TW201348259A - 對神經節苷脂類具雙重專一性之重組抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種新穎單株抗體及這些抗體之片段，彼等對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3具有雙重專一性及高親和力，且不會辨識其他神經節苷脂類。在另一態樣中，本發明係關於這些抗體及其片段於治療腫瘤的用途，該腫瘤特徵為大量表現這可被這些抗體辨識的二種抗原中之任一者或混合表現兩者抗原。同樣地，本發明係關於這些抗體在診斷表現這二種GM3神經節苷脂變異體類中至少一者之腫瘤的用途。

Description

對神經節苷脂類具雙重專一性之重組抗體及其用途
本發明係關於生物技術、特別是關於人類健康領域。本發明提供經遺傳工程修飾之單株抗體，並描述該些抗體及彼等片段用於腫瘤療法和/或診斷之用途。
N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類作為腫瘤相關抗原
神經節苷脂類係含涎酸的醣神經鞘脂質類，其可在脊椎動物的細胞膜中發現到。這些分子涉及不同功能，例如細胞黏附、訊息傳遞、組織發育及分化、以及腫瘤進展(tumor progression)(Hakomori，PNAS USA 99：225-32,2002)。
數種神經節苷脂類經特徵化為腫瘤相關抗原，這是因為它們在某些類型的癌症中被表現或表現增加。N-羥乙醯基GM3(簡稱NeuGc-GM3)及N-乙醯基GM3(簡稱NeuAc-GM3或僅為GM3)係腫瘤相關抗原。
本發明係關於與N-羥乙醯基GM3及N-乙醯基GM3兩者均具有高親和力結合的單株抗體。
NeuGc-GM3在正常人類組織中不會被表現(Varki，Biochimie 83：615-22,2001)，但可在數種腫瘤中被發現(Marquina等人，Cancer Res 56：5165-71,1996；Fernández等人，Expert Rev Vaccines 2：817-23,2003)。
雖然N-乙醯基GM3常見於正常人類組織中(Svennerholm，in Structure and Function of神經節苷脂類，Plenum Press,New York-London,pp.533-540,1980；Prokazova等人，Biochemistry(Moscow)74：235-49,2009)，但因為其於不同種類癌症中被過量表現，故被定義為一種腫瘤相關抗原(Hersey等人，Int J Cancer 41：336-43,1988；Ravindranath等人，Biochem Biophys Res Commun 353：251-8,2007；Noguchi等人，Glycobiology 16：641-50,2006)。在一項由美國國家癌症中心所協調近期研究中，該研究目標為定出那些抗原應優先作為癌症免疫療法標的，而於該研究結果所選擇的75個抗原中，GM3排名占第48位(Cheever等人，Clinical Cancer Res 15：5323-37,2009)。
N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具有極為類似的結構。它們係由三個單醣單元(涎酸、半乳糖及葡萄糖)及一腦醯胺尾所構成。這二種神經節苷脂類不同之處僅在於存在於N-乙醯基涎酸(NeuAc)的氮官能基中的甲基的酵素性羥化，經此轉換即成為N-羥乙醯基 涎酸(NeuGc)。換言之，NeuAc-及NeuGc-GM3互不相同處僅在它們的涎酸單元中以羥基替換氫原子。然而，這小小的結構差異，導致在免疫系統明顯不同的辨識作用(Portoukalian，Clin Rev Allergy Immunol 19：73-78,2000；Varki,Biochimie 83：615-22,2001)。
辨識N-乙醯基GM3的單株抗體
數種辨識GM3(N-乙醯基)的鼠或人來源之單株抗體已於文獻中描述：M2590 mAb(鼠IgM)(Hirabayashi等人，J Biol Chem 260：13328-33,1985)；FCM1 mAb(人IgM)(Yamaguchi等人，PNAS 84：2416-20,1987)；DH2 mAb(鼠IgG)(Dohi等人，Cancer Res 48,5680-5,1988)；GMR6 mAb(鼠IgM)(Kotani等人，Biochim Biophys Acta 1117：97-103,1992)；L612 mAb(人類IgM)(Hoon等人，Cancer Res 53：5244-20,1993)；mAbs「17」及AH18(人IgM)(Brandt等人，專利號US005610280A,1997)；GMA1 mAb(人IgG)(Mukerjee等人，Hybridoma 17：133-42,1998)。從這八個抗體中，mAbs DH2及L612已顯示對GM3具專一性，而其他六個抗體顯示對其他神經節苷脂類的延長反應性。這些抗體均未顯示辨識N-羥乙醯基GM3或其他N-羥乙醯基化神經節苷脂類。
在更近期報導中，三個抗GM3抗體(稱為GM3A6、GM3A8及GM3A15)係自單鏈Fv(scFv)片段的噬菌體 展示庫所獲得。此庫係自一群癌症病患的抗體基因譜系(antibody gene repertoire)中所構築(Lee等人，J Am Chem Soc 124：12439-46,2002)。這些片段的解離常數(KD)以SPR(表面電漿子共振)/Biacore測定係10-5至10-7M的級值。
一般而言，抗神經節苷脂單株抗體的親和力已發現係在低/中等範圍內。藉由SPR/Biacore解離常數測量數種這些抗體的Fab片段係在10-6至10-7M的級值(Catimel等人，Glycobiology 8：927-38；Boffey等人，J Neuroimmunol 165：92-103,2005；Townson等人，Glycobiology 17：294-303,2007)，僅有下列者為例外，例如抗-GD2及抗GD1b片段顯示KD為10-8M的級值(Boffey等人，J Neuroimmunol 165：92-103,2005；Hu等人，J Immunol：183；5748-55,2009)。
針對N-乙醯基GM3，特別是其低致免疫性，代表非常難以獲得高親和力IgG抗體(Livingston等人，Cancer Immunol Immunother 29：179-84,1989；Portoukalian,Clin Rev Allergy Immunol 19：73-8,2000)。
抗N-乙醯基GM3抗體的臨床前及臨床結果
目前已發表mAbs DH2及L612的體外及體內抗腫瘤活性證據。mAb DH2於體外誘發抗體依賴性細胞毒性且在C57BL/6小鼠中抑制B16黑色素瘤細胞生長(Dohi等人，Cancer Res 48,5680-5,1988。mAb L612以表現N-乙 醯基GM3癌細胞進行體外實驗中產生補體依賴性細胞毒性(Nishinaka等人，J Immunogenetics 48：73-5,1998)。此抗體的經設計版本係呈現六聚體IgM形式，在小鼠中顯示產生補體依賴性細胞死亡能力的增強以及較大的抗腫瘤效果(Azuma等人，Clin Cancer Res 13：2745-50,2007)。
mAb L612已被用在臨床的第I期試驗，該試驗有九位轉移性黑色素瘤病患參與(Irie等人，Cancer Immunol Immunother 53：110-7,2004)。至今，此為唯一已被報導的抗N-乙醯基GM3抗體臨床試驗。數位病患顯示對治療的臨床反應。又，即使N-乙醯基GM3在正常組織中的普遍性，但該抗體未產生毒性反應。
N-乙醯基GM3神經節苷脂亦為臨床上的主動免疫療法之標的，即針對黑色素瘤病患的GM3/VSSP疫苗第I期試驗(Guthmann等人，J Immunother 27：242-51,2004)。先前，針對猴子所進行的為期12個月實驗中，此疫苗產生強烈的IgM及IgG同型兩者抗GM3抗體反應而未有產生毒性效果(Bada等人，Exp Toxicol.21：263-7,2002)。在該臨床試驗中，於病患體內產生的抗N-乙醯基GM3抗體係IgM同型。未觀察到認為有毒性的效果。
辨識N-羥乙醯基GM3的單株抗體
二個會辨識N-羥乙醯基GM3而非其N-乙醯基化變異體的單株抗體已描述於文獻中：mAb P3(鼠IgM) (Vazquez等人，Hybridoma 14：551-56,1995)及mAb 14F7(鼠IgG)(Carr等人，Hybridoma 19：241-47,2000)。P3抗體亦辨識其他N-羥乙醯基化神經節苷脂類(Moreno等人，Glycobiology 8,695-708,1998)，而14F7抗體對N-羥乙醯基GM3具專一性。
