BR0107262B1 - Composição farmacêutica inalatória - Google Patents

Description

Composição farmacêutica inalatória CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica, com efeito, quimiopreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas de seres humanos e animais. Mais especificamente, a referida composição compreende como principio ativo pelo menos um monoterpeno e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso da referida composição farmacêutica na preparação de medicamentos utilizados para a inibição do crescimento de células tumorais; e inibição e/ou controle de metástases de tumores primários.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO 0 câncer permanece paralelamente às viroses, como o grande desafio à medicina atual. Doenças cardíacas causam um número maior de mortes do que o câncer e existem outros problemas sérios na área da saúde, como a má nutrição e as infecções parasitárias, mas nestas áreas, o nível de conhecimento dos fatores causais e dos métodos propedêuticos e terapêuticos é maior. Previsões realistas indicam que, apesar dos progressos obtidos nas áreas de pesquisa objetivando novos tratamentos, o câncer deverá ser uma das mais importantes causas de morte neste século. Estatisticamente, uma pessoa em cada cinco morrerá decorrente diretamente de processos neoplásicos. A prevenção e a detecção precoce, ainda são os recursos mais importantes para a redução da morbidade e da mortalidade decorrentes desta patologia.

Avanços no conhecimento da biologia molecular têm proporcionado maior entendimento dos mecanismos fundamentais que regulam a proliferação e a diferenciação celular, assim como o desenvolvimento de metástases tumorais. Um tumor é definido como maligno, quando suas células invadem tecidos circundantes, promovendo quebra de barreiras, entrando na corrente sanguínea ou vasos linfáticos, formando tumores secundários à distancia, ou metástases. A proliferação celular normal ocorre sinergicamente pela atuação de fatores promotores, os oncogenes, e de fatores restritivos, os genes supressores. 0 desenvolvimento das neoplasias parece ser decorrente ou da excessiva ativação dos oncogenes, com a consequente alteração de sua expressão, ou da perda da função de seus supressores, ou talvez de ambos os mecanismos simultaneamente. 0 Sistema Nervoso Central (SCN) é constituído de células neuronais, elementos vasculares, glândulas e tecido de sustentação denominado glia. As células da glia são derivadas do neuroectoderma, e compreendem os astrócitos, os oligodendrócitos e as células ependimárias. Os astrocitomas, tumores que se originam dos astrócitos, constituem-se na maioria das neoplasias intra-parenquimatosas cerebrais, podendo ocorrer, tanto na região supratentorial quanto infratentorial, em qualquer idade, e são classificados dependendo do seu grau de malignidade, em 4 níveis, pela Organização Mundial de Saúde. 0 astrocitoma grau I, ou astroeitoma pilocítico, é considerado benigno, enquanto os de grau II, chamados glioma de baixo grau, os de grau III, ou astrocitoma anaplásico, e os de grau IV, ou glioblastoma multiforme (GBM), são considerados malignos. Nos astrocitomas de grau II, o crescimento celular é difuso; nos de grau III, observa-se pleomorfismo moderado, com aumento de mitoses e vascularização; nos GBM as células são indiferenciadas e com zonas de necrose. Existem ainda os gliomas chamados mistos, que são o resultado da combinação de diferentes tipos de células.

Os gliomas ocorrem em um órgão, o encéfalo, que se encontra em um espaço fechado, a caixa craniana; o crescimento do tecido tumoral ocasiona o rompimento da barreira hematoencefálica, causando edema cerebral. Como o encéfalo não possui vasos linfáticos para drenar os fluidos causadores deste edema, inicia-se então a compressão e consequente lesão do tecido cerebral normal.

Geralmente a terapia é decidida de acordo com o grau histológico, mas nem sempre o resultado ao tratamento corresponde ao esperado. Até o momento, não estamos seguros em afirmar que os gliomas são sensíveis aos tratamentos preconizados: ablação cirúrgica, radioterapia e quimioterapia. A despeito do grande número de drogas ora em experimentação no tratamento dos gliomas (BRANDES, A.A., PASETTO, L.M., MONFARDINI, S.: New drugs in reccurente high grade gliomas. 1: Anticancer Res 2000, May-Jun; 20 (3B): 1913- 20; THOMAS, H.D., LIND, M.J., FORD, J.,BLEEHEN, N.,CALVERT, A.H., BODY, AV.: Pharmacokinetics os carboplain administred in combination whith theg bradkinin agonist Cereport (RPM-7) for the treatment of brain tumours. 1: Câncer Chemotheer Pharmacol 2000, 45(4):284-90; BRANDES, A.A., PASETTO, L.M., MONFARDINI, S.: Temozolomide in patients with high grade gliomas 1 Oncology 2000 Sep, 59(3):181-6-, CIORDIA, R. , SUPKO, J., TAINEAU, M. BATCHELOR, T.: Cytotoxic chemotherapy: advances in delivery, pharmacology, and testing. 1: Curr Oncol Rep 2000 Sep; 2(5): 445-53; NIMA, T., MOSTAFA, M.G. , MORI, K. : Antitumor effect and peritumoral brain edema formation in relation to MX2, ACNU, and doxorubicin therapy: a comparative analysis using rodent models of gliomas. 1: Neurol Res 2000, Dec; 22(8):819-24.,- READ, T.A., SORENSEN, D.R., MAHESPARAN, R. , ENGER, P.O., TIMPL, R. , OLSEN, B.R., HJELSTUEN, Μ; H. , HARALDSETH, O., BJERKVIG, R. : Local Endostatin tratment of gliomas administered by microencapsulated producer cells. 1: Nat. Biotechnol 2001 Jan: 19(1):20-34), até a presente data nada foi encontrado drogas com resultados que signifique um avanço na terapêutica destes tumores.

