TW201738271A - 對表皮生長因子受體變異體ｉｉｉ具特異性之抗體類及彼等之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗體，其特異性結合至EGFRvIII(表皮生長因子受體變異體III)。本發明進一步提供結合至EGFRvIII及另一抗原(例如CD3)之雙特異性抗體，以及抗體共軛體(例如抗體-藥物共軛體)。本發明進一步關於編碼抗體之核酸，以及獲得此等抗體(單特異性及雙特異性)及抗體共軛體之方法。本發明進一步關於使用這些抗體及抗體共軛體來治療經EGFRvIII調介的病理(包括諸如神經膠母細胞瘤之癌症)之治療方法。

Description

對表皮生長因子受體變異體III具特異性之抗體類及彼等之用途
本發明關於特異性結合至表皮生長因子受體變異體III(EGFRvIII)的抗體(例如全長抗體或其抗原結合片段)。本發明進一步關於異多聚體抗體(heteromultimeric antibody)(例如雙特異性抗體)及抗體共軛體(例如抗體-藥物共軛體)。亦提供包含EGFRvIII抗體之組成物、用於製造及純化此等抗體之方法，以及彼等在診斷及治療之用途。
EGFR變異體III(EGFRvIII)為EGFR的腫瘤特異性突變體，係基因體重排之產物，其常相關於野生型EGFR基因擴增。EGFRvIII係藉由外顯子2至7的框內刪除(in-frame deletion)產生267個胺基酸的刪除並在連結處有甘胺酸取代而形成。該經截斷之受體失去其結合配體能力但獲取持續激酶活性。有趣的是，EGFRvIII常與全長野生型EGFR在相同腫瘤細胞中共同表現。再者，表現 EGFRvIII之細胞展現增生、侵入、血管新生、及對細胞凋亡抗性提高。
EGFRvIII最常見於多形性神經膠質母細胞瘤(GBM)中。估計25至35%的GBM攜有此經截斷之受體。又，其表現常反映更侵犯性表型及不良預後。除了GBM，亦有報導在其他實性腫瘤，諸如非小細胞肺癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌，有EGFRvIII之表現。相反地，EGFRvIII在健康組織中不表現。在正常組織中缺少表現，使EGFRvIII為發展腫瘤特異性靶向療法的理想標靶。迄今，尚未有任何經FDA核准之抗EGFRvIII單株抗體(例如單特異性或雙特異性)確認在治療諸如GBM之癌症具有高親和力、高特異性、及高效價。因此，針對治療諸如GBM之癌症具有經改善之療效及安全性數據(safety profile)且適合用於人患者之抗體(例如單特異性或雙特異性)仍有需求。
在本文中所揭示之發明係關於特異性結合至表皮生長因子受體變異體III(EGFRvIII)之抗體(例如單特異性或雙特異性抗體)及抗體共軛體。在一個態樣中，本發明提供經單離之抗體，其特異性結合至EGFRvIII，其中該抗體包含(a)重鏈變異(VH)區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、 100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144、或145中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、或237中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223、或236中之序列；及/或輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238、或239中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196、或199中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197、或200中之序列。
在另一態樣中，所提供者係經單離之抗體，其特異性結合至EGFRvIII，其中該抗體包含：VH區，其包含顯示於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217、或218中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或VL區，其包含顯示於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213、或215中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。在一些實施態樣中，如本文中所述之VH區包含於不在CDR內的殘基中具有一個或數個保守性胺基酸取代之變異體，及/或如本文中所述之VL區包含於不在CDR內的胺基酸中具有一個或數個胺基酸取代之變異體。例如，在一些實施態樣中，該VH或VL區可包含上述之胺基酸序列或彼之具有於不在CDR內的殘基中不多於10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個保守性取代之變異體。
在一些實施態樣中，所提供者係經單離之抗體，其特異性結合至EGFRvIII，其中該抗體包含：VH區，其包含顯示於SEQ ID NO：5、9、11、15、30、37、或41中之序列；及/或VL區，其包含顯示於SEQ ID NO：6、10、12、16、31、38、或42中之序列。在一些實施態樣中，該VH區包含顯示於SEQ ID NO：5中之序列且該VL區包含顯示於SEQ ID NO：6中之序列。在一些實施態樣中，該VH區包含顯示於SEQ ID NO：9中之序列且該VL區包 含顯示於SEQ ID NO：10中之序列。在一些實施態樣中，該VH區包含顯示於SEQ ID NO：11中之序列且該VL區包含顯示於SEQ ID NO：12中之序列。在一些實施態樣中，該VH區包含顯示於SEQ ID NO：15中之序列且該VL區包含顯示於SEQ ID NO：16中之序列。在一些實施態樣中，該VH區包含顯示於SEQ ID NO：30中之序列且該VL區包含顯示於SEQ ID NO：31中之序列。在一些實施態樣中，該VH區包含顯示於SEQ ID NO：37中之序列且該VL區包含顯示於SEQ ID NO：38中之序列。在一些實施態樣中，該VH區包含顯示於SEQ ID NO：41中之序列且該VL區包含顯示於SEQ ID NO：42中之序列。
在另一態樣中，所提供者係雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係全長之人抗體，其包含特異性結合至標靶抗原(例如EGFRvIII)之該雙特異性抗體之第一抗體變異域，及包含能夠藉由特異性結合至位在人免疫效應細胞上的效應抗原(例如分化簇3(CD3))而召募人免疫效應細胞活性之該雙特異性抗體之第二抗體變異域。在一些實施態樣中，該第一抗體變異域包含重鏈變異(VH)區，其包含顯示於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217、或218中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或輕鏈變異(VL)區，其包含 顯示於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213、或215中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。在一些實施態樣中，該第一抗體變異域包含(a)重鏈變異(VH)區，其包含(i)VH互補決定區域一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144、或145中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、或237中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223、或236中之序列；及/或(b)輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238、或239中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：150、152、155、157、160、163、172、 175、179、183、186、188、191、193、196、或199中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197、或200中之序列。
在一些實施態樣中，該第二抗體變異域包含特異性抗CD3的VH及/或VL區。例如，該第二抗體變異域包含重鏈變異(VH)區，其包含顯示於SEQ ID NO：240中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或輕鏈變異(VL)區，其包含顯示於SEQ ID NO：241中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。在一些實施態樣中，該第二抗體變異域包含(a)VH區，其包含(i)VH CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：244、110、或245中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：246或247中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：248中之序列；及/或VL區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：249中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：250中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：251中之序列。
在一些實施態樣中，如本文中所述之抗體包含恆定區。在一些實施態樣中，如本文中所述之抗體係人IgG1、IgG2或IgG2△a、IgG3、或IgG4亞型。在一些實施態樣中，如本文中所述之抗體包含經醣苷化之恆定區。在一些實施態樣中，如本文中所述之抗體包含具有對一或多個人Fc γ受體的結合親和力降低的恆定區。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體之該第一及第二抗體變異域兩者包含人IgG2(SEQ ID NO：290)的鉸鏈區中位置223、225、及228(例如(C223E或C223R)、(E225R)、及(P228E或P228R))以及在CH3區中的位置409或368(例如K409R或L368E(EU編碼制))之胺基酸修飾。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體之該第一及第二抗體變異域兩者包含人IgG2的位置265(例如D265A)之胺基酸修飾。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體之該第一及第二抗體變異域兩者包含人IgG2的位置265(例如D265A)、330(例如A330S)、及331(例如P331S)的一或多者之胺基酸修飾。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體之該第一及第二抗體變異域兩者包含人IgG2的位置265(例如D265A)、330(例如A330S)、及331(例如P331S)各者之胺基酸修飾。
在另一態樣中，本發明提供經單體之抗體，其包含在本發明的EGFRvIII抗體之特定部位經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤。
在一個變體中，本發明提供經單體之抗體，其包含在本發明的EGFRvIII抗體的位置222、340、或370之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及胺基酸修飾。在一些實施態樣中，該胺基酸修飾係自離胺酸至精胺酸之取代。
在一些實施態樣中，本發明之EGFRvIII抗體進一步 包含連接子。
在另一態樣中，本發明提供如本文中所述之EGFRvIII抗體之共軛體，其中該抗體係經共軛至一劑，其中該劑係選自由下列所組成之群組：細胞毒性劑、免疫調節劑、顯像劑、治療性蛋白質(therapeutic protein)、生物聚合物、及寡核苷酸。在一些實施態樣中，該劑係細胞毒性劑，其包括但不限於蒽環素(anthracycline)、耳抑素(auristatin)、喜樹鹼(camptothecin)、康柏達司塔汀(combretastatin)、尾海兔素(dolastatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、烯雙炔(enediyne)、格爾德黴素(geldanamycin)、吲哚啉并-苯并二吖呯二聚物(indolino-benzodiazepine dimer)、美登素(maytansine)、嘌黴素(puromycin)、吡咯并苯并二吖呯二聚物(pyrrolobenzodiazepine dimer)、紫杉烷(taxane)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、妥布賴森(tubulysin)、半星芒體(hemiasterlin)、司普力西歐史塔丁(spliceostatin)、普拉地內酯(pladienolide)、及其立體異構物、同電子排列體(isostere)、類似物、或衍生物。例如，該細胞毒性劑係MMAD(單甲基耳抑素D(Monomethyl Auristatin D))、0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、3377(N,2-二甲基丙胺醯基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯 基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧丁基}-N-甲基-L-纈胺醯胺)、0131(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、或0121(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)。
在一些實施態樣中，本發明提供共軛體，其包含式：抗體-(含有麩胺醯胺之醯基供體標籤)-(連接子)-(細胞毒性劑)。
在其他實施態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含如本文中所述之任何抗體或抗體共軛體。
本發明亦提供細胞株，其重組性製造如本文中所述之任何抗體。
本發明亦提供核酸，其編碼如本文中所述之任何抗體。本發明亦提供編碼如本文中所述之任何抗體的重鏈變異區及/或輕鏈變異區之核酸。
本發明亦提供套組，其包含有效量之如本文中所述之任何抗體或抗體共軛體。
本發明亦提供治療需要彼之個體之方法，其包含提供如本文中所述之經單離之抗體、雙特異性抗體、或抗體共 軛體，以及投予該等抗體至該個體。
亦所提供者係治療個體中相關於表現EGFRvIII的惡性細胞的病況之方法，其包含投予需要彼之個體有效量之醫藥組成物，該醫藥組成物包含如本文中所述之抗體或抗體共軛體。在一些實施態樣中，該病況係癌症。在一些實施態樣中，該癌症係EGFRvIII相關性癌症(例如任何具有EGFRvIII表現之癌症)，其係選自由下列所組成之群組：多型性神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiform)、退行性星細胞瘤(anaplastic astrocytoma)、巨細胞神經膠母細胞瘤(giant cell glioblastoma)、神經膠肉瘤(gliosarcoma)、退行性寡樹突神經膠細胞瘤(anaplastic oligodendroglioma)、退行性室管膜瘤(anaplastic ependymoma)、退行性寡星細胞瘤(anaplastic oligoastrocytoma)、脈絡叢癌(choroid plexus carcinoma)、退行性神經節性神經膠質瘤(anaplastic ganglioglioma)、松果體母細胞瘤(pineoblastoma)、松果體細胞瘤(pineocytoma)、腦膜瘤(meningioma)_、髓質上皮瘤(medulloepithelioma)、室管膜母細胞瘤(ependymoblastoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、小腦幕上原始神經外胚層腫瘤(supraentorial primitive neuroectodermal tumor)、非典型畸胎/類橫紋肌細胞瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumor)、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、髓母細胞瘤(medullobastoma)、大腸直腸癌、肛門癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤(mesothelioma)、子宮癌、及膀胱癌。
在另一態樣中，本發明提供抑制具有表現EGFRvIII的惡性細胞之個體中腫瘤生長或進展之方法，其包含投予需要彼之個體有效量之醫藥組成物，該醫藥組成物包含如本文中所述之經單離之抗體、雙特異性抗體、或抗體共軛體。
在另一態樣中，本發明提供抑制抑制個體中表現EGFRvIII的惡性細胞轉移(metastasis)之方法，其包含投予需要彼之個體有效量之醫藥組成物，該醫藥組成物包含如本文中所述之抗體、雙特異性抗體、或抗體共軛體。
在另一態樣中，本發明提供誘發具有表現EGFRvIII的惡性細胞之個體中腫瘤消退之方法，其包含投予需要彼之個體有效量之醫藥組成物，該醫藥組成物包含如本文中所述之經單離之抗體、雙特異性抗體、或抗體共軛體。
圖1A、圖1B、及圖1C顯示三種EGFRvIII抗體株：mAb 42G9(圖1A)、32A10(圖1B)及32G8(圖1C)對三種F98細胞株：F98(EGFR陰性)、F98-EGFRwt、及F98-EGFRvIII的FACS結合直方圖之實施例。X軸係螢光強度；Y軸係最大/經對模式常規化之百分比。
圖2A、2B及2C描繪的直方圖顯示藉由流式細胞測量來測量野生型EGFR及EGFRvIII在GBM細胞株中的表現：LN229-EGFRvIII(圖2A)、LN18-EGFRvIII(圖2B)及DKMG(圖2C)。EGFRvIII係用mAb 42G9來偵測且 EGFRwt係用EGFR野生型特異性mAb來偵測。X軸係螢光強度；Y軸係最大/經對模式常規化之百分比。
圖3A及3B顯示的圖證實三種EGFRvIII-CD3雙特異性抗體在經EGFRvIII轉導的LN18-EGFRvIII(圖3A)及親代LN18(圖3B)細胞中之細胞毒性。
圖4A及4B顯示的圖證實三種EGFRvIII-CD3雙特異性抗體在經EGFRvIII轉導的LN229-EGFRvIII(圖4A)及親代LN229(圖4B)細胞中之細胞毒性。
圖5顯示的圖證實三種EGFRvIII-CD3雙特異性抗體在表現內源性EGFRvIII及EGFR野生型蛋白的DKMG細胞中之細胞毒性。
圖6顯示的圖描繪EGFRvIII-CD3雙特異性抗體在LN229-EGFRvIII GBM細胞株之皮下模式中的體內抗腫瘤活性。
在本文中所揭示之發明提供特異性結合至EGFRvIII(例如人EGFRvIII)之抗體(例如單特異性或雙特異性抗體)及抗體共軛體。本發明亦提供編碼這些抗體之聚核苷酸、包含這些抗體及抗體共軛體之組成物、以及製造及使用這些抗體及抗體共軛體之方法。本發明亦提供用於治療個體中相關於經EGFRvIII調介之病理的病況(諸如癌症)之方法。
一般技術
除非特別指出，否則本發明之實施將利用習知分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、免疫學、病毒學、單株抗體產生及工程化之技術，彼等係在本技術領域內。此等技術在文獻中有充分解釋，諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A. Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
“抗體”係免疫球蛋白分子，其係能透過位在該免疫球蛋白分子之變異區中的至少一個抗原辨認部位特異性結合至標靶，諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等。如本文中所使用，該用語涵蓋不只完整多株或單株抗體，還有其抗原結合片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)及結構域抗體(包括例如鯊魚及駱駝抗體)、以及包含抗體之融合蛋白、及任何其他包含抗原辨認部位的免疫球蛋白分子的經修飾之建構。抗體包括任何類型之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或彼等之亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。取決於其之重鏈恆定區之抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可被分派到不同類型中。有五種主要的免疫球蛋白類型：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且這些中的數種可進一步分成亞型(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應不同類型免疫球蛋白之 該等重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型免疫球蛋白的次單元結構及三維構形係熟知。
用語抗體之“抗原結合片段(antigen binding fragment)”或“抗原結合部份(antigen binding portion)”，如本文中所使用，係指完整抗體之一或多個片段，該片段保留特異性結合至給定抗原(例如EGFRvIII)之能力。抗體之抗原結合功能可藉由完整抗體之片段進行。抗體之“抗原結合片段”用語所涵蓋之結合片段之實例包括Fab；Fab’；F(ab’)2；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；單一結構域抗體(dAb)片段(Ward et al.,Nature 341：544-546,1989)、及經單離之互補決定區(CDR)。
“優先結合(preferentially bind)”或“特異性結合(specifically bind)”(在本文中互換使用)至標靶(例如EGFRvIII蛋白)之抗體、抗體共軛體、或多肽係該領域理解清楚之用語，且判定該等特異性或優先結合之方法亦為該領域所廣為周知。若分子與特定細胞或物質之反應或相連相較於與其他細胞或物質之交互反應或相連係更頻繁、更快速、更長時間及/或更高親和力，該分子被稱為展現“特異性結合(specific binding)”或“優先結合(preferential binding)”。若抗體與標靶之結合相較於與其他物質之結合具有更高親和力、結合性(avidity)、更快速、及/或更長時間，則該抗體“特異性結合(specific binding)”或“優先結合(preferential binding)”至標靶。例如，特異性或優先結合 至EGFRvIII表位之抗體係指相較於與其他EGFRvIII表位或非EGFRvIII表位結合時，以更高之親和力、結合性、更快速、及/或更長時間與此表位結合之抗體。藉由閱讀此定義亦可了解，例如，特異性或優先結合至第一標靶之抗體(或部分(moiety)或表位)可能或不會特異性或優先結合至第二標靶。因此，“特異性結合”或“優先結合”不一定需要(雖然可包括)排他性結合。一般來說(但不必然)，所謂的結合係指優先結合。
抗體之“變異區(variable region)”係指(不論單獨或經組合之)抗體輕鏈之變異區或抗體重鏈之變異區。如本技術領域中已知，重鏈及輕鏈之變異區各由三個互補決定區(CDR)所連接之四個架構區(FR)組成，CDR亦稱為高度變異區(hypervariable region)。各鏈中之CDR藉由FR被拉近，且與另一鏈之CDR促成抗體之抗原結合部位之形成。至少有二種技術用於判定CDR：(1)基於跨種序列變異性之方法(即Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)基於抗原-抗體複合體之結晶學研究之方法(Al-lazikani等人，1997,J.Molec.Biol.273：927-948)。如本文中所使用，CDR可係指藉由任一方法或藉由二種方法之組合所界定之CDR。
