CN104136463B - 具有对于神经节苷脂的双重特异性的重组抗体以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有对于神经节苷脂N‑乙酰GM3和N‑羟乙酰GM3的双重特异性和高亲和力并且不识别其他神经节苷脂的新型单克隆抗体和这些抗体的片段。在另一个方面，本发明涉及这些抗体及其片段在肿瘤治疗中的用途，所述肿瘤具有被这些抗体所识别的所述两种抗原中任一种的显著表达，或所述两种抗原的混合表达。本发明还涉及这些抗体在表达所述抗原中至少一种的肿瘤的诊断中的用途。

Description

具有对于神经节苷脂的双重特异性的重组抗体以及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，和特别地涉及人类健康。在本发明中描述了通过基因工程技术进行改造的单克隆抗体，和这些抗体及其片段在肿瘤的治疗和/或诊断中的用途。
现有技术
作为肿瘤相关抗原的神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3
神经节苷脂是包含唾液酸并且存在于脊椎动物质膜中的鞘糖脂。这些分子参与各种功能例如细胞粘附、信号转导、组织发育与分化，并且还参与肿瘤进展(Hakomori,PNASUSA 99:225-32,2002)。
由于它们在一定类型的癌症中显现出表达或其表达增加，数种神经节苷脂已被表征为肿瘤相关抗原。在这些与肿瘤相关的神经节苷脂之中，包括N-羟乙酰GM3(NeuGc-GM3)和N-乙酰GM3(NeuAc-GM3，或简单地GM3)。
NeuGc-GM3在正常的人组织中不表达(Varki,Biochimie83:615-622,2001)，但在几种类型的肿瘤中显现出表达(Marquina等人,Cancer Res 56:5165-71,1996；Fernández等人,Expert Rev Vaccines 2:817-23,2003)。本发明涉及以高亲和力识别N-羟乙酰GM3和N-乙酰GM3两者的单克隆抗体。
N-乙酰GM3在正常的人组织中是普遍的(Svennerholm,Structure and Functionof Gangliosides,Plenum Press,New York-London,第533-540页,1980；Prokazova等人,Biochemistry(Moscow)74:235-49,2009)，但它也被定义为肿瘤相关抗原，因为它在不同类型的癌症中过表达(Hersey等人,Int J Cancer 41:336-43,1988；Ravindranath等人,Biochem Biophys Res Commun 353:251-8,2007；Noguchi等人,Glycobiology 16:641-50,2006)。在一项由美国国家癌症研究所组织的、旨在确定哪些抗原应当在癌症的免疫疗法中优先考虑作为靶标的近期研究中，GM3在75种所选择的抗原中占据第48位(Cheever等人,Clinical Cancer Res 15:5323-37,2009)。
神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3具有非常相似的结构，其由三个糖单元(唾液酸、半乳糖和葡萄糖)和一个神经酰胺尾巴构成(图1)。它们之间的差异仅在于在N-乙酰唾液酸(NeuAc)的含氮官能团中存在的甲基基团的羟基化，这导致形成N-羟乙酰唾液酸(NeuGc)。也就是说，它们之间的差异仅在于在唾液酸中氢原子被羟基基团取代。然而，该小的结构差异导致被免疫系统的有差别的识别(Portoukalian,Clin Rev Allergy Immunol19:73-78,2000；Varki,Biochimie 83:615-22,2001)。
识别N-乙酰GM3的单克隆抗体
在文献中已描述了数种识别GM3(N-乙酰基)的人类或鼠类来源的单克隆抗体：M2590 mAb(鼠类IgM)(Hirabayashi等人,J Biol Chem 260:13328-33,1985)；FCM1 mAb(人IgM)(Yamaguchi等人,PNAS 84:2416-20,1987)；DH2 mAb(鼠类IgG)(Dohi等人,Cancer Res48,5680-5,1988)；GMR6 mAb(鼠类IgM)(Kotani等人,Biochim Biophys Acta 1117:97-103,1992)；L612 mAb(人IgM)(Hoon等人,Cancer Res 53:5244-20,1993)；mAbs“17”和AH18(人IgM)(Brandt等人,专利US005610280A,1997)；GMA1 mAb(人IgG)(Mukerjee等人,Hybridoma 17:133-42,1998)。在这八种抗体之中，mAbs DH2和L612已被证明对于GM3是特异的，而其余六种抗体显示对于其他神经节苷脂的扩展的反应性。这些抗体中没有一个显示出识别N-羟乙酰GM3，也没有一个显示出识别其他N-羟乙酰化的神经节苷脂。
在更近期的一项工作中，从在噬菌体表面上表达的单链Fv片段(scFv)文库中获得了三种抗-GM3抗体(称为GM3A6、GM3A8和GM3A15)。所述文库是从一组癌症患者的抗体基因储库开始构建的(Lee等人,J Am Chem Soc 124:12439-46,2002)。通过SPR/Biacore测得的这些scFv片段的解离常数(KD)为大约10-5-10-7M。
通常，抗神经节苷脂的单克隆抗体的亲和力是低的或中等的。关于这些抗体中的几种抗体的Fab片段，通过SPR/Biacore测得的解离常数为大约10-6-10-7M(Catimel等人,Glycobiology 8:927-38；Boffey等人,J Neuroimmunol 165:92-103,2005；Townson等人,Glycobiology17:294-303,2007)，具有极少的例外，例如抗-GD2和抗-GD1b片段，其具有大约10-8M的KD(Boffey等人,J Neuroimmunol 165:92-103,2005；Hu等人,J Immunol 183:5748-55,2009)。
在神经节苷脂N-乙酰GM3的特别情况下，其低的免疫原性对于获得高亲和力的IgG抗体是一个巨大的障碍(Livingston等人,Cancer Immunol Immunother 29:179-84,1989；Portoukalian,Clin Rev Allergy Immunol 19:73-8,2000)。
用抗-N-乙酰GM3抗体的临床前和临床结果