Os pesquisadores da presente invenção vêem buscando alternativas para solucionar os problemas encontrados na técnica, e que represente um real e definitivo passo na terapia destes tumores.

Surpreendentemente os inventores buscaram fontes alternativas de agentes com efetiva propriedade antimitótica para combater processos neoplásicos gliais.

Um exemplo de agentes com propriedades antimitóticas que estão sendo estudados nos últimos anos, são os monoterpernos.

Terpenos são hidrocarbonetos de origem natural, produzidos a partir de unidades isoprênicas ativadas. Classificam-se quanto ao número de unidades isoprênicas em: monoterpenos (10 átomos de carbono), sesquiterpenos (15 átomos de carbono), triterpenos (30 átomos de carbono) e tetraterpenos (40 átomos de carbono).

Os monoterpenos (classe mais simples) são encontrados principalmente nos óleos essenciais de muitas frutas (figura 1) e vegetais que são rotineiramente consumidos. Estes compostos têm mostrado que exercem atividades em tumores mamários, pancreáticos, hepáticos, de cólon, e prostáticos, representando uma nova classe de agentes terapêuticos. O limoneno é o monoterpeno monocíclico mais simples, e foi o primeiro terpeno estudado com propriedades antimitóticas. O potencial dos monoterpenos na prevenção do câncer, foi demonstrado pela primeira vez, em trabalho onde a administração do limoneno junto ao carcinógeno benzo(rst)pentafeno, reduz o desenvolvimento de tumores em ratos (HOMBURGER, F., TREGER, A., BOGER, E.: Inhibition of murine subcutaneous and intravenous benzo(rst)pentaphene carcinogenesis by sweet Orange oils and d-limonene. Oncology 25:1-20, 1971.). Outros experimentos relatam a propriedade deste composto em prevenir e reduzir o crescimento de carcinoma mamário induzido em ratos (ELEGBEDE, J.A., ELSON, C.E., QUERESHI, A, TANNER, M.A., GOULD, M.N.: Inhibition of DMBA - induced maimary câncer by the monoterpene d-limonene.

Carcinogenesis 5:661-664, 1984; ELEGBEDE, J.A., ELSON, C.E., QUERESHI, A, TANNER, M.A., GOULD, M.N.: Regression of rat mammary tumors following dietary D-limonene. J. Nath. Câncer Inst. 76:323-325, 1986 e Haag e cols.).

Os monoterpenos possuem diversos efeitos celulares e moleculares tanto "in vivo" quanto "in vitro", inibem a isoprenilação de pequenas proteínas G, e isto alteraria a transdução do sinal e resultaria na alteração da expressão gênica (CROWELL, P.L., RES, Z., LIN., S., VEDEJS, E. , and GOULD, M.N. : Structure-activity relationships among monoterpene inhibitors of protein isoprenylation and cell proliferation. Biochem. Pharmacol, 47:1404-1415, 1994).

Em tumores que mostraram regressão pelo tratamento com monoterpenos, foram demonstradas alterações no nível celular, inclusive no genoma. O produto genético melhor caracterizado é o aumento do receptor de manose 6-fosfato M6P/IGF II e nos níveis tumorais do fator B do crescimento tumoral. 0 aumento destas duas proteínas pode ser claramente visto pela análise imuno-histoquímica. O mRNA para M6P aumenta em tumores tratados quando em regressão, e estas duas proteínas são importantes no controle do crescimento de tumores de mama em roedores e humanos. Ο MP6 tem uma dupla função: primeiro, ele ajuda a degradar IGF II, que é um potente mitógeno para câncer de mama, a remoção desde agente mitogênico potencialmente reduz o crescimento tumoral; segundo, este receptor está envolvido na ativação da forma latente secretada da TGF-B (JIRTLE, R.L., HAAG, J.D., ARIAZI E.A., GOULD, M.N.: Increaseã leveis of mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor and transforming growth factor beta I leveis during monoterpene-induced regresslon of mammary tumours. Câncer Res 53:3849-3852, 1993; JIRTLE, R.L., HAAG, J.D., ARIAZI E.A., GOULD, M.N.: Increaseã leveis of M6P/IGF-II receptor and TGF- Bl leveis during monoterpene-induced regression of mammary tumours. Câncer Res 53:3849-3852, 1993).

Autores demonstraram que o limonemo, o monoterpeno predominante no óleo essencial da casca de laranja, tem atividade quimiopreventiva e quimioterapêutica substancial contra tumores mamários, pulmonares e gástricos induzidos quimicamente em roedores. 0 limoneno inibe o desenvolvimento de tumores induzidos pelo 7,12 dimetil(a)antraceno ou N, nitroso- N-metilurea. Os mecanismos de ação responsáveis pelas atividades quimiopreventiva e quimioterapêutica baseiam-se na inibição seletiva da isoprenilação da proteína 21-26K (CROWELL, P.L., CHANG, R.R., EWN, Z., ELSON, CE; and GOULD, M.N. : Selective inhibition of isoprenylation of 21-26K Da proteins by the anticarcinogen D-limonene and its metabolites. J Boi. Chem, 266:17685-17679,1994).