變異域(variable domain)之“CDR”係在變異區內之胺基酸殘基，該等胺基酸殘基係根據Kabat定義、Chothia定義、Kabat及Chothia之累積定義、AbM定義、接觸定 義、及/或構形定義，或該領域廣為周知之任何CDR判定方法來鑑別。抗體CDR可能經鑑別為原先由Kabat等人所界定之高度變異區。參見例如Kabat等人，1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C.。CDR之位置亦可能經鑑別為原先由Chothia等人所描述之結構性圈環結構。參見例如Chothia等人，Nature 342：877-883,1989。其他CDR鑑別之方法包括“AbM定義”，該方法為Kabat法及Chothia法之折衷，係源自利用Oxford Molecular之AbM抗體模型軟體(現為Accelrys®)，或如MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262：732-745,1996中所述之基於所觀察之抗原接觸之CDR的“接觸定義(contact definition)”。在另一方法中，在本文中稱為CDR之“構形定義(conformational definition)”，CDR之位置可能經鑑別為對抗原結合造成焓貢獻之殘基。參見例如Makabe等人，Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166,2008。又其他CDR邊界定義可能不嚴格遵守上述方法中之一者，但將與至少部分之Kabat CDR重疊，不過它們可能依特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果被縮短或延長。如本文中所使用，CDR可係指由本技術領域中已知之任何方法(包括多種方法之組合)而界定之CDR。用在本文中之方法可利用根據這些方法中任一者所界定之CDR。對於包含超過一種CDR之任何給定實施態樣，該等CDR可根據Kabat、Chothia、延長、 AbM、接觸、及/或構形定義中任一者加以界定。
如本文中所使用，“單株抗體(monoclonal antibody)”係指自實質上同型(homogeneous)之抗體族群所獲得之抗體，即除了可能少量存在之可能天然發生之突變以外，組成該族群之個別抗體係相同的。單株抗體具高度特異性，其係以單一抗原部位為目標。又，不同於通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體之多株抗體製劑，各單株抗體係以抗原上之單一決定簇為目標。修飾語“單株(monoclonal)”指示出係自實質上同型之抗體族群所獲得之抗體的特徵，且不被解讀為需要藉由任何特定之方法產製該抗體。例如，根據本發明所使用之單株抗體可藉由首先由Kohler and Milstein,Nature 256：495,1975所描述之融合瘤方法來製成，或可藉由重組DNA方法諸如U.S.Pat.No.4,816,567中所述者來製成。該等單株抗體亦可自使用例如McCafferty et al.,Nature 348：552-554,1990中所述之技術而產生之噬菌體庫來單離。
如本文中所使用，“人化(humanized)”抗體係指非人(例如鼠)抗體之形式，其為包含源自非人免疫球蛋白之最少序列之嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或彼等之片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab')2或抗體之其他抗原結合次序列)。較佳地，人化抗體係其中源自接受者之互補決定區(CDR)的殘基被源自具有所欲之特異性、親和力、及能力之非人物種(諸如小鼠、大鼠、或兔)(捐贈者抗體)之CDR的殘基所替代之人免疫球蛋白(接受者抗體)。在一些情況 中，人免疫球蛋白之Fv架構區(FR)殘基被對應之非人殘基所替代。另外，該人化抗體可包含不見於接受者抗體或不見於經導入之CDR或架構序列中之殘基，但該些殘基被包括以進一步改善及最佳化抗體之表現。一般而言，人化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常二個變異域，其中所有或實質上所有之CDR區對應非人免疫球蛋白之CDR區且所有或實質上所有之FR區係人免疫球蛋白共通序列(consensus sequence)之FR區。該人化抗體亦將理想地包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或恆定域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之恆定區或恆定結構域。較佳地具有如WO 99/58572中所述之經修飾之Fc區之抗體。其他形式之人化抗體具有一或多個相對於原始抗體經改變之CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2、或CDR H3)，該等CDR亦被稱為一或多個“衍生自(derived from)”原始抗體之一或多個CDR之CDR。
如本文中所使用，“人抗體(human antibody)”係指具有對應由人所產生之抗體的胺基酸序列之胺基酸序列的抗體，及/或利用任何該領域之技藝人士所知或此處所揭示之製備人抗體之技術所製備之抗體。此定義之人抗體包括含有至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽之抗體。一個該等實例係包含小鼠輕鏈及人重鏈多肽之抗體。人抗體可利用該領域已知之多種技術製備。在一實施態樣中，該人抗體係選自噬菌體庫，其中該噬菌體庫表現人抗體(Vaughan et al.,Nature Biotechnology,14：309-314,1996； Sheets et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162,1998；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227：381,1991；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581,1991)。人抗體亦可藉由免疫接種動物加以製備，該動物體內之內源性基因座(loci)已被基因轉殖導入之人免疫球蛋白基因座所取代，例如其中內源性免疫球蛋白基因已被部份或完全不活化之小鼠。此方法係描述於美國專利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016號。或者，該人抗體可藉由使產製針對標靶抗原之抗體的人B淋巴細胞永生化加以製備(該等B淋巴細胞可自個體收集或自該cDNA之單細胞選殖收集或可能在試管內經免疫)。見例如Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77,1985；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1)：86-95,1991及美國專利第5,750,373號。
用語“嵌合抗體(chimeric antibody)”係用來指其中之可變區序列係源自一物種且恆定區序列係源自另一物種之抗體，諸如其中該可變區序列係源自小鼠抗體且該恆定區序列係源自人抗體之抗體。
用語“多肽(polypeptide)”、“寡肽(oligopeptide)”、“胜肽(peptide)”及“蛋白質(protein)”在本文中係交換使用以指稱任何長度之胺基酸鏈。例如，該鏈可係相對短(例如10至100個胺基酸)或更長。該鏈可為線性或分支，其可能包含經修飾之胺基酸及/或可能被非胺基酸中斷。該等用 語亦包含經天然或人為干預修飾之胺基酸鏈；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記成份共軛。該定義亦包括例如包含一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及該領域習知之其他修飾之多肽。應了解的是該多肽可以單鏈或相連之鏈存在。
“單價抗體(monovalent antibody)”每分子包含一個抗原結合部位(例如IgG或Fab)。在一些情況中，單價抗體可具有超過一個抗原結合部位，但該等結合部位係源自不同抗原。
“單特異性抗體(monospecific antibody)”每分子包含二個相同抗原結合部位(例如IgG)而使該等二個結合部位結合抗原上的相同表位。由此，它們互相競爭結合至一個抗原分子。大部分自然界中所見之抗體係單特異性。在一些情況中，單特異性抗體亦可係單價抗體(例如Fab)。
“雙價抗體(bivalent antibody)”每分子包含二個抗原結合部位(例如IgG)。在一些情況中，該二個結合部位具有相同之抗原特異性。然而，雙價抗體可為雙特異性。
“雙特異性(bispecific)”或“雙重特異性(dual-specific)”抗體係具有二個不同的抗原結合部位之雜交抗體。雙特異性抗體之二個抗原結合部位結合至二個不同表位，該等表位可位於相同或不同的蛋白質標靶上。
“雙功能性”係在二個臂中具有相同抗原結合部位(即相同胺基酸序列)但各結合部位可辨識二個不同抗原之抗 體。
“異多聚體(heteromultimer)”、“異多聚體複合體(heteromultimeric complex)”或“異多聚體多肽(heteromultimeric polypeptide)”係包含至少第一多肽及第二多肽的分子，其中該第二多肽與第一多肽的胺基酸序列至少一個胺基酸殘基不同。異多聚體可包含由該第一多肽和第二多肽所形成的“異二聚體(heterodimer)”，或者可形成更高級的三級結構，其中存在除了第一多肽和第二多肽以外之多肽。
“異二聚體(heterodimer)”、“異二聚體蛋白”、“異二聚體複合體(heteromultimeric complex)”、或“異多聚體多肽(heteromultimeric polypeptide)”係包含第一多肽及第二多肽的分子，其中該第二多肽與第一多肽的胺基酸序列至少一個胺基酸殘基不同。
如本文所用之“鉸鏈區(hinge region)”、“鉸鏈序列(hinge sequence)”、及其變化形式包括此項技術中已知之含義，其於例如Janeway et al.,ImmunoBiology：the immune system in health and disease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(4th ed.,1999)；Bloom et al.,Protein Science(1997),6：407-415；Humphreys et al.,J.Immunol.Methods(1997),209：193-202中說明。
如本文中所使用，“免疫球蛋白樣鉸鏈區(immunoglobulin-like hinge region)”、“免疫球蛋白樣鉸鏈序列(immunoglobulin-like hinge sequence)”、及其變體係 指免疫球蛋白樣或抗體樣分子(例如免疫黏附素)之鉸鏈區及鉸鏈序列。在一些實施例中，免疫球蛋白樣鉸鏈區可來自或來源於任何IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型或來自IgA、IgE、IgD或IgM，包括其嵌合形式，例如嵌合IgG1/2鉸鏈區。
用語“免疫效應細胞(immune effector cell)”或“效應細胞(effector cell)”如本文中所使用係指人類免疫系統中天然細胞譜系內之細胞，其可經活化而影響標靶細胞之活力。標靶細胞之活力可包括細胞存活、增殖及/或與其他細胞相互作用之能力。
本發明之抗體可使用本技術領域中熟知之技術(例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或此等技術之組合或其他本技術領域中已知之技術)來製造(參見例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50,1999及Fellouse,F.A.,et al,J.MoI.Biol.,373(4)：924-40,2007)。
如本技術領域中已知，“聚核苷酸(polynucleotide)”或“核酸(nucleic acid)”在本文中交換使用，係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼等之類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被納入鏈中之基質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及彼等之類似物。若存在的話，對核苷酸結構之修飾可在該鏈組合之前或之後進行。核苷酸之序列可被非核苷酸成份中斷。聚核苷酸在聚合之後可進一步被修飾，諸如 與標記組份共軛。其他類型之修飾包括例如“蓋帽(cap)”、以類似物取代一或多個天然發生之核苷酸、核苷酸間修飾諸如舉例來說該些具有不帶電鍵結(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸醯胺化物、胺基甲酸酯等)及帶電鍵結(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、該些含有側基團者，諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、訊息肽、聚L-離胺酸等)、該些具有嵌入劑(intercalator)者(例如吖啶、補骨脂素等)、該些含有螯合劑者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、該些含有烷化劑者、該些具有經修飾之鍵結者(例如α異位性核酸等)以及未經修飾之聚核苷酸形式。另外，任何通常存在於糖類中之羥基可能被例如膦酸基、磷酸基取代、被標準保護基保護或被活化以製備與其他核苷酸之額外鍵結，或可能與固體支持物共軛。該5’及3’端OH可被磷酸化或被胺類或自1至20個碳原子之有機蓋帽基團取代。其他羥基亦可被衍生成為標準保護基。聚核苷酸亦可包含該領域通常已知之核糖或去氧核糖糖類之類似形式，包括例如2’-O-甲基-核糖、2’-O-烯丙基核糖、2’-氟-核糖、2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α或β異位性糖類、差向異構體糖類諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖糖類、呋喃糖糖類、景天酮庚糖、非環類似物及無鹼基核苷類似物諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵結可被替代性連接基團取代。該些替代性連接基團包括但不限於其中磷酸鹽被P(O)S(“硫代鹽(thioate)”)、P(S)S(“二硫代鹽(dithioate)”)、(O)NR2(“醯 胺化物(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲縮醛(formacetal)”)取代之實施態樣，其中各R或R’係獨立地H或經取代或未經取代之烷基(1至20個C)，該烷基可選擇地含有醚(-O-)鍵結、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非聚核苷酸中之所有鍵結需要完全相同。前面的敘述適用於在本文中提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
本技術領域中已知，抗體之“恆定區(constant region)”係指(不論單獨或經組合之)抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
如本文中所使用，“實質上純的(substantially pure)”係指其為至少50%純的(也就是不含污染物)，更佳地至少90%純的，更佳地至少95%純的，甚至更佳地至少98%純的，且最佳地至少99%純的物質。
“宿主細胞(host cell)”包括可以或已經接受載體以導入多核苷酸插入物之個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且該後代可能因為天然、意外或蓄意突變而不一定與原始親代細胞完全相同(在形態學或基因學DNA互補性上)。宿主細胞包括經本發明之多核苷酸在體內轉染之細胞。
如該領域所知，用語“Fc區(Fc region)”係用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區域。該“Fc區(Fc region)”可為天然序列Fc區或變異體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能不同，人IgG重鏈Fc區通常被定義為從 Cys226處之胺基酸殘基或從Pro230延伸至彼之羧基端。Fc區中之殘基編號係如Kabat所述之EU指數。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白之Fc區大致上包含CH2及CH3二個恆定區。
如本技術領域中所使用，“Fc受體(Fc receptor)”或“FcR”描述結合至抗體之Fc區之受體。較佳之FcR係天然序列人FcR。另外，較佳之FcR係與IgG抗體結合之受體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII、及FcγRIII亞型之受體，包括等位基因變異體及該等受體之選擇式剪接形式。FCγRII受體包括FcγRIIA(“活化受體(activating receptor)”)及FcγRIIB(“抑制受體(inhibiting receptor)”)，彼等具有類似之胺基酸序列但主要差異在於其胞質結構域。FcR係於Ravetch and Kinet,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92,1991；Capel等人，Immunomethods,4：25-34,1994；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.,126：330-41,1995中回顧。“FcR”亦包括新生兒受體FcRn，該受體負責轉運母體IgG至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.,117：587,1976；及Kim等人，J.Immunol.,24：249,1994)。
用語“競爭(compete)”如本文中所使用，就抗體而言，係指第一抗體或彼之抗原結合片段(或部份)與表位結合之方式充份類似於第二抗體或彼之抗原結合部份之結合，使得第一抗體與彼之同源表位在第二抗體存在時之結合結果 呈可偵測地降低，相較於第二抗體不存在時該第一抗體與彼之同源表位之結合。或者，該情況可為但不一定是該第二抗體與彼之表位之結合亦因第一抗體之存在而可偵測地降低。也就是說，第一抗體可抑制第二抗體與彼之表位之結合，但第二抗體不抑制該第一抗體與彼之個別表位之結合。然而，當各種抗體不論以相同、較高或較低程度可偵測地抑制另一抗體與彼之同源表位或配體結合時，該等抗體被稱為彼此“交叉競爭(cross-compete)”與彼等個別表位之結合。本發明包含競爭抗體及交叉競爭抗體。不論該競爭或交叉競爭所藉以發生之機轉為何(例如空間位阻、構形變化或與共同表位或彼之部分結合)，技藝人士將了解根據此處所提供之揭示，本發明包含競爭及/或交叉競爭抗體且彼等可被用於此處所揭示之方法。
“功能性Fc區(functional Fc region)”具有天然序列Fc區之至少一種效應功能。例示性“效應功能(effector function)”包括C1q結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性、吞噬作用、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)等。該等效應功能通常需要Fc區與結合結構域(例如抗體變異域)結合且可利用該領域已知之各種用於評估該等抗體效應功能之測定檢測。
“天然序列Fc區(native sequence Fc region)”包含與在天然中發現之Fc區的胺基酸序列完全相同之胺基酸序列。“變異體Fc區(variant Fc region)”包含與天然序列Fc區有至少一個胺基酸修飾之差異的胺基酸序列，但仍保留 該天然序列Fc區之至少一種效應功能。在一些實施態樣中，該變異體Fc區相較於天然序列Fc區或親代多肽之Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區或親代多肽之Fc區中自約1至約10個胺基酸取代，且較佳地自約1至約5個胺基酸取代。在本文中，變異體Fc區將較佳地具有與天然序列Fc區及/或與親代多肽之Fc區至少約80%之序列一致性，最佳地具有至少約90%之序列一致性，更佳地具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%之序列一致性。
用語“效應功能(effector function)”係指可歸因於抗體之Fc區之生物活性。抗體效應功能之實例包括但不限於抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)、Fc受體結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、吞噬作用、C1q結合及細胞表面受體(例如B細胞受體(BCR))之下調。參見例如U.S.Pat No.6,737,056。該等效應功能通常需要Fc區與結合域(例如抗體變異域)結合且可利用該領域已知之各種用於評估該等抗體效應功能之測定檢測。例示性效應功能檢測係經由Fcγ3及/或C1q結合。
如本文中所使用，“抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)”或“ADCC”係指經細胞調介之反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、及巨噬細胞)辨識標靶細胞上之經結合之抗體，且後續造成該標靶細胞溶裂。所關注之分子之ADCC活性可 使用體外ADCC檢定來評估，諸如美國專利第5,500,362或5,821,337號中所述者。可用於該試驗之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。或者或此外，所關注之分子之ADCC活性可於體內(例如動物模式中)評估，諸如Clynes et al.,1998,PNAS(USA),95：652-656中所揭示者。
“補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity)”或“CDC”係指在補體存在下溶解(lysing)標靶。該補體活化途徑係由補體系統之第一補體(C1q)與和同源抗原(cognate antigen)複合之分子(例如抗體)結合所啟動。為了評估補體活化，可進行例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods,202：163(1996)所述之CDC檢定。
如本文中所使用，“治療(treatment)”係指得到有益或所欲臨床結果之方法。以本發明之目的而言，有益或所欲之臨床結果包括但不限於下列一或多項：減少(或摧毀)贅生(neoplastic)或癌性細胞之增生、抑制贅生細胞轉移、縮小或減少表現EGFRvIII之腫瘤之尺寸、緩解EGFRvIII相關性疾病(例如癌)、減少EGFRvIII相關性疾病(例如癌)所導致之症狀、提高罹患EGFRvIII相關性疾病(例如癌)者的生活品質、減少治療EGFRvIII相關性疾病(例如癌)所需之其他藥物之劑量、延緩EGFRvIII相關性疾病(例如癌)之進展、治癒EGFRvIII相關性疾病(例如癌)、及/或延長有EGFRvIII相關性疾病(例如癌)之病患的存活。
“減緩(ameliorating)”意指相較於未投予EGFRvIII抗體(單特異性或雙特異性)，減輕或改善一或多種症狀。“減緩(ameliorating)”亦包括縮短或減少症狀之持續時間。
如本文中所使用，藥物、化合物、或醫藥組成物之“有效劑量(effective dosage)”或“有效量(effective amount)”係足以產生任一或多種有益或所欲結果之量。就預防性用途而言，有益或所欲結果包括消除或減少風險、減輕嚴重性或延遲疾病之開始，包括疾病之生化學、組織學及/或行為學之症狀、彼之併發症及在疾病發展期間所表現之中間病理學表型。就治療性用途而言，有益或所欲結果包括下列臨床結果：諸如一或多種EGFRvIII相關性疾病或病況(諸如像是多發性骨髓瘤)之發生率減少或緩解、降低治療該疾病所需之其他藥物之劑量、提高其他藥物之效果、及/或延緩病患之EGFRvIII相關性疾病進展。有效劑量可分一或多次投予來投予。就本發明之目的而言，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量係足以直接或間接完成預防性或治療性治療之量。如在臨床上所了解的，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量可能與或可能不與另一藥物、化合物或醫藥組成物組合達到。因此，“有效劑量(effective dosage)”可在投予一或多種治療劑之情況中被考慮，且可考慮給予有效量之單一劑，若與一或多種其他劑組合時可能或係經達成所欲之結果。
“個體(individual或subject)”係哺乳動物，更佳者係人。哺乳動物亦包括但不限於靈長動物、馬、犬、貓、小 鼠及大鼠。
如本文中所使用，“載體(vector)”意指構築體，其能在宿主細胞中遞送及較佳地表現一或多種所關注之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體、包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體、及某些真核細胞諸如生產細胞。
如本文中所使用，“表現控制序列(expression control sequence)”意指引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如持續型或誘導性啟動子或增強子。表現控制序列係可操作地與所欲轉錄之核酸序列連接。
如本文中所使用，“醫藥上可接受之載體(pharmaceutically acceptable carrier)”或"醫藥上可接受之賦形劑(pharmaceutical acceptable excipient)”包括任何當與活性成分組合時能使該成分保留生物活性且不與個體之免疫系統反應之任何物質。實例包括但不限於任何標準醫藥載劑諸如磷酸鹽緩衝液溶液、水、乳液諸如油/水乳液、及各種類型之潤濕劑。較佳之用於氣溶膠或腸胃外投予之稀釋劑係磷酸鹽緩衝液(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含該等載體之組成物係由眾所周知之習知方法調製(見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing,2005)。