在文献中所描述的各种不同的抗-GM3抗体之中，已经发表了关于mAbs DH2和L612的体外和体内抗肿瘤活性的证据。抗体DH2在体外诱导依赖于抗体的细胞毒性，并且在C57BL/6小鼠中抑制B16黑素瘤细胞的生长(Dohi等人,Cancer Res 48,5680-5,1988)。mAbL612在用表达GM3的癌细胞在体外进行的实验中产生依赖于补体的细胞毒性(Nishinaka等人,J Immunogenetics 48:73-5,1998)。以六聚体IgM形式的该抗体的经工程改造的形式显示出增加的产生依赖于补体的细胞死亡的能力和更大的在小鼠中的抗肿瘤效应(Azuma等人,Clin Cancer Res 13:2745-50,2007)。
已经将mAb L612用于临床，在包括九名转移性黑素瘤患者的I期试验中(Irie等人,Cancer Immunol Immunother 53:110-7,2004)。迄今为止，这是已被记录的唯一的用抗-N-乙酰GM3抗体的临床试验。数位患者对于治疗具有临床应答。此外，该抗体未产生毒性效应，尽管N-乙酰GM3在正常组织中普遍存在。
N-乙酰GM3还是在临床中主动疗法的靶标，在黑素瘤患者中用GM3/VSSP疫苗的I期试验中(Guthmann等人,J Immunother27:242-51,2004)。以前，在12个月期间在猴子中进行的临床前试验中，该疫苗产生了强烈的IgM和IgG类型的抗-GM3抗体的应答，然而未产生毒性效应(Bada等人,Exp Toxicol.21:263-7,2002)。在临床试验中，在患者中产生的抗-N-乙酰GM3抗体是IgM类型的，并且也没有观察到重大的毒性效应。
识别N-羟乙酰GM3的单克隆抗体
在文献中已经描述了两种识别N-羟乙酰GM3但不识别其N-乙酰化变体的单克隆抗体：mAb P3(鼠类IgM)(Vazquez等人,Hybridoma14:551-56,1995)和mAb 14F7(鼠类IgG)(Carr等人,Hybridoma19:241-47,2000)。抗体P3还识别其他的N-羟乙酰化的神经节苷脂(Moreno等人,Glycobiology 8,695-708,1998)，而抗体14F7经证明对于N-羟乙酰GM3是特异的。
作为本发明的目标的抗体的设计和基因工程改造基于抗体14F7的可变结构域的氨基酸序列和晶体学结构(Krengel等人,J Biol Chem279:5597-603,2004)。
单克隆抗体14F7
由以登录号ECACC 98101901进行保藏的杂交瘤所产生的鼠类单克隆抗体14F7描述在专利申请EP 0972782/A1中。该抗体的人源化变体和片段描述在专利申请WO 2004/094477/A1中。
mAb 14F7是以高特异性(Carr等人,Hybridoma 19:241-47,2000)和高亲和力识别N-羟乙酰GM3的IgG1同种型的免疫球蛋白，具有对于其scFv片段而测得的大约10-8M的解离常数(Rojas等人,J Immunol Methods 293:71-83,2004)。免疫组织化学研究已证明，抗体14F7识别数种类型的肿瘤，例如乳腺导管癌和黑素瘤(Carr等人,Hybridoma 19:241-47,2000)，胃、结肠和胰腺的腺癌(Blanco等人,ISRN Gastroenterol,Article ID 645641,2011)，生殖泌尿系统的肿瘤(Blanco等人,ISRN Pathology,Article ID 953803,2011)，和神经外胚层的肿瘤(Scursoni等人,Clin Devel Immunol,Article ID 245181,2011)。
mAb 14F7与N-羟乙酰GM3的结合位点位于其重链可变区(VH)中，如从在噬菌体上表达的scFv片段的文库的构建中所显示的，这些scFv片段将mAb 14F7的VH结构域与鼠类和人类的各种各样的轻链可变结构域(VL)相组合(Rojas等人,J Immunol Methods 293:71-83,2004)。该文库的超过三分之一的片段能够识别N-羟乙酰GM3，这也证明了mAb 14F7的VH结构域可以与各种不同的VL结构域相联合并保持该抗体的原始的特异性。
在体外和体内研究中，mAb 14F7能够引起不依赖于补体的细胞死亡并抑制在小鼠中骨髓瘤的生长(Carr等人,Hybridoma 21:463-8,2002)。在乳腺癌患者中进行的I/II期前瞻性临床试验之中，用锝标记的抗体14F7在肿瘤中积累(Oliva等人,Breast Cancer ResTreat96:115-21,2006)。
后来的研究证明，通过在细胞膜中引起损伤的新型机制，抗体14F7杀死肿瘤细胞，但不杀死正常细胞(Roque-Navarro等人,Mol Cancer Ther 7:2033-41,2008)。mAb 14F7的高亲和力对于产生该类型的死亡来说是一个重要的因素，如用具有增加的亲和力的抗体P3的突变体进行的近期实验所证明的那样(Fernandez-Marrero等人,Mol Immunol 48:1059-67,2011)。抗体P3或其嵌合变体P3Q(其具有mAb P3的可变区和人IgG1的恒定区)不能够在表达N-羟乙酰GM3的肿瘤细胞中产生不依赖于补体的细胞死亡。然而，由Fernandez-Marrero等人所获得的突变体P3Q E99R(其具有更高的对于N-羟乙酰GM3的亲和力(在mAbsP3Q和14F7的亲和力之间))能够产生不依赖于补体的细胞死亡。具有更高亲和力的mAb14F7具有比由突变体P3Q E99R所产生的更大的死亡效应。
以N-羟乙酰GM3作为靶标的临床疗法
迄今为止，关于识别神经节苷脂N-羟乙酰GM3的抗体可以具有抗肿瘤效应的最强证据来自以该神经节苷脂作为靶标的两种疫苗产品的II/III期临床试验。这些产品之一为在其制剂中包含N-羟乙酰GM3分子本身的NGcGM3/VSSP疫苗，而另一种产品为称为雷妥莫单抗(Racotumumab)或1E10的抗独特型抗体(Fernández等人,Clin Devel Immunol,ArticleID 814397,2010)。这两种疫苗都在癌症患者中产生高的抗-N-羟乙酰GM3抗体滴度，具有经证明的抗肿瘤效应(Fernández等人,Clin Devel Immunol,Article ID 814397,2010；Hernández等人,J Immunol 186:3735-44,2011)。
在噬菌体上表达的抗体片段文库
作为本发明目标的具有双重特异性的抗体从在丝状噬菌体上表达的scFv片段的组合文库中获得，所述文库是特别为该目的而设计的。