Outros trabalhos demonstraram que a dieta com a administração de limoneno a 10% causa a regressão completa de tumores de lOmm de diâmetro em carcinoma mamário de ratos induzidos pelo 7,12 dimetil benz(a)antraceno (D.M.B.A.) (HAAG, J.D.; LINDSTROM, M.J and GOULD. M.N.: Limonene-induced regression of mammary carcinomas. Câncer Res., 52:4021-4026, 1992. Estes e outros achados, levaram autores a iniciar ensaios clínicos (VIGUSHIN, D.M.; POON, G.; BODDY, A.; JARMAN, M and COOMBES, R.C.: Phase I clinicai and pharmacokinetic study of D-limonene. Proc-AM. Assoe.Câncer Res., 38:604, 1997). Embora o limoneno tenha comprovada propriedade antimitótica em ratos, é necessária quantidade muito grande desta substância para a obtenção de resultados satisfatórios em seres humanos, portadores de neoplasias, o que inviabiliza 0 seu uso em terapêutica corrente. Este fato levou à pesquisa de análogos mais potentes para a utilização em ensaios clínicos. O Álcool Perílico (AP), também chamado p-meta-1,7-dieno-6- 01 ou 4-isopropenil - ciclohexenocarbinol, conforme estrutura química mostrada na Figura 2 é um monoterpeno achado nos óleos essenciais de lavanda, hortelã, salva, cerejas, limão, bergamota selvagem, gengibre e sementes de aipo, análogo ao limoneno, que mostrou „ ser cinco vezes mais potente na regressão de tumores induzidos em camundongos, quando é utilizado na dieta à 2% (HAAG, J.D. and GOULD, M.N. : Mammary carcinoma regression induced by perillyl alcohol, a hidroxylated analog of limonene. Câncer chemother. Pharmacol., 34:477-483, 1994).

Estudos em animais têm mostrado sua ação na regressão de tumores de mama, pancreáticos e hepáticos, sua aplicação como agente quimiopreventivo para tumores de cólon, pele e pulmão, e como agente quimioterápico para neuroblastoma e tumores de próstata (HAAG, J.D. and GOULD, M.N.: Mammary carcinoma regression induced by perillyl alcohol, a hidroxylated analog of limonene. Câncer chemother. Pharmacol, 34:477-483, 1994; BURKE, Y.D., STARK, M.J., ROACH, S.L., SEM, S.E., and CROWELL, P.L.: Inhibition of pancreatic câncer growth by dietary isoprenoids farnesol and geraniol. Lipids, 32:151-156, 1997; STARK, M.J., BURKE, Y.D., MAKINZIE, J.H., AYUOBI, A.S., CROWELL, P.L.: Chemotherapy of pancreatic câncer with the monoterpene perillyl alcohol. Câncer Lett 9:15-21, 1995; STAYROOK, K.R., MCKINZIE, BURKE, Y.D.: Induction of the apopto&is - promoting protein Bak by perillyl alcohol in pancreatic ductal adenocarcinoma relative to untransformed ductal epithelial cells. Carcinogenesis, 1997, 18:1655-1658 20. BELANGER, J.T.: Perillyl alcohol: applications in oncology. Altern Mad Ver 1998 Dec, 3:6, 448-57).

Experimentos mostraram acentuada diminuição da proliferação celular em células de carcinoma pancreático quando injetadas em hamsters pela via subcutânea. Neste trabalho o grupo tratado foi alimentado com dieta de AP a 2- 4%, e após 3 semanas de quimioterapia, houve regressão completa do tumor em 5 de 25 camundongos tratados, sendo que não houve nenhuma regressão de tumores em camundongos do grupo controle. Não se observou toxicidade nos estudos histológicos das células de fígado, rins e pâncreas (STARK, M.J., BURKE, Y.D., MAKINZIE, J.H., AYUOBI, A.S., CROWELL, P.L.: Chemotherapy of pancreatic câncer with the monoterpene perillyl alcohol. Câncer Lett 9:15-21, 1995).

Estudos mostraram que células neoplásicas epiteliais de duetos pancreáticos tratados com AP, em doses de 100, 300, e 500μΜ, exibiram índices mais altos de apoptose de 2.6, 8.8 e 18 respectivamente, em comparação com células neoplásicas de duetos pancreáticos sem tratamento. Os autores deste estudo concluíram que o AP age nas células neoplásicas produzindo apoptose, porque aumenta a proteína proaptótica Bak. A expressão Bak foi duas vezes maior nas células epiteliais neoplásicas tratadas com AP, que nas células neoplásicas não tratadas. É sabido que a proteína Bak é induzida pelo gene supressor p53 (STAYROOK, K.R., MCKINZIE, BURKE, Y.D.: Induction of the apoptosis - promoting protein Bak by perillyl alcohol in pancreatic ductal adenocarcinoma relative to untransformed ductal epithelial cells. Carcinogenesis, 1997, 18:1655-1658 20. BELANGER, J.T.: Perillyl alcohol: applications in oncology. Altern Mad Ver 1998 Dec, 3:6, 448- 57) .

Dois estudos feitos na Universidade de Madison - WI nos EUA mostraram que a dieta com o AP a 2,5%, resultou em completa regressão de tumores mamários em ratos. No primeiro estudo os tumores mamários foram induzidos pelo carcinógeno DMBA, e a alimentação com o AP a 2,5% iniciou-se quando os tumores alcançaram o diâmetro de 3 mm e a regressão completa dos tumores foi alcançada na terceira semana consecutiva do tratamento. No segundo trabalho, ratos divididos em 4 grupos foram tratados com a dieta de AP a 0,5%, 1,0%, 1,5% e 2,0%, sendo que a terapia teve inicio quando os tumores mamários alcançaram lOmm de diâmetro. A dieta com o AP a 1% mostrou um nível significativo de regressão tumoral, e a dieta a 3% mostrou como resposta, completa regressão tumoral (nota: entende-se como regressão completa quando o tumor induzido não é mais palpável) (HAAG, J.D. and GOULD, M.N. : Mammary carcinoma regression induced by perillyl alcohol, a hidroxylated analog of limonene. Câncer chemother. Pharmacol, 34:477-483, 1994;). O efeito do AP em tumores de fígado foi mostrado em estudos onde ratos foram induzidos pelo carcinógeno dietilnitroamino (DEN). Após 19 semanas de tratamento com dieta de AP a 2%, os animais do grupo tratado exibiram redução 10 vezes maior do volume tumoral, em comparação com os animais do grupo controle. Os ratos tratados com AP tiveram perda de 10% do peso corporal comparados com os não tratados, o que foi atribuído a diminuição da gordura corporal (MILLS, J.J., CHARI, R.S, BOYER, I.J GOULD, M.N and JIRTLE, R.K.: Induction of apoptosis in liver tumors by the monoterpene perillyl alcohol. Câncer Res, 55:979-983, 1995).