用語“含有麩胺醯胺之醯基供體標籤(acyl donor glutamine-containing tag)”或“麩醯胺酸標籤(glutamine tag)”如本文中所使用係指含有一或多個Gln殘基之多肽或蛋白質，其係作為轉麩醯胺酸酶胺受體。參見例如WO2012059882及WO2015015448。
用語“kon”或“ka”如本文中所使用係指抗體與抗原結合之速率常數。特別地，該等速率常數(kon/ka及koff/kd)及平衡解離常數係使用整個抗體(即雙價)及單體EGFRvIII蛋白(例如經組胺酸標籤之EGFRvIII融合蛋白)來測量。
用語“koff”或“kd”如本文中所使用係指抗體自抗體/抗原複合體解離之速率常數。
用語“KD”如本文中所使用係指抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。
在本文中提及“約(about)”某數值或參數時，包括(且描述)與該數值或參數本身相關之實施態樣。舉例來說，提及“約X(about X)”之用語包括“X”之用語。數值範圍包含界定該範圍之數值。大致上來說，用語“約(about)”係指變數之指示數值及係指在指示數值的實驗誤差內變數之所有數值(例如針對平均的95%信賴區間內)或指示數值的10百分比內，無論哪個較大。若用語“約(about)”係用於時間區段(年、月、週、天等)上下文內，用語“約(about)”意指時間段加上或減少下一級時間段的一個量(例如約1年意指11至13個月；約6個月意指6個月加上或減少1週； 約1週意指6至8天等)、或所指示數值10百分比，無論哪個較大。
應了解的是，只要此處之實施態樣係以用語“包含(comprising)”描述，其亦提供其他以“由...組成(consisting of)”及/或“實質上由...組成(consisting essentially of)”之用語所描述之類似實施態樣。
本發明之態樣或實施態樣係以馬庫西群組或其他選擇性形式之群組描述，本發明不僅包含被標示為整體之整個群組，但亦包含該群組之個別成員及該主要群組中所有可能之亞群，且亦包含不含其中一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除該申請專利之發明中任何群組成員之一或多者。
除非另有界定，否則用於本文中的所有技術及科學用語具有如本發明所屬的技術領域中具有通常知識者一般所了解之相同意義。若有相衝突之情況，以本說明書、包括定義為主。在本說明書及申請專利範圍中，用語“包含(comprise)”或變化諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”將被理解為意指包括被敘述之整體或整體之群，但不排除任何其他整體或整體之群。除非上下文另外要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。
例示性方法及材料係於此處敘述，不過與此處所述之方法及材料類似或相等者亦可被用於實施或檢測本發明。材料、方法、及實施例係僅供說明且不意欲為限制。
EGFRvIII抗體及製成彼之方法
本發明提供結合至EGFRvIII之抗體[例如人EGFRvIII(例如登錄號：P00533 Feature Identifier VAR_066493，或GenBank登錄號AJN69267； (SEQ ID NO：201))]且特徵在於下列特徵之一或多者：(A)降低或調降EGFRvIII之蛋白質表現；(b)治療、預防、 減緩個體中相關於表現EGFRvIII的惡性細胞的病況之一或多種症狀(例如癌症，諸如多型性神經膠母細胞瘤)；(c)抑制個體中腫瘤生長或進展(其具有表現EGFRvIII的惡性腫瘤)；(d)抑制個體(其具有一或多個表現EGFRvIII的惡性細胞)中表現EGFRvIII的癌(惡性)細胞之轉移；(e)誘發表現EGFRvIII的腫瘤消退(例如長期消退)；(f)在表現EGFRvIII的惡性細胞中發揮細胞毒性活性；(g)阻斷EGFRvIII與其他尚未經鑑定之因子之交互作用；及/或(h)誘發殺除或抑制鄰近非表現EGFRvIII的惡性細胞生長之旁觀者效果。
在一個態樣中，所提供者係經單離之抗體，其特異性結合至EGFRvIII，其中該抗體包含(a)重鏈變異(VH)區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144、或145中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、或237中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：67、72、73、79、85、104、107、108、 114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223、或236中之序列；及/或(b)輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238、或239中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196、或199中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197、或200中之序列。
在另一態樣中，所提供者係經單離之抗體，其特異性結合至EGFRvIII，其中該抗體包含：VH區，其包含顯示於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217、或218中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或VL區，其包含顯示於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213、或215中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。
在一些實施態樣中，所提供者係具有如表1中所列之 部分輕鏈序列的任一者及/或如表1中所列之部分重鏈序列的任一者。在表1中，畫底線序列係根據Kabat之CDR序列，粗體係根據Chothia。
在本文中，亦所提供者係對EGFRvIII的抗體之抗原結合域的CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR、及CDR接觸區)。CDR區的判定係在本技術領域內所熟知者。應了解的是，在一些實施態樣中，CDR可係Kabat及Chothia CDR之組合(亦稱為“結合型CR(combined CR)”或“延長型之CDR(extended CDR)”)。在一些實施態樣中，該等CDR係Kabat CDR。在其他實施態樣中，該等CDR係Chothia CDR。換言之，在有多於一個CDR之實施態樣中，該等CDR可係Kabat、Chothia、組合之CDR之任一者、或其組合。表2提供在本文中所提供之CDR序列實例。
在一些實施態樣中，本發明提供與本文中所述之抗體結合且競爭的抗體，本文中所述之抗體包括m62G7、h62G7、h62G7-H14/L1-DV、h62G7-EQ/L6、42G9、 32A10、20B9、14C11、21E11、49B11、46E10、12H6、19A9、21E7、11B11、12B2、11F10、17G11、29D5、30D8、20E12、26B9、32G8、34E7、20G5、C6、B5、42G9-1、32A10-1、20B9-1、14C11-1、21E11-1、49B11-1、46E10-1、12H6-1、19A9-1、21E7-1、11B11-1、12B2-1、11F10-1、17G11-1、29D5-1、30D8-1、20E12-1、26B9-1、32G8-1、34E7-1、20G5-1、C6-1、及B5-1。
在一些實施態樣中，本發明亦提供基於CDR接觸區的對EGFRvIII抗體之抗體CDR部分。CDR接觸區係充滿抗體對抗原特異性的抗體區域。一般而言，CDR接觸區包括CDR及Vernier區(Vernier zone)中的殘基位置，其受拘束以維持抗體結合特定抗原的適當圈環結構。參見例如Makabe et al.,J.Biol.Chem.,283：1156-1166,2007。CDR接觸區的判定係在本技術領域內所熟知者。
如本文中所述之EGFRvIII抗體對EGFRvIII(諸如人EGFRvIII(例如(SEQ ID NO：201))的結合親和力(KD)可係約0.001至約5000nM。在一些實施態樣中，該結合親和力係約5000nM、4500nM、4000nM、3500nM、3000nM、2500nM、2000nM、1789nM、1583nM、1540nM、1500nM、1490nM、1064nM、1000nM、933nM、894nM、750nM、705nM、678nM、532nM、500nM、494nM、400nM、349nM、340nM、353nM、300nM、250nM、244nM、231nM、225nM、207nM、200nM、186nM、172nM、136nM、113nM、104nM、101nM、 100nM、90nM、83nM、79nM、74nM、54nM、50nM、45nM、42nM、40nM、35nM、32nM、30nM、25nM、24nM、22nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、12nM、10nM、9nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM之任何者。在一些實施態樣中，該結合親和力係小於約5000nM、4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM、或0.5nM之任何者。
雙特異性抗體為對至少二種不同抗原具有結合特異性單株抗體，可使用在本文中所揭示之抗體來製備。用於製造雙特異性抗體之方法係本技術領域中已知(參見例如Suresh et al.,Methods in Enzymology 121：210,1986)。傳統上，雙特異性抗體之重組製造係基於共同表現二個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，具有二個有不同特異性之重鏈(Millstein and Cuello,Nature 305,537-539,1983)。因此，在一個態樣中，所提供者係雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係全長之人抗體，其包含特異性結合至標靶抗原(例如EGFRvIII)之該雙特異性抗體之第一抗體變異域，及包含能夠藉由特異性結合至位在人免疫效應細胞上的效應抗原而召募人免疫效應細胞活性之該雙特異性抗體之第二 抗體變異域。
人免疫效應細胞可係任何各種本技術領域中已知的免疫效應細胞。例如，該免疫效應細胞可係人類淋巴細胞(lymphoid cell)譜系之成員，其包括但不限於T細胞(例如細胞毒性T細胞)、B細胞、及自然殺手(NK)細胞。該免疫效應細胞亦可例如(而不限制)為人骨髓樣譜系之成員，其包括但不限於單核球、嗜中性顆粒球、及樹突細胞。此等免疫效應細胞可對標靶細胞具有細胞毒性或細胞凋亡效果或於藉由結合效應抗原(effector antigen)而活化時的其他所欲效果。
該效應抗原係表現在人免疫效應細胞上之抗原(例如蛋白質或多肽)。可由異二聚體蛋白(例如異二聚體抗體或雙特異性抗體)所結合的效應抗原之實例包括但不限於人CD3(或CD3(分化簇)複合體)、CD16、NKG2D、NKp46、CD2、CD28、CD25、CD64、及CD89。
該標靶細胞可係對人為原生(native)或外來者。在原生標靶細胞中，該細胞可業經轉形成惡性細胞或病理性改質(例如原生標靶細胞被病毒、瘧原蟲(plasmodium)或細菌感染)。在外來標靶細胞中，該細胞係侵入病原體，諸如細菌、瘧原蟲、或病毒。
標靶抗原係在疾病狀況(例如發炎疾病、增生性疾病(例如癌症)、免疫失調、神經疾病、神經退化疾病、自體免疫疾病、感染疾病(例如病毒感染或寄生性感染)、過敏反應、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病)中表現在 標靶細胞上。標靶抗原並非效應抗原。在一些實施態樣中，該標靶抗原係EGFRvIII。
在一些實施態樣中，所提供者係雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係全長之人抗體，其包含特異性結合至標靶抗原之該雙特異性抗體之第一抗體變異域，及包含能夠藉由特異性結合至位在人免疫效應細胞上的效應抗原而召募人免疫效應細胞活性之該雙特異性抗體之第二抗體變異域，其中該第一抗體變異域包含重鏈變異(VH)區，其包含顯示於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217、或218中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或輕鏈變異(VL)區，其包含顯示於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213、或215中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。
在一些實施態樣中，所提供者係雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係全長之人抗體，其包含特異性結合至標靶抗原之該雙特異性抗體之第一抗體變異域，及包含能夠藉由特異性結合至位在人免疫效應細胞上的效應抗原而召募人免疫效應細胞活性之該雙特異性抗體之第二抗體變異域，其中該第一抗體變異域包含(a)重鏈變異(VH)區，其 包含(i)VH互補決定區域一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144、或145中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、或237中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223、或236中之序列；及/或(b)輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238、或239中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196、或199中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197、或200中之序列。
在一些實施態樣中，該第二抗體變異域包含重鏈變異 (VH)區，其包含顯示於SEQ ID NO：240中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或輕鏈變異(VL)區，其包含顯示於SEQ ID NO：241中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。
在一些實施態樣中，該第二抗體變異域包含(a)重鏈變異(VH)區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：244、110、或245中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：246或247中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：248中之序列；及/或(b)輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：249中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：250中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：251中之序列。
表3顯示第二抗體變異域(對CD3具特異性)之特定胺基酸及核酸序列。在表3中，畫底線序列係根據Kabat之CDR序列，粗體係根據Chothia。
表4顯示第二抗體變異域(對CD3具特異性)之CDR序列實例。
在一些實施態樣中，在本文中所提供之含有CD3特異性變異域的雙特異性抗體含有抗CD3序列，如U.S.Publication No.20160297885中所提供者，其在此為所有目的以引用方式併入。
根據製造雙特異性抗體的一個途徑，具有所欲之結合特異性之抗體變異域(抗體-抗原結合部位)係經融合為免疫球蛋白恆定區序列。該融合較佳的是與免疫球蛋白重鏈恆定區，其包含至少部分鉸鏈、CH2及CH3區。較佳係具有第一重鏈恆定區(CH1)，其含有輕鏈結合所必須之部位，存在於該等融合的至少一者。編碼免疫球蛋白重鏈融合及免疫球蛋白輕鏈(若需要的話)之DNA，係插入分開之表現載體，且共同轉染至適合宿主生物中。在當不相等比例的三個多肽鏈用於構築提供最佳產率時的實施態樣中， 此在調整三個多肽片段的共有部分提供極大的彈性。然後，當至少二個多肽鏈的表現等比例產生高產率或當比例不為特別重要時，可插入二個或全部三個多肽鏈的編碼序列在一個表現載體中。
在另一途徑中，該雙特異性抗體由雜合免疫球蛋白重鏈(其具有第一結合特異性)在一個臂及雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)在另一臂所構成。此不對稱結構，僅在雙特異性分子的一半具有免疫球蛋白輕鏈，促進所欲之雙特異性化合物自非所欲免疫球蛋白鏈組合分離。此途徑係描述於PCT Publication No.WO 94/04690。
在另一途徑中，該雙特異性抗體係由在一個臂的第一鉸鏈區胺基酸修飾所構成，且在第一鉸鏈區中的該經取代/經替代之胺基酸具有與在另一臂的第二鉸鏈區對應胺基酸相反的電荷。此方法係描述於International Patent Application No.PCT/US2011/036419(WO2011/143545)。
在另一途徑中，所欲之異多聚體或異二聚體蛋白(例如雙特異性抗體)的形成係藉由改變或工程化第一與第二類免疫球蛋白Fc區(例如鉸鏈區及/或CH3區)之間界面而增強。在此途徑中，該雙特異性抗體可由CH3區所構成，其中該CH3區包含第一CH3多肽及第二CH3多肽，彼等一起交互作用以形成CH3界面，其中在CH3界面內的一或多個胺基酸去安定化均二聚體(homodimer)形成且對均二聚體形成不為靜電不利者。此方法係描述於International Patent Application No.PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)。
在另一途徑中，該雙特異性抗體可使用經工程化至在一個臂中針對抗原(例如EGFRvIII)之抗體的含有麩醯胺酸胜肽標籤及經工程化至在另一臂中針對第二抗原的第二抗體之另一胜肽標籤(例如含有Lys胜肽標籤或反應性內源性Lys)來產生(於存在轉麩醯胺酸酶下)。此方法係描述於International Patent Application No.PCT/IB2011/054899(WO2012/059882)。
在一些實施態樣中，如本文中所述之異二聚體蛋白(例如雙特異性抗體)包含全長之人抗體，其中特異性結合至標靶抗原(例如EGFRvIII)之雙特異性抗體的第一抗體變異域，及包含能夠藉由特異性結合至位在人免疫效應細胞上的效應抗原(例如CD3)而召募人免疫效應細胞活性之該雙特異性抗體之第二抗體變異域，其中該異二聚體蛋白之該第一及第二抗體變異域包含人IgG2(SEQ ID NO：290)的鉸鏈區中位置223、225、及228(例如(C223E或C223R)、(E225R)、及(P228E或P228R))以及在CH3區中的位置409或368(例如K409R或L368E(EU編碼制))之胺基酸修飾。
在一些實施態樣中，該異二聚體蛋白之該第一及第二抗體變異域兩者人IgG1(SEQ ID NO：291)的鉸鏈區中位置221及228(例如(D221R或D221E)及(P228R或P228E))以及在CH3區中的位置409或368(例如K409R或L368E(EU編碼制))之胺基酸修飾。
在一些實施態樣中，該異二聚體蛋白之該第一及第二抗體變異域兩者人IgG4(SEQ ID NO：292)的鉸鏈區中位置228(例如(P228E或P228R))以及在CH3區中的位置409或368(例如R409或L368E(EU編碼制)）之胺基酸修飾。
人IgG1、IgG2、及IgG4之野生型Fc區之胺基酸序列係列於下文：
IgG2(SEQ ID NO：290)
IgG1(SEQ ID NO：291)
IgG4(SEQ ID NO：292)
可用於本發明之抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異共軛抗體(heteroconjugate antibody)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部份(例如結 構域抗體)之融合蛋白、人化抗體、及任何包含所需特異性的抗原辨識部位之免疫球蛋白分子之其他修飾建構，包括抗體之醣苷化變異體、抗體之胺基酸序列變異體、及共價修飾抗體。抗體可係鼠、大鼠、人、或任何其他來源(包括嵌合或人化抗體)。
在一些實施態樣中，如本文中所述之EGFRvIII抗體係單株抗體。例如，EGFRvIII抗體係人化單株抗體或嵌合單株抗體。
在一些實施態樣中，該抗體包含經修飾之恆定區，諸如像是但不限於具有激起免疫反應潛力提高之恆定區。例如，恆定區可係經修飾以具有對Fcγ受體(諸如像是FcγRI、FcγRIIA、或FcγIII)親和力提言。
在一些實施態樣中，該抗體包含經修飾之恆定區，諸如像是免疫惰性之恆定區，即，具有激起免疫反應潛力下降。在一些實施態樣中，該恆定區的修飾係如Eur.J.Immunol.,29：2613-2624,1999；PCT Application No.PCT/GB99/01441；及/或UK Patent Application No.98099518中所述者。Fc可係人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4。Fc可係人IgG2，並含有突變A330P331至S330S331(IgG2△a)，其中胺基酸殘基係參照野生型IgG2序列來編號。Eur.J.Immunol.,29：2613-2624,1999。在一些實施態樣中，該抗體包含IgG4之恆定區，其包含下列突變(Armour et al.,Molecular Immunology 40 585-593,2003)：E233F234L235至P233V234A235 (IgG4△c)，其中編號係參照野生型IgG4。在又另一實施態樣中，Fc係人IgG4 E233F234L235至P233V234A235，具有G236(IgG4△b)刪除。在另一實施態樣中，Fc係任何人IgG4 Fc(IgG4、IgG4△b或IgG4△c)，其含有鉸鏈安定化突變S228至P228(Aalberse et al.,Immunology 105,9-19,2002)。在另一實施態樣中，Fc可係經去糖苷化(aglycosylated)之Fc。
在一些實施態樣中，該恆定區係藉由突變恆定區中寡醣接附殘基(諸如Asn297)及/或糖苷化辨識序列部分的側翼殘基而去糖苷化。在一些實施態樣中，該恆定區係針對酵素N-連接型醣苷化的去糖苷化。該恆定區可係針對酵素N-連接型醣苷化的去糖苷化或在醣苷化缺陷宿主細胞中表現而去糖苷化。
在一些實施態樣中，該恆定區具有經修飾之恆定區，其移除或減少Fc γ受體結合。例如，Fc可係含有D265突變之人IgG2，其中該胺基酸殘基係參照野生型IgG2序列(SEQ ID NO：290)而編號。因此，在一些實施態樣中，該恆定區具有經修飾之恆定區，其具有顯示於SEQ ID NO：252中之序列：
編碼顯示於SEQ ID No：252中之序列的核酸係顯示於 SEQ ID NO：253：
在一些實施態樣中，該恆定區具有經修飾之恆定區，其具有顯示於SEQ ID NO：254中之序列：
編碼顯示於SEQ ID No：254中之序列的核酸係顯示於SEQ ID NO：255：
人Kappa恆定區之胺基酸係顯示於SEQ ID NO：256：GTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。且編碼SEQ ID No：256中之序列的核酸係顯示於SEQ ID NO：257：
判定抗體對EGFRvIII的結合親和力之一種方式係測量雙價抗體對單體EGFRvIII蛋白質的結合親和力。 EGFRvIII抗體的親和力可藉由配備有預先固定化之抗小鼠Fc或抗人Fc的表面電漿子共振(BiacoreTM3000TM surface plasmon resonance(SPR)system,BiacoreTM,INC,Piscataway NJ)、使用HBS-EP運作緩衝液(0.01M HEPES,pH 7.4,0.15 NaCl,3mM EDTA,0.005% v/v Surfactant P20)來判定。經單體性8個組胺酸標籤之人EGFRvIII胞外域可經稀釋於HBS-EP緩衝液至小於0.5μg/mL的濃度並使用各種接觸時間跨個別晶片通道來注入，以達到二個抗原密度範圍，針對詳細動力學研究為50至200反應單位(RU)或針對篩選檢定為800至1,000RU。再生研究已顯示25mM NaOH於25% v/v乙醇中有效地移除結合之EGFRvIII蛋白質而維持晶片上EGFRvIII抗體的活性超過200次注入。通常，經純化之經8個組胺酸標籤EGFRvIII樣本的連續稀釋(橫跨0.1至10x濃度的估計KD)係注入1min(100μL/分鐘)且允許達至2小時的解離時間。EGFRvIII蛋白質之濃度係藉由在280nm下的吸光度基於經8個組胺酸標籤EGFRvIII蛋白質序列特異性消光係數來判定。動力結合速率(kon或ka)及解離速率(koff或kd)係藉由總體擬合數據至1：1 Langmuir結合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)、使用BIAevaluation程式而同時獲得。平衡解離常數(KD)值以koff/kon計算。此操作方案適合用於判定抗體對任何單體EGFRvIII結合親和力，包括人EGFRvIII、其他動物之EGFRvIII(諸如小鼠 EGFRvIII、大鼠EGFRvIII、或靈長類EGFRvIII)，以及不同形式EGFRvIII(例如經糖苷化之EGFRvIII)。抗體結合親和力通常在25℃下來測量，但亦可在37℃下來測量。