在噬菌体上的抗体片段展示(或缩写为“噬菌体表达”)技术是一种高通量技术，其允许产生包含大量的(直至数十亿)具有不同氨基酸序列的片段的文库，和随后选择在特异性和亲和力方面具有所希望的结合能力的片段(Hoogenboom,Methods Mol Biol 178:1-37,2002)。
具有双重特异性的抗体
癌症是特征在于遗传异质性的疾病，这使得用单一的治疗试剂对其进行治疗变得困难。由于该原因，针对多个与该疾病相关的分子靶标的联合疗法具有更大的成功可能性。在该意义上，可能的是使用具有不同特异性的抗体的混合物，但该类型的疗法由于开发和制造这些不同抗体中的每一种抗体的高成本而结果会是非常昂贵的。
用基因工程技术已经可能产生各种不同的解决方案以获得具有识别两个或更多个分子的能力的抗体或源自其的片段。这些分析研究基本上在于将超过一个的抗体结合位点(每一个具有不同的特异性)组合为同一个分子构建物(Hudson和Souriau,Nat Med 9:129-34,2003；Hollander,Immunotherapy 1:211-22,2009)。
最近，描述了具有双重特异性的抗体的一种新的概念设计，其中将单克隆抗体的结合位点设计成用于识别第二个抗原，同时保持对于原始抗原的识别。该新的概念设计被应用于抗体赫赛汀，其中使用了噬菌体表达技术，从而获得了突变体，其除了保持以高亲和力识别原始抗原(HER2分子)外，还以高亲和力识别血管内皮生长因子(VEGF)(Bostrom等人,Science 323:1610-14,2009)。具有双重特异性的抗体的该新的概念设计(“二合一”)具有几个优点，其中非常重要的一个优点是：容易将其作为单克隆抗体来产生。
发明详述
本发明涉及具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性和高亲和力的重组单克隆抗体。源自这些抗体的片段也包括在本发明的范围之内。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性和高亲和力的抗体，其中所述抗体的重链可变区包含下列CDRs：
CDR-H1：GYRFRSYQIH，SEQ ID NO:3
CDR-H2：YIDPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:17
CDR-H3：ESPRLRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:34。
在另一个实施方案中，本发明涉及抗体，其特征在于，重链可变区的序列为SEQ IDNO:1：
QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSS。
在另一个特别的实施方案中，本发明涉及单克隆抗体，其具有有着下列序列的重链和轻链可变区：
SEQ ID NO:1：
QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSS，
和
SEQ ID NO:2：
DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSCRASQSISNNLHWYQQRTHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNRWPLTFGAGTKLELKRA。
在另一个方面中，本发明涉及单克隆抗体，其具有有着SEQ ID NO:1的重链可变区：
QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSS，并且轻链可变区的序列为任一的抗体轻链可变区的序列。
在另一个方面，轻链可变区为任一的人抗体的轻链可变区。
在另一个特别的方面，轻链可变区为任一的人源化抗体的轻链可变区。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及抗体，其特征在于，抗原结合结构域包含从由下列序列组成的组中选择的CDR-H1的序列：
CDR-H1 GYRFRSYQIH，SEQ ID NO:3
CDR-H1 GYSFTRYQIH，SEQ ID NO:4
CDR-H1 GYRFTSNQIH，SEQ ID NO:5
CDR-H1 GYSFNRYQIH，SEQ ID NO:6
CDR-H1 GYSFRRYQIH，SEQ ID NO:7
CDR-H1 GYSITRYQIH，SEQ ID NO:8
CDR-H1 GYSFTRYQIH，SEQ ID NO:9
CDR-H1 GYSFKSYQIH，SEQ ID NO:10
CDR-H1 GYSFTSYQIH，SEQ ID NO:11
CDR-H1 GYRFTRYWIH，SEQ ID NO:12
CDR-H1 GYTFTRYQIH，SEQ ID NO:13
CDR-H1 GYPFTRYQIH，SEQ ID NO:14
CDR-H1 GYSFSRYQIV，SEQ ID NO:15
CDR-H1 GYHFTRYQIH，SEQ ID NO:16。
在另一个实施方案中，本发明的抗体的特征在于，CDR-H2的序列从由下列序列组成的组中选择：
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:17
CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD，SEQ ID NO:18
CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:19
CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:20
CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD，SEQ ID NO:21
CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:22
CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD，SEQ ID NO:23
CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD，SEQ ID NO:24
CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:25
CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:26
CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:27
CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:28
CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD，SEQ ID NO:29
CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:30
CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:31
CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD，SEQ ID NO:32
CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD，SEQ ID NO:33。
在另外一个实施方案中，本发明的抗体的特征在于，CDR-H3的序列从由下列序列组成的组中选择：
CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:34
CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY，SEQ ID NO:35
CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:36
CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:37
CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY，SEQ ID NO:38。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含上面所列举的CDRs H1、H2和H3序列的任一组合。在另一个实施方案中，本发明的抗体的特征在于，CDR-H2的序列和/或CDR-H3的序列包含从由下列置换组成的组中选择的氨基酸置换中的至少一个：
CDR-H2 Asp 52被Ala、Glu、Asn、Ser或Thr置换
CDR-H2 Ala 53被Asp、Glu、Gly、His、Leu、Ser、Thr或Tyr置换
CDR-H3 Arg 100-Arg 100A被Ala-Lys、His-Arg或Thr-Arg置换
CDR-H3 Gly 100B被Ala、Asp、Phe、Leu、Gln、Arg或Ser置换
CDR-H3 Tyr 100 D被Phe置换；
并且另外还包含任一的抗体轻链。
在另一个特别的实施方案中，本发明包含人IgG1恒定区(对于重链)和CK(对于轻链)。
在另一个方面，本发明涉及本说明书的抗体的Fab、Fab'、(Fab)2和scFv片段。
本发明的片段的特征在于：
从由下列序列组成的组中选择的CDR-H1的序列：
CDR-H1 GYRFRSYQIH，SEQ ID NO:3
CDR-H1 GYSFTRYQIH，SEQ ID NO:4
CDR-H1 GYRFTSNQIH，SEQ ID NO:5
CDR-H1 GYSFNRYQIH，SEQ ID NO:6
CDR-H1 GYSFRRYQIH，SEQ ID NO:7
CDR-H1 GYSITRYQIH，SEQ ID NO:8
CDR-H1 GYSFTRYQIH，SEQ ID NO:9
CDR-H1 GYSFKSYQIH，SEQ ID NO:10
CDR-H1 GYSFTSYQIH，SEQ ID NO:11
CDR-H1 GYRFTRYWIH，SEQ ID NO:12
CDR-H1 GYTFTRYQIH，SEQ ID NO:13
CDR-H1 GYPFTRYQIH，SEQ ID NO:14
CDR-H1 GYSFSRYQIV，SEQ ID NO:15
CDR-H1 GYHFTRYQIH，SEQ ID NO:16；
从由下列序列组成的组中选择的CDR-H2的序列：
CDR-H2 YIDPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:17
CDR-H2 YINPATASTESNQKFKD，SEQ ID NO:18
CDR-H2 FIDPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:19
CDR-H2 DIDPGRAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:20
CDR-H2 YIDPATANTESNQKFKD，SEQ ID NO:21
CDR-H2 FINPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:22
CDR-H2 FIDPASAYTVSNQKFKD，SEQ ID NO:23
CDR-H2 YIDPATAKTESNQKFKD，SEQ ID NO:24
CDR-H2 YINPGSAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:25
CDR-H2 YLDPANAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:26
CDR-H2 YVDPANAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:27
CDR-H2 YINPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:28
CDR-H2 YIDPATAWTESNQKFKD，SEQ ID NO:29
CDR-H2 YIDPGTAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:30
CDR-H2 YIDPRTAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:31
CDR-H2 YVDPATAHTESNQKFKD，SEQ ID NO:32
CDR-H2 YINPATAYTDSNQKFKD，SEQ ID NO:33；从由下列序列组成的组中选择的CDR-H3的序列：
CDR-H3 ESPRLRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:34
CDR-H3 ESPRFRRGRYYYAMDY，SEQ ID NO:35
CDR-H3 ESPRMRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:36