Estudos "in vitro" indicam que o AP pode ser ativo contra neuroblastoma - Neuro-2A incubação de células Neuro 2A com lmM de AP, inibiu a síntese de DNA e da proliferação celular (SHIW, GOULD, M.N. : Induction of differentiation in Neuro - 2A cells by the monoterpene Perillyl Alcohol. Câncer Lett 1995; 95: 1-6) . O AP também inibiu a proliferação celular em câncer de próstata em estudo "in vitro". O AP inibiu a proliferação causada pelo ácido lisofosfatídico, o qual é expressa em muitas linhagens celulares de câncer de próstata.

Por causa dos seus efeitos nos níveis de IL-2 plasmáticos, especula-se que o AP pode ser um agente quimioterápico útil contra neoplasias malignas associadas com níveis plasmáticos elevado de IL-2, tais como doença de Hodgkin, leucemia de célula T em adulto, e linfoma cutâneo de células T. A incubação de células de linfoma T com lmm, 2mm e 3mm de ácido perílico, (Figura 3) que é um metabólito do AP, diminui o nível de MAP quinase após 48 horas, na dose dependente em 25%, 45% e 60% (SCHULZ, S., REINHOLD, D., SCHMIDT, H. et al. : Perillic acid inhibits Ras/MAP Kinase driven IL-2, production in human T lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun 1997; 241:720-725).

Ensaios mostraram que a dieta com AP, inibiu o desenvolvimento de adenocarcinoma de cólon induzido em ratos.

Foram alimentados ratos com lg ou lg de AP/Kg e usado o carcinógeno azoximetano (AOM). Os ratos alimentados com 2g de AP/Kg mostraram diminuição significativa da incidência e multiplicidade de adenocarcinomas de cólon. Além de proteger contra a implantação de câncer de cólon, o AP pode inibir metástase de tumores de cólon já estabelecidos (REDDY BS., WANG CX, SAMAHA H, et al. : Chemoprevention of colon carcinogen.esis by dietary perillyl alcohol. Câncer Res 1997; 57:420-425). 0 AP pode ser ativo contra melanoma. Células de melanoma B16 íçram incubadas com AP e o resultado mostrou diminuição do número de células de melanoma em 50% (HE L, MO H HADISUSILO S, et al.: Isoprenoids supress the growth of murine B16 melanomas in vitro and in vivo. L Mutr 1997; 127: 668-674).

Ensaios demonstram que a dieta com AP a 2% em ratos com tumores de fígado induzidos, aumentou o nível de mRNA para os receptores TGF-beta tipo I, II e III.

Estudos mostram que o AP pode diminuir os níveis de proteína ciclina Dl em até 70% em células de câncer de mama depois de 5 horas de incubação. Sabe-se que a ciclina Dl permite que as células cancerosas se introduzam na fase S de resposta da replicação do DNA (SHI, W., and GOULD, M.N.: The anticancer monoterpene perillyl alcohol causes a decrease in cellular cyclin Dl leveis contributing to an early Gi, arrest in mammary cells. Proc. Am. Assoe. Câncer Res, 38:263, 1997). O mecanismo exato da ação do AP na regressão tumoral ainda é desconhecido, porém os ensaios mostram que altera vários parâmetros celulares como o aumento do receptor da manose 6- fosfato MGP/IFG II, aumento dos receptores TGF beta tipo I, II e III, que podem ter papel protetor na tumorogênese do câncer de pulmão, diminuição da síntese da proteína p21 ras, aumento do catabolismo da p21 ras e a indução das fases I e II dos sistemas de detoxificação hepática. Estudos com ratos, que foram alimentados com dieta de AP a 2%, mostraram inibição da isoprenilação de pequenas proteínas G e da síntese da coenzima Q. A redução da síntese da coenzima Q podería inibir o crescimento tumoral, porque diminui a síntese de ATP na cadeia de transporte de elétrons. Entre as proteínas G, a prenilação da Ras foi inibida em 17% pela farnesil transferase (FPTase), e a prenilação da RhoA em 28% pela geranil transferase (GGPTase) (BELANGER, J.T.: Perillyl alcohol: applications in oncology. Altern Mad Ver 1998 Dec, 3:6, 448-57).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma primeira concretização da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo como princípio ativo pelo menos um monoterpeno e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Mais especificamente, a referida composição apresenta um efeito quimiopreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas de seres humanos e animais. Adicionalmente, uma segunda concretização preferencial da presente invenção, refere-se ao uso da referida composição farmacêutica na preparação de -um medicamento para tratar neoplasias malignas em seres humanos e animais, promover a inibição do crescimento de células tumorais e inibir e/ou controlar a proliferação celular - metástases - de tumores primários. Referido medicamento, é utilizado nos processos expansivos neoplásicos cerebrais e medulares, em particular em pacientes portadores de gliomas.