如本文中所述之抗體可藉由任何本技術領域中已知方法來製成。對於製造融合瘤細胞株，宿主動物之免疫化之途徑及排程係通常依經建立及習知的抗體刺激及製造技術，如本文中進一步所述者。用於製造人及小鼠抗體的一般技術係本技術領域中已知及/或如本文中所述。
應涵蓋的是，任何哺乳動物個體(包括人)或來自彼之製造抗體細胞可經操作以供作為製造哺乳動物(包括人)及融合瘤細胞株之基礎。通常，宿主動物係經由腹腔、肌肉注射、口服、皮下、腳底、及/或皮內接種一劑量之免疫原，並且包含於此所述之方法。
可使用一般體細胞雜交技術(Kohler,B.and Milstein,C.,Nature 256：495-497,1975)或由Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18：377-381,1982改良者，以從淋巴球及永生骨髓瘤細胞製備融合瘤。雜交可使用之骨髓瘤細胞株包括但不限於X63-Ag8.653及其他由Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA取得者。一般而言，使用融合劑(fusogen)(如聚乙二醇)融合骨髓瘤細胞及淋巴球細胞之技術或電方法皆為此技術領域之習知技術。於融合後，將細胞從融合培養基中相互分離，並且於選定之成長培養基中成長，如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT)培 養基，以去除未染種的母細胞。於此所述之任何一種培養基，不論是含有血清或不含血清的培養基，皆可用來培養分泌單株抗體之融合瘤。而以另一種細胞融合技術，可使用EBV永生B細胞(EBV immprtalized B cell)生產本發明之單株抗體。於此技術中融合瘤將擴大並經過次選殖(subcloned)，需要時，可使用一般免疫法之步驟(如放射免疫分析法、酵素免疫分析法或螢光免疫分析法)檢驗其上清液中之抗免疫原之活性。
融合瘤包含所有融合瘤母細胞之衍生物及子代細胞，皆可作為生產對EGFRvIII或其部份具有特異性之單株抗體之抗體來源。
以融合瘤生產之抗體，可使用習知方法於體內或體外成長抗體。需要時，亦可使用傳統純化免疫球蛋白之方法(如硫酸胺沉澱法、凝膠電泳法、透析法、色層分析法及超過濾作用)，將單株抗體由培養基或體液中分離出來。當其中含有不想要的活性抗體存在時，可使用固相上接有由免疫原製成之吸附劑進行純化，再將想要的抗體由免疫原上沖提並且釋放出來。將宿主動物以表現人EGFRvIII的細胞、或經共軛至蛋白質(其係在待免疫化物種中係致免疫性，例如)、包含標靶胺基酸序列之片段免疫化，可產出抗體(如單株抗體)族群，其中該蛋白質係為待免疫物種之免疫原，如鎖孔帽貝血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清蛋白(serum albumin)、牛甲狀腺蛋白(bovine thyroglobulin)或使用雙功能性或衍生化試劑之大 豆胰蛋白酶(soybean trypsin)抑制劑，例如：順丁烯二醯亞胺苄醯基磺基琥珀醯亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)(由離胺酸殘基結合)、戊二醛(glutaraldehyde)、琥珀酸酐(succinic anhydride)、SOCl2、或R1N=C=NR，其中R及R1係不同烷基。
需要時，可將所關注之抗體(單株或多株抗體)定序(sequenced)，且其核苷酸序列可選殖在用以表現或增生的載體上。編碼所關注之抗體之序列可維持於宿主細胞之載體，之後可擴增宿主細胞，並且將其冰凍以供將來利用。在細胞培養中製造重組單株抗體可透過本技術領域中已知方法選殖來自B細胞的抗體基因來進行。參見例如Tiller et al.,J.Immunol.Methods 329,112,2008；U.S.Pat.No.7,314,622。
或者，聚核苷酸序列亦可用於基因操作，以將此抗體“人化(humanize)”或增進其抗體的親和力或其他特性。例如，可將恆定區工程化為更像人恆定區，以避免抗體使用於人體臨床試驗及治療時產生免疫反應。較佳的是，對抗體序列進行基因操作，使其對EGFRvIII具有更大親和力且對抑制EGFRvIII有更大效力。
人化單株抗體有四個一般步驟。有：(1)確定起始抗體輕鏈及重鏈變異域之核苷酸及預測的胺基酸序列；(2)設計人化抗體，即，確定在人化過程中使用何種抗體框架區；(3)實際人化方法/技術；以及(4)轉染及表現人化抗 體。參見例如U.S.Pat.Nos.4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；及6,180,370。
業已闡述了諸多含有源自非人免疫球蛋白之抗原結合部位的「人化」抗體分子，包括具有融合至人恆定區之齧齒類或經改造之齧齒類V區及其毗連CDR的嵌合抗體。參見例如Winter et al.Nature 349：293-299,1991、Lobuglio et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224,1989、Shaw et al.J Immunol.138：4534-4538,1987、及Brown et al.Cancer Res.47：3577-3583,1987。其他些參考文獻闡述在與適宜人抗體恆定區融合之前接枝至人支撐架構區(FR)之齧齒類CDR。參見例如Riechmann et al.Nature 332：323-327,1988、Verhoeyen et al.Science 239：1534-1536,1988、及Jones et al.Nature 321：522-525,1986。另一參考文獻闡述由以重組方式構建之齧齒類架構區支撐的齧齒類CDR。參見例如European Patent Publication No.0519596。此等「人化」分子經設計可使針對齧齒類抗人抗體分子之不期望的免疫學反應最小化，否則該不期望的免疫學反應會限制彼等部分在人接受者中治療應用之持續時間及效力。例如，抗體恆定區可經工程化而使其免疫學上呈惰性(例如不引發補體溶裂)。參見例如PCT Publication No.PCT/GB99/01441；UK Patent Application No.9809951.8。其他亦可利用之人化抗體之方法係經揭示於下列者：Daugherty et al.,Nucl.Acids Res.19：2471-2476,1991及U.S.Pat.Nos.6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；及6,350,861；及PCT Publication No.WO 01/27160。
有關上文討論的人化抗體之一般原理亦係可適用於客製化抗體以用於例如犬、貓、靈長類、馬及牛。又，一或多個人化如本文中所述抗體的態樣可結合例如CDR移植、架構突變及CDR突變。
在一個變體中，全人抗體可藉由使用市售業經工程化以表現特定人免疫球蛋白的蛋白質之小鼠來獲得。亦可使用經設計可產生更合乎需要(例如，全人抗體)或具更強免疫反應之基因轉殖動物來產生人化或人抗體。此技術之實例係XenomouseTM(來自Abgenix,Inc.(Fremont,CA))及HuMAb-Mouse®及TC MouseTM(來自Medarex,Inc.(Princeton,NJ))。
或者，抗體可用任何本技術領域中已知方法以重組方式製備並表現。或者，抗體可藉由噬菌體展示技術以重組方式製備。參見例如U.S.Pat.Nos.5,565,332；5,580,717；5,733,743；及6,265,150；及Winter et al.,Annu.Rev.Immunol.12：433-455,1994。或者，可使用噬菌體展示技術(McCafferty et al.,Nature 348：552-553,1990)在體外由來自未經免疫之供體的所有免疫球蛋白變異(V)域基因產生人類抗體及抗體片段。根據次技術，將抗體V結構域基因在框內選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要衣殼蛋白基因中，並在噬菌體顆粒表面 上展示為功能抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒含有噬菌體基因組之單鏈DNA拷貝，故基於抗體功能性質之選則亦會達成對編碼展示彼等性質之抗體之基因的選擇。故噬菌體可模擬B細胞的某些性質。噬菌體展示可在各種形式中進行，文獻回顧參見例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571,1993。V基因片段之若干來源可用於噬菌體展示。Clackson et al.,Nature 352：624-628,1991從源自經免疫小鼠脾之V基因的小型隨機組合庫中分離到多樣系列的抗噁唑酮抗體。可構建來自未經免疫之人類供體的所有V基因，且可基本依照Mark et al.,J.Mol.Biol.222：581-597,1991或Griffith et al.,EMBO J.12：725-734,1993所述之技術分離到針對抗原(包括自身抗原)多樣陣列之抗體。在天然免疫反應中，抗體基因可以高比率積累突變(體細胞超突變)。所引入的某些改變會賦予更高之親和力，且展現高親和力表面免疫球蛋白之B細胞會在後續抗原攻擊過程中優先複製及分化。此天然過程可利用稱作“鏈重排(chain shuffling)”之技術來模擬。(Marks et al.,Bio/Technol.10：779-783,1992)。在此方法中，由噬菌體展示獲得之“初級(primary)”人抗體的親和力可藉由以自未經免疫之供體獲得之所有天然存在之V結構域基因變體(所有部分(repertoire))依序取代重鏈及輕鏈V區基因來改進。此技術能夠產生親和力介於pM至nM之間的抗體及抗體片段。。用於製備相當大噬菌體抗體所有組成部分之 策略(亦稱作“各庫之母(the mother-of-all libraries)”)已由Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.21：2265-2266,1993闡述。基因重排亦已用來自齧齒類抗體得到人抗體，其中人抗體具有類似於起始齧齒類抗體之親和力及特異性。根據此方法(亦稱作“抗原決定部位印跡(epitope imprinting)”)，由噬菌體展示技術得到之齧齒類抗體的重鏈或輕鏈V結構域基因由人V結構域基因的所有組成部分取代，從而形成醫齒類-人嵌合體。對抗原之選擇可促成能夠恢復功能性抗原結合部位之人類可變區的分離，即，表位可控制(印跡)夥伴之選擇。當重複該過程以取代餘下之齧齒類V結構域時，可得到人抗體(參見PCT Publication No.WO 93/06213)。與藉由CDR接枝進行之齧齒類抗體的傳統人化不同，此技術可提供全人抗體，此等抗體不含齧齒類來源之架構或CDR殘基。
抗體可以重組方式如下製備：首先分離由宿主動物產生之抗體；獲得基因序列；並使用基因序列以重組方式在宿主細胞(例如，CHO細胞)中表現抗體。可採用的另一方法係在植物(例如菸草)或基因轉殖乳表現抗體序列。曾有人揭示了用於在植物或奶牛體內以重組方式表現抗體之方法。參見例如Peeters,et al.Vaccine 19：2756,2001；Lonberg,N.and D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65,1995；and Pollock,et al.,J Immunol Methods 231：147,1999。用於製備抗體衍生物(例如人化、單鏈等)之方法為本技術領域中已知。
亦可利用免疫檢定及流式細胞測量(諸如螢光激活細胞分選(FACS))來分離對EGFRvIII或所關注之腫瘤抗原具特異性之抗體。
可使如本文中所述之抗體結合至多種不同載體上。載體可具活性及/或呈惰性。熟知載體之實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐綸、澱粉酶、玻璃、天然及改質纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖以及磁石。就本發明目的而言載體性質可以係可溶或不可溶。熟習此項技術者知曉用於結合抗體之其他適宜載體，或能夠使用常規實驗對此加以確認。在一些實施態樣中，該載體包含靶向心肌之部分。
編碼單株抗體之DNA係易於利用習知方法(例如利用能與編碼該單株抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)分離及定序。雜交瘤細胞作為該DNA之較佳來源。一經分離後，該DNA可被置入表現載體中(諸如PCT Publication No.WO 87/04462所揭示之表現載體)，該表現載體接著被轉染至原本並不產製免疫球蛋白之宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞，以獲得單株抗體在該重組宿主細胞中之合成。參見例如PCT Publication No.WO 87/04462。該DNA亦可藉由例如以人重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列取代同源鼠序列(Morrison et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851,1984)或藉由使非免疫球蛋白多肽之所有或部分之編碼序列與該免疫球蛋白編碼序列共價結 合而加以修飾。在該方式中，“嵌合(chimeric)”或“雜交(hybrid)”抗體係經製備以具有在本文中之單株抗體之結合特異性。
如本文中所述之EGFRvIII抗體可利用本技術領域中已知之方法鑑定或特徵分析，藉此偵測及/或測量EGFRvIII表現之降低。在一些實施態樣中，EGFRvIII抗體係藉由培養候選劑與EGFRvIII及監測結合及/或隨之而來之EGFRvIII表現降低而鑑別。該結合檢定可以純化之EGFRvIII多肽或以天然表現或經轉染以表現EGFRvIII多肽之細胞進行。在一個實施態樣中，該結合檢定係競爭結合檢定，其中候選抗體與已知EGFRvIII抗體競爭EGFRvIII結合之能力係經評估。該檢定可以不同形式進行，包括ELISA形式。
在初步識別之後，候選EGFRvIII抗體之活性可進一步經已知用於測試該標靶生物活性之生物檢定證實及再確認。或者，生物檢定可被直接用於篩選候選物。若干用於識別及特徵化抗體之方法係詳細描述於實施例中。
EGFRvIII抗體可利用該領域眾所周知之方法特徵化。舉例來說，一個方法係用於識別彼所結合之表位或“表位定位(epitope mapping)”。該領域有許多已知之用於定位及特徵化蛋白質上表位之位置之方法，包括破解抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭測定、基因片段表現測定及基於合成胜肽之檢定，例如於Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999第11章所述。另一實例中，表位定位可被用於決定抗體所結合之序列。表位定位可自不同商業來源取得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。該表位可為線性表位，也就是包含在單段之胺基酸中，或由不一定包含在單段中之胺基酸三維交互作用所形成之構型表位。各種長度之肽(例如至少4至6個胺基酸長)可被分離或合成(例如重組)及用於EGFRvIII或其他腫瘤抗體之結合測定。在另一實例中，EGFRvIII抗體所結合之表位可於系統性篩選中決定，其係藉由使用衍生自EGFRvIII序列之重疊肽並測定EGFRvIII抗體之結合。根據基因片段表現檢定，編碼EGFRvIII之開放閱讀框係隨機或按特異性基因結構分段，且EGFRvIII之表現片段與所欲測試之抗體的反應性係經判定。該基因片段舉例來說可能由PCR產製，接著於體外在放射性胺基酸存在時被轉錄及轉譯成蛋白質。該抗體與該放射性標記EGFRvIII之結合接著由免疫沉潑及膠體電泳決定。特定表位亦可藉由使用噬菌體顆粒表面所展示之隨機肽序列之大型庫(噬菌體庫)識別。或者，經定義之重疊肽片段庫可於簡單結合測定中被測試與該受測抗體之結合。在另一實施例中，抗原結合結構域之突變誘發、結構域替換實驗及丙胺酸掃描突變誘發可被進行以識別表位結合所需、足夠及/或必要之殘基。舉例來說，結構域替換實驗可利用突變EGFRvIII進行，其中EGFRvIII蛋白質之各種片段已被 來自其他物種(例如小鼠)之EGFRvIII序列或密切相關但具抗原獨特性之蛋白(例如Trop-1)取代(替換)。藉由評估該抗體與該突變EGFRvIII之結合，可評估特定EGFRvIII片段對抗體結合之重要性。在EGFRvIII特異性抗體(即抗體不結合EGFRwt(野生型)或任何其他蛋白質)的情況中，表位可自EGFRvIII對EGFRwt的序列比對來推衍出。
另一可用於特徵化EGFRvIII抗體之方法係使用已知和相同抗原，也就是EGFRvIII之不同片段，結合之其他抗體的競爭檢定，以決定EGFRvIII抗體是否如其他抗體般與該相同表位結合。競爭檢定為該領域之技藝人士所廣為周知。
表現載體可被用於直接表現EGFRvIII抗體。該領域之技藝人士熟悉投予表現載體以獲得活體內外源性蛋白質之表現。參見例如U.S.Pat.Nos.6,436,908；6,413,942；及6,376,471。投予表現載體包括局部或全身性投予，包括注射、經口投予、粒子槍或經導管投予及局部投予。在另一實施態樣中，該表現載體係直接投予至交感神經幹或神經節，或至冠狀動脈、心房、心室或心包膜中。
靶向遞輸含有表現載體之治療性組成物或次基因組多核苷酸亦可被使用。受體媒介性DNA遞送技術係描述於例如Findeis et al.,Trends Biotechnol.,1993,11：202；Chiou et al.,Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff,ed.,1994；Wu et al.,J.Biol.Chem.,263：621,1988；Wu et al.,J.Biol.Chem., 269：542,1994；Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：3655,1990；及Wu et al.,J.Biol.Chem.,266：338,1991。含有多核苷酸之治療性組成物係以約100ng至約200mg之DNA範圍投予以供基因治療療程中之局部投予。約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg、及約20μg至約100μgDNA濃度範圍亦可被用於基因治療操作方案期間。該治療性多核苷酸及多肽可利用基因遞輸載具被遞送。該基因遞輸載具可為病毒性或非病毒性來源(一般參見Jolly,Cancer Gene Therapy,1：51,1994；Kimura,Human Gene Therapy,5：845,1994；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1：185；and Kaplitt,Nature Genetics,6：148,1994).該基因遞送載具可為病毒性或非病毒性來源(一般參見Jolly,1994,Cancer Gene Therapy 1：51；Kimura,1994,Human Gene Therapy 5：845；Connelly,1995,Human Gene Therapy 1：185及Kaplitt,1994,Nature Genetics 6：148)。該等編碼序列之表現可利用內源性哺乳動物或異源性啟動子被誘導。編碼序列之表現可為持續性或經調節的。
供遞送所欲多核苷酸及在所欲細胞中表現之病毒基底載體係該領域所熟知。例示性病毒基底載具包括但不限於重組反轉錄病毒(參見例如PCT Publication Nos.WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；U.S.Pat.Nos.5,219,740 and 4,777,127；GB Pat.No.2,200,651；及 EP Pat.No.0 345 242)、α病毒基底載體(例如辛得比司(Sindbis)病毒載體、聖利基(Semliki)森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅氏河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委內瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))及腺病毒相關病毒(AAV)載體(參見例如PCT Publication Nos.WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984 and WO 95/00655)。如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147所述之投予與已殺死之腺病毒連接之DNA亦可被採用。
非病毒性遞送載具及方法亦可被採用，包括但不限於與單獨已殺死之腺病毒連接或未連接之多價陽離子縮合DNA(參見例如Curiel,Hum.Gene Ther.,3：147,1992)；與配體連接之DNA(參見例如Wu,J.Biol.Chem.,264：16985,1989)；真核細胞遞送載具細胞(參見例如U.S.Pat.No.5,814,482；PCT Publication Nos.WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；and WO 97/42338)及核電荷中和或與細胞膜融合。裸DNA亦可被採用。例示性裸DNA介導方法係描述於PCT Publication No.WO 90/11092及U.S.Pat.No.5,580,859。可作為基因遞送載具之脂質體係描述於U.S.Pat.No.5,422,120；PCT Publication Nos.WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；及EP 0524968。其他方法係描述於Philip,Mol.Cell Biol.,14：2411,1994及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci., 91：1581,1994。
在一些實施態樣中，本發明涵蓋組成物，包括醫藥組成物，其包含本文中所述之抗體或由本文中所述之方法所製造且具有本文中所述之特性。如本文中所使用，組成物包含一或多種結合至EGFRvIII之抗體、及/或一或多種包含編碼一或多種這些抗體之序列的聚核苷酸。這些組成物可另包含適合賦形劑，諸如醫藥上可接受之賦形劑，其包括緩衝劑，其係本技術領域中已熟知。
本發明亦提供製備任何該等抗體之方法。本發明之抗體可利用該領域已知之方法製備。多肽可藉由抗體之蛋白水解或其他降解方式、藉由如上所述之重組方法(即單一或融合多肽)或藉由化學合成加以製備。該等抗體之多肽特別是最多約50個胺基酸之較短多肽係方便地藉由化學合成製備。化學合成之方法係該領域所知且可自商業途徑獲得。舉例來說，抗體可藉由採用固相方法之自動多肽合成儀產製。亦見美國專利第5,807,715、4,816,567及6,331,415號。
在另一替代態樣中，該等抗體可利用該領域廣為週知之重組方法製備。在一個實施態樣中，多核苷酸包含編碼下列抗體之重鏈及/或輕鏈變異區之序列：m62G7、h62G7、h62G7-H14/L1-DV、h62G7-EQ/L6、42G9、32A10、20B9、14C11、21E11、49B11、46E10、12H6、19A9、21E7、11B11、12B2、11F10、17G11、29D5、30D8、20E12、26B9、32G8、34E7、20G5、C6、B5、 42G9-1、32A10-1、20B9-1、14C11-1、21E11-1、49B11-1、46E10-1、12H6-1、19A9-1、21E7-1、11B11-1、12B2-1、11F10-1、17G11-1、29D5-1、30D8-1、20E12-1、26B9-1、32G8-1、34E7-1、20G5-1、C6-1、或B5-1。編碼該感興趣之抗體的序列可被維持於宿主細胞之載體中，接著該宿主細胞可被擴增及冷凍以供將來使用。載體(包括表現載體)及宿主細胞另於此處說明。
包含二個共價連結抗體之異源共軛抗體亦屬於本發明之範圍內。該等抗體已被用於使免疫系統細胞以非所欲細胞為標靶(U.S.Pat.No.4,676,980)及用於治療HIV感染(PCT Publication Nos.WO 91/00360及WO 92/200373；EP 03089)。異源共軛抗體可利用任何方便之交聯方法製備。適當之交聯劑及技術係該領域所廣為周知且描述於U.S.Pat.No.4,676,980。
嵌合或雜交抗體亦可利用已知之合成蛋白質化學方法於活體外製備，包括該些涉及交聯劑之方法。舉例來說，免疫毒素可利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵被構築。供此目的使用之適當試劑實例包括亞胺基硫醇鹽(iminothiolate)及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
