CN101240021A - 抗人cdk5rap2蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体及其应用，属于含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备。本发明中的CDK5RAP2免疫原为原核表达多肽，经免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞融合，用上述原核表达多肽进行筛选，获得阳性克隆，亚型鉴定及小鼠腹腔注射制备腹水，腹水抗体进行细胞和组织的免疫组化，观察CDK5RAP2蛋白的表达和定位检测。本发明的单克隆抗体与CDK5RAP2蛋白具有特异性结合能力，用于检测细胞内和组织内人CDK5RAP2蛋白的表达和定位，能够用作为人CDK5RAP2蛋白的免疫组化检测试剂。

Description

抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备，具体是一种抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体及其应用，用来检测人体组织特别是肿瘤组织细胞中CDK5RAP2的表达与定位。

背景技术

CDK5RAP2(CDK5 regulatory subunit associated protein 2，CDK5调节亚基相关蛋白2)是一种崭新的蛋白，它分布于胞浆中，并在中心体处聚集。CDK5RAP2基因发现于常染色体隐性遗传疾病—小头畸形中。RT-PCR，ELASA等方法发现CDK5RAP2在人体的各个组织中均有不同程度的表达，尤其在神经系统，骨骼肌，胎儿肝脏，肾脏，卵巢等表达水平很高。作为一种定位于中心体处的蛋白，CDK5RAP2的功能以及它的异常对中心体功能的影响是值得探索的。CDK5RAP2存在于细胞质中，但在细胞分裂间期富集于中心体，而在细胞分裂期则富集于染色体极。进一步的研究显示CDK5RAP2主要分布在PCM(中心粒周围物质)表面及中心粒的附器所在处。

中心体是细胞骨架重要的组成部分，作为细胞中首要的微管组织中心(MTOC)，中心体在细胞的生命活动中调节微管的数量、稳定性、极性和空间排列，对于维持细胞的形态和细胞中物质的运输有着重要的作用，在细胞分裂期中心体形成纺锤体极而引导染色体向两极而运动，并且对于细胞分裂末期两个子代细胞的胞膜分离有着不可缺少的作用。在肿瘤早期诊断的研究中发现中心体数量和质量的异常在众多的肿瘤中均有存在。中心体异常的表现包括：中心体数目和质量的异常、额外的中心粒、过量的中心体周围物质、中心体蛋白的异常磷酸化等^[5]。

近来学者们在实验中发现，使用siRNA敲除CDK5RAP2的表达后，γ微管蛋白在中心体周围的水平明显减少，甚至可以完全消失，与此同时微管的排列情况也出现紊乱，这表明在γ微管蛋白定位于中心体以及在中心体扮演微管组织中心角色的过程中需要CDK5RAP2。作为中心体功能蛋白成分的一分子，CDK5RAP2与肿瘤之间关系的研究是值得拓展的。

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。单克隆抗体是研究蛋白质表达和分布的主要工具之一，针对CDK5RAP2的单克隆抗体可以检测细胞和组织(尤其是肿瘤组织)中CDK5RAP2的表达水平和定位情况，有助于深入研究CDK5RAP2的细胞学功能及在肿瘤中的生物学作用。

发明内容

本发明是为了解决CDK5RAP2在细胞生物功能中的作用，以及CDK5RAP2与肿瘤之间的关系，应用于基础医学研究和临床检测问题，而提供一种抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体及其应用。

本发明是按以下技术方案实现的。

一种抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体，该抗体能特异性识别人CDK5RAP2蛋白1-70位点氨基酸，氨基酸序列如图8所示；杂交瘤保藏号为：CGMCC2293。

所述的抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体在制备免疫组化检测试剂中的应用，用来检测人体组织特别是肿瘤组织细胞中CDK5RAP2的表达与定位。

所述的CDK5RAP2免疫原为原核表达多肽，涵盖该分子1-70氨基酸，其氨基酸序列为：

MMDLVLEEDVTVPGTLSGCSGLVPSVPDDLDGINPNAGLGNGLLPNVSEETVSPTRARNMKDFENQITEL。

以此原核表达多肽免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞融合，用上述原核表达多肽进行筛选，获得阳性克隆，亚型鉴定及小鼠腹腔注射制备腹水，腹水抗体进行细胞和组织的免疫组化，观察CDK5RAP2蛋白的表达和定位检测。