Uma terceira concretização da presente invenção, refere-se ao uso referida composição farmacêutica como agente quimiopreventivo e quimioterápico em seres humanos e animais. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS: A Figura 1 mostra um cromatograma do óleo essencial da casca do limão, evidenciando os componentes monoterpenicos com prevalência do limoneno. A Figura 2 mostra a estrutura qnímica do álcool perílico. A Figura 3 mostra a estrutura química dos metábolitos do álcool perílico. A Figura 4 mostra um gráfico com o efeito do álcool perílico, inibindo o crescimento celular em linhagens de Gliomas C6, nas concentrações de 30% a 0,03%. A Figura 5 mostra microfotografias de células de Glioma C6 durante o crescimento exponencial e submetidas ao tratamento com álcool perílico na diluição de 0,03%, após 30 minutos e após 2 horas. A Figura 6 mostra o efeito do álcool perílico evidenciando a inibição da síntese de proteínas das células de Glioma C6 nas concentrações de 0,03%, 0,3% e 3%. A Figura 7 mostra a representação gráfica dos resultados obtidos para o tratamento baseado na inalação com álcool perílico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica, com efeito, quimiopreventivo e quimioterápico para neoplasias malignas de seres humanos e animais, compreendendo como princípio ativo pelo menos um monoterpeno e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

Para a presente concretização, o monoterpeno utilizado é selecionado dentre o álcool perílico ou seus metabólitos, o ácido perílico e o ácido dihidroperílico, ou ainda, o monoterpeno da referida composição pode ser uma combinação do álcool perílico e seus metabólitos. Adicionalmente, aqueles com conhecimento na técnica poderão facilmente notar que a presente invenção não está limitada ao uso destas substâncias monoterpenicas como princípio ativo. Qualquer outra substância de origem monoterpenica que seja capaz de apresentar efeito como agente quimioterápico e/ou quimiopreventivo contra tumores de elevado grau de agressividade, poderão ser utilizadas para substituir qualquer uma das substâncias aqui mencionadas.

Na presente composição, o álcool perílico é representado pela fórmula estrutural p-meta-1,7-dieno-6,1 ou 4-isopropenilhexanocarbinol.

Dentre as substâncias diluentes que poderão ser utilizadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis da presente composição, encontram-se o etanol, soro fisiológico e o óleo de soja. Cabe salientar, que essas substâncias constituem substâncias diluentes de uso preferencial, não sendo, portanto, limitantes da presente invenção. Quaisquer outras substâncias que sejam capazes de interagir a nível molecular com o princípio ativo da presente composição sem alterar as propriedades terapêuticas do princípio ativo da composição da presente invenção, preservando o seu mecanismo de ação, poderão ser utilizadas para substituir qualquer uma das substâncias aqui mencionadas. A composição farmacêutica da presente invenção compreende cerca de 0,03% a 30% de pelo menos um monoterpeno como princípio ativo e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Mais especificamente, de uma maneira geral, os monoterpenos empregados estão na faixa de 30% da composição.

Entretanto, para uma concretização preferencial, a presente composição compreende 0,3% de álcool perílico. É possível ainda observar que a composição farmacêutica apresenta efeito contra células tumorais do sistema nervoso central (SNC). Mais especificamente, efeito contra astrócitos e contra células glia e ainda, mais particularmente, referida composição farmacêutica apresenta efeito quimiopreventivo e quimiterápico contra as células tumorais de Glioma C6 e U87.

Adicionalmente, uma segunda concretização preferencial da presente invenção, refere-se ao uso da referida composição farmacêutica na preparação de um medicamento para tratar neoplasias malignas em seres humanos e animais, promover a inibição do crescimento de células tumorais e inibir e/ou controlar a proliferação celular - metástases - de tumores primários.

Referido medicamento, é utilizado nos processos expansivos neoplásicos cerebrais e medulares, em particular em tumores que acometem o sistema nervoso central. Mais especificamente, para uma concretização preferencial, referido medicamento é utilizado em pacientes portadores de gliomas.

Nesse sentido, a presente invenção visa mostrar o efeito antimitótico do monoterpeno - álcool perílico - em células de gliomas C6 e U87, induzidos em camundongos, em experimentos "in vitro" e "in vivo" e sua utilização como alternativa terapêutica em seres humanos e animais portadores de neoplasias malignas.

Uma terceira concretização da presente invenção refere-se ao uso da referida composição farmacêutica como agente quimiopreventivo e quimioterápico em seres humanos e animais.

Os resultados obtidos para os experimentos "in vitro" utilizando a composição da presente invenção, mostrou que a referida composição a base de álcool perílico tem uma potente ação na diminuição do crescimento, do metabolismo e da síntese de proteínas das células dos tumores de glioma C6 e U87.

Os testes de toxicidade foram realizados por meio da inoculação da composição objeto da presente invenção em tecido cerebral e os resultados foram obtidos por meio das análises âe cortes de cérebro, nervo óptico, medula espinhal e fígado.

Através dos resultados, foi possível notar que houve alterações indicativas de toxicidade nos estudos histológicos.

Adicionalmente, em outra concretização da presente invenção, os ensaios "in vivo", evidenciaram a ação inibitória deste monoterpeno - álcool perílico -, no crescimento de tumores induzidos em camundongos e ratos.

Outro aspecto observado foi à capacidade de inibir o aparecimento de metástase. 0 uso da presente composição mostrou efeito significativo na inibição do crescimento de células no controle de metástase de tumores primários. Nesses ensaios, os animais foram submetidos ao tratamento com a presente composição farmacêutica por meio da via inalatória, através de nebulizações e via oral.