在重組人化抗體中，Fc部分可經修飾以避免與Fcγ受體及補體及免疫系統之交互作用。用於製備該等抗體之技術係描述於WO 99/58572。舉例來說，恆定區可經基因工程改造以更為近似人恆定區以避免若該抗體用於人之臨 床試驗及治療時之免疫反應。參見例如美國專利號5,997,867及5,866,692。
本發明涵蓋對本發明之抗體及多肽的修飾，包括如表5中所示之變異體，其包括不會顯著影響它們的性質的功能性等效抗體及具有增強或下降之活性和/或親和力的變異體。舉例而言，該胺基酸序列可經突變以獲得具有所欲之對EGFRvIII結合親和力的抗體。多肽的修飾係本技術領域中例行實務且不需在本文中詳述。修飾多肽的實例包括具有胺基酸殘基保守性取代、胺基酸的一或多個刪除或添加(彼等不顯著劣化功能性活性或成熟(增強)多肽對其配體的親和力)、或使用化學類似物之多肽。
胺基酸序列插入包括胺端和/或羧端融合(範圍在一個殘基至含有一百或更多個殘基的多肽之長度)和序列內插入單個或多個胺基酸殘基。末端插入的實例包括以N端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至表位標籤之抗體。其他抗體分子之插入變異體包括融合至酵素或多肽(增加抗體在血液循環中半生期)的抗體N或C端。
取代變異體具有至少一個抗體分子中胺基酸殘基經移除且不同殘基插入其位。取代性突變誘發最感興趣之位置包括超變異區，但FR改變亦被考慮。保留性取代係顯示於表5中表頭“保守性取代(conservative substitution)”之下。若該取代導致生物活性改變，則更多在表5中稱為“例示性取代”或另於下述參照胺基酸分類之實質上改變可被導入及篩選該產物。在一些實施態樣中，相較於標準親 代抗體，在本文中所提供之抗體取代變異體具有不多於15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個保守性取代在VH或VL區。在一些實施態樣中，該取代係不在VH或VL區的CDR內。
抗體生物性質之實質上修飾係藉由選擇彼等在維持下列之效果上顯著不同之取代加以完成：(a)取代區域之多肽骨架之結構，例如片狀或螺旋構型，(b)標靶位置之分子的電荷或疏水性或(c)側鏈之主體。天然發生之胺基酸殘基根據常見之側鏈性質分成下列群組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)極性不帶電荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(負電荷)：Asp、Glu；(4)鹼性(正電荷)：Lys、Arg；(5)影響側鏈方向性之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe、His。
非保守性取代係藉由以該等分類之一中的成員與另一分類交換達成。
任何未涉及維持抗體適當構型之半胱胺酸殘基亦可被取代，通常由絲胺酸取代，以增進該分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反的，半胱胺酸鍵可被加入抗體以增進彼之穩定性，特別是當該抗體係抗體片段諸如Fv片段。
胺基酸修飾可從改變或修飾一或多個胺基酸至完全重新設計一區諸如變異區。變異區之變化可改變結合親和力及/或特異性。在一些實施態樣中，不超過一至五個保守性胺基酸取代發生在CDR域內。在其他實施態樣中，不超過一至三個保守性胺基酸取代發生在CDR域內。在其他實施態樣中，該CDR域係CDR H3及/或CDR L3。
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽，也包括具有其他 轉譯後修飾之多肽，諸如舉例來說以不同之糖進行糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體係於彼等之恆定區中的保守位置經糖基化(Jefferis and Lund,Chem.Immunol.65：111-128,1997；Wright and Morrison,TibTECH 15：26-32,1997)。免疫球蛋白之寡糖側鏈影響該蛋白質之功能(Boyd et al.,Mol.Immunol.32：1311-1318,1996；Wittwe and Howard,Biochem.29：4175-4180,1990)及該糖蛋白之不同部分之間的分子內交互作用，其可影響該糖蛋白之構形及所呈現之三維表面(Jefferis and Lund,supra；Wyss and Wagner,Current Opin.Biotech.7：409-416,1996)。根據特定辨認結構，寡糖亦可被用來使給定糖蛋白瞄準某些分子。也有報告指出抗體之糖基化會影響抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)。特別是，經四環素調節表現β(1,4)-N-乙醯葡萄胺基轉移酶III(GnTIII，一種催化形成平分型GlcNAc之糖基轉移酶)之CHO細胞被報告具有增強之ADCC活性(Umana et al.,Nature Biotech.17：176-180,1999)。
抗體之糖基化通常不是N-連接就是O-連接。N-連接係指碳水化合物基團連接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸、天冬醯胺酸-X-蘇胺酸及天冬醯胺酸-X-半胱胺酸係供碳水化合物基團與天冬醯胺酸側鏈酵素性連接之辨識序列，其中X係除脯胺酸以外之任何胺基酸。因此，多肽中有任何該等三肽序列之存在即產生可能的糖基化位置。O-連接糖基化係指連接糖類N-乙醯 半乳糖胺、半乳糖或木糖之一者與羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，不過5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸亦可被使用。
在抗體中加入糖基化位置可藉由改變胺基酸序列以使該序列包含一或多個上述之三肽序列(供N-連接糖基化位置)而方便地完成。該改變亦可藉由在原始抗體之序列加入或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基加以完成(供O-連接糖基化位置)。
抗體之糖基化模式亦可在不改變基礎核苷酸序列下加以改變。糖基化大多取決於用來表現該抗體之宿主細胞。由於用來表現重組糖蛋白(例如抗體)以作為潛在治療劑之細胞種類鮮少為天然細胞，因此抗體之糖基化模式的變化可被預期(見例如Hse et al.,J.Biol.Chem.272：9062-9070,1997)。
除了宿主細胞之選擇以外，在重組產製抗體期間可影響糖基化之因素包括生長模式、培養基配方、培養密度、氧化、pH、純化程序及該類似因素。多種方法已被提出以改變在特定宿主生物體中達成之糖基化模式，包括導入或過度表現與寡糖產製有關之某些酵素(美國專利第5,047,335、5,510,261及5,278,299號)。糖基化(或某些類型之糖基化)可藉由酵素自糖蛋白移除，舉例來說利用內切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3。此外，該重組宿主細胞可經基因工程化以不處理某些種類之多醣。這些及類似之技術 係該領域所廣為週知。
其他修飾之方法包括使用該領域已知之偶合技術，包括但不限於酵素方法、氧化性取代及螯合。修飾可被用於例如連接用於免疫測定之標記。經修飾之多肽係利用該領域已建立之方法製備，且可利用該領域已知之標準測定篩選，這些方法中有些係於下面及實施例中描述。
其他抗體修飾包括如PCT公開號WO 99/58572所述經修飾之抗體。該等抗體除了包含針對標靶分子之結合結構域，還包含具有實質上與人免疫球蛋白重鏈之所有或部分恆定區同源之胺基酸序列的效應結構域。該等抗體能與標靶分子結合但不引發顯著之補體依賴性溶解或細胞媒介性標靶破壞。在一些實施態樣中，該效應結構域能與FcRn及/或FcγRIIb專一性結合。彼等通常是根據衍生自二或多種人免疫球蛋白重鏈CH2區之嵌合性結構域。以此方式修飾之抗體特別適用於慢性抗體治療，以避免傳統抗體治療所引發之發炎及其他不良反應。
本發明包括親和性成熟之實施態樣。舉例來說，親和性成熟抗體可藉由該領域已知之方法產製(Marks et al.,Bio/Technology,10：779-783,1992；Barbas et al.,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813,1994；Schier et al.,Gene,169：147-155,1995；Yelton et al.,J.Immunol.,155：1994-2004,1995；Jackson et al.,J.Immunol.,154(7)：3310-9,1995,Hawkins et al.,J.Mol.Biol.,226：889-896,1992；and PCT Publication No.WO2004/058184)。
下列方法可被用於調整抗體之親和性及特徵化CDR。一種特徵化抗體之CDR及/或改變(諸如改善)多肽諸如抗體之結合親和性之方法被稱為「庫掃描突變形成」。通常，庫掃描突變形成係如下述。CDR中之一或多個胺基酸位置係利用該領域已建立之方法經兩或多個(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸取代。如此產生小型殖株庫(在一些實施態樣中，每個經分析之胺基酸位置皆有一個殖株)，每個殖株皆有兩或多個成員之複雜性(若各位置被兩或多個胺基酸取代)。通常，該殖株庫亦包括包含天然(未經取代之)胺基酸之殖株。各庫中之少量殖株(例如約20至80個殖株，依該庫之複雜性而定)係經篩選其與該標靶多肽(或其他結合標靶)之結合親和性，結合性增加、相同、降低或不具結合性之候選殖株被識別。測定結合親和性之方法係該領域所廣為週知。結合親和性可利用BiacoreTM表面電漿共振分析測定，該分析檢測約2倍或更高之結合親和性差異。BiacoreTM特別適用於當起始抗體已經以相當高之親和性結合時，例如約10nM或小於10nM之KD。利用BiacoreTM表面電漿共振篩選係描述於此處之實施例。
結合親和性可利用金耐科薩(Kinexa)生物感測器、鄰近閃爍檢測、ELISA、ORIGEN免疫測定(IGEN)、螢光淬熄、螢光轉移及/或酵母菌展示測定。結合親和性亦可利用適當之生物測定篩選。
在一些實施態樣中，CDR中之每個胺基酸位置(在一些實施態樣中一次一個位置)皆利用該領域已知之突變形成方法(某些方法於此處描述)以所有20個天然胺基酸取代。如此產生小型殖株庫(在一些實施態樣中，每個經分析之胺基酸位置有一個殖株)，各殖株具有20個成員之複雜性(若每個位置被所有20個胺基酸取代)。
在一些實施態樣中，該經篩選之庫包含兩或多個位置之取代，該兩或多個位置可能在相同CDR內或在兩或多個CDR內中。因此，該庫可能包含在一個CDR中取代兩或多個位置。該庫可能包含在二或多個CDR中取代兩或多個位置。該庫可能包含取代3、4、5或多個位置，該等位置見於二、三、四、五或六個CDR中。該取代可利用低多餘性密碼子製備。見例如Balint et al.,Gene 137(1)：109-18,1993之表2。
該CDR可為CDRH3及/或CDRL3。該CDR可為CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3之一或多者。該CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR或延伸CDR。
具有改善結合性之候選物可被定序，藉此識別導致改善親和性之CDR取代突變(亦稱為「改善」取代)。可結合之候選物亦被定序，藉此識別保留結合性之CDR取代。
可進行多次篩選。舉例來說，具有改善結合性之候選物(各候選物在一或多個CDR之一或多個位置包含胺基酸取代)亦可被用於設計第二庫，該庫在各經改善之CDR位 置(即在CDR中取代突變顯示改善結合性之胺基酸位置)包含至少該原始及經取代之胺基酸。此庫之製備、篩選及選擇另於下討論。
庫掃描突變形成亦提供特徵化CDR之方法，因為具有改善結合力、相同結合力、降低結合力或無結合力之克隆的頻率亦提供有關各胺基酸位置對抗體-抗原複合物之穩定性的重要性之資訊。舉例來說，如果CDR之一個位置被改變成所有20個胺基酸仍保留結合力，該位置被認為不可能是抗原結合所必需之位置。相反地，如果CDR之一個位置只有在低比例之取代中保留結合力，該位置被認為是對CDR之功能具重要性之位置。因此，庫掃描突變形成方法產生有關CDR中之位置的資訊，有些位置可被改變成許多不同之胺基酸(包括所有20個胺基酸)，有些位置無法被改變或僅能被改變成少數幾種胺基酸。
具有改善親和性之候選物可利用所希望之篩選或選擇方法被組合於第二庫中，該庫包括在該位置經改善之胺基酸及原始胺基酸，且可能另外包括該位置之額外取代，視所希望或所允許之該庫之複雜性而定。此外若有需要的話，鄰近之胺基酸位置可被隨機化成至少兩或多種胺基酸。鄰近胺基酸之隨機化可能允許該突變CDR之額外構型可塑性，此可能進而允許或促進導入更多之改善突變。該庫亦可能包含在第一次篩選時不顯示改善親和性之取代位置。
該第二庫係利用該領域已知之任何方法篩選或選擇具 有改善及/或改變之結合親和性之庫成員，包括利用BiacoreTM表面電漿共振分析篩選，及利用該領域已知之任何用於選擇之方法選擇，包括噬菌體展示、酵母菌展示及核糖體展示。
本發明亦包含融合蛋白質，該融合蛋白質包含一或多個源自本發明之抗體的片段或區域。在一實施態樣中，本發明提供一種融合多肽，該融合多肽包含如SEQ ID NO：2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,29,31,33,36,38,40,42,45,47,49,51,211,212,213,or 215所示之輕鏈可變區之至少10個連續胺基酸，及/或如SEQ ID NO：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,30,32,34,35,37,39,41,43,44,46,48,50,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,202,203,204,205,206,207,208,209,210,214,216,217,or 218所示之重鏈可變區之至少10個連續胺基酸。在其他實施態樣中，本發明提供包含該輕鏈可變區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個連續胺基酸及/或該重鏈可變區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個連續胺基酸之融合多肽。在另一實施態樣中，該融合多肽包含一或多個CDR。在另一實施態樣中，該融合多肽包含輕鏈可變區及/或重鏈可變區，如選自SEQ ID NO：1及2、3及4、3及5、6及5、7及5、8及9、10及11或12及13之任一序列對所示。在另一實施態樣中，該融合多肽包含一或多個CDR。在仍其他 實施態樣中，該融合多肽包含CDR H3(VH CDR3)及/或CDR L3(VL CDR3)。就本發明之目的而言，融合蛋白包含一或多種抗體及在天然分子中未與其連接之另一胺基酸序列，例如異源性序列或來自另一區之同源性序列。例示性異源序列包括但不限於「標籤」諸如FLAG標籤或6His標籤。標籤係該領域所廣為周知。
融合多肽可藉由該領域已知之方法產製，例如合成或重組。通常，本發明之融合蛋白係藉由使用此處所描述之重組方法使編碼彼等之多核苷酸表現加以製備，不過亦可藉由該領域所知之其他方法製備，包括例如化學合成。
本發明亦提供組成物，該等組成物包含與劑共軛(例如連接)以利與固相支持物(諸如生物素或抗生物素蛋白)偶合之抗體。為了簡單起見大致將以抗體為例，但應了解該等方法適用於此處所述之任何EGFRvIII抗體實施態樣。共軛一般係指如此處所述之連接該等成分。該連接(通常以近距離相連固定該等成分以至少供投予)可以數種方式達成。舉例來說，當劑與抗體各自具有能與彼此反應之取代基時，兩者間之直接反應係可能的。舉例來說，一者之親核基團(諸如胺基或氫硫基)可能能與另一者之含有羰基之基團(諸如酐或酸性鹵化物)或含有好的離去基團(例如鹵化物)之烷基反應。
本發明亦提供編碼本發明之抗體之經分離之多核苷酸，及包含該多核苷酸之載體及宿主細胞。
因此，本發明提供聚核苷酸(或組成物，其包括醫藥 組成物)，其包含編碼下列任何者的聚核苷酸：m62G7、h62G7、h62G7-H14/L1-DV、h62G7-EQ/L6、42G9、32A10、20B9、14C11、21E11、49B11、46E10、12H6、19A9、21E7、11B11、12B2、11F10、17G11、29D5、30D8、20E12、26B9、32G8、34E7、20G5、C6、B5、42G9-1、32A10-1、20B9-1、14C11-1、21E11-1、49B11-1、46E10-1、12H6-1、19A9-1、21E7-1、11B11-1、12B2-1、11F10-1、17G11-1、29D5-1、30D8-1、20E12-1、26B9-1、32G8-1、34E7-1、20G5-1、C6-1、及B5-1，或具有結合EGFRvIII能力的任何片段或彼之部分。
在另一態樣中，本發明提供編碼此處所述之任何抗體(包括抗體片段)及多肽之多核苷酸，諸如具有受損效應功能之抗體及多肽。多核苷酸可利用該領域已知之方法製備及表現。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之任何多核苷酸之組成物(諸如醫藥組成物)。在一些實施態樣中，該組成物包含表現載體，該表現載體包含編碼此處所述之任何抗體之多核苷酸。
表現載體及投予多核苷酸組成物另於此處描述。
在另一態樣中，本發明提供製備此處所述之任何多核苷酸之方法。
與任何該等序列互補之多核苷酸亦包含於本發明中。多核苷酸可能為單股(編碼或反義)或雙股，且可能為DNA(基因組、cDNA或合成性)或RNA分子。RNA分子包 括HnRNA分子及mRNA分子，該HnRNA分子包含內含子且以一對一之方式對應DNA分子，該mRNA分子不包含內含子。額外之編碼或非編碼序列可能(但不一定)存在於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可能(但不一定)與其他分子及/或支持物質連接。
多核苷酸可能包含天然序列(即編碼抗體或彼之部分之內源性序列)或可能包含該序列之變異體。多核苷酸變異體包含一或多個取代、添加、刪除及/或插入以使該經編碼之多肽的免疫反應性相對於天然免疫反應性分子而言不被減少。對該經編碼之多肽的免疫反應性之影響通常係如此處所述檢測。變異體較佳地展現與編碼天然抗體或彼之部分之多核苷酸序列具有至少約70%之一致性，更佳地至少約80%之一致性，甚至更佳地至少約90%之一致性及最佳地至少約95%之一致性。
若二個多核苷酸或多肽序列如下所述排比以得到最高對應性且該二個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則該二個序列被稱為「一致」。兩序列之間的比較通常藉由在比較窗中比較序列加以進行，以識別及比較具有序列相似性之局部區域。此處所使用之「比較窗」係指至少約20個、通常30個至約75個、或40個至約50個連續位置之區段，在該窗中一序列可與具有相同連續位置數量之參考序列在該二序列經最佳排比後比較。
供比較之序列的最佳排比可利用雷斯基(Lasergene)生物資訊套裝軟體中之邁佳來(Megalign)程式(DNASTAR, Inc.,Madison,WI)以內建參數進行。此程式具體化下列文獻中描述之數種排比法：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W..J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
較佳地，「序列一致性之百分比」係藉由在至少20個位置之比較窗中比較二個經最佳排比之序列加以決定，其中在比較窗中多核苷酸或多肽序列之部分相較於供二序列最佳排比之參考序列(其不包含添加或刪除)可能包含20%或低於20%、通常5%至15%、或10%至12%之添加或刪除(即缺口)。百分比之計算係藉由測定二個序列中出現相同之核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目，以得到匹 配位置之數目，將該匹配位置之數目除以參考序列之位置總數(即窗之大小)，並將該結果乘以100以得到序列一致性百分比。
變異體亦可能或選擇性地與天然基因或彼之部分或互補部分實質上同源。該等多核苷酸變異體能在中度嚴謹度條件下與編碼天然抗體之天然發生之DNA序列(或互補序列)雜交。
適當之「中度嚴謹度條件」包括在5倍SSC、0.5% SDS、1.0毫莫耳EDTA(pH 8.0)之溶液中預先清洗；於50℃至60℃之5倍SSC中隔夜雜交；接著於65℃中各以含有0.1% SDS之2倍、0.5倍及0.2倍SSC清洗20分鐘兩次。
此處所使用之「高度嚴謹度條件」或「高嚴謹條件」係該些：(1)採用低離子張力及高溫清洗，例如於50℃之0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二基硫酸鈉；(2)在42℃之雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/含有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉之pH 6.5之50mM磷酸鈉緩衝液之50%(體積/體積)甲醯胺；或(3)於42℃採用50%甲醯胺、5倍SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5倍丹哈德(Denhardt’s)溶液、經超音波化之鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，並於42℃以0.2倍SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)清洗及於55℃以50%甲醯胺清 洗，之後於55℃以含有EDTA之0.1倍SSC進行高嚴謹度清洗。該領域之技藝人士將知道如何視需要調整溫度、離子強度等條件以配合像是探針長度等類似之因子。
該領域之一般技藝人士將瞭解的是，由於基因密碼簡併之結果，有許多核苷酸序列編碼此處所描述之多肽。這些多核苷酸中有些與任何天然基因之核苷酸序列具有極低之同源性。然而，本發明特別考慮因為使用不同的密碼子而有所差異之多核苷酸。另外，包含此處所提供之多核苷酸序列之基因的等位基因係屬於本發明之範圍內。等位基因係因為一或多個突變，諸如核苷酸之刪除、添加及/或取代而被改變之內源性基因。該形成之mRNA及蛋白質可能但不一定具有經改變之結構或功能。等位基因可利用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)加以識別。
本發明之多核苷酸可利用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學多核苷酸合成之方法係該領域所廣為週知，不須在此詳細說明。該領域之技藝人士可利用此處所提供之序列及商用DNA合成儀產製所欲之DNA序列。
在利用重組方法製備多核苷酸時，包含所欲序列之多核苷酸可被插入適當之載體中，該載體接著可被導入適當之宿主細胞以供複製及擴增，在下面進一步討論。多核苷酸可藉由該領域所知之任何方法被插入宿主細胞中。細胞之轉形係藉由直接攝取、胞飲作用、轉染、F交配(F-mating)或電穿孔導入外源性多核苷酸。一旦導入後，該外源性多核苷酸可以非整合性載體(諸如質體)或整合至該 宿主細胞之基因組中而被維持於該細胞內。經此放大之多核苷酸可利用該領域所熟習之方法自該宿主細胞分離。見例如Sambrook et al.,1989。
另外，PCR能複製DNA序列。PCR技術係該領域所廣為周知，於美國專利第4,683,195、4,800,159、4,754,065及4,683,202號及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中描述。
RNA可藉由使用適當載體中經分離之DNA且將其插入適當之宿主細胞中獲得。當細胞複製且該DNA被轉錄成為RNA時，該RNA即可利用該領域之技藝人士所廣為週知之方法分離，例如於Sambrook et al.,1989(同上)所述。
適當之選殖載體可根據標準技術建構，或可選自該領域為數眾多之可用選殖載體。雖然該經選擇之選殖載體可能因所意圖使用之宿主細胞而異，適用之選殖載體通常具有自我複製之能力、可能具有特定限制內切酶之單一目標及/或可能帶有可用於選擇含有該載體之殖株的標誌基因。適當實例包括質體及細菌性病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體諸如pSA3及pAT28。這些及許多其他選殖載體可購自商業賣方諸如BioRad、Strategene及Invitrogen。
表現載體通常是可複製之多核苷酸建構物，其包含本發明之多核苷酸。這暗示表現載體必需能在宿主細胞中以附加體或染色體DNA之組成部分被複製。適當之表現載體包括但不限於質體、病毒載體(包括腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開號WO 87/04462中所揭示之表現載體。載體成份通常包括但不限於下列一或多項：信號序列、複製起點、一或多種標誌基因、適當之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子及終止子)。就表現(即轉譯)而言，通常也需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位置、轉譯起始位置及終止密碼子。