本發明之目的為該抗體的概念設計及遺傳工程，其係基於14F7抗體變異結構域的胺基酸序列及晶體結構(Krengel等人，J Biol Chem 279：5597-603,2004)。
14F7單株抗體
單株抗體14F7係以寄存號碼ECACC 98101901的融合瘤所製造，已描述於專利申請案EP 0972782/A1。此抗體的人化變異體類及片段係描述於專利申請案WO 2004/094477/A1。
mAb 14F7係IgG免疫球蛋白，其辨識N-羥乙醯基GM3具高專一性(Carr等人，Hybridoma 19：241-47,2000)及高親和力，測量其Fv片段，顯示的解離常數級值為10-8M(Rojas等人，J Immunol Methods 293：71-83,2004)。免疫組織化學研究已顯示14F7辨識數種腫瘤，例如乳腺管道癌及黑色素瘤(Carr等人，Hybridoma 19：241-47,2000)、胃、結腸及胰臟腺癌(Blanco等人，ISRN Gastroenterol,Article ID 645641,2011)、生殖泌尿系統的腫瘤(Blanco等人，ISRN Pathology,Article ID 953803,2011)及神經外胚層腫瘤(Scursoni等人，Clin Devel Immunol,Article ID 245181,2011)。
如透過結合mAb 14F7VH結構域與大量各種不同的鼠及人來源兩者之輕鏈變異結構域的scFv片段噬菌體展示庫的構築所顯示者，14F7的N-羥乙醯基GM3結合位置係位於其重鏈(VH)的變異結構域(Rojas等人，J Immunol Methods 293：71-83,2004)。該噬菌體展示庫片段中超過三分之一者可辨識N-羥乙醯基GM3，其進一步顯示mAb 14F7的VH結構域可與不同輕鏈變異結構域(VL)搭配而同時維持原來的抗體專一性。
在體外及體內研究中，mAb 14F7可產生補體-非依賴性細胞死亡，且在小鼠中抑制骨髓瘤生長(Carr等人，Hybridoma 21：463-8,2002)。在針對乳癌病患進行的前瞻性第I/II期臨床試驗中，經鎝標定的14F7抗體累積在腫瘤中(Oliva等人，Breast Cancer Res Treat 96：115-21,2006)。
更近期的研究顯示，透過在細胞膜產生損傷的新穎機制，14F7殺除腫瘤細胞，但不會殺除正常細胞(Roque-Navarro等人，Mol Cancer Ther 7：2033-41,2008)。如最近使用親和力提高的mAb P3突變型的實驗顯示，mAb 14F7的高親和力構成產生這類死亡的重要因素(Fernandez-Marrero等人，Mol Immunol 48：1059-67,2011)。mAb P3或其嵌合型P3Q均無法誘發表現N-羥乙醯基GM3的腫瘤細胞之補體非依賴性細胞死亡，而Fernandez-Marrero及其同仁(稱為P3Q E99R)所獲得的 展現對N-羥乙醯基GM3親和力(介於mAbs P3Q及14F7的親和力)經提高之突變型，可產生此類細胞死亡。應注意的是，具有較高親和力的mAb 14F7相較於P3 E99R突變型顯示較強的補體-非依賴性細胞死亡效果。
在臨床上靶定N-羥乙醯基GM3的療法
迄今，顯示抗N-羥乙醯基GM3抗體可具有抗腫瘤效果的最有力證據來自二個靶定此種神經節苷脂的分子疫苗的第II/III期臨床試驗。這些產品的其中之一為NGcGM3/VSSP疫苗，在其配方中含有N-羥乙醯基GM3分子。第二個產品係稱之為Racotumumab或1E10的抗個體遺傳型抗體(Fernández等人，Clin Devel Immunol,Article ID 814397,2010)。兩種疫苗在癌症病患均誘發高度抗N-羥乙醯基GM3抗體效價，並明顯顯示抗腫瘤效果(Fernández等人，Clin Devel Immunol,Article ID 814397,2010；Hernández等人，J Immunol 186：3735-44,2011)。
抗體片段的噬菌體展示庫
本發明的發明標的係雙重專一性抗體，其係自特別為此目的所設計的scFv片段噬菌體展示庫所獲得。
抗體片段的噬菌體展示是一種高速技術，能構築含有大量(達至數十億)具有不同胺基酸序列的片段庫、並後續篩選該些具有所欲專一性及親和力性質的片段 (Hoogenboom,Methods Mol Biol 178：1-37,2002)。
具雙重專一性的抗體
癌症是一種具有遺傳異質性特徵的疾病，這使癌症難以使用單一治療用劑來治療。為此理由，靶定不同癌症相關抗原的合併療法具有較高的成功可能性。依此方向的可能方式係結合具有不同專一性的抗體。然而，此類療法由於開發及製造各個抗體的高成本而極為昂貴。
使用遺傳工程，已可創造各種方法以獲得具有辨識二種或更多分子的能力之抗體或抗體片段。最常用的方法包含結合超過一個抗體結合區，各區具有不同專一性，成為單一分子構築(Hudson and Souriau,Nat Med 9：129-34,2003；Hollander,Immunotherapy 1：211-22,2009)。
在近期，已有描述顯示雙重專一性抗體的新穎概念性設計。在此新方式中，單株抗體的結合位置經改造以辨識第二個抗原，而同時保有原來抗原辨識。藉由使用噬菌體展示技術，此新穎設計應用至抗體Herceptin。結果，獲得的突變型，不只保有結合至原來抗原(HER2分子)的高親和力、亦具有辨識血管內皮生長因子(VEGF)的高親和力(Bostrom等人，Science 323：1610-14,2009)。此種具雙重專一性抗體(「二合一」抗體)的新穎概念性設計具有數種優點。其中一個非常重要的優點是雙重專一性抗體可輕易地以單株抗體形式製造。
發明詳細說明
本發明係關於對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具雙重專一性及高親和力之重組抗體。衍生自這些抗體的任何片段亦為本發明所包括的範圍。
在一較佳實施態樣中，本發明係關於對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具雙重專一性及高親和力之抗體，其中該抗體的重鏈變異區含有下列CDR(互補決定區)：
CDR-H1 GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17
CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34
在另一較佳實施態樣中，本發明係關於一種抗體，其中該重鏈變異區的序列為SEQ ID NO：1：
在另一特定實施態樣中，本發明係關於一種單株抗體，其中該重鏈變異區具有SEQ ID NO：1的序列：
且輕鏈變異區具有SEQ ID NO：2的序列：
在另一態樣中，本發明係關於一種單株抗體，其中該重鏈變異區的序列為SEQ ID NO：1：
而輕鏈變異區的序列為任何抗體輕鏈變異區的序列。
在另一態樣中，該輕鏈變異區為任何人抗體的輕鏈變異區。
在另一特定態樣中，該輕鏈變異區為任何人化抗體的輕鏈變異區。
在一較佳實施態樣中，本發明係關於一種抗體，其中該重鏈結合結構域包含選自由下列序列所組成的群組之CDR-H1序列：
CDR-H1 GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3
CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：4
CDR-H1 GYRFTSNQIH,SEQ ID NO：5
CDR-H1 GYSFNRYQIH,SEQ ID NO：6
CDR-H1 GYSFRRYQIH,SEQ ID NO：7
CDR-H1 GYSITRYQIH,SEQ ID NO：8
CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：9
CDR-H1 GYSFKSYQIH,SEQ ID NO：10
CDR-H1 GYSFTSYQIH,SEQ ID NO：11
CDR-H1 GYRFTRYWIH,SEQ ID NO：12
CDR-H1 GYTFTRYQIH,SEQ ID NO：13
CDR-H1 GYPFTRYQIH,SEQ ID NO：14
CDR-H1 GYSFSRYQIV,SEQ ID NO：15
CDR-H1 GYHFTRYQIH,SEQ ID NO：16
在另一實施態樣中，本發明之抗體的特徵在於CDR-H2序列係選自由下列序列所組成的群組：
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17
CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD,SEQ ID NO：18
CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：19
CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：20
CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD,SEQ ID NO：21
CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：22
CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD,SEQ ID NO：23
CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD,SEQ ID NO：24
CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：25
CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：26
CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：27
CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：28
CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD,SEQ ID NO：29
CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：30
CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：31
CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD,SEQ ID NO：32
CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD,SEQ ID NO：33
在另外的實施態樣中，本發明之抗體的特徵在於 CDR-H3序列係選自由下列序列所組成的群組：
CDR-H3....ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34
CDR-H3....ESPRFRRGRYYYAMDY,SEQ ID NO：35
CDR-H3....ESPRMRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：36
CDR-H3....ESPRVRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：37
CDR-H3....ESPRLRRGLYYYAMDY,SEQ ID NO：38
在另一實施態樣中，本發明之抗體包含任何如上所列之CDR H1、H2及H3序列的任何組合。
在另一實施態樣中，本發明之抗體特徵在於CDR-H2序列和/或CDR-H3序列包含至少一選自由下列所組成的群組之胺基酸取代：CDR-H2 Asp 52被Ala、Glu、Asn、Ser或Thr取代
CDR-H2 Ala 53被Asp、Glu、Gly、His、Leu、Ser、Thr或Tyr取代
CDR-H3 Arg 100-Arg 100A被Ala-Lys、His-Arg或Thr-Arg取代
CDR-H3 Gly 100B被Ala、Asp、Phe、Leu、Gln、 Arg或Ser取代
CDR-H3 Tyr 100 D被Phe取代
且另包含任何來自抗體的輕鏈。
在另一特定實施態樣中，本發明的抗體包含人IgG1重鏈恆定區及人κ輕鏈恆定區。
在另一態樣中，本發明係關於本發明之抗體的Fab、Fab'、(Fab)2及scFv片段。
本發明的片段特徵在於：CDR-H1序列，係選自由下列序列所組成的群組：
CDR-H1 GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3
CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：4
CDR-H1 GYRFTSNQIH,SEQ ID NO：5
CDR-H1 GYSFNRYQIH,SEQ ID NO：6
CDR-H1 GYSFRRYQIH,SEQ ID NO：7
CDR-H1 GYSITRYQIH,SEQ ID NO：8
CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：9
CDR-H1 GYSFKSYQIH,SEQ ID NO：10
CDR-H1 GYSFTSYQIH,SEQ ID NO：11
CDR-H1 GYRFTRYWIH,SEQ ID NO：12
CDR-H1 GYTFTRYQIH,SEQ ID NO：13
CDR-H1 GYPFTRYQIH,SEQ ID NO：14
CDR-H1 GYSFSRYQIV,SEQ ID NO：15
CDR-H1 GYHFTRYQIH,SEQ ID NO：16
CDR-H2序列，係選自由下列序列所組成的群組：
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17
CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD,SEQ ID NO：18
CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：19
CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：20
CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD,SEQ ID NO：21
CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：22
CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD,SEQ ID NO：23
CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD,SEQ ID NO：24
CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：25
CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：26
CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：27
CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：28
CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD,SEQ ID NO：29
CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：30
CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：31
CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD,SEQ ID NO：32
CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD,SEQ ID NO：33
CDR-H3序列，係選自由下列序列所組成的群組：
CDR-H3....ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34
CDR-H3....ESPRFRRGRYYYAMDY,SEQ ID NO：35
CDR-H3....ESPRMRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：36
CDR-H3....ESPRVRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：37
CDR-H3....ESPRLRRGLYYYAMDY,SEQ ID NO：38
在另一實施態樣中，本發明之片段包含任何如上所列之CDR H1、H2及H3序列的任何組合。
這些抗體及它們的片段可用於本發明說明書中所揭露的診斷及治療目的。因此，在另一態樣中，本發明係關於一種組成物，其包含本發明之抗體和/或這些抗體的片段，並用於診斷或治療與神經節苷脂抗原N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3相關的疾病。