Outro aspecto da presente invenção está relacionado ao fato da composição farmacêutica, objeto da presente concretização, poder ser utilizada como tratamento isolado em seres humanos e animais, portadores de neoplasias malignas, tão bem como, o seu uso na forma de medicamento poder ser associado ou não de outras opções de tratamento, tal como a radioterapia.

De modo a melhor descrever e caracterizar os aspectos inventivos da presente invenção, esta passará a ser descrita na forma de exemplos. Entretanto, esses exemplos compreendem concretizações preferenciais não sendo, portanto, limitativos da invenção. Qualquer técnico no assunto, poderá facilmente entender que substituições usuais da técnica dos componentes e/ou procedimentos aqui descritos que não apresentem efeitos surpreendentes e inesperados, estão plenamente suportadas pelo escopo aqui revelado.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - Efeito do álcool perílico na inibição do crescimento de células tumorais de glioma C6 e U87. 0 aceptor de hidrogênio brometo de 3 - (4,5 dimetiltiazol - 2il) - 2,5 difeniltetrazolium (MTT) é normalmente usado para estimar a viabilidade celular em protocolos de "screening" de drogas. Tal ensaio se baseia no fato de que apenas células viáveis reduzem tetrazolium a derivados de formazam, o qual podem ser quantificados espectrofotometricamente. 0 álcool perílico (AP) foi diluído logaritmicamente e as concentrações utilizadas foram 30%, 3%, 0,003% e 0,0003%. A linhagem células alvo (glioma - C6) foi semeada em placas de 96 poços, na concentração de 5,0 x 10 células por poço. Após a aderência das células, estas foram colocadas frente às diversas diluições do AP, em triplicatas, tendo como controle positivo o detergente Tween, e, como controle negativo apenas o meio de cultura (DMEM). Passadas 48 horas de incubação, em estufa de CO2 a 5% do gás e 37 2C de temperatura, foi adicionado 1,0 pg por poço de uma solução de MTT, e a cultura voltou a ser incubada por três horas nas mesmas condições descritas anteriormente. Após verter o sobrenadante da placa, a revelação colorimétrica foi feita com a adição de 100 pg de DMSO em cada poço. A leitura foi realizada em leitor ELISA utilizando-se o filtro de 490nm.

Os resultados obtidos para a inibição do crescimento de células tumorais de glioma C6 e U87 é mostrada na Figura 4.

Nota-se que o AP apresentou importante inibição do metabolismo da célula alvo nas concentrações de 30% a 0,03%. EXEMPLO 2 - Efeito da ação biológica do Álcool Perílico na embriogênese (ovo embrionado e na síntese de proteínas).

Os ovos utilizados foram embrionados durante 7 dias. Estes foram observados por transiluminação em câmara escura para a confirmação da viabilidade dos embriões. Nesta etapa, também foram marcados na casca o local da câmara de ar e do embrião.

No fluxo laminar, os ovos foram limpos com álcool iodado, e feito iam pequeno furo na casca, no centro da câmara e no lado oposto ao embrião. Utilizando uma pêra afixada no furo da câmara, o ar foi puxado, deslocando a câmara para a parte lateral do ovo, ou seja, no lado oposto ao do embrião. Ambos os furos foram vedados com fita adesiva, e observados na câmara escura para constatar a formação da câmara de ar na lateral. A fita adesiva foi retirada deste local, com os ovos no interior do fluxo laminar.

Com uma pinça, foi aberta uma pequena janela na casca, a partir do lado oposto ao embrião. Com uma pipeta estéril, o extrato a ser testado foi inoculado sobre a CAM. A janela foi vedada com fita adesiva. Os ovos foram incubados a 37 SC, na posição horizontal, sem agitação, por 7 dias.

Abertura do ovo: após 7 dias de incubação, uma janela maior foi aberta na casca dos ovos, e injetou-se com uma seringa, 5mL da solução Carson's (800mL de água, 100 mL de formol 40%, 18.6g de Na2HP04 . H20, 4.2g de NaOH) abaixo da CAM, espalhando sobre ela, e lmL sobre a membrana. Os ovos foram incubados na geladeira por 3 horas e 30 minutos. Após fixação foi feita observação do embrião, quanto ao seu desenvolvimento. EXEMPLO 3 - Estudo do álcool perílico na metástase: a) Cultura de células: culturas de células glioma C6 e U87 foram previamente tratadas com álcool perílico. Após o tratamento, as células foram depositadas sobre a CAM superior conforme descrito anteriormente. Após alguns dias, a migração das células para a CAM inferior foi identificada através de extração de DNA da CAM e amplificação do exon 8 do gene da p53 (região específica humana) e outro gene específico da CAM como controle da reação de PCR. b) Extração de DMA: as amostras de CAM foram maceradas, e 20 pL da solução obtida foram passados a um eppendorf novo. A extração do DNA foi feita pela técnica de proteinase K seguida de fenol clorofórmio álcool isoamílico (24:25:1). c) Reação de polimerase em cadeia (PCR) : o DNA obtido foi submetido à PCR, para amplificação do exon 8 da p53. A

amplificação desse gene serviu de marcador de migração do DNA celular. d) Eletroforese: após a realização da reação de PCR, as amostras foram analisadas pela corrida em gel de poliacrilamida à 8%, o qual foi posteriormente corado com prata. EXEMPLO 4 - Estudo do efeito do extrato na síntese de proteínas de células C6 e U87 a) Manutenção das células: cultura de células de glioma foram mantidas em frascos apropriados com meio de cultura contendo células C6 em atmosfera de 5% de CO2 à 37 SC. b) Efeito de diferentes concentrações no crescimento celular: células foram tratadas com diferentes concentrações da composição e feita uma curva de crescimento celular.