含有感興趣之多核苷酸之載體可藉由任何適當之方法導入宿主細胞，包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染、微彈撞擊(microprojectile bombardment)、脂質體轉染(lipofection)及感染(例如該載體為感染性劑諸如痘瘡病毒)。導入載體或多核苷酸之選擇通常將視該宿主細胞之特徵而定。
本發明亦提供包含此處所述之任何多核苷酸之宿主細胞。任何能過度表現異源性DNA之宿主細胞可被使用以分離編碼該感興趣之抗體、多肽或蛋白質之基因。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括但不限於COS、HeLa及CHO細胞。亦見PCT公開號WO 87/04462。適當之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草桿菌)及酵母菌(諸如啤酒釀母菌、分裂酵母(S.pombe)或乳酸克 魯維酵母菌(K.lactis))。較佳地，該宿主細胞以相較於該對應之感興趣之內源性抗體或蛋白質若存在於宿主細胞中高出約5倍、更佳為高出10倍、甚至更佳為高出20倍之量表現cDNA。篩選與EGFRvIII特異性結合之宿主細胞係利用免疫檢定或FACS進行。過度表現感興趣之抗體或蛋白之細胞可被識別。
EGFRvIII抗體共軛體
本發明亦提供一種如此處所述之EGFRvIII抗體之共軛體(或免疫共軛體)，其中該抗體係直接或間接經由連接子與劑(例如細胞毒性劑)共軛以用於靶向性免疫療法(例如抗體-藥物共軛體)。舉例來說，細胞毒性劑可如此處所述與該EGFRvIII抗體或連接或共軛以用於靶向性局部遞送該細胞毒性劑至腫瘤(例如EGFRvIII表現腫瘤)。
用於共軛細胞毒性劑或其他治療劑與抗體之方法已於許多文獻中說明。舉例來說，抗體之化學修飾可經由離胺酸側鏈胺或藉由還原鏈間雙硫鍵而被活化之半胱胺酸氫硫基進行，以使共軛反應得以發生。見例如Tanaka et al.,FEBS Letters 579：2092-2096,2005及Gentle et al.,Bioconjugate Chem.15：658-663,2004。經工程化於抗體之特定位置之反應性半胱胺酸殘基以利用經定義之化學計量供特定藥物共軛亦已被描述。見例如Junutula et al.,Nature Biotechnology,26：925-932,2008。在轉麩醯胺酶及胺存在時，使用含有麩胺醯胺之醯基供體標籤或藉由多肽 工程化使成反應性之內源性麩胺醯胺(即形成共價鍵以作為醯基供體之能力)之共軛(例如包含或連接至反應性胺之細胞毒性劑)亦描述於國際專利申請WO2012/059882及WO2015015448。
在一些實施態樣中，此處描述之EGFRvIII抗體或共軛物包含在該抗體之特定位置(例如該EGFRvIII抗體之羧基端、胺基端或其他位置)經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤。在一些實施態樣中，該標籤包含胺基酸麩胺醯胺(Q)或胺基酸序列LQG、LLQGG(SEQ ID NO：258)、LLQG(SEQ ID NO：259)、LSLSQG(SEQ ID NO：260)、GGGLLQGG(SEQ ID NO：261)、GLLQG(SEQ ID NO：262)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO：263)、GLLQGGG(SEQ ID NO：264)、GLLQGG(SEQ ID NO：265)、GLLQ(SEQ ID NO：266)、LLQLLQGA(SEQ ID NO：267)、LLQGA(SEQ ID NO：268)、LLQYQGA(SEQ ID NO：269)、LLQGSG(SEQ ID NO：270)、LLQYQG(SEQ ID NO：271)、LLQLLQG(SEQ ID NO：272)、SLLQG(SEQ ID NO：273)、LLQLQ(SEQ ID NO：274)、LLQLLQ(SEQ ID NO：275)、LLQGR(SEQ ID NO：276)、LLQGPP(SEQ ID NO：277)、LLQGPA(SEQ ID NO：278)、GGLLQGPP(SEQ ID NO：279)、GGLLQGA(SEQ ID NO：280)、LLQGPGK(SEQ ID NO：281)、LLQGPG(SEQ ID NO：282)、LLQGP(SEQ ID NO：283)、LLQP(SEQ ID NO：284)、LLQPGK(SEQ ID NO：285)、LLQAPGK(SEQ ID NO：286)、 LLQGAPG(SEQ ID NO：287)、LLQGAP(SEQ ID NO：288)、及LLQLQG(SEQ ID NO：289)。
所亦提供者係經單體之抗體，其包含在抗體的位置222、340、或370(EU編碼制)之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤及胺基酸修飾，其中該修飾係胺基酸刪除、插入、取代、突變、或彼等之任何組合。在一些實施態樣中，該胺基酸修飾係自離胺酸至精胺酸(例如K222R、K340R、或K370R)之取代。
可與本發明之EGFRvIII抗體共軛之劑包括但不限於細胞毒性劑、免疫調節劑、顯影劑、治療性蛋白質、生物聚合物或寡核苷酸。
細胞毒性劑的實例包括但不限於蒽環素(anthracycline)、耳抑素(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、康柏達司塔汀(combretastatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、吡咯并苯并二吖呯二聚物(pyrrolobenzodiazepine dimer)、吲哚啉并-苯并二吖呯二聚物(indolino-benzodiazepine dimer)、烯雙炔(enediyne)、格爾德黴素(geldanamycin)、美登素(maytansine)、嘌黴素(puromycin)、紫杉烷(taxane)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、喜樹鹼(camptothecin)、妥布賴森(tubulysin)、半星芒體(hemiasterlin)、司普力西歐史塔丁(spliceostatin)、普拉地內酯(pladienolide)、及其立體異構物、同電子排列體(isostere)、類似物、或衍生物。
蒽環素係源自細菌鏈黴菌，且已用於治療廣泛範圍之癌症，諸如白血病、淋巴瘤、乳癌、子宮癌、卵巢癌、及 肺癌。例示性蒽環素包括但不限於正定黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(即甲烯土黴素(adriamycin))、表阿黴素(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone)。
海兔毒素(dolastatin)及彼等之肽類似物及衍生物耳抑素係高度有效之抗有絲分裂劑，已被顯示具有抗癌及抗真菌活性。見例如U.S.Pat.No.5,663,149及Pettit et al.,Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965,1998。例示性海兔毒素及耳抑素包括但不限於海兔毒素10、耳抑素E、耳抑素EB(AEB)、耳抑素EFP(AEFP)、MMAD(一甲基耳抑素D或一甲基海兔毒素10)、MMAF(一甲基耳抑素F或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙胺酸)，MMAE(一甲基耳抑素E或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-dolaisoleuine-dolaproine-降麻黃鹼)、5-苯甲醯基戊酸-AE酯(AEVB)及其他新穎之耳抑素(諸如U.S.Publication No.2013/0129753中所述者)。在一些實施態樣中，該耳抑素係0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，其具有下列結構：
在一些實施態樣中，該耳抑素係3377(N,2-二甲基丙胺醯基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧丁基}-N-甲基-L-纈胺醯胺)，其具有下列結構：
在一些實施態樣中，該耳抑素係0131-OMe(N,2-二甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，其具有下列結構：
在其他實施態樣中，該耳抑素係0131(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1- 基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，其具有下列結構：
在其他實施態樣中，該耳抑素係0121(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)，其具有下列結構：
喜樹鹼(camptothecin)為細胞毒性喹啉生物鹼，其可抑制拓樸異構酶I。喜樹鹼(camptothecin)及其衍生物之實例包括但不限於拓樸替康(topotecan)及伊立替康(irinotecan)，及其代謝物諸如SN-38。
康柏達司塔汀類(combretastatins)為天然酚類，其於腫瘤中具有血管裂解性質。例示之康柏達司塔汀類(combretastatins)及其衍生物包括但不限於康柏達司塔汀A-4(combretastatin A-4)(CA-4)及奧瑞布林(ombrabulin)。
倍癌黴素(duocarmycin)及CC-1065係具有細胞毒性效力之DNA烷化劑。見Boger and Johnson,PNAS 92：3642- 3649(1995)。例示之倍癌黴素(duocarmycin)及CC-1065包括但不限於(+)-倍癌黴素A(duocarmycin A)及(+)-倍癌黴素SA(duocarmycin SA)、(+)-CC-1065、及如同於國際專利申請案PCT/IB2015/050280中揭示之化合物，包括但不限於具有下面結構之N~2~-乙醯基-L-離胺醯基-L-纈胺醯基-N~5~-胺甲醯基-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1-(氯甲基)-3-[(5-{[(1S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基]羰基}噻吩-2-基)羰基]-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基}氧基)羰基](甲基)胺基}乙基)(甲基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-鳥胺醯胺： 具有下面結構之N~2~-乙醯基-L-離胺醯基-L-纈胺醯基-N~5~-胺甲醯基-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(1S)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦醯氧基)-1,6-二氫吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2H)-基]羰基}雙環[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氫吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)胺基}乙基)(甲基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-鳥胺醯 胺： 具有下面結構之N~2~-乙醯基-L-離胺醯基-L-纈胺醯基-N~5~-胺甲醯基-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(氯甲基)-6-[(4-{[(1S)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦醯氧基)-1,6-二氫吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2H)-基]羰基}五環[4.2.0.0~2,5~.0~3,8~.0~4,7~]辛-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氫吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)胺基}乙基)(甲基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-鳥胺醯胺：
烯雙炔(enediyne)係一類抗腫瘤細菌產物，其特徵為具有九員及十員環或有經共軛之三鍵-雙鍵-三鍵之環狀系統存在。示範性烯雙炔(enediyne)包括但不限於卡利奇黴素(calicheamicin)、埃斯培拉黴素(esperamicin)、恩西拉黴素(uncialamicin)、達內黴素(dynemicin)及其衍生物。
格爾德黴素(geldanamycin)係與Hsp90(熱休克蛋白90)結合之苯醌安莎黴素(ansamycin)抗生素，其已被用來作為抗腫瘤藥。示範性格爾德黴素(geldanamycin)包括但不限於17-AAG(17-N-烯丙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素)及17-DMAG(17-二甲基胺基乙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素)。
半星芒體(hemiasterlin)及其類似物(例如HTI-286)結合至微管蛋白，裂解正常之微管動態學，且於化學計量下使微管解聚合化。
美登素類(maytansines)或其衍生物類美登素類( maytansinoids)可藉於有絲分裂期間經由抑制微管蛋白之聚合以抑制微管形成而抑制細胞增殖。參見Remillard et al.,science 189：1002-1005,1975。例示之美登素類(maytansines)及類美登素類(maytansinoids)包括但不限於美登素(mertansine)(DM1)及其衍生物以及安絲菌素(ansamitocin)。
吡咯并苯并二吖呯二聚物類(pyrrolobenzodiazepine dimers)(PBD)及吲哚啉并-苯并二吖呯二聚物類(indolino-benzodiazepine dimers)(IGN)為含有一或多種免疫功能基或其相等物之抗腫瘤劑，其結合至雙螺旋DNA。PBD及IGN分子係以天然產物安曲黴素(athramycin)為基底，且與DNA以序列選擇性方式交互作用，又較佳地為嘌呤-鳥嘌呤-嘌呤序列。例示之PBD及其類似物包括但不限於SJG-136。
司普力西歐史塔丁類(spliceostatins)及普拉地內酯類(pladienolides)為抗腫瘤劑，其抑制剪接及與剪接體SF3b交互作用。司普力西歐史塔丁類(spliceostatins)包括但不限於司普力西歐史塔丁A(spliceostatin A)、FR901464、及具有下面結構之乙酸(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-側氧基乙基)-4-羥基-1,6-二氧雜螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氫-2H-哌喃-3-基]胺基}-5-側氧基戊-3-烯-2-基酯： 。普拉地內酯類(pladienolides)之實例包括但不限於普拉地內酯B(pladienolide B)、普拉地內酯D(pladienolide D)、或E7107。
紫杉烷類(taxanes)為雙萜類，其作為抗微管蛋白劑或有絲分裂抑制劑。例示之紫杉烷類(taxanes)包括但不限於太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如TAXOL®)及歐洲紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®)。
妥布賴森類(tubulysins)為由黏球菌(myxobacteria)菌型中分離出來的天然產物，其已顯示可使微管解聚合化且誘使有絲分裂停頓。例示之妥布賴森類(tubulysins)包括但不限於妥布賴森A(tubulysin A)、妥布賴森B(tubulysin B)、及妥布賴森D(tubulysin D)。
長春花生物鹼類(Vinca alkyloids)亦為抗微管蛋白劑。例示之長春花生物鹼類(Vinca alkyloids)包括但不限於長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春花鹼醯胺(vindesine)、及長春瑞濱(vinorelbine)。
因此，在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係選自由下列所組成之群組：MMAD(單甲基耳抑素D(Monomethyl Auristatin D))、0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1- 基}-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、3377(N,2-二甲基丙胺醯基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-側氧丁基}-N-甲基-L-纈胺醯胺)、0131(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、0131-OMe(N,2-二甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、0121(2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)、及乙酸(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-側氧基乙基)-4-羥基-1,6-二氧雜螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氫-2H-哌喃-3-基]胺基}-5-側氧基戊-3-烯-2-基酯。
在一些實施態樣中，該劑為免疫調節劑。免疫調節劑之實例包括但不限於更昔洛韋(gancyclovier)、伊那西普(etanercept)、他克艾司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、沃克普林(voclosporin)、環孢靈素 (cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、馬替麥考分酯(mycophenolgate mofetil)、胺甲蝶呤(methotrextrate)、糖皮質激素(glucocorticoid)及其類似物、細胞激素、幹細胞生長因子、淋巴毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子、介白素(例如介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、及IL-21)、集落刺激因子(例如顆粒性白血球集落刺激因子(G-CSF)及顆粒性白血球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、-β及-γ)、定名為“S 1因子”之幹細胞生長因子、紅血球生成素及血小板生成素、或其組合。
在一些實施態樣中，該劑部分為顯影劑(例如螢光團或螯合劑)，諸如螢光素、若丹明(rhodamine)、鑭系元素螢光質、及其衍生物、或結合至螯合劑之放射性同位素。螢光團之實例包括但不限於異硫氰酸螢光素(FITC)(例如5-FITC)、亞醯胺螢光素(fluorescein amidite)(FAM)(例如5-FAM)、伊紅、羧基螢光素、赤蘚紅、Alexa Fluor®(例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700、或750)、羧基四甲基若丹明(carboxytetramethylrhodamine)(TAMRA)(例如5,-TAMRA)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)(TMR)、及磺醯若丹明(sulforhodamine)(SR)(例如SR101)。螯合劑之實例包括但不限於1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸 (DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷，1-戊二酸-4,7-乙酸(deferoxamine)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、及1,2-雙(o-胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)(BAPTA)。
在一些實施態樣中，治療性或診斷性放射性同位素或其他標記(例如PET或SPECT標記)可引入該共軛至本文所述EGFRvIII抗體之劑中。放射性同位素或其他標記之實例包括但不限於3H、11C、13N、14C、15N、15O、35S、18F、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Se、76Br、77Br、86Y、89Zr、90Y、94Tc、95Ru、97Ru、99Tc、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、111Ag、111In、113In、121Te、122Te、123I、124I、125I、125Te、126I、131I、131In、133I、142Pr、143Pr、153Pb、153Sm、161Tb、165Tm、166Dy、166H、167Tm、168Tm、169Yb、177Lu、186Re、188Re、189Re、197Pt、198Au、199Au、201Tl、203Hg、211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、224Ac、或225Ac。
一些實施態樣中，該劑為治療性蛋白包括但不限於毒素、荷爾蒙、酵素、及生長因子。
毒素蛋白(或多肽)之實例包括但不限於白喉(例如白喉A鏈)、假單胞菌外毒素及內毒素、蓖麻毒素(例如蓖麻毒素A鏈)、相思豆毒素(例如相思豆毒素A鏈)、莫迪素(modeccin)(例如莫迪素A鏈)、α-核糖毒素(alpha-sarcin)、三年桐蛋白(Aleurites fordii protein)、香石竹毒 蛋白(dianthin protein)、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌腸毒素-A、商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白樹毒素(gelonin)、白喉毒素、美洲商陸蛋白(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII、及PAP-S)、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、麻瘋素毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲黴素、酚徽素、伊諾黴素(neomycin)、單端孢黴烯、抑制劑胱胺酸結模體(ICK)肽(例如地中海果蠅毒素(ceratotoxin))、及芋螺毒素(例如KIIIA或SmIIIa)。
在一些實施態樣中，該劑為生物可相容性聚合物。如本文所述之EGFRvIII抗體可共軛至生物可相容性聚合物以增加血清半生期及生物活性、及/或延長體內半生期。生物可相容性聚合物之實例包括水溶性聚合物諸如聚乙二醇(PEG)或其衍生物及含兩性離子之生物可相容性聚合物(例如含磷酸膽鹼之聚合物)。
在一些實施態樣中，該劑為寡核苷酸，諸如反義寡核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供如本文所述之抗體或抗原結合片段的共軛物，其中該共軛物包含下式：抗體-(含有麩胺醯胺之醯基供體標籤)-(連接子)-(細胞毒性劑)。
含一或多個反應性胺之連接子的實例包括但不限於Ac-Lys-Gly(乙醯基-離胺酸-甘胺酸)、胺基己酸、Ac-Lys-β-Ala(乙醯基-離胺酸-β-丙胺酸)、胺基-PEG2(聚乙二醇)- C2、胺基-PEG3-C2、胺基-PEG6-C2(或胺基PEG6-丙醯基)、Ac-Lys-Val-Cit-PABC(乙醯基-離胺酸-纈胺酸-瓜胺酸-p-胺基苄氧羰基)、胺基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC、胺基己醯基-Val-Cit-PABC、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]丙醯基}哌啶-3,5-二基]雙-Val-Cit-PABC、[(3S,5S)-1-{3-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]丙醯基}哌啶-3,5-二基]雙-Val-Cit-PABC、腐胺、或Ac-Lys-腐胺。
使用EGFRvIII抗體及其抗體共軛體之方法
本發明之抗體或抗體共軛體可用於許多應用，其包括但不限於治療性處理方法及診斷性處理方法。