較佳的是，本發明包含組成物、包括醫藥組成物，其包括具有對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3具雙重專一性及高親和力的一或數個抗體或衍生彼等抗體之片段。更佳的是，本發明包含醫藥組成物其含有至少一本發明之抗體和/或片段及醫藥上可接受之載體和/或佐劑。再更佳的是，本發明包含一種含有重鏈變異區具有SEQ ID NO：1且輕鏈變異區具有SEQ ID NO：2的抗體。
在一態樣中，本發明亦係關於治療方法，其包含將本 發明之抗體及衍生自彼等抗體之片段用於具有至少表現N-乙醯基GM3或N-羥乙醯基GM3神經節苷脂抗原的其中一者的腫瘤之個體。在一特定實施態樣中，該個體係人類。
在另外態樣中，本發明係關於一種試劑套組，其可用於腫瘤診斷，包含衍生自彼等抗體中的至少一者。在較佳實施態樣中，此試劑套組的用途包含診斷基於例如來自病患的組織檢體或體液中有N-乙醯基GM3和/或N-羥乙醯基GM3的存在，像是腫瘤組織檢體、血液檢體等等。
獲得本發明之抗體的方法 以mAb 14F7為基礎的scFv片段噬菌體展示庫設計及構築
本發明之抗體及抗體片段係從特別為本發明目的所設計之單鏈Fv(scFv)抗體片段的噬菌體展示庫所獲得。首先，此庫的新穎性及理論基礎為謹慎篩選scFv胺基酸序列中欲隨機化的位置，其侷限於具有參與抗原結合高度可能性的區域。
在本發明說明書中，使用卡巴(Kabat)編號系統以編號VH抗體結構域的胺基酸序列。針對本發明之標的的抗體及片段，此編號系統在位置52(52A)、82(82A、82B、82C)及100(從100A至100H)後引入插入字母。
scFv片段的輕鏈變異結構域(VL)稱為3Fm，自先前的研究獲得(Rojas等人，J Immunol Methods 293：71-83,2004)，其經選擇作為唯一VL結構域來構築scFv 庫。3Fm scFv片段含有14F7 mAb的VH結構域，而其VL結構域係自鼠輕鏈庫提取，因此與原來14F7 mAb的VL結構域不相關。然而，即使它們的輕鏈間有明顯差異，該3Fm片段維持mAb 14F7所顯示的對N-羥乙醯基GM3專一性及高親和力。重要的是，該3Fm片段可於細菌表現。
考量到Rojas等人(J Immunol Methods 293：71-83,2004)及Krengel等人(J Biol Chem 279：5597-603,2004)的實驗數據指出輕鏈對於抗原辨識不重要，庫中的VL結構域的序列維持不變。
mAb 14F7的VH序列用以作為基礎序列來設計scFv庫的VH結構域。篩選欲突變的位置群組均位於VH高度變異環，乃基於14F7 Fab片段晶體結構的分析(Krengel等人，J Biol Chem 279：5597-603,2004)及數據顯示僅有VH結構域係對NeuGc-GM3結合為重要的。篩選欲突變的位置係基於二個主要標準：1)所作的突變最好應使胺基酸殘基暴露於溶劑；以及2)欲突變的位置限定於自VH中的位置52處的半徑12埃之區域內。後者的標準是基於Krengel等人(J Biol Chem 279：5597-603,2004)所報導的突變實驗，其顯示胺基酸Asp 52參與14F7 mAb與其抗原的交互作用。
VH結合位置中共二十個位置藉由調整VH結構域基因合成流程予以溫和性隨機化(soft randomization)(Fairbrother等人，Biochemistry 37：17754-64,1998)。 使用此溫和性隨機化程序，可在各個經選定之變異位置引入二十個天然胺基酸中的任一者，而同時於各個分子保有相對原來mAb 14F7的VH序列之有限度歧異性。
將下列位置予以隨機化：Ser 28、Phe 29、Thr 30、Ser 31、Trp 33、Ile 34、Tyr 50、Ile 51、Asp 52、Ala 53、Thr 54、Tyr 56、Glu 58、Arg 98、Leu 99、Arg 100、Arg 100A、Gly 100B、Ile 100C及Tyr 100D。
Phe 29、Ile 34及Ile 51為其中三個予以突變的位置，對應著殘基為埋入蛋白質中的疏水性胺基酸，且對保有CDR H1及H2立體構形是重要的。特別針對這三個胺基酸以及CDR H3中的Leu 99，係使用特別經設計的密碼子：分別為TTT,ATT,ATT及TTG，其中標底線的核苷酸代表該核苷酸(85%)與其他三種核苷酸(15%)等莫耳混合的混合。這些針對疏水性胺基酸的部分簡併化(partially degenerated)密碼子，有利於插入原來胺基酸於對應位置。此設計背後的目的係為產生有限度的歧異性，其對CDR立體構形僅具有小量效果，同時可對結合親和力具有某些修飾作用。
考量到Krengel及其同仁(Krengel等人，J Biol Chem 279：5597-603,2004)闡明胺基酸Asp 52對於14F7結合至NeuGc-GM3的重要性，針對此位置設計特定密碼子混合(G-80%/A-20%)A(C-50%/T-50%)，其編碼六個不同且多為小及中型尺寸殘基的胺基酸，其中原本的天冬胺酸占較多量。至於剩餘的15個隨機化位置，特定位 置之三聯體編碼(triplet coding)的各鹼基係以含85%原來核苷酸及15%另外三個核苷酸混合的混合物來合成。
經設計的VH基因集合經合成並選殖至pHAB噬菌體質體(phagemid)載體，含有編碼3Fm scFv片段的基因(Rojas等人，J Immunol Methods 293：71-83,2004)。呈現scFv片段的噬菌體使用M13 K07輔助噬菌體從庫中取出(rescue)，之後以Marks及同仁(J Mol Biol 222：581-97,1991)所述之程序純化。
取得具有高親和力辨識N-乙醯基GM3神經節苷脂能力、而同時保有對N-羥乙醯基GM3高親和力辨識的突變scFv片段，毫無疑問地，是令人驚訝的結果。事實上，mAb 14F7的VH結構域之胺基酸改變賦予這些突變型新穎性質，是無法從現有數據預測的。由於噬菌體展示庫的理論設計結合經調整之溫和性隨機化程序以及謹慎篩選欲突變位置，基於結構知識、目標是將展示庫的序列歧異性集中至與神經節苷脂抗原結合有關的區域，而可獲得此種對二種神經節苷脂類具雙重專一性及高親和力的抗體片段。
篩選具雙重專一性的scFv片段
本發明之標的係對N-羥乙醯基GM3及N-乙醯基GM3神經節苷脂類具雙重專一性抗體片段，係自僅使用N-乙醯基GM3作為標的分子進行三回合噬菌體篩選及放大後的經構築之庫所獲得，這是因為以N-羥乙醯基GM3 單回合篩選的測試，顯示展示庫含有大量片段可辨識此抗原所致。
篩選回合係依照類似Rojas及同仁(J Immunol Methods 293：71-83,2004)所述程序進行。以50ml的量、使用指數生長TG1細胞來取出經篩選的噬菌體(如Marks等人，J Mol Biol 222：581-97,1991中所述)。經純化的噬菌體用作為下一篩選回合的起始材料。在三回合後，於96孔盤取出各個經選殖的噬菌體殖株(Marks等人，J Mol Biol 222：581-97,1991)。
經選殖的噬菌體辨識N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3之能力則依照Rojas等人，J Immunol Methods 293：71-83,2004中所述的類似程序以ELISA評估。該些顯示對兩種神經節苷脂類均有高結合能力的抗體片段之核苷酸序列則由Macrogen(Korea)測定。
特徵分析具雙重專一性抗體的結合位置
除了對NeuAc-GM3及NeuGc-GM3具雙重專一性的片段，亦將其他源自該庫的抗體片段定序。此包括在ELISA實驗中僅N-羥乙醯基GM3辨識的片段以及無法辨識二種神經節苷脂類中任一者的片段。
又，對經選定的胺基酸位置群組的結合之影響，藉由從具雙重專一性片段其中之一開始進行各個位置的詳盡式隨機化(exhaustive randomization)來研究。
這些研究能判定在結合位中那些胺基酸對於N-羥乙 醯基GM3及N-乙醯基GM3的雙重辨識是最重要的。表1顯示從庫中提取、屬於具雙重專一性的scFv片段的VHCDR胺基酸序列群組。表2顯示在VH結構域那些序列位置與雙重專一性有關，以及那些位置允許不同程度的胺基酸變異性。
僅在CDR H1中的二或三個突變即足以賦予該片段除了結合至N-羥乙醯基GM3之外亦可結合至N-乙醯基GM3的能力。特定言之，Ser 28→Arg、Thr 30→Arg及Trp 33→Gln的取代所產生的突變型(RRQ)對二種神經節苷脂類具有高親和力。
構築對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具雙重專一性的重組免疫球蛋白
本發明包含對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具雙重專一性、不論是人或鼠來源或來自任何其他物種任何同型的免疫球蛋白，以及這些免疫球蛋白的任何類型片段。任何所欲同型之免疫球蛋白可從具有結合至二種神經節苷脂類能力的scFv片段的VH結構域的胺基酸序列以及人或鼠來源或來自任何物種的VL序列進行構築。此目標可利用已建立之分子生物學技術，用任何經描述有效表現重組蛋白、特別是單株抗體的載體來達成。