CDR-H3 ESPRVRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:37
CDR-H3 ESPRLRRGLYYYAMDY，SEQ ID NO:38。
在另一个实施方案中，本发明的片段包含上面所列举的CDRsH1、H2和H3序列的任一组合。
这些抗体及其片段对于在本说明书中所披露的诊断和治疗目的来说是有用的。因此，另一方面，本发明涉及包含本说明书的抗体和/或其片段的组合物，所述组合物用于诊断或治疗与神经节苷脂抗原N-乙酰GM3和/或N-羟乙酰GM3有关的疾病。
优选地，本发明包括组合物(其中包括药物组合物)，其包含一种或几种具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性和高亲和力的抗体或者源自这些抗体的片段。更优选地，本发明包括药物组合物，其包含至少一种本发明的抗体和/或片段以及药学上可接受的载体和/或助剂。更加优选地，本发明包括具有SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:2的轻链可变区的抗体。
在一个方面，本发明还涉及治疗方法，其包括向携带表达神经节苷脂抗原N-乙酰GM3和/或N-羟乙酰GM3中至少一种的肿瘤的受试者施用本发明的抗体及其片段。在一个特别的实施方案中，所述受试者为人。
在另外一个方面，本发明涉及在肿瘤的诊断中有用的试剂盒，其包含本发明的抗体和/或源自其的片段中的至少一种。在一个特别的实施方案中，所述方法包括但不限于诊断，例如，基于在患者的组织或体液样品(例如肿瘤组织样品、血液样品等)中与病理学状况相关的抗原(例如神经节苷脂N-乙酰GM3和/或N-羟乙酰GM3)的存在。
获得本发明的抗体的方法
基于mAb 14F7的scFv片段文库的设计和构建
从特别为该目的而设计的单链Fv区片段(scFv)的基因文库开始来获得作为本发明的目标的抗体。该设计的合理性和原创性首先在于仔细地选择在抗体片段的氨基酸序列中待随机化的位置，从而将突变限制在最可能与抗原相互作用的区域中。
在本说明书中使用了Kabat编号方案来对抗体的VH区的序列进行编号。对于作为本发明的目标的抗体及其片段，该编号方案在位置52(52A)、82(82A至82C)和100(100A至100H)后面将插入字母引入到VH区中。
作为该文库的scFv片段的轻链(VL结构域)，选择在先前工作中获得的3Fm片段的轻链(Rojas等人,J Immunol Methods 293:71-83,2004)。该片段包含mAb 14F7的VH结构域，而其VL结构域从鼠类轻链文库中提取并且不与mAb 14F7的原始VL结构域有关。然而，尽管有着不同的轻链，3Fm片段保持了mAb 14F7对于NeuGc-GM3的特异性和高亲和力，并且此外可以在细菌中表达。考虑到由Rojas等人(J Immunol Methods 293:71-83,2004)和由Krengel等人(J Biol Chem 279:5597-603,2004)所获得的实验数据(其表明轻链在抗原的识别中不是重要的)，该链的序列在文库中保持不变。
该文库的片段的重链的设计采取抗体14F7的VH区的序列作为基础。从mAb 14F7的Fab片段的晶体学结构的分析出发(Krengel等人,J Biol Chem 279:5597-603,2004)，并且此外还知道到VH结构域是决定该抗体与N-羟乙酰GM3的结合的结构域，在VH结构域的高变环中选择一组待突变的位置。待突变的位置的选择基于两个主要标准：1)优先突变其侧链暴露于溶剂的氨基酸；和2)突变区域限定于在离VH的位置52半径为12埃的范围之内的位置。该最后一个标准基于由Krengel等人(J Biol Chem 279:5597-603,2004)所报告的诱变实验，其证明了氨基酸Asp 52参与抗体14F7与其抗原的相互作用。
总之，通过调整VH结构域的基因合成过程来使VH中的结合位点的20个位置经历温和随机化(Fairbrother等人,Biochemistry37:17754-64,1998)，这使得能够在每个待突变的位置处引入二十种天然氨基酸中的任一种，而同时在每个独个分子中保持其重链的有限程度的相对于抗体14F7的原始VH链而言的偏离。
经历随机化的位置为下列位置：Ser 28、Phe 29、Thr 30、Ser 31、Trp 33、Ile 34、Tyr 50、Ile 51、Asp 52、Ala 53、Thr 54、Tyr 56、Glu 58、Arg 98、Leu 99、Arg 100、Arg100A、Gly 100B、Ile 100C和Tyr 100D。
待突变的位置中的三个位置，Phe29、Ile34和Ile51，相应于具有埋在该蛋白质内部的其侧链的疏水性氨基酸，它们对于维持CDRsΗ1和H2的构象来说是重要的。特别地对于这三个氨基酸，以及对于CDRH3中的Leu 99，分别使用特别设计的密码子：TTT、ATT、ATT和TTG，其中加下划线的核苷酸表示所述核苷酸(85％)与其余三种核苷酸的等摩尔混合物(15％)的混合物。这些部分简并的密码子编码疏水性氨基酸，从而特许原始氨基酸插入在每个位置处。该设计的目的是产生有限的多样性，其可以对于CDRs的构象仅具有非常轻微的影响，其中对于与抗原的亲和力具有可能的调节效应。
考虑到Krengel等人(J Biol Chem 279:5597-603,2004)证实了氨基酸Asp 52对于与NeuGc-GM3的结合来说是重要的，为该氨基酸设计了特殊的密码子混合物(G-80％/A-20％)A(C-50％/T-50％)，其编码六个不同氨基酸，所述氨基酸大多数具有尺寸小的和中等的侧链，并且其中原始的天冬氨酸占优势。对于其余的15个随机化位置，通过使用包含85％的原始核苷酸和15％的其余三种核苷酸的等摩尔混合物的核苷酸混合物，合成了编码那个位置的三联体的每个碱基。
合成所设计的VH基因集合，并将其克隆入包含3Fm scFv片段的基因的噬菌粒pHAB中(Rojas等人,J Immunol Methods 293:71-83,2004)。通过使用辅助噬菌体M13 K07，从该文库中拯救出呈现scFv片段的噬菌体，然后通过使用由Marks等人(J Mol Biol 222:581-97,1991)所描述的实验方案来进行纯化。
具有以高亲和力识别神经节苷脂N-乙酰GM3的能力并且同时保持N-羟乙酰GM3的高亲和力识别的14F7的突变型抗体的片段的获得是令人惊奇的结果。赋予突变体以新特性的在抗体14F7的重链中的氨基酸改变不是从以前积累的零散知识中可预测的。获得具有双重特异性的抗体是可能的，这是由于文库的合理设计，其中将温和随机化程序与基于结构知识的待突变位置的仔细选择相组合，以便将文库的多样性集中在该抗体的对于其抗原的结合来说相关的结合位点的区域中。