这样设计的本发明，其抗体与CDK5RAP2蛋白具有特异性结合能力，能够用作人CDK5RAP2蛋白的免疫组化检测试剂。用来检测人体组织特别是肿瘤组织细胞中CDK5RAP2的表达与定位。

杂交瘤由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；

保藏号为：CGMCC2293，保藏日期：2007年12月14日。

附图说明

图1显示Hela细胞的CDK5RAP2免疫荧光染色；

图2显示Hela细胞的pericentrin免疫荧光染色；

图3显示敲除CDK5RAP2的Hela细胞的CDK5RAP2免疫荧光染色；

图4显示敲除CDK5RAP2的Hela细胞的pericentrin免疫荧光染色；

图5显示CDK5RAP2在乳腺癌细胞系MCF-7中的表达与定位；

图6显示CDK5RAP2在乳腺导管内癌中的表达与定位；

图7显示CDK5RAP2在正常乳腺(阴性对照)中的表达；

图8是CDK5RAP2氨基酸序列。

具体实施方式

一、CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体的制备

1.实验材料来源

BALB/c小鼠由天津肿瘤医院提供，MCF-7细胞、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)由天津肿瘤医院提供。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂、HAT、HT条件培养基成分购自Invitrigen公司。DMEM培养基、聚乙二醇(PEG)、RPMI 1640培养基购自Hyclone公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠Ig、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)、8-氮鸟嘌呤(8-AG)购自Sigma公司。

2.动物免疫

取7～10周龄BALB/c雌性小鼠4只，将100ug CDK5RAP2多肽(香港科技大学齐众教授提供)溶于0.2ml 0.1M PBS(pH7.2)，与等体积弗氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，腹部皮下多点注射。第1次免疫后第15和29天，分别用100ug多肽/0.2ml PBS与等体积弗氏不完全佐剂(Sigma)充分混匀后加强免疫，融合前3d由尾静脉强化免疫注射50ug多肽/0.2mlPBS 1次。

3.细胞融合

取经加强免疫的BALB/c小鼠1只，放血处死后，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液。取2×10⁷个骨髓瘤细胞(SP2/0)，于37℃水浴中加50％PEG(MW 4000)1ml融合，将融合细胞接种于96孔培养板内，分别采用HAT和HT培养基进行选择性培养。待杂交瘤细胞长至培养孔底面1/3时，用CDK5RAP2多肽作包被抗原，以ELISA法筛选抗体，选择抗体分泌阳性孔，采用有限稀释法，将杂交瘤细胞稀释为5-10个/ml，接种于96孔培养板内，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100％。

4.阳性杂交瘤腹水单克隆抗体的制备

BALB/c小鼠腹腔注射Pristane0.5ml/只，1周后腹腔注射生长良好的杂交瘤细胞10⁷，10d左右，小鼠腹部胀大至其活力极差时，处死小鼠，抽取其腹水，离心去沉淀，收集上清测定效价。

5.间接ELISA法检测抗体效价

以CDK5RAP2蛋白包被酶标板，设空白对照组，37℃包被过夜。用0.25％BSA 37℃封闭1h。加入腹水抗体，以封闭液作系列梯度稀释，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠Ig，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。OPD底物显色系统显色5-10min，测定OD492值。

6.抗体亚型鉴定

以羊抗鼠Ig包被酶标板，，37℃包被过夜。用0.25％BSA 37℃封闭1h。加入杂交瘤培养上清，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。分别加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。OPD底物显色系统显色5-10min，测定OD492值。

7.结果

细胞融合后，以重组CDK5RAP2多肽为检测抗原，间接ELISA筛选获得一株单抗，亚型鉴定为IgGl，小鼠腹水效价为1∶5000。

二、CDK5RAP2单抗的特异性检测

1.实验方法

将Hela细胞及CDK5RAP2稳定敲除的Hela细胞(香港科技大学齐众教授惠赠)胰酶消化，取适量细胞点于载玻片上，37℃培养8小时后，冷甲醇固定，2％BSA封闭1h，加CDK5RAP2单抗、中心粒周蛋白(pericentrin)抗体孵育37℃2h，PBS洗涤后加不同荧光素标记的二抗室温闭光孵育1h，荧光显微镜下观察。见附图1-4。

2.结果判定

Pericentrin作为中心体标志在两组细胞中均有染色，而敲除CDK5RAP2的Hela细胞没有CDK5RAP2单抗的荧光显