藉由上文所述之方法而獲得的抗體(例如單特異性及雙特異性)及抗體共軛體可用以作為藥物。在一些實施態樣中，此藥物可用於治療癌，包括實體腫瘤及液體腫瘤(liquid tumor)。在一些實施態樣中，該癌症係EGFRvIII相關癌症，其包括但不限於：神經膠質母細胞瘤(例如多型性神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiform))、退行性星細胞瘤(anaplastic astrocytoma)、巨細胞神經膠母細胞瘤(giant cell glioblastoma)、神經膠肉瘤(gliosarcoma)、退行性寡樹突神經膠細胞瘤(anaplastic oligodendroglioma)、退行性室管膜瘤(anaplastic ependymoma)、退行性寡星細胞瘤(anaplastic oligoastrocytoma)、脈絡叢癌(choroid plexus carcinoma)、退行性神經節性神經膠質瘤(anaplastic ganglioglioma)、松果體母細胞瘤(pineoblastoma)、松果體 細胞瘤(pineocytoma)、腦膜瘤(meningioma)、髓質上皮瘤(medulloepithelioma)、室管膜母細胞瘤(ependymoblastoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、小腦幕上原始神經外胚層腫瘤(supraentorial primitive neuroectodermal tumor)、非典型畸胎/類橫紋肌細胞瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumor)、混合型神經膠質瘤(mixed glioma)、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、髓母細胞瘤(medullobastoma)、大腸直腸癌、肛門癌、子宮頸癌、腎癌、皮膚癌、胰癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤(mesothelioma)、子宮癌、淋巴瘤、或白血病。
在一些實施態樣中，所提供者係抑制具有表現EGFRvIII的惡性細胞之個體中腫瘤生長或進展之方法，其包含投予需要彼之個體有效量之組成物，該組成物包含如本文中所述之EGFRvIII抗體或EGFRvIII抗體共軛體。在其他實施態樣中，所提供者係抑制個體中表現EGFRvIII的細胞轉移(metastasis)之方法，其包含投予需要彼之個體有效量之組成物，該組成物包含如本文中所述之EGFRvIII抗體或EGFRvIII抗體共軛體。在其他實施態樣中，所提供者係誘發個體中惡性細胞腫瘤消退之方法，其包含投予需要彼之個體有效量之組成物，該組成物包含如本文中所述之EGFRvIII抗體或EGFRvIII抗體共軛體。
在一些實施態樣中，根據本發明之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛物可用於製造供治療需要彼之 病患之癌症的藥物。
在一些實施態樣中，治療可併以一或多種針對癌症之療法，該療法係選自下列群組：抗體療法、化療、細胞介素療法、靶向療法、疫苗療法、樹突細胞療法、基因療法、荷爾蒙療法、手術切除、雷射光療法及放射療法。例如，本發明之之抗體(單特異性或雙特異性)或抗體共軛物可經投予至病患連同(例如之前、同時、或下列者)1)標準照護，包括輻射、手術切除、化療(例如替莫唑胺(temozolomide)、丙卡巴肼(procarbazine)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、環己亞硝脲(lomustine)、長春新鹼(vincristine)等)、抗體療法諸如貝伐單抗(bevacizumab)、抗血管新生療法、及/或腫瘤治療領域；2)疫苗，其包括EGFRvIII疫苗；3)靶向療法，諸如激酶抑制劑(例如依維莫司(everolimus))；及4)免疫療法，其包括但不限於抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗41BB、抗TIM3、抗LAG3、抗TIGIT、抗OX40、抗HVEM、抗BTLA、抗CD40、抗CD47、抗CSF1R、抗CSF1、抗MARCO、抗IL8、抗CXCR4、及抗CTLA4抗體。
根據本發明之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體的投予可以任何便利方式進行，其包括藉由氣溶膠吸入、注射、攝取、轉輸、植入或移植。本文中所述之組成物可皮下、皮內、腫瘤內、顱內、節間內(intranodally)、髓內(intramedullary)、肌內、靜脈內或淋巴內(intralymphatic)、或腹膜內注射而投予。在一個實施 態樣中，本發明之異多聚體抗體組成物較佳的是藉由靜脈內注射來投予。
在一些實施態樣中，抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛物之投予可包含投予例如每kg體重約0.01至約20mg(包括在此範圍內所有mg/kg的整數值)。在一些實施態樣中，抗體或抗體共軛物之投予可包含投予每kg體重約0.1至10mg(包括在此範圍內所有mg/kg的整數值)。該異多聚體抗體可以一或多劑投予。在一些實施態樣中，該抗體或抗體共軛物有效量可以單劑投予。在一些實施態樣中，該抗體有效量可以在一段時間超過一劑投予。投予時機係在管理醫師之判斷內且取決於病患臨床病況。雖然個體需求各異，但針對特定疾病或病況的給定抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體的有效量最佳範圍之判定係本技術領域內。有效量意指提供治療或預防益處的量。所投予之劑量將取決於接受者之年齡、健康及重量、共同治療(若有的話)之種類、治療頻率及所欲之效果的本質。在一些實施態樣中，有效量的異多聚體抗體或包含彼等抗體之組成物係非經腸胃投予。在一些實施態樣中，投予可係靜脈內投予。在一些實施態樣中，投予可藉由注射至腫瘤內而直接完成。
在一些實施態樣中，在本文中所提供之抗EGFRvIII抗體可用於診斷目的，諸如在檢定中，以鑑別樣本中或患者中的EGFRvIII蛋白質(例如在免疫組織化學檢定)。
組成物
在一個態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含如上述之本發明之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體或其部分於醫藥上可接受之載體中。在某些實施態樣中，本發明之多肽可以中性形式(包括兩性離子形式)存在或為正電荷或負電荷物質。在一些實施態樣中，該多肽可與相對離子錯合以形成“醫藥上可接受之鹽類”，其係指包含一或多個多肽及一或多個相對離子之錯合物，其中該等相對離子係源自醫藥上可接受之無機及有機酸類及鹼類。
該抗體(例如單特異性或雙特異性)或該抗體共軛體或其部分可單獨投予或併以一或多個其他本發明之多肽組合或併以一或多種其他藥物(或為其任何組合)。本發明之醫藥組成物、方法及用途由此亦涵蓋併以(共同投予)其他活性劑之實施態樣，如下所述。
如本文中所使用，用語“共同投予(co-administration或co-administering)”及“併以(與...組合)(in combination with)”指涉本發明之抗體及一或多種其他治療劑，係意欲意指、且係指並包括下列者：(i)當此等組分係經調配一起成為單一劑型，該單一劑型實質上相同時間釋放該組分予該病患時，係同步投予在本文中所揭示之異二聚體及治療劑的此組合予需要治療之病患；(ii)當此等組分係互相分開調配成為分離之劑型，其於實質上相同時間被病患用藥、隨之該等組分係在實質上相同時間經釋放予該病患時，係實質上同步投予在本文中所揭示之異二聚體及治療 劑的此組合予需要治療之病患；(iii)當此等組分係互相分開調配成為分離之劑型，其於連續時間被病患以各投予之間明顯時間間隔用藥、隨之該等組分係在實質上不同時間經釋放予該病患時，係依序投予在本文中所揭示之異二聚體及治療劑的此組合予需要治療之病患；(iv)當此等組分係經調配一起成為單一劑型，該單一劑型以經控制方式釋放該組分、隨之它們在相同和/或不同次係同時、連續、和/或重疊釋放予該病患時(若各部分可藉由相同或不同途徑來投予)，係依序投予在本文中所揭示之異二聚體及治療劑的此組合予需要治療之病患。
通常，在本文中所揭示之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體或其部分係適合以與一或多種醫藥上可接受之賦形劑聯合之調合物來投予。用語‘賦形劑(excipient)’在本文中所使用係描述本發明之化合物以外任何成分。賦形劑的選擇將很大程度地取決於諸如特定投予模式、賦形劑對溶解度及安定性之效果、及劑型本質之因素。如本文中所使用，“醫藥上可接受之賦形劑”包括任何及所有生理可相容之溶劑、分散液介質、塗覆、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收遲滯劑(delaying agent)、及類似者。醫藥上可接受之賦形劑的一些實例係水、食鹽水、磷酸鹽緩衝液、右旋糖、甘油、乙醇及類似者，和彼等之組合。在許多情況中，較佳的是包括等張劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨糖醇、或氯化鈉在該組成物中。醫藥上可接受之物質的另外實例係潤濕劑或小量輔助物質諸如 潤濕或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增強抗體的儲放壽命或有效性。
本發明之醫藥組成物及其製備方法將為熟習本技術領域者所清楚明瞭者。此等組成物及其製備方法可見於例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Edition(Mack Publishing Company,1995)。醫藥組成物較佳的是於GMP條件下製造。
本發明之醫藥組成物可以大量、以單一單位劑量、或複數個單一單位劑量來製備、包裝、或販賣。如本文中所使用，“單位劑量”係分離之醫藥組成物量，其包含預定量之活性成分。活性成分量通常等同會投予個體或此劑量便利分額(諸如像是此劑量的二分之一或三分之一)的有效成分之劑量。本技術領域中所接受之用於投予胜肽、蛋白質或抗體之任何方法可適用於在本文中所揭示之異二聚體蛋白質及其部分。
本發明之醫藥組成物典型上適用於非經腸胃投予。如本文中所使用，醫藥組成物的“非經腸胃投予(parenteral administration)”包括以個體之組織之物理破裂為特徵的任何投予途徑及透過組織內裂口投予醫藥組成物，由此通常導致直接投予至血流中、至肌肉中、或至內部器官中。非經腸胃投予由此包括但不限於藉由注射劑組成物、藉由透過手術切口施加組成物、藉由透過穿入組織非手術傷口施加組成物、及類似者投予醫藥組成物。特定言之，非經腸胃投予所涵蓋者包括但不限於皮下、腹膜內、肌內、胸骨 內、靜脈內、動脈內、脊髓內、室內、尿道內、顱內、滑液內(intrasynovial)注射或輸注；及腎透析輸注技術。較佳實施態樣包括靜脈內及皮下途徑。
適用於非經腸胃投予之醫藥組成物調合物典型上通常包含活性成分併以醫藥上可接受之載體，諸如無菌水或無菌等張食鹽水。此等調合物可以適用於推注(bolus)投予或連續投予之形式來製備、包裝、或販賣。可注射調合物可以單位劑型(諸如安瓿)或含有防腐劑之多劑容器來製備、包裝、或販賣。用於非經腸胃投予之調合物包括但不限於懸浮液、溶液、乳膠於油狀或水性媒液、糊劑、及類似者中。此等調配物可另包含一或多種額外成分，其包括但不限於懸浮劑、安定劑、或分散劑。在用於非經腸胃投予之調合物的一個實施態樣中，該活性成分係以乾燥(即粉末或顆粒)形成來提供以供非經腸胃投予經重組之組成物之前用適合媒液(例如無菌無熱原水)來重組(reconstitution)。非經腸胃調合物亦包括水溶液，其可含有賦形劑諸如鹽類、碳水化合物及緩衝劑(較佳的是pH為3至9)，但為一些應用，它們可更適於經調配為無菌非水溶液或為經乾燥之形式以與適合媒液(諸如無菌無熱原水)合用。例示性非經腸胃投予形式包括在無菌水溶液中之溶液或懸浮液，例如水性丙二醇或右旋糖溶液。此等劑型可適於緩衝，若需要時。其他可用之可非經腸胃投予之調合物包括包含微晶形式或微脂體製劑的活性成分者。用於非經腸胃投予之調合物可經調配以立即和/或修飾釋放 (modified release)。修飾釋放調合物包括控釋、遲釋、持續釋放、脈衝釋放、靶向釋放、及計畫性釋放調合物。例如，在一個態樣中，無菌可注射溶液可藉由併入所需量的異二聚體蛋白質(例如雙特異性抗體)於適當溶劑中、依需要加上前述所列成分的一者或組合、接以過濾滅菌來製備。通常，分散液係藉由併入活性化合物至含有基本分散介質及來自上文所列的所需其他成分之無菌媒液來製備。在用於無菌可注射溶液製備的無菌粉末情況中，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加上任何額外所欲之成分(來自其先前無菌過濾溶液)之粉末。溶液之適當流動性可藉由例如使用塗覆諸如卵磷脂、藉由維持需要粒徑(在分散之情況中)及藉由使用界面活性劑來維持。可注射組成物之延長吸收可藉由延遲吸收的用劑(例如單硬脂酸鹽類及明膠)包括至組成物中來產生。
本發明之例示性、非限制性醫藥組成物係作為無菌水溶液之調配物，該無菌水溶液具有pH範圍在約5.0至約6.5且包含約1mg/mL至約200mg/mL的在本文中所揭示之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體，約1毫莫耳(millimolar)至約100毫莫耳的組胺酸緩衝液、約0.01mg/mL至約10mg/mL的聚山梨糖醇酯80、約100毫莫耳至約400毫莫耳的繭糖、及約0.01毫莫耳至約1.0毫莫耳的二鈉EDTA二水合物。
給藥方案可經調整以提供最佳所欲之反應。例如，可投予單一推注、隨時間投予數次分開之劑量可或該劑量可 依治療情況急迫性所指示來比例減少或增加。特別有利的是調和非經腸胃組成物成劑量單位型以供簡便投予及劑量均一。劑量單位型，如本文中所使用，係指物理性分離之單元，其適用作為待治療病患/個體的單位劑量；各單位含有預定數量之活性化合物，其經計算以聯合需要的醫藥載體產生所欲之治療效果。用於本發明之劑量單位型之規格通常藉由及直接取決於下列來規定：(a)化學治療劑獨特的特性及所欲達成的特定治療或預防效果，及(b)針對個體治療敏感性混煉此活性化合物的本技術領域中固有限制。
因此，熟悉本技術者將理解，基於在本文中所提供之揭露，該劑量及給劑方案係根據治療技術領域中所熟知之方法來調整。即，最大可耐受劑量可即建立且有效量提供可偵測之對病患治療益處亦可判定，投予各劑的時序需要亦同，以提供可偵測之治療益處予病患。因此，雖然某些劑量及投予給藥方案在本文中係例示性，但這些實施例並非限制在實施本發明中可提供予病患的劑量及投予給藥方案。
應注意的是，劑量值可隨欲減輕之病況的型式及嚴重度而異，且可包括單劑或多劑。應進一步了解的是，針對任何特定個體，特定給藥方案應根據個體需求及投予或指導組成物投予的人員之專業判斷隨時間調整，且在本文中所述之劑量範圍僅係例示性且不欲限制所請之組成物的範圍或實施。進一步，以此發明之組成物的給藥方案可基於 各種因素，包括患者的疾病類型、年齡、重量、性別、病況、病況的嚴重度、投與途徑、以及所利用之特定抗體。因此，該給藥方案可變異大，但可使用標準方法例行判定。例如，劑量可基於藥物動力學或藥力學參數來調整，可包括臨床效果諸如毒性效果及/或實驗室數值。因此，本發明涵蓋以熟悉本技術者判定之病患內劑量遞升(intra-patient dose-escalation)。判定適當劑量及給藥方案係相關技術領域中所熟知且一旦提供在本文中所揭示之教示可為熟悉本技術領域者了解應涵蓋者。
針對投予人個體，在本文中所揭示之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體的總每月劑量典型上範圍在每位患者約0.5至約1200mg，當然取決於投予模式、作用機制、及標靶生物學。舉例而言，靜脈內每月劑量可需要約1至約1000mg/病患。總每月劑量可以單一或分開劑量投予，且可在醫師的考慮下，落在本文中所給定之典型範圍外。
用於治療或預防有效量的在本文中所揭示之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體之例示性、非限制性範圍係約1至約1000mg/病患/月。在某些實施態樣中，該異二聚體蛋白質可以約1至約200、或約1至約150mg/患者/月來投予。
套組
本發明亦提供用於本方法之套組。本發明之套組包括 一或多個含有如本文所述之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體之容器及根據本文中所述之本發明之方法中之任一者所使用之說明。通常，該等說明包含投予該異二聚體蛋白質之說明以用於上述之治療性處理。
有關使用如本文所述之抗體(例如單特異性或雙特異性)或抗體共軛體之說明通常包括用於該意圖處理之劑量、給劑排程、及投予途徑之資訊。該等容器可為單位劑量、大量包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組所提供之說明通常為在標籤或包裝仿單上之書面說明(例如包含在套組中之紙)，但機器讀取之說明(例如磁性或光學儲存磁碟上攜帶之說明)亦可被接受。
本發明之套組係經適當包裝。適當之包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、可彎折之包裝(例如密封之美拉(Mylar)或塑膠袋)及該類似物。亦考慮的是與特殊裝置組合使用之包裝，諸如吸入器、經鼻投予裝置(例如霧化器)或輸注裝置諸如小型泵。套組可能具有無菌接口(例如該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜注溶液袋或小瓶)。該容器也可能具有無菌接口(例如該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜注溶液袋或小瓶)。該組成物中之至少一種活性劑係雙特異性抗體。該容器可能另包含第二醫藥活性劑。
套組可能可任意選擇地提供額外成份諸如緩衝劑及解說資訊。通常，該套組包含容器及在該容器上或與該容器相關之標籤或包裝仿單。
為所有目的以引用方式併入者係美國臨時申請案第62/281,543號(2016年1月21日申請)及第62/431,766號(2016年12月8日申請)內容。
生物寄存
本發明之代表材料係經寄存在American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA。所寄存包括具有編碼輕鏈變異區之聚核苷酸之載體，以及具有編碼重鏈變異區之聚核苷酸之載體。該等寄存係根據布達佩斯條約中關於用於專利程序目的之微生物寄存的國際認可條款和根據布達佩斯條約之管理條款進行。這確保該寄存之存活培養物的維持從寄存之日起30年。該寄存之培養物將根據布達佩斯條約的條款由ATCC予以提供，並受制於輝瑞公司和ATCC之間的協議，此確保該寄存之培養物的後代在相關之美國專利發佈時或任何美國或外國專利申請案對公眾公開(以先行者為準)時能被永久和不受限制地取得，並保證美國專利商標局專員所決定之可取用該寄存之培養物的後代之個人將有權按35 U.S.C.第122節及根據之比此35 U.S.C.第122節之專員規則(包括37 C.F.R.第1.14節，特別參考886 OG 638)來取得。
本申請案之受讓人已同意若寄存物質之培養在合適之條件下培養而死亡或損失或被破壞，該物質將在通知時以另一相同物質及時更換。寄存物質之可用性並不能被解釋 為被許可在違反任何政府當局根據其專利法所授予的權利下實施本發明。
下列實施例僅用於說明目的且不欲以任何方式限制本發明的範圍。事實上，除了在本文中所示及描述者，熟習本技術領域者依下前述說明將更清楚本發明之各種改良，本發明之各種改良係落在所附申請專利範圍之範圍內。
實施例
實施例1：針對重組抗EGFRvIII鼠-人嵌合抗體及人化抗體之親和力判定
此實施例判定嵌合及人化抗EGFRvIII抗體在25℃及37℃下的親和力。
自融合瘤產生之抗EGFRvIII小鼠(m)抗體m62G7係經定序及經次選殖至供表現鼠-人嵌合抗體之用的適合載體中。小鼠抗體m62G7之CDR係經移植(grafting)至人架構(framework)上，且經表現為人IgG1重組抗體h62G7。h62G7的親和力變異體係藉由引入突變於重鏈及輕鏈的CDR中而製成。重組抗EGFRvIII嵌合抗體m62G7及人化h62G7抗體之親和力係在配備有研究級經抗人Fc偶合之CM4感測晶片的表面電漿子共振BiacoreTM T200生物感測器(GE Healthcare Inc.,Piscataway,NJ)上來測量。接著將抗EGFRvIII抗體藉由抗人Fc來捕獲。接著，將單體經8個組胺酸標籤之人EGFRvIII胞外域注入作為分析物(10倍連續稀釋，最高濃度在1000nM)。抗EGFRvIII抗體對人 EGFRvIII的親和力係在25℃及37℃兩者下測量(表6)。在相同檢定條件下，這些抗體均未顯示可偵測之結合至1000nM的經8個組胺酸標籤之重組野生型蛋白質EGFRwt。
在表6中，h62G7變異體係參照重鏈變異接著輕鏈變異來描述。舉例而言，抗體株“h62G7-EQ/L6”係指該h62G7株含有該“EQ”變異在重鏈(在本文中亦稱為“h62G7-EQ”)中及該“L6”變異在輕鏈(在本文中亦稱為“h62G7-L6”)中。這些重鏈及輕鏈胺基酸序列係提供在表2中。又，在本申請案中，h62G7變異體可用重鏈或輕鏈變異體先寫在前面來指涉-所以，例如“h62G7-EQ/L6”及“h62G7-L6/EQ”兩者均係指含有h62G7-EQ重鏈及h62G7-L6輕鏈之抗體。
實施例2：針對人抗EGFRvIII抗體之親和力判定
此實施例判定各種人抗EGFRvIII抗體在37℃下的親和力。
為產生人的抗EGFRvIII抗體，將基因轉殖AlivaMab 小鼠(Ablexis LLC,San Francisco,CA)用表現EGFRvIII、F98-npEGFRvIII(American Type Culture Collection,Manassas,VA)及針對EGFRvIII中的連結區域(junction region)之胜肽(SEQ ID NO：227：CGSGSGLEEKKGNYVVTDH)的大鼠神經膠質母細胞瘤細胞株交替排程來免疫化。融合瘤係使用標準技術而產生。為判定這些融合瘤對EGFRvIII之結合親和力及特異性，將培養物上清液中之抗體使用配備有經抗小鼠Fc偶合的CM4感測晶片之BiacoreTM T200生物感測器(BiacoreTM AB,Uppsala,Sweden-now GE Healthcare)、藉由抗小鼠Fc來捕獲。接著，將單體經8個組胺酸標籤之人EGFRvIII胞外域注入作為分析物(以最高濃度1000nM開始10倍連續稀釋)。抗EGFRvIII抗體對人EGFRvIII的親和力係在37℃下測量(表7)。在相同檢定條件下，這些融合瘤抗體均未顯示可偵測之結合至1000nM的經8個組胺酸標籤之重組野生型蛋白質EGFRwt。
實施例3：藉由流動式細胞測量術之抗EGFRvIII抗體對表現EGFRvIII細胞株之結合特異性
此實施例證實抗EGFRvIII抗體對表現EGFRvIII細胞株之細胞結合特異性
為評估自AlivaMab小鼠所產生之EGFRvIII抗體之細胞結合特異性，使用三種等基因系(isogenic)大鼠神經膠質母細胞瘤細胞株及人癌細胞株：F98(不表現任何形式之人EGFR)、F98-EGFRwt(表現野生型EGFR)、F98-npEGFRvIII(表現EGFRvIII)及A431(表皮樣癌細胞株，具有野生型EGFR過量表現)，均獲自American Type Culture Collection(Manassas,VA)。對於細胞染色，將500,000個細胞以50μl融合瘤上清液在4℃下培育45min、用結合緩衝液(PBS(磷酸鹽緩衝液)+0.5% BSA(牛血清白蛋白))洗滌，接以用來自Jackson ImmunoResearch Laboratories(West Grove,PA)的經FITC共軛之山羊抗小鼠Fc特異性二級抗體培育。表8A及8B顯示EGFRvIII抗體(抗體株20G5除外)在表現EGFRvIII細胞株上的平均螢光強度(MFI)係在未表現之細胞株上的至少10倍大。圖1A、圖1B、及圖1C顯示三種EGFRvIII特異性抗體株(其業經選殖且經表現為重組人IgG1抗體)42G9(圖1A)、32A10(圖1B)及32G8(圖1C)對三種F98細胞株的FACS結合直方圖之實施例。
實施例4：針對來自噬菌體庫的全人抗EGFRvIII抗體之親和力判定
此實施例判定各種人抗EGFRvIII抗體在25℃下的親和力。
獲自噬菌體庫篩選之人抗EGFRvIII抗體係經定序及經次選殖至供表現重組人IgG1抗體之用的適合載體中。抗體之親和力係在配備有經抗人Fc偶合之CM4感測晶片的表面電漿子共振BiacoreTM T200生物感測器(GE Healthcare Inc.,Piscataway,NJ)上在25℃下(表9)來測量。將抗EGFRvIII抗體藉由抗人Fc來捕獲。接著，將單體經8個組胺酸標籤之人EGFRvIII胞外域注入作為分析物(在1000nM開始10倍連續稀釋)。在二種抗體中，僅C6顯示在25℃下極弱但可偵測之結合至1000nM的經8個組胺酸標籤之重組野生型蛋白質EGFRwt。
實施例5：GBM細胞株表現EGFRvIII之產生及特性分析
此實施例證實野生型EGFR及EGFRvIII表現於GBM細胞株中。