具有双重特异性的scFv片段的选择
作为本发明的目标的具有对于神经节苷脂N-羟乙酰GM3和N-乙酰GM3的双重特异性的抗体片段通过该文库的噬菌体的三轮选择和扩增来获得，其中仅使用N-乙酰GM3作为靶分子，因为先前进行的针对N-羟乙酰GM3的单轮选择证明该文库包含大量的能够识别该抗原的片段。
遵循与由Rojas等人(J Immunol Methods 293:71-83,2004)所描述的相似的程序来进行选择过程。使用处于指数生长的TG1细胞来以50毫升的规模拯救所选择的噬菌体，如在(Marks等人,J Mol Biol222:581-97,1991)中所描述的那样。使用经纯化的噬菌体作为起始材料以用于下一轮选择。在三轮之后，将独个地选择出的噬菌体克隆在96-孔平板中进行拯救(Marks等人,J Mol Biol 222:581-97,1991)。
遵循与在(Rojas等人,J Immunol Methods 293:71-83,2004)中所描述的相似的程序，通过ELISA来评价所选择的噬菌体与N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3结合的能力。由Macrogen公司(韩国)测定了显示出更大的与这两种神经节苷脂结合的能力的抗体片段的核苷酸序列。
具有双重特异性的抗体的结合位点的表征
除了具有对于NeuAc-GM3和NeuGc-GM3的双重特异性的片段外，还对仅识别N-羟乙酰GM3的源自该文库的其他抗体片段以及在ELISA实验中不能够识别所述两种神经节苷脂中任一种的片段进行了测序。另外地并且从选自于该文库的具有双重特异性的片段之一开始，通过对每个位置独个地进行穷举随机化，研究了VH区的特殊的一组位置的影响。
这些研究使得能够详细地确定该抗体的结合位点的氨基酸中的哪些氨基酸对于N-羟乙酰GM3和N-乙酰GM3的双重识别来说是最重要的。在表1中，显示了一组从文库中提取的具有双重特异性的scFv片段的重链CDRs的序列。在表2中，显示了在VH结构域的序列中的对于双重特异性来说相关的位置，和允许不同程度的氨基酸可变性的位置。
在CDR H1中仅两个或三个突变就足以赋予抗体片段以除了与N-羟乙酰GM3结合外，还与N-乙酰GM3结合的能力。特别地，置换Ser 28→Arg、Thr 30→Arg和Trp 33→Gln产生具有对于所述两种神经节苷脂的高亲和力的突变体(突变体RRQ)。
具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性的重组免疫球蛋白的构建
本发明包括具有对于神经节苷脂NeuAc-GM3和NeuGc-GM3的双重特异性的任何同种型的(无论是人类来源的、鼠类来源的还是其他物种来源的)免疫球蛋白，以及这些免疫球蛋白的任何类型的片段。可以从具有与所述两种神经节苷脂结合的能力的scFv片段的VH区的氨基酸序列以及从鼠类、人类或其他物种来源的VL区的序列开始来构建任何所希望的同种型的免疫球蛋白。通过采用已建立的分子生物学技术，通过使用被描述用于重组蛋白质(特别是单克隆抗体)的有效表达的载体中的任一种，可以达到该目的。
在一个实施方案中，通过使用通常用于在高等细胞中表达免疫球蛋白的载体pAH4604和pAG4622(Coloma等人,J Immunol Methods52:89-104,1992)，可以构建出IgG1同种型的免疫球蛋白。
待用于构建具有对于神经节苷脂NeuAc-GM3和NeuGc-GM3的双重特异性的免疫球蛋白的VH序列可以从在本发明中所构建的噬菌体文库中直接提取，或者可以从在表1中所显示的实验数据开始进行设计，通过在序列中保留对于双重特异性来说重要的位置和在允许一定程度的可变性的CDRs的位置处引入合适的氨基酸中的任一种。待使用的VL序列允许高程度的可变性(在构架区中和在高变环中)，如在(Rojas等人,J Immunol Methods 293:71-83,2004)中所证实的那样。
在另一个实施方案中，本发明还包括嵌合免疫球蛋白(即具有人的恒定区和人的可变区)，以及具有人源化的可变区的免疫球蛋白。
药物组合物
在一个实施方案中，本发明提供了包含一种或多种本发明的抗体或其片段的药物组合物。在一个实施方案中，这些药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
如在本发明中所使用的，表述“药学上可接受的载体或助剂”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。还可以在组合物中掺入补充的活性化合物。术语“药学上可接受的载体或助剂”是指这样的载体或助剂，其可以连同所述抗体或片段一起施用给受试者，并且不破坏它们的药理学活性且当以对于递送治疗量的所述抗体来说足够的剂量进行施用时不是毒性的。配制药物组合物以使其与所预知的其施用途径相容。施用途径的例子尤其包括，肠胃外途径，例如肠胃外、真皮内、静脉内和皮下途径。用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含下列组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节涨度的试剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠，来进行调节。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
对于促进按剂量给药的实施和均一性来说，配制单剂量形式的肠胃外组合物是有利的。如在本文中所使用的，单剂量给药形式是指作为用于待治疗的受试者的单一剂量来说合适的在物理上分离的单位；每个单位包含为产生所希望的治疗效果而计算出的预定量的活性化合物，以及与之相联合的所需要的药学载体。
可以将药物组合物包含在容器、包装或分配器中，连同关于其施用的指导说明书一起。
治疗方法
本发明的抗体可以用于治疗表达神经节苷脂N-乙酰GM3或神经节苷脂N-羟乙酰GM3或同时这两种神经节苷脂的肿瘤。
本发明的抗体的合适的治疗剂量在大约1mg/剂至大约1g/剂，优选地大约50mg/剂至大约500mg/剂的范围内。本发明的抗体通过任何合适的途径进行施用，包括肠胃外、皮下、肺内、鼻内和颅内途径，和如果希望用于局部治疗，损伤内途径。