Após observação da concentração da droga (composição) no crescimento celular foram escolhidas 3 concentrações para se investigar o efeito na síntese de proteínas celulares. Para isto, as células foram previamente tratadas com a droga teste e em tempos determinados o meio de crescimento celular foi trocado por meio de isento de metionina. Porém o novo meio de cultura continha metionina radioativa com 40 uCi/mL de 35S-metionina. Procedeu-se um pulso de uma hora de incorporação. Após incorporação o meio foi retirado e as células foram ressuspensas em tampão de amostra para SDS-PAGE. c) Análise das proteínas por autorradiografia: as proteínas foram analisadas em SDS - PAGE seguido de autorradiografia.

Neste experimento foi observada alteração significativa com a indução de proteínas. As proteínas foram cortadas do gel para futuras análises de sequenciamento. A sequência de aminoácidos obtida indicou uma sequência gênica codificante para aquelas proteínas. Esta sequência foi identificada utilizando-se dados do Gene Bank, conforme mostra a Figura 6. EXEMPLO 5 - Efeito do AP no controle da metilação gênica e na atividade da Telomerase com a linhagem de glioma humana U87 Efeito do AP na metilação de DNA A metilação de DNA é um processo epigenético de inativação da expressão gênica que contribui na tumorigênese de vários tumores. Entre os principais genes inativados por metilação nos tumores estão o gene CDKN2 que codifica a proteína ρΐβ, o gene RB; e o gene MLHl. CDKN2 (pl6) e RB são considerados genes tumorais supressores com funções relacionadas e o gene que MLHl esta envolvido com o mecanismo de reparo de DNA mal pareado. A análise de metilação da região promotora dos genes MLHl, RB, CDKN2 e TERT será realizada através do método denominado MSP (do inglês, methylation-specific PCR). Essa técnica foi desenvolvida por Herman e seus colaboradores (HERMAN, J.G et al: Metilation-specif PCR: a novel assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad. Sei USA: 93:9821-9826, 1996) e baseia-se em diferenças na sequência do DNA metilado e não metilado após o tratamento com bisulfito de sódio. Tal tratamento promove a deaminação de citosinas não metiladas, que em consequência são convertidas em uracil, mas tal tratamento não é capaz de modificar as citosinas metiladas.

Dessa forma, durante a reação de PCR as uracilas resultantes são substituídas por timina. 0 uso de iniciadores específicos para essas sequências pode distinguir quais delas estavam originalmente metiladas ou não. 0 protocolo de tratamento com o bisulfito de sódio a ser utilizado será o mesmo descrito por von Eggeling (Von EGGELING et al: Analysis of the Tumor Supressor Gene pl6(INK4A> in Microdissected Melanona Metastases by Sequencing and Microsatellite and Mathilation Screening Arch. Dermatolol. Res. 291:474-477, 1999). EXEMPLO 6 - Efeito do AP na atividade da telomerase A telomerase é uma ribonucleoproteína responsável pela síntese de sequências repetitivas de DNA telomérico, cuja unidade básica é formada pela sequência TTzAGGG nos vertebrados. A atividade telomerase em humanos apenas é observada durante a embriogênese (ULANER, G.A et al. : Telomerase activity in humans development is regulated by human telomerase reverse transcriptase (HTERT) transcription and by alternative splicing of HTERT transcription. Câncer research 58:4168-4172, 1998), algumas evidências indicam que essa atividade ocorra em função da diferenciação celular, de tal forma que, a medida em que as células vão chegando nos estágios finais da diferenciação a atividade da telomerase é interrompida (BESTILNY, L. J et al. : Selective inhibition of telomerase activity during terminal differentiation of immortal cell lines. Câncer research 56: 3796-3802, 1996; YAMADA, O et al.: Down-regulation of telomerase activity is an early event of cellular differentiation without apparent telomeric DNA chance. Leukemia Research 22:711-717, 1998).

Após o nascimento, os tecidos somáticos não apresentam atividade dessa enzima (HARLEY, C.B; FUTCHER, A. B, GREIDER, C. W. : Telomeres shorten during aging of human fibroblasts.

Nature 345:458-460, 1990). Entretanto, a atividade da telomerase em humanos pode ocorrer em alguns tipos celulares após o nascimento, como é o caso das células germinativas (ALLSOPP, R.P et al.: Telomere lenght predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc. Natl. Acd. Sei. USA 89: 10114-10118, 1992) das células indiferenciadas (COUNTER, C.M. et al. : Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad. Sei. USA 91: 2900-2904, 1994) e dos linfócitos B e T. A reativação da telomerase em vários tipos de câncer tem sido descrita (KIM, N.W et al.: Specific association of human telomerase activity with immortal cells and câncer. Science 266:2011- 2014, 1994; ALVES, G et al.: Determination of telomerase activity in squamous cell carcinoma of the penis.

Ins J. of Oncology 18:67-70, 2001). Entretanto, desconhece-se o efeito do AP sobre a atividade da telomerase em células tumorais de gliomas.