在一實施態樣中，可使用常用於在哺乳動物細胞中表現免疫球蛋白的pAH4604及pAG4622(Coloma等人，J Immunol Methods 52：89-104,1992)載體來構築IgG1同型 免疫球蛋白。
用於構築具雙重專一性的免疫球蛋白之VH序列可直接從本發明所構築之噬菌體展示庫來提取，或可用表1中所示之實驗數據為基礎進行設計，維持序列中對達成雙重專一性具重要性的位置，並引入於CDR位置中可允許某些變異性程度的任何其他適當胺基酸。所使用的VL序列允許大的變異性程度，框架及高變異區兩者均可(如Rojas等人，J Immunol Methods 293：71-83,2004所闡述)。
在另一實施態樣中，本發明亦提供嵌合免疫球蛋白，即具有人恆定區及鼠變異區以及人化變異區的免疫球蛋白。
醫藥組成物
在一實施態樣中，本發明提供包含一或多個本發明之抗體或彼等之片段的醫藥組成物。在一實施態樣中，這些醫藥組成物亦包含醫藥上可接受之賦形劑。
當用於本發明中時，用語「醫藥上可接受之賦形劑載體或佐劑」包含可相容於醫藥投予的溶劑、分散介質、塗膜、抗細菌及抗真菌劑、等張劑及延遲吸收劑等等。補充性活性化合物亦可併入該組成物中。「醫藥上可接受之賦形劑載體或佐劑」亦可指涉適合與抗體或片段投予個體的載體或佐劑，該載體或佐劑不會破壞抗體或片段的醫藥活性、且當投予足以投遞該抗體治療用量的劑量時為無毒 性。
醫藥組成物經調配而適合其所欲之投予途徑。不經腸道投予實例其中包括例如不經腸道、皮內、經靜脈及皮下。用於不經腸道、皮內或皮下投予的溶液或懸浮液可包括下列組分：無菌稀釋劑(例如注射用水、生理食鹽水、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑(例如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯)；抗氧化劑(例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)；螯合劑(例如伸乙二胺四乙酸)；緩衝液(例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)；以及用於調整滲性用劑(例如氯化鈉或右旋糖)。pH可用酸或鹼調整，例如鹽酸或氫氧化鈉。不經腸道製劑可包封於以玻璃或塑膠所製成的安瓿瓶、可丟棄式注射器或多劑量小瓶。
有利的是調配不經腸道組成物呈劑量單位形式，以便於投予及劑量的一致化。在本文中，單位劑量形式係指實體上分離的單位，適用於針對待治療個體單劑量之用，每單位含有預定量的活性化合物，其經過計算以產生併以需載體藥物所欲治療效果。
醫藥組成物可與使用說明書一同容納於容器、包裝或分配器中。
治療方法
本發明之抗體可用於治療表現N-羥乙醯基GM3或N-乙醯基GM3或這兩種神經節苷脂類的腫瘤。
本發明之抗體的適合治療劑量在每劑約1mg至約1克的範圍內，較佳為每劑約50mg至約500mg。本發明之抗體藉由任何適合方式投予，包括不經腸胃、皮下、肺內、鼻內及顱內途徑，且若需局部治療，可為病灶內途徑。
治療方法包含依照熟習本技術者已知適合以單株抗體或衍生之片段的被動式治療的劑量方案，將醫藥組成物投予病患。治療方法實例在未侷限本發明所請範圍下，包含在為期例如6週期間每週投予200mg本發明之抗體的藥量，及於後續維持治療期間例如每2或3週投予200mg本發明之抗體的藥量。
圖1. A)於ELISA實驗中使用不同抗體濃度以mAb 7C1辨識神經節苷脂類N-羥乙醯基GM3及N-乙醯基GM3。B)於ELISA實驗中藉由14F7hT抗體(人化版的mAb 14F7，具有人IgG1同型)、7C1及T1h(人化抗體，具有人IgG1同型，用作為陰性對照組)辨識N-羥乙醯基GM3神經節苷脂。C)於TLC平板上免疫染色N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類(分別各在4片平板上的第1及第2條)。從左至右：分別為以苔黑酚化學染色及以抗體14F7hT、7C1及T1h免疫染色。僅7C1抗體顯示與N-乙醯基GM3的反應性。D)於ELISA實驗中藉由抗體14F7hT及7C1辨識不同神經節苷脂類組。
圖2. 於流式細胞技術實驗中以mAb 7C1辨識表現N-乙醯基GM3或N-羥乙醯基GM3的腫瘤細胞株。A)經轉形腫瘤細胞株L1210-SH的染色，該細胞株僅表現GM3神經節苷脂的N-乙醯基變異體。B)野生型腫瘤細胞株L1210的染色，該細胞株主要表現N-羥乙醯基GM3神經節苷脂。
圖3. 7C1抗體相對於抗體14F7hT對表現N-乙醯基GM3或N-羥乙醯基GM3的腫瘤細胞之細胞毒性效果。A)對野生型細胞株L1210的細胞毒性效果。B)對經轉形細胞株L1210-SH的細胞毒性效果。C)實驗結果的總結表。
圖4. A)於流式細胞技術實驗中以人化7C1抗體辨識Balb/c小鼠脾細胞。B)使用經抗體7C1處理、來自Balb/c小鼠的經純化B淋巴球之細胞存活性分析。在兩者實驗中，B淋巴球以抗B220多株抗體染色。嵌合抗體C5Q係用作為陰性對照組。
實施例
實施例1. 構築對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具雙重專一性的重組IgG1免疫球蛋白(7C1抗體)。
VH基因從對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具雙重專一性的scFv片段的VH結構域之胺基 酸序列作為起點來設計。此基因針對哺乳動物細胞中表現而經最佳化。編碼原來mAb 14F7的VL結構域的基因以相似方式設計。這二個基因由Geneart(Germany)合成。
經選擇的VH結構域相對於原來14F7 VH序列於胺基酸層級僅呈現三個突變。這些突變為：Ser 28→Arg、Thr 30→Arg及Trp 33→Gln。
依照已知的分子生物學程序，將編碼VH及VL的基因分別選殖至載體pAH4604及pAG4622(Coloma等人，J Immunol Methods 52：89-104,1992)中。些載體係用於在哺乳動物細胞中表現免疫球蛋白。該pAH4604載體含有人IgG1同型的重鏈恆定區，而pAG4622載體含有人κ鏈的恆定結構域。不會產生抗體的Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞用來表現重組免疫球蛋白。為此目的，將細胞循序地轉染經獲得針對重鏈及輕鏈的基因構築。這些細胞所製造的免疫球蛋白以蛋白質A管柱純化。
所獲得的重組抗體稱為7C1。
mAb 7C1辨識N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類的能力，依照類似前人所述程序，以ELISA、使用不同抗體濃度來評估(Rojas等人，J Immunol Methods 293：71-83,2004)。如圖1A中所示，二個定量結合至二個神經節苷脂類的抗體光學密度(OD)曲線非常類似，mAb 7C1可以幾乎等同的親和力結合至二個神經節苷脂類。又，如圖1B所示，mAb 7C1及N-羥乙醯基GM3(以及換成mAb 7C1及N-乙醯基GM3)之間結合的 親和力與所觀察到的mAb 14F7與N-羥乙醯基GM3結合之親和力非常類似。
這些實驗係使用具有人IgG1同型的人化版本的mAb 14F7(稱為14F7hT)來進行，其保留原來14F7抗體的結合特性(Fernandez-Marrero等人，Immunobiology 216：1239-47,2011)。抗體T1h(抗CD6)亦具有人IgG1同型，係用作為陰性對照組。
此外，mAb 7C1結合至二種神經節苷脂類的能力藉由薄層層析(TLC)證明。如圖1C中所示，mAb 7C1可藉由N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3的經純化樣品產生染色色帶。
如圖1D中所示，抗體未辨識任何來自包括N-乙醯基及N-羥乙醯基型兩種神經節苷脂的多樣神經節苷脂類組的分子，mAb 7C1的專一性確為雙重而非多重專一性。
實施例2. 藉由mAb 7C1辨識表現N-乙醯基GM3或N-羥乙醯基GM3的腫瘤細胞株。
mAb 7C1辨識表現N-乙醯基GM3或N-羥乙醯基GM3的腫瘤細胞之能力，係使用二種L1210小鼠淋巴球性白血病細胞株(來自美國菌種保存中心)變異株，以流式細胞技術來證明。野生型細胞(L1210)表現N-羥乙醯基GM3，而稱之為L1210-SH的基因轉形型則表現N-乙醯基GM3(Fernández-Marrero等人，Mol Immunol 48：1059-67,2011)。