治疗方法包括以本领域技术人员已知用于用单克隆抗体或其片段进行的被动疗法的剂量方案向患者施用本发明的药物组合物。治疗方法的一个例子(但其并不限制本发明)包括在例如6周期间施用周剂量为200mg的本发明的抗体，然后例如每2或3周施用维持剂量，直至有限的疾病或毒性进展。
附图简述
图1.A)在ELISA试验中，mAb 7C1对神经节苷脂N-羟乙酰GM3和N-乙酰GM3的识别，其中使用不同浓度的抗体。B)在ELISA试验中，抗体14F7hT(具有人IgG1同种型的mAb 14F7的人源化形式)、7C1和T1h(用作阴性对照的人源化抗体)对神经节苷脂N-羟乙酰GM3的识别。C)神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3在TLC板上的免疫染色(分别为走样道1和2，在所述4个板的每一个板上)。从左至右：分别为用苔黑酚对所述两种神经节苷脂进行的揭示，以及用抗体14F7hT、7C1和T1h对所述两种神经节苷脂进行的免疫染色。仅抗体7C1显示出与N-乙酰GM3的反应性。D)在ELISA试验中，抗体14F7hT和7C1对一组不同神经节苷脂的识别。
图2.在流式细胞术实验中，mAb 7C1对表达N-乙酰GM3或N-羟乙酰GM3的肿瘤细胞系的识别。A)仅表达N-乙酰GM3的转化肿瘤细胞系L1210-SH的标记。B)主要表达N-羟乙酰GM3的天然肿瘤细胞系L1210的标记。
图3.与抗体14F7hT相比较，抗体7C1对于表达N-乙酰GM3或N-羟乙酰GM3的肿瘤细胞的细胞毒性效应。A)对于天然细胞系L1210的细胞死亡效应。B)对于转化细胞系L1210-SH的细胞毒性效应。C)具有该实验的数字结果的总结表格。
图4.A)在流式细胞术实验中，人源化抗体7C1对Balb/c小鼠脾细胞的识别。B)细胞生存力试验，其使用以抗体7C1进行处理的经纯化的Balb/c小鼠的B淋巴细胞。在这两个实验中，B淋巴细胞均用抗-B220的多克隆抗体进行标记，并且使用人源化抗体C5Q作为不相关的对照。
实施例
实施例1.具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性的IgG1同 种型的重组免疫球蛋白(抗体7C1)的构建
从具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性的scFv片段的VH区的氨基酸序列开始，设计了编码该结构域的基因，还对其进行了优化以用于在哺乳动物细胞中表达。类似地，设计了编码抗体14F7的原始VL区的基因。这两个基因均由Geneart(德国)公司合成。
所选择的VH结构域在氨基酸水平上相对于抗体14F7的原始序列而言仅具有三个突变。这三个突变为：Ser 28→Arg、Thr 30→Arg和Trp 33→Gln。
遵循已知的分子生物学程序，将编码VH和VL的基因分别克隆到载体pAH4604和pAG4622中(Coloma等人,J Immunol Methods52:89-104,1992)。这些载体被用于在高等细胞中表达免疫球蛋白。载体pAH4604包含IgG1同种型的人的恒定区，而载体pAG4622包含人的κ恒定区。为了表达重组免疫球蛋白，使用不产生抗体的鼠类骨髓瘤细胞Sp2/0，将其相继地用所获得的关于VH和VL的遗传构建物进行转染。通过使用A蛋白柱来纯化由这些细胞所产生的免疫球蛋白。
所产生的重组单克隆抗体接受7C1的编号。
遵循与由Rojas等人(J Immunol Methods 293:71-83,2004)所描述的相似的程序，对于不同浓度的免疫球蛋白，通过ELISA来测量重组抗体7C1与神经节苷脂NeuAc-GM3和NeuGc-GM3结合的能力。
如在图1A中所显示的，mAb 7C1实际上能够以相同的亲和力与所述两种神经节苷脂结合，其中观察到量化了抗体7C1对神经节苷脂NeuAc-GM3和NeuGc-GM3的识别水平的光密度(OD)曲线彼此非常相似。此外，抗体7C1与N-羟乙酰GM3(和通过转换，还与N-乙酰GM3)的结合亲和力与对于mAb 14F7与N-羟乙酰GM3的结合所观察的亲和力是非常相似的(仅稍微偏低)，如在图1B中所显示的。
在这些实验中，使用了具有人IgG1同种型的mAb 14F7的人源化形式(称为14F7hT)，其保留了原始抗体14F7的识别特性(Fernandez-Marrero等人,Immunobiology216:1239-47,2011)。作为阴性对照，使用了也具有人IgG1同种型的抗体T1h(抗-CD6)。
另外，通过薄层色谱法(TLC)验证了抗体7C1与所述两种神经节苷脂结合的能力，如在图1C中所显示的，其中观察到mAb 7C1能够标记N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的经纯化的样品。
抗体7C1的特异性是真正双重的，不是多重的，如图1D中所证明的，其中显示该抗体不识别不同神经节苷脂组的分子中的任一种分子，无论是N-乙酰类型的还是N-羟乙酰类型的。
实施例2.抗体7C1对表达N-乙酰GM3或N-羟乙酰GM3的肿瘤细胞系的识别
经由使用为小鼠淋巴细胞白血病细胞系的L1210细胞系(从美国典型培养物保藏中心购买)的两种变体的流式细胞术实验来证明抗体7C1识别表达神经节苷脂N-羟乙酰GM3或N-乙酰GM3的肿瘤细胞的能力。使用表达N-羟乙酰GM3的所述细胞系的天然株系本身，和表达N-乙酰GM3的遗传转化变体(L1210-SH)(Fernández-Marrero等人,Mol Immunol 48:1059-67,2011)。
Roque-Navarro等人(Mol Cancer Ther 7:2033-41,2008)证实了由L1210细胞系进行的N-羟乙酰GM3的高表达，这通过抗体14F7对该细胞系的显著识别而得到证明。这些细胞的神经节苷脂含量的提取分析作为结果而给出了85:15的NeuGc-GM3/NeuAc-GM3的比例。
表达N-乙酰GM3而非N-羟乙酰GM3的细胞系L1210-SH通过抑制CMP-NeuAc羟化酶表达的干扰RNA片段的慢病毒转导来获得，所述CMP-NeuAc羟化酶将N-乙酰唾液酸转化为N-羟乙酰唾液酸(Shaw和Schauer,Biol Chem Hoppe Seyler 369:477-86,1988)。Fernández-Marrero等人(Mol Immunol 48:1059-67,2011)证实了在该转化细胞系中N-羟乙酰GM3表达的急剧减少。
流式细胞术实验在FACScan设备(Becton Dickinson)上进行。在每个试验中，收集104个细胞。为了对细胞进行荧光标记，使用缀合有FITC的抗-人IgG抗体。作为阴性对照，使用抗体T1h。
