于，其与醣类抗原结合且包含：轻链变异区，其中所述轻链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％至100％与SEQ ID NO：7、8以及9所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列；

其中CDR包含至少一个以下胺基酸取代：

(a)CDR1中的胺基酸残基24被中性胺基酸或疏水性胺基酸取代；

(b)CDR1中的胺基酸残基32被中性胺基酸或非甲硫胺酸的疏水性胺基酸取代；

(c)CDR2中的胺基酸残基49被中性胺基酸取代；

(d)CDR2中的胺基酸残基53被中性胺基酸或碱性胺基酸取代；以及/或

(e)CDR3中的胺基酸残基93被非天门冬酰胺酸的中性胺基酸、碱性胺基酸或疏水性胺基酸取代。

9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，其还包含至少一个以下的架构：

(a)于轻链前导序列及CDR1之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：10同源的胺基酸序列的架构；

(b)于轻链的CDR1及CDR2之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：11同源的胺基酸序列的架构；

(c)于轻链的CDR1及CDR2之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：11同源的胺基酸序列的架构，其中所述架构中的胺基酸残基45为脯胺酸且未被取代；

(d)于轻链的CDR1及CDR2之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：11同源的胺基酸序列的架构，其中所述架构中的胺基酸残基46为色胺酸且未被取代；以及/或

(e)于轻链的CDR2及CDR3之间并具有大约90％至100％与SEQ ID NO：12同源的胺基酸序列的架构。

10.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR1中的胺基酸残基24被以下任一个所取代：

(a)选自甘胺酸或丝胺酸的中性胺基酸；或

(b)为色胺酸的疏水性胺基酸。

11.如权利要求第8项所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，其中CDR1中的胺基酸残基32被以下任一个所取代：

(a)选自甘胺酸或麸酰胺酸的中性胺基酸；或

(b)为缬胺酸的疏水性胺基酸。

12.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR2中的胺基酸残基49被为甘胺酸的中性胺基酸取代。

13.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR2中的胺基酸残基53被以下任一个所取代：

(a)选自甘胺酸或苏胺酸的中性胺基酸；或

(b)为离胺酸的碱性胺基酸。

14.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，CDR3中的胺基酸残基93被以下任一个所取代：

(a)选自麸酰胺酸、丝胺酸或苏胺酸的中性胺基酸；

(b)为精胺酸的碱性胺基酸；或

(c)选自苯丙胺酸、白胺酸或甲硫胺酸的疏水性胺基酸。

15.一种与醣类抗原结合的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，其包含：重链变异区及轻链变异区，其中所述重链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％至100％与SEQ ID NO：1、2以及3所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列，以及/或其中所述轻链变异区包含三个CDR，CDR1、CDR2以及CDR3，其分别具有大约90％至100％与SEQ IDNO：7、8以及9所载的胺基酸序列同源的胺基酸序列。

16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，还包含至少一个以下的架构：

(a)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：4同源的胺基酸序列的重链架构；

(b)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：5同源的胺基酸序列的重链架构；

(c)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：6同源的胺基酸序列的重链架构；

(d)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：5同源的胺基酸序列的重链架构，其中所述重链架构中的胺基酸残基46为甘胺酸且未被取代；

(e)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：10同源的胺基酸序列的轻链架构；

(f)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：11同源的胺基酸序列的轻链架构；

(g)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：12同源的胺基酸序列的轻链架构；

(h)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：11同源的胺基酸序列的轻链架构，其中所述轻链架构中的胺基酸残基45为脯胺酸且未被取代；以及/或

(i)具有大约90％至100％与SEQ ID NO：11同源的胺基酸序列的轻链架构，其中所述胺基酸残基46为色胺酸且未被取代。

17.如权利要求1、8或15项所述的抗体或其抗原结合部位，其特征在于，所述醣类抗原为Globo H、阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、Gb4、Gb3、sLe^x、Le^x、sLe^a、Le^a、Le^y、聚唾液酸(PSA)、sTn、Tn、TF、GD1a、GT1b、A2B5、GD2、GD3、岩藻醣基GM1、GM1、GM2、GM3或Neu5GcGM3。

18.一种医药组成物，其特征在于，包含：

如权利要求1、8或第15所述的抗体或其抗原结合部位；以及

药学上可接受的载体。

19.如权利要求18所述的医药组成物，其特征在于，还包含至少一个添加的治疗剂。

20.一种抑制癌细胞增生的方法，其特征在于，包含施予有效量的如权利要求1、8或15所述的抗体或其抗原结合部位至其需求个体，其中所述癌细胞增生被抑制。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述需求个体为人类。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的癌症是表现Globo H的癌症。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述表现Globo H的癌症是选自由以下组成的群组：肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、神经胶母细胞瘤、肺癌、乳癌、口腔癌、头颈部癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、膀胱癌、胰脏癌、肠癌、大肠癌、肾脏癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睪丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌以及前列腺癌。