L1210的高N-羥乙醯基GM3表現量可由mAb 14F7對這些細胞的明顯辨識來證實。又，分析這些細胞醣脂質含量，顯示85：15的NeuGc-GM3/NeuAc-GM3比率。(Roque-Navarro等人，Mol Cancer Ther 7：2033-41,2008)。
L1210-SH細胞株是會表現N-乙醯基GM3而非N-羥乙醯基的變異株，由慢病毒轉導抑制CMP-NeuAc羥化酶表現的短干擾RNA，而將N-乙醯基型涎酸轉換為N-羥乙醯基型來獲得(Shaw and Schauer,Biol Chem Hoppe Seyler 369：477-86,1988)。相對於野生型株，此種經轉形之細胞株顯示N-羥乙醯基GM3表現劇烈減少(Fernández-Marrero等人，Mol Immunol 48：1059-67,2011)。
流式細胞技術實驗係用FACScan設備(Becton Dickinson)進行。於每次分析中，收集104個細胞。使用經FITC共軛之抗人IgG抗體來作細胞螢光染色。T1h抗體係用以作為陰性對照組。
如圖2A所示，mAb 7C1可染色L1210-SH細胞(表現N-乙醯基GM3)，相反地，mAb 14F7hT無法辨識這些細胞。又，mAb 7C1亦染色具有高度表現N-羥乙醯基GM3的野生型L1210細胞。在本例中用作為陽性對照組之野生型細胞亦被mAb 14F7hT染色(圖2B)。應注意的是，藉由mAb 7C1的野生型L1210細胞染色強度大於mAb 14F7hT所產生染色強度，這可藉由mAb 7C1亦會與野生型細胞 中表現的N-乙醯基GM3分子結合來解釋。
實施例3. mAb 7C1對表現N-乙醯基GM3或N-羥乙醯基GM3的腫瘤細胞之細胞毒性作用。
mAb 7C1以補體-非依賴性機轉殺除表現N-乙醯基GM3或N-羥乙醯基GM3腫瘤細胞的能力，於使用L1210及L1210-SH細胞株的實驗中證明。
在這些實驗中，細胞首先以1百萬個細胞/毫升的濃度懸浮於具有1%胎牛血清培養基中，再於5% CO2氣氛、37℃下培養於100微克/毫升的抗體中共3小時。之後，將細胞洗滌、懸浮於具有10微克/毫升碘化丙啶(簡稱PI，Sigma-Aldrich)的PBS中，並接著藉由流式細胞技術分析。藉由測量正面及側面散射及PI內化來辨別死亡細胞。散射量位在活細胞特徵範圍之外且有PI染色的細胞視為死亡，並計數之。
相對於僅在野生型L1210細胞產生細胞死亡的mAb 14F7hT，具雙重專一性的抗體7C1在野生型L1210細胞株(圖3A)及表現N-乙醯基GM3的經轉形之L1210-SH細胞(圖3B)二者均產生明顯細胞死亡效果。應注意的是，藉由7C1抗體所產生對於野生型L1210細胞的細胞毒性作用(95%)，強於mAb 14F7hT所產生者(54%)，這顯示mAb 7C1可對具有混合過量表現N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類的細胞產生強烈細胞毒性作用。圖3C總結這些實驗的結果。
實施例4. 藉由mAb 7C1辨識正常細胞而未產生細胞死亡。
在使用Balb/c小鼠脾細胞的實驗中，顯示在腫瘤細胞產生強烈細胞毒性作用的雙重特異性7C1抗體，在表現N-羥乙醯基GM3或N-乙醯基GM3的正常細胞中並不會產生細胞死亡。
在流式細胞技術實驗中，Balb/c小鼠淋巴球以抗B220多株抗體(Dako，1：200稀釋)及mAb 7C1(濃度為10微克/毫升)雙重染色。細胞存活性分析係使用以mAb 7C1培養的Balb/c脾臟B淋巴球進行。將經磁珠(Miltenyi Biotec)純化的1百萬個B淋巴球，於37℃、5% CO2氣氛下，以溶於補充1% BSA的DMEM-F12培養基之50微克抗體培養3小時。經抗體誘發的細胞死亡以PI嵌入來測定。人化抗體C5Q於細胞辨識實驗及細胞存活性分析中係作為陰性對照組。
如圖4A所示，mAb 7C1使Balb/c B淋巴球以及其他脾細胞有強烈染色。但，即使mAb 7C1強烈辨識這些細胞，但如圖4B所示，以經純化之B淋巴球進行的細胞存活性分析，顯示mAb 7C1對正常B淋巴球不具有細胞毒性作用。
<110> 分子免疫學中心(CENTRO DE INMUNOLOGIA MOLECULAR)
<120> 對神經節苷脂類具雙重專一性之重組抗體及其用途
<130> 對神經節苷脂類具雙重專一性之重組抗體及其用途
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 重組
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<211> 16
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<213> 重組
<400> 38

Claims (22)

  1. 一種單株抗體，其特徵在於：該抗體對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具有雙重專一性及高親和力。
  2. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其中該重鏈變異區含有下列CDR(互補決定區)：CDR-H1：GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3 CDR-H2：YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17 CDR-H3：ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該重鏈變異區之序列為SEQ ID NO：1：
  4. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該CDR-H1之序列係選自由下列序列所組成的群組：CDR-H1 GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：4 CDR-H1 GYRFTSNQIH,SEQ ID NO：5 CDR-H1 GYSFNRYQIH,SEQ ID NO：6 CDR-H1 GYSFRRYQIH,SEQ ID NO：7 CDR-H1 GYSITRYQIH,SEQ ID NO：8 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：9 CDR-H1 GYSFKSYQIH,SEQ ID NO：10 CDR-H1 GYSFTSYQIH,SEQ ID NO：11 CDR-H1 GYRFTRYWIH,SEQ ID NO：12 CDR-H1 GYTFTRYQIH,SEQ ID NO：13 CDR-H1 GYPFTRYQIH,SEQ ID NO：14 CDR-H1 GYSFSRYQIV,SEQ ID NO：15 CDR-H1 GYHFTRYQIH,SEQ ID NO：16。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該CDR-H2之 序列係選自由下列序列所組成的群組：CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17 CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD,SEQ ID NO：18 CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：19 CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：20 CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD,SEQ ID NO：21 CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：22 CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD,SEQ ID NO：23 CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD,SEQ ID NO：24 CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：25 CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：26 CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：27 CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：28 CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD,SEQ ID NO：29 CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：30 CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：31 CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD,SEQ ID NO：32 CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD,SEQ ID NO：33。