如在图2A中所显示的，抗体7C1能够标记L1210-SH细胞系的细胞(其表达N-乙酰GM3)，这与不识别所述细胞的抗体14F7hT不同。另一方面，抗体7C1还标记L1210的天然株系的细胞(其具有N-羟乙酰GM3的高表达)，所述细胞也被在该情况下用作阳性对照的抗体14F7hT标记(图2B)。要强调的是，相比于被mAb 14F7hT进行的标记而言，L1210的天然株系被mAb 7C1进行的标记是更强的，这归因于mAb 7C1可以与GM3的N-羟乙酰变体和N-乙酰变体(两者均在这些细胞中表达)结合。
实施例3.抗体7C1对于表达N-乙酰GM3或N-羟乙酰GM3的肿瘤细胞的细胞毒性效应
在用细胞系L1210和L1210-SH进行的实验中证实了抗体7C1通过不依赖于补体的细胞死亡机制来杀死表达N-乙酰GM3或N-羟乙酰GM3的肿瘤细胞的能力。为了用该抗体来诱导死亡，将细胞以1百万个细胞/毫升的浓度悬浮在具有1％胎牛血清的培养基中，随后与该抗体一起在5％CO2的气氛中在37摄氏度下温育3小时。然后，洗涤细胞，将其悬浮在具有10微克/毫升的碘化丙锭(PI)的PBS中，并通过流式细胞术进行分析。通过测量前向和侧向散射以及PI的掺入来鉴定死细胞。将具有在活细胞的特征范围外的散射水平且还被PI标记的细胞计数为死细胞。
与仅在天然的L1210细胞系中产生细胞死亡的mAb 14F7不同，具有双重特异性的抗体7C1在天然的L1210细胞系中(图3A)和在表达N-乙酰GM3的转化细胞系L1210-SH中(图3B)都产生显著的细胞死亡效应。要强调的是mAb 7C1在天然的L1210细胞系中产生的强的细胞死亡效应(95％)，其比由mAb 14F7hT所产生的效应(54％)更大，这证明抗体7C1在具有神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的混合过表达的细胞中具有更高的细胞毒性效应。图3C总结了这些实验的结果。
实施例4.mAb 7C1对正常细胞的识别，没有产生细胞死亡
然而，在肿瘤细胞中具有强的细胞毒性效应的抗体7C1在表达N-羟乙酰GM3或N-乙酰GM3的正常细胞不产生细胞死亡，如用Balb/c小鼠的脾细胞来进行的实验所证明的那样。
在通过流式细胞术进行的细胞识别实验中，将Balb/c小鼠的B淋巴细胞用抗-B220的多克隆抗体(Dako，稀释度1:200)和用抗体7C1(以10微克/毫升的浓度)进行双标记。细胞生存力试验用与抗体7C1一起温育的来自Balb/c小鼠脾脏的B淋巴细胞来进行。将一百万个用磁珠(Myltecni Biotec)进行纯化的B淋巴细胞与溶解在补充有1％BSA的DMEM-F12培养基中的50微克的抗体一起在37℃下在CO2的气氛中温育3小时。由该处理所诱导的死亡通过碘化丙锭的掺入来测定。在细胞识别实验中和在细胞生存力实验中均使用人源化抗体C5Q作为不相关的对照。
如在图4A中所显示的，mAb 7C1产生了Balb/c小鼠的B淋巴细胞以及其他脾细胞的显著标记。尽管有着mAb 7C1对这些细胞的显著识别，但是用经纯化的B淋巴细胞来进行的细胞生存力试验证明抗体7C1对于正常的B淋巴细胞不具有细胞毒性效应，如在图4B中所显示的。
表1.从噬菌体文库中提取的scFv片段(其具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性)的重链高变区(CDRs)的序列。
*该表中的CDR H1包括VH区的位置26-35，根据(Chothia&Lesk,J Mol Biol 196:901-17,1987)。在不同克隆的序列中的短线表示与在mAb 14F7的序列中的相应氨基酸一致。最常见的突变用粗体字母标识。
表2.在VH区的一组位置处进行的scFv氨基酸的各种不同置换对于所述片段与NeuAc-GM3和NeuGc-GM3的结合的影响。
*在突变体RRQ(这三个字母分别表示在位置28、30和33处存在的氨基酸)的序列上实现了结果与双重特异性相容的置换。

Claims (7)

1.抗神经节苷脂的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有对于神经节苷脂N-乙酰GM3和N-羟乙酰GM3的双重特异性和高亲和力，
其中，重链可变区包含下列CDRs：
CDR-H1：GYRFRSYQIH，SEQ ID NO:3
CDR-H2：YIDPATAYTESNQKFKD，SEQ ID NO:17
CDR-H3：ESPRLRRGIYYYAMDY，SEQ ID NO:34；并且
轻链可变区的序列为SEQ ID NO:2：
DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSCRASQSISNNLHWYQQRTHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNRWPLTFGAGTKLELKRA。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于，重链可变区的序列为SEQ ID NO:1：
QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYRFRSYQIHWLKQRPDQGLEWIGYIDPATAYTESNQKFKDKAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCARESPRLRRGIYYYAMDYWGQGTSVTVSS。
3.源自根据权利要求1或2的抗体的片段，其特征在于，所述片段为Fab、Fab'、(Fab)2或scFv类型的片段。
4.用于治疗表达神经节苷脂N-乙酰GM3和/或N-羟乙酰GM3的恶性肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含根据权利要求1或2的抗体或者根据权利要求3的片段中的任一种，以及药学上稳定的载体。
5.根据权利要求1或2的抗体或者根据权利要求3的片段中的任一种在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在有此需要的受试者中治疗表达神经节苷脂N-乙酰GM3和/或N-羟乙酰GM3的恶性肿瘤。
6.根据权利要求5的用途，其中所述受试者为人。
7.用于诊断表达神经节苷脂N-乙酰GM3和/或N-羟乙酰GM3的疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含根据权利要求1或2的抗体或者根据权利要求3的片段中的任一种。
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