使用五種經GFP(綠螢光蛋白)及螢光素酶轉導(transduce)之人神經膠質母細胞瘤細胞株DKMG、LN18、LN18-EGFRvIII、LN229及LN229-EGFRvIII以供功能性特徵分析之用。DKMG，其表現內源野生型EGFR及EGFRvIII兩者，係獲自DSMZ(Braunschweig,Germany)。LN18及LN229，其僅表現野生型EGFR，係獲自American Type Culture Collection(Manassas,VA)。為產生經GFP-螢光素酶標示之細胞株，將DKMG、LN18及LN229係用編碼GFP(綠螢光蛋白)及螢光素酶兩者於雙順反子(bicistronic)系統中之慢病毒(lentivirus)顆粒(Amsbio,Cambridge,MA)來轉導。接著，藉由用編碼全長EGFRvIII基因(SEQ ID NO：201)之慢病毒(lentivirus)載體來性狀引入(transduction)親代細胞株而產生LN18-EGFRvIII及LN229-EGFRvIII。接著，使用流式細胞儀分析在各個細胞株中的野生型EGFR及EGFRvIII表現。對於細胞染色，將300,000個細胞以在100μl結合緩衝液中的3μg EGFR野生型特異性或EGFRvIII特異性抗體在 4℃下培育45min、用結合緩衝液洗滌，接以用來自Jackson ImmunoResearch Laboratories(West Grove,PA)的經Alexa Fluor 647共軛之山羊抗人Fc特異性二級抗體培育。圖2A至C顯示野生型EGFR及EGFRvIII分別在LN229-EGFRvIII、LN18-EGFRvIII及DKMG中表現分布數據變化(expression profile)。
實施例6：EGFRvIII-CD3雙特異性抗體的體外細胞毒性檢定
此實施例證實EGFRvIII-CD3雙特異性抗體對表現EGFRvIII的GBM細胞株之細胞毒性。
為產生EGFRvIII-CD3雙特異性抗體，將抗EGFRvIII及抗CD3抗體之重鏈變異域經次選殖至適當的基於人IgG2之雙特異性載體並在HEK293細胞中與它們的對應輕鏈表現。純化EGFRvIII-CD3雙特異性抗體係根據經公開發表之方法來完成(J Mol Biol,2012,3,pp204-219；美國專利公開案2013/0115208)。在這些檢定中，EGFRvIII-CD3雙特異性抗體含有抗EGFRvIII抗體株h62G7-EQ/L6、30D8、或42G9之抗EGFRvIII序列。
在此實施例中，標靶細胞係：經EGFRvIII轉導之LN18-EGFRvIII細胞(圖3A)及親代LN18(圖3B)細胞；經EGFRvIII轉導之LN229-EGFRvIII(圖4A)及親代LN229(圖4B)細胞；以及DKMG細胞(其表現內源性EGFRvIII及EGFR野生型蛋白質)(圖5)。
對於細胞毒性檢定，將經螢光素酶轉導之標靶細胞在10,000個細胞/孔下、在PBMC培養基(RPMI，10%FBS，2mM的L-麩醯胺酸，1% Pen/Strep，20uM β-巰乙醇，10mM的HEPES，1%的非必需胺基酸，1mM丙酮酸鈉)中平板培養於白色96孔盤，並在37℃下培育。二十四小時後，經活化之T細胞在所欲之T：E(標靶：效應細胞)比例下(10,000個T細胞用於1：1，針對LN18及LN229細胞；50,000個T細胞用於1：5，針對DKMG細胞)係加至標靶細胞連同EGFRvIII-CD3雙特異性抗體、陰性對照組人IgG、陰性對照組於雙特異性Fc骨架(backbone)中的CD3單價抗體、或陰性對照組於野生型人IgG中之雙價抗EGFRvIII mAb 42G9。將細胞在37℃下培育另外24h。為偵測在檢定結束下存活標靶細胞的量，將培養基丟棄並將100μl的150μg/ml螢光素加至各孔。發光訊號係在SpectraMax M5孔盤讀值機上獲得(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。活標靶細胞百分比係藉由將各樣本發光讀值對僅含有標靶細胞的對照組盤孔發光讀值來正歸化而判定。
結果總結於圖3A、3B、4A、4B、及5中。在圖中，EGFRvIII-CD3雙特異性抗體數據係由空心符號來示之，且陰性對照組抗體數據係藉由實心符號來示之。
表現EGFRvIII之標靶細胞對用EGFRvIII-CD3雙特異性抗體h62G7-EQ/L6/CD3 biFc、30D8/CD3 biFc、及42G9/CD3 biFc之處理顯示劑量依賴性反應。相反地，僅 表現EGFR野生型蛋白質的標靶細胞未經殺除，由此指示出EGFRvIII-CD3雙特異性抗體對表現EGFRvIII的細胞之特異性。此外，表現EGFRvIII之標靶細胞並未顯示對以陰性對照抗體(人IgG、CD3單價biFc、或42G1 hIgG1(抗EGFRvIII抗體))處理之反應。
舉例而言，經用0.01nM的h62G7-EQ/L6/CD3 biFc處理之LN18-EGFRvIII標靶細胞在檢定結束時係僅約20%存活。相反地，經用0.1nM的對照IgG、CD3單價biFc或42G9 hIgG1處理之LN18-EGFRvIII標靶細胞在檢定結束時係約100%存活(圖3A)。此外，經用0.01nM的h62G7-EQ/L6/CD3 biFc處理之親代細胞株LN18標靶細胞在檢定結束時係約100%存活(圖3B)。
在另一實施例中，經用0.01nM的42G9/CD3 biFc處理之LN229-EGFRvIII標靶細胞在檢定結束時係僅約35%存活。相反地，經用0.1nM的對照IgG、CD3單價biFc、或42G9 hIgG1處理之LN229-EGFRvIII標靶細胞在檢定結束時係約90至100%存活(圖4A)。此外，經用0.01nM的42G9/CD3 biFc處理之親代細胞株LN229標靶細胞在檢定結束時係約100%存活(圖4B)。
在另一實施例中，經用1nM的h62G7-EQ/L6/CD3 biFc處理之DKMG標靶細胞在檢定結束時係僅約35%存活(圖5)。相反地，經用1nM的對照IgG、CD3單價biFc或42G9 hIgG1處理之DKMG標靶細胞在檢定結束時係約100%存活(圖5)。
這些數據證實EGFRvIII-CD3雙特異性抗體有效調介EGFRvIII表現細胞之藉由T細胞的殺除。
實施例7：抗EGFRvIII-CD3雙特異性抗體在GBM模式LN229-EGFRvIII中的體內研究
此實施例判定抗EGFRvIII雙特異性抗體在皮下LN229-EGFRvIII GBM細胞株模式中的體內抗腫瘤活性。
將三百萬個LN229-EGFRvIII細胞皮下植入至5至6週大的NSG小鼠(Jackson Laboratory,Sacramento,CA)中。腫瘤體積係藉由卡尺裝置每週測量一次且以下式計算：腫瘤體積=(長度×寬度 2 )/2。在腫瘤植入後第18天，將動物依腫瘤尺寸隨機分配為每組五隻動物。腹膜內投予單一劑量2千萬新鮮泛T細胞，接以尾靜脈一次推注(bolus tail vein injection)0.5mg/kg的EGFRvIII-CD3雙特異性抗體(該抗體含有抗EGFRvIII抗體株h62G7-EQ/L6、30D8、或42G9的抗EGFRvIII序列)、或在雙特異性Fc骨架中的CD3單價對照組。
結果總結於圖6中。在圖中，EGFRvIII-CD3雙特異性抗體數據係由空心符號來示之，且陰性對照組抗體數據係藉由實心符號來示之。
EGFRvIII-CD3雙特異性抗體h62G7-EQ/L6/CD3 biFc、30D8/CD3 biFc、及42G9/CD3 biFc抑制表現EGFRvIII的LN229-EGFRvIII GBM細胞之體內生長。相反地，陰性對照抗體CD3單價biFc及未處理對照組(即小 鼠未以T細胞或抗體給劑)並未抑制LN229-EGFRvIII GBM細胞之體內生長。舉例而言，在腫瘤植入後第37天，經EGFRvIII-CD3雙特異性抗體30D8/CD3 biFc及42G9/CD3 biFc處理之小鼠的平均腫瘤體積小於100mm3，而未處理或經CD3單價biFc處理之小鼠的平均腫瘤體積係大於1200mm3。
這些數據證實EGFRvIII-CD3雙特異性抗體抵抗表現EGFRvIII腫瘤細胞的體內抗腫瘤活性。
雖然所揭示之教示業經參照各種應用、方法、套組、及組成物來說明，但應理解的是，可在不悖離本文中之教示及下文所請發明下而作出各種改變及修飾。上文之實施例係提供以更能描繪所揭示之教示且未意欲限制在本文中所呈現之教示範圍。雖然該教示已就這些例示性實施態樣而言來說明，但熟悉本技術者將容易了解可有這些例示性實施態樣的許多變異及修飾而不需過度實驗。所有此等變異及修飾係在本教示之範圍內。
在本文中所引用之所有參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書、及類似者，以及彼等中所引用之參考文獻，在此係以引用方式全部併入。若所併入之文獻及類似材料的一或多者不同於或牴觸本案，包括但不限於所界定之用語、用語之使用、所述之技術、或類似者，則以本案為準。
上文之說明及實施例詳述某些本發明之特定實施態樣且說明本案發明人所思酌之最佳模式。然而，應理解的 是，不論前述文字中顯現詳述有多詳盡，本發明係可以許多方式來實施，且本發明應依據所附之申請專利範圍及其任何等效物來解讀。
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<220>
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<223> 合成構築體
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
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<223> 合成構築體
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<220>
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<212> PRT
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<223> 合成構築體
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<220>
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 275
<210> 276
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 277
<210> 278
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 278
<210> 279
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 279
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<210> 281
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<210> 284
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<220>
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<210> 289
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 292

Claims (29)

  1. 一種經單離之抗體，其特異性結合至表皮生長因子受體變異體III(EGFRvIII)，其中該抗體包含(a)重鏈變異(VH)區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144、或145中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、或237中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223、或236中之序列；及/或(b)輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238、或239中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、 188、191、193、196、或199中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197、或200中之序列。
  2. 一種經單離之抗體，其特異性結合至表皮生長因子受體變異體III(EGFRvIII)，其中該抗體包含：VH區，其包含顯示於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217、或218中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或VL區，其包含顯示於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213、或215中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。
  3. 一種經單離之抗體，其特異性結合至EGFRvIII且與如請求項1或2之抗體競爭。
  4. 一種雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係全長之人抗體，其包含特異性結合至標靶抗原之該雙特異性抗體之第一抗體變異域，及包含能夠藉由特異性結合至位在人免疫效應細胞上的效應抗原而召募人免疫效應細胞活性之該雙特異性抗體之第二抗體變異域，其中該第一抗體變異域包含重鏈變異(VH)區，其包含顯示於SEQ ID NO： 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30、32、34、35、37、39、41、43、44、46、48、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、202、203、204、205、206、207、208、209、210、214、216、217、或218中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或輕鏈變異(VL)區，其包含顯示於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、31、33、36、38、40、42、45、47、49、51、211、212、213、或215中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。
  5. 如請求項4之雙特異性抗體，其中該第二抗體變異域包含重鏈變異(VH)區，其包含顯示於SEQ ID NO：240中之VH序列的VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3；及/或輕鏈變異(VL)區，其包含顯示於SEQ ID NO：241中之VL序列的VL CDR1、VL CDR2、及VL CDR3。
  6. 一種雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體係全長之人抗體，其包含特異性結合至標靶抗原之該雙特異性抗體之第一抗體變異域，及包含能夠藉由特異性結合至位在人免疫效應細胞上的效應抗原而召募人免疫效應細胞活性之該雙特異性抗體之第二抗體變異域，其中該第一抗體變異域包含a. 重鏈變異(VH)區，其包含(i)VH互補決定區域一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：62、63、64、74、75、76、80、81、82、88、89、90、93、94、95、99、 100、101、109、110、111、115、116、117、121、122、123、132、133、134、137、138、139、143、144、或145中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：65、66、68、69、70、71、77、78、83、84、86、87、91、92、96、97、98、102、103、105、106、112、113、118、119、124、125、127、128、130、131、135、136、140、141、146、147、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、或237中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：67、72、73、79、85、104、107、108、114、120、126、129、142、148、219、220、221、222、223、或236中之序列；及/或b. 輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：149、154、156、159、162、165、166、168、169、170、171、173、174、176、178、181、182、185、187、190、192、195、198、238、或239中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：150、152、155、157、160、163、172、175、179、183、186、188、191、193、196、或199中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：151、153、158、161、164、167、177、180、184、189、194、197、或200中之序列。
  7. 如請求項6之雙特異性抗體，其中該第二抗體變異域特異性結合至該效應抗原CD3。
  8. 如請求項7之雙特異性抗體，其中該第二抗體變異域包含a. 重鏈變異(VH)區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含顯示於SEQ ID NO：244、110、或245中之序列；(ii)VH CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：246或247中之序列；及iii)VH CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：248中之序列；及/或b. 輕鏈變異(VL)區，其包含(i)VL CDR1，其包含顯示於SEQ ID NO：249中之序列；(ii)VL CDR2，其包含顯示於SEQ ID NO：250中之序列；及(iii)VL CDR3，其包含顯示於SEQ ID NO：251中之序列。
  9. 如請求項4至8中任一項之雙特異性抗體，其中該異二聚體蛋白之該第一及第二抗體變異域兩者包含人IgG2(SEQ ID NO：290)的鉸鏈區中位置223、225、及228以及在CH3區中的位置409或368(EU編碼制)之胺基酸修飾。
  10. 如請求項9之雙特異性抗體，其進一步包含在人IgG2的位置265、330及331之一或多者的胺基酸修飾。
  11. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含在特定部位經工程化之含有麩胺醯胺之醯基供體標籤。
  12. 如請求項11之抗體，其中該抗體包含連接子。
  13. 一種核酸，其編碼如請求項1至12中任一項之抗體。
  14. 一種載體，其包含如請求項13之核酸。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項13之核酸或如請求項14之載體。
  16. 一種如請求項1至3及11至12中任一項之抗體之共軛體，其中該抗體係經共軛至一劑，其中該劑係選自由下列所組成之群組：細胞毒性劑、免疫調節劑、顯像劑、治療性蛋白質(therapeutic protein)、生物聚合物、及寡核苷酸。
  17. 如請求項1至3及11至12中任一項之抗體、請求項4至10中任一項之雙特異性抗體或請求項16之共軛體，其係用於作為藥物。
  18. 如請求項17之抗體、雙特異性抗體、或共軛體，其中該藥物係用於治療選自由下列所組成之群組的EGFRvIII相關癌症：多型性神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiform)、退行性星細胞瘤(anaplastic astrocytoma)、巨細胞神經膠母細胞瘤(giant cell glioblastoma)、神經膠肉瘤(gliosarcoma)、退行性寡樹突神經膠細胞瘤(anaplastic oligodendroglioma)、退行性室管膜瘤(anaplastic ependymoma)、退行性寡星細胞瘤(anaplastic oligoastrocytoma)、脈絡叢癌(choroid plexus carcinoma)、退行性神經節性神經膠質瘤(anaplastic ganglioglioma)、松果體母細胞瘤(pineoblastoma)、松果體細胞瘤(pineocytoma)、腦膜瘤(meningioma)、髓質上皮瘤(medulloepithelioma)、室管膜母細胞瘤(ependymoblastoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、小 腦幕上原始神經外胚層腫瘤(supraentorial primitive neuroectodermal tumor)、非典型畸胎/類橫紋肌細胞瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumor)、混合型神經膠質瘤(mixed glioma)、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、髓母細胞瘤(medullobastoma)、大腸直腸癌、肛門癌、子宮頸癌、腎癌、皮膚癌、胰癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤(mesothelioma)、子宮癌、淋巴瘤、及白血病。
  19. 如請求項18之抗體、雙特異性抗體、或共軛體，其中該癌係多形性神經膠質母細胞瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、或前列腺癌。
  20. 一種如請求項1至3中任一項之抗體、如請求項4至10中任一項之雙特異性抗體、或如請求項16之共軛體用於製造供治療需要彼之個體的藥物之用途。
  21. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至3中任一項之抗體、如請求項4至10中任一項之雙特異性抗體、或如請求項16之共軛體。
  22. 一種有效量之如請求項21之醫藥組成物用於製造供治療個體中與表現EGFRvIII的惡性細胞相關之病況的藥物之用途。
  23. 如請求項22之用途，其中該病況係癌症。
  24. 如請求項23之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群組的EGFRvIII相關癌症：多型性神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiform)、退行性星細胞瘤(anaplastic astrocytoma)、巨細胞神經膠母細胞瘤(giant cell glioblastoma)、神經膠肉瘤(gliosarcoma)、退行性寡樹突神經膠細胞瘤(anaplastic oligodendroglioma)、退行性室管膜瘤(anaplastic ependymoma)、退行性寡星細胞瘤(anaplastic oligoastrocytoma)、脈絡叢癌(choroid plexus carcinoma)、退行性神經節性神經膠質瘤(anaplastic ganglioglioma)、松果體母細胞瘤(pineoblastoma)、松果體細胞瘤(pineocytoma)、腦膜瘤(meningioma)、髓質上皮瘤(medulloepithelioma)、室管膜母細胞瘤(ependymoblastoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、小腦幕上原始神經外胚層腫瘤(supraentorial primitive neuroectodermal tumor)、非典型畸胎/類橫紋肌細胞瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumor)、混合型神經膠質瘤(mixed glioma)、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、髓母細胞瘤(medullobastoma)、大腸直腸癌、肛門癌、子宮頸癌、腎癌、皮膚癌、胰癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌、間皮瘤(mesothelioma)、子宮癌、淋巴瘤、及白血病。
  25. 如請求項24之用途，其中該癌係多形性神經膠質母細胞瘤、頭頸癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、或前列腺癌。
  26. 一種有效量之如請求項21之醫藥組成物用於製造供抑制具有表現EGFRvIII的惡性細胞之個體中腫瘤生長或進展的藥物之用途。
  27. 一種有效量之如請求項21之醫藥組成物用於製造供抑制個體中表現EGFRvIII的惡性細胞轉移(metastasis)的藥物之用途。
  28. 一種有效量之如請求項21之醫藥組成物用於製造供誘發具有表現EGFRvIII的惡性細胞之個體中腫瘤消退的藥物之用途。
  29. 一種製造抗體之方法，其包含在產生製造該抗體或雙特異性抗體條件下培養如請求項15之宿主細胞，以及自該宿主細胞或培養單離該抗體或雙特異性抗體。
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