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該CDR-H3之序列係選自由下列序列所組成的群組：CDR-H3....ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34 CDR-H3....ESPRFRRGRYYYAMDY,SEQ ID NO：35 CDR-H3....ESPRMRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：36 CDR-H3....ESPRVRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：37 CDR-H3....ESPRLRRGLYYYAMDY,SEQ ID NO：38。
  7. 一種抗神經節苷脂單株抗體，其特徵在於該抗體對N-乙醯基GM3及N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類具有雙重專一性及高親和力，且其特徵在於該抗體包含由下列序列所組成的群組之CDR H1、H2及H3序列的任何組合： CDR-H1 GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：4 CDR-H1 GYRFTSNQIH,SEQ ID NO：5 CDR-H1 GYSFNRYQIH,SEQ ID NO：6 CDR-H1 GYSFRRYQIH,SEQ ID NO：7 CDR-H1 GYSITRYQIH,SEQ ID NO：8 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：9 CDR-H1 GYSFKSYQIH,SEQ ID NO：10 CDR-H1 GYSFTSYQIH,SEQ ID NO：11 CDR-H1 GYRFTRYWIH,SEQ ID NO：12 CDR-H1 GYTFTRYQIH,SEQ ID NO：13 CDR-H1 GYPFTRYQIH,SEQ ID NO：14 CDR-H1 GYSFSRYQIV,SEQ ID NO：15 CDR-H1 GYHFTRYQIH,SEQ ID NO：16 CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17 CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD,SEQ ID NO：18 CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：19 CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：20 CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD,SEQ ID NO：21 CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：22 CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD,SEQ ID NO：23 CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD,SEQ ID NO：24 CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：25 CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：26 CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：27 CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：28 CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD,SEQ ID NO：29 CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：30 CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：31 CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD,SEQ ID NO：32 CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD,SEQ ID NO：33 CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34 CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY,SEQ ID NO：35 CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：36 CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：37 CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY,SEQ ID NO：38。
  8. 如申請專利範圍第1至7項之單株抗體，其中該輕 鏈變異區之序列為SEQ ID NO：2：
  9. 如申請專利範圍第1至7項之單株抗體，其中該輕鏈變異區之序列為任何抗體輕鏈變異區之序列。
  10. 如申請專利範圍第1至7項之單株抗體，其中該輕鏈變異區之序列為任何人化抗體輕鏈變異區之序列。
  11. 如申請專利範圍第2項之抗體，其中CDR-H2序列和/或CDR-H3序列包含至少一選自由下列所組成的群組之胺基酸取代：CDR-H2 Asp 52被Ala、Glu、Asn、Ser或Thr取代CDR-H2 Ala 53被Asp、Glu、Gly、His、Leu、Ser、Thr或Tyr取代CDR-H3 Arg 100-Arg 100A被Ala-Lys、His-Arg或Thr-Arg取代CDR-H3 Gly 100B被Ala、Asp、Phe、Leu、Gln、Arg或Ser取代CDR-H3 Tyr 100 D被Phe取代。
  12. 一種片段，其衍生自申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體。
  13. 如申請專利範圍第12項之片段，其中：CDR-H1序列，係選自由下列序列所組成的群組：CDR-H1 GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：4 CDR-H1 GYRFTSNQIH,SEQ ID NO：5 CDR-H1 GYSFNRYQIH,SEQ ID NO：6 CDR-H1 GYSFRRYQIH,SEQ ID NO：7 CDR-H1 GYSITRYQIH,SEQ ID NO：8 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：9 CDR-H1 GYSFKSYQIH,SEQ ID NO：10 CDR-H1 GYSFTSYQIH,SEQ ID NO：11 CDR-H1 GYRFTRYWIH,SEQ ID NO：12 CDR-H1 GYTFTRYQIH,SEQ ID NO：13 CDR-H1 GYPFTRYQIH,SEQ ID NO：14 CDR-H1 GYSFSRYQIV,SEQ ID NO：15 CDR-H1 GYHFTRYQIH,SEQ ID NO：16 CDR-H2序列，係選自由下列序列所組成的群組：CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17 CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD,SEQ ID NO：18 CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：19 CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：20 CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD,SEQ ID NO：21 CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：22 CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD,SEQ ID NO：23 CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD,SEQ ID NO：24 CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：25 CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：26 CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：27 CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：28 CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD,SEQ ID NO：29 CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：30 CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：31 CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD,SEQ ID NO：32 CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD,SEQ ID NO：33 CDR-H3序列，係選自由下列序列所組成的群組：CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34 CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY,SEQ ID NO：35 CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：36 CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：37 CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY,SEQ ID NO：38。
  14. 如申請專利範圍第13項之片段，其中該片段包含由下列序列所組成的群組之CDR H1、H2及H3序列的任 何組合：CDR-H1 GYRFRSYQIH,SEQ ID NO：3 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：4 CDR-H1 GYRFTSNQIH,SEQ ID NO：5 CDR-H1 GYSFNRYQIH,SEQ ID NO：6 CDR-H1 GYSFRRYQIH,SEQ ID NO：7 CDR-H1 GYSITRYQIH,SEQ ID NO：8 CDR-H1 GYSFTRYQIH,SEQ ID NO：9 CDR-H1 GYSFKSYQIH,SEQ ID NO：10 CDR-H1 GYSFTSYQIH,SEQ ID NO：11 CDR-H1 GYRFTRYWIH,SEQ ID NO：12 CDR-H1 GYTFTRYQIH,SEQ ID NO：13 CDR-H1 GYPFTRYQIH,SEQ ID NO：14 CDR-H1 GYSFSRYQIV,SEQ ID NO：15 CDR-H1 GYHFTRYQIH,SEQ ID NO：16 CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：17 CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD,SEQ ID NO：18 CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：19 CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：20 CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD,SEQ ID NO：21 CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：22 CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD,SEQ ID NO：23 CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD,SEQ ID NO：24 CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：25 CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：26 CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：27 CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：28 CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD,SEQ ID NO：29 CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：30 CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD,SEQ ID NO：31 CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD,SEQ ID NO：32 CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD,SEQ ID NO：33 CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：34 CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY,SEQ ID NO：35 CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：36 CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY,SEQ ID NO：37 CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY,SEQ ID NO：38。
  15. 如申請專利範圍第13或14項之片段，其中該片段為Fab型。
  16. 如申請專利範圍第13或14項之片段，其中該片段為Fab'型。
  17. 如申請專利範圍第13或14項之片段，其中該片段為(Fab)2型。
  18. 如申請專利範圍第13或14項之片段，其中該片段為scFv型。
  19. 一種用於治療表現N-乙醯基GM3和/或N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類的惡性腫瘤之醫藥組成物，其特徵在於該醫藥組成物包含如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體、或衍生自這些抗體中任一者的片段，以及穩定的醫藥載體。
  20. 一種治療表現N-乙醯基GM3和/或N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類的惡性腫瘤之方法，其特徵在於該方法包含將申請專利範圍第19項之醫藥組成物投予需要此類治療的個體。
  21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該個體為人類。
  22. 一種用於診斷表現N-乙醯基GM3和/或N-羥乙醯基GM3神經節苷脂類之疾病的試劑套組，其特徵在於該試劑套組包含如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體、或衍生自這些抗體中任一者的片段。
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