Além da associação entre a telomerase e o câncer, em seu trabalho Kim e seu grupo (KIM, N.W et al. : Specific association of human telomerase activity with immortal cells and câncer. Science 266:2011- 2014, 1994) desenvolveram uma nova técnica de detecção da atividade da telomerase, denominada ensaio TRAP (telomeric repeat amplification protocol) , a qual é utilizada até hoje por praticamente todos os grupos de pesquisadores que estudam essa enzima. Tal ensaio consiste primeiramente na preparação do extrato celular que, em seguida, é usado em uma reação que possui duas etapas. A primeira etapa vai permitir a síntese das unidades de repetição teloméricas, pois ao extrato celular é adicionado o oligonucleotídeo (ou iniciador) TS (e outros reagentes necessários) que servirá como molde para que a telomerase inicie a síntese. Entretanto, essa reação só poderá acontecer caso exista atividade da telomerase nos extratos celulares. A segunda etapa consiste na amplificação das unidades de repetição teloméricas previamente sintetizadas, através de uma reação de PCR. Para que essa reação se processe, ao tubo de reação são adicionados: o oligonucleotídeo (ou iniciador) CX, que juntamente com TS servirão como iniciadores, e a Taq polimerase. Os produtos, marcados radioativamente durante a reação de PCR, são separados através de eletroforese em gel de poliacrilamida e visualizados em autoradiografia. Atualmente, o protocolo mais utilizado é a marcação de -um dos iniciadores com um fluorocromo, permitindo a detecção dos produtos de PCR em um sequenciador automático de DNA. Deste modo, se as unidades de repetição teloméricas forem detectadas isso indicará que existe atividade da telomerase no extrato celular na reação. EXEMPLO 7 - Efeito da inalação do álcool perílico na proliferação celular e apoptose dos timócitos de camundongos C57BL6.

Introdução: 0 álcool perílico é um monoterpeno isolado dos óleos essenciais de vegetais como lavanda, hortelã, sementes de aipo e cereja. Experimentos in vivo em ratos, utilizando o tratamento por via oral com 0,3% AP, na dieta ou por gavage, promoveu a regressão de tumores pancreáticos, hepáticos, mama, próstata e neuroblastoma. Embora os metabólitos do AP - ácido perílico e di-hidroperílico sejam considerados os principais responsáveis pela sua atividade anti-tumoral, estudos in vitro, mostram que o AP induz apoptose de células transformadas, e promove diferenciação celular, sendo considerado um agente quimioterápico promissor, no controle da proliferação e diferenciação de células transformadas.

Objetivo: Analisar in vivo e ex vivo o efeito da inalação/nebulização do AP na proliferação celular e apoptose de timócitos normais, visando a utilização desta via, no tratamento de tumores primários do sistema nervoso central.

Metodologia: Camundongos C57BL6/J de ambos os sexos, com 4 a 6 semanas, foram pesados antes e após serem submetidos ao tratamento por inalação diária (1, 2, 3 e 5 dias), durante vinte segundos, com 800pL de AP 0,3%. Como grupo controle foram incluídos os grupos: não tratados; sham do estresse nebulizado com tampão salina e sham nebulizado com o veículo etanol (ETOH). O timo, baço e fígado foram coletados e pesados para estabelecer a relação do peso e massa corporal (g/BW). Os timócitos foram isolados e a apoptose foi determinada pela análise da fragmentação oligonucleossomal do DNA, por eletroforese em gel de agarose. A determinação da proliferação celular in vitro, pela redução mitocondrial do sal de tetrazolium (MTT), foi realizada nas culturas de 2 x 106 esplenócitos em RPMI, contendo 5% do soro fetal bovino. 0 tecido hepático foi processado para análise histológica do efeito dos metabólitos do AP na estrutura hepática.

Resultados: Não foi observada alteração clínica (convulsão, mudança de comportamento, pelagem, diarréia) durante e após o tratamento. A inalação com AP, durante o 3e, 2 a e 5a dias, causou aumento do peso (g/BW) do timo, baço e fígado, além do aumento significativo na proliferação (MTT) dos esplenócitos in vitro, porém não causou aumento da apoptose dos timócitos.

Contudo, o grupo controle tratado com etanol apresentou apoptose acentuada, com intensa fragmentação de DNA.

Conclusão: Embora preliminares, os resultados sugerem, conforme mostrado na Figura 7, que o tratamento por inalação com AP, é capaz de aumentar a atividade do sistema imune, sem induzir apoptose de células normais não transformadas. EXEMPLO 8 - Efeito do álcool perílico em tumores Gliomas C6 induzidos em núcleo caudado de ratos Para avaliarmos o efeito anti-tumoral do AP em células de glioma C6 e U87 em tecido cerebral de ratos, procederemos a inoculação destas células no núcleo caudado, por via exterotáxica. Dividiremos os ratos em grupos tratados e controle. 0 grupo tratado será diariamente submetido a nebulização com AP diluído em solução fisiológica. No final de 21 dias, todos os animais serão sacrificados e serão feitos estudos histopatológicos do tecido cerebral.

De todo o exposto acima, a invenção em questão apresenta dois objetivos fundamentais, porém não exaustivos, quais sejam: Desenvolvimento de tratamentos mais eficazes no combate a processos neoplásicos malignos em seres humanos e animais; e.

Compreender melhor os mecanismos moleculares no processo de carcinogênese, o que futuramente poderá ser aplicado na prevenção ou diagnóstico precoce desta patologia.

Claims (5)

1. Composição farmacêutica inalatória, com efeito quimipreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas caracterizada por compreender como principio ativo 0,3% (v/v) de álcool perilico e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição farmacêutica inalatória de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por apresentar efeito contra células tumorais do sistema nervoso central (SNC).

3. Composição farmacêutica inalatória de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por apresentar efeito contra células tumorais dos astrócitos e de células glia.

4. Composição farmacêutica inalatória de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por apresentar efeito contra células tumorais de Glioma.

5. Composição farmacêutica inalatória de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por apresentar efeito contracélulas tumorais de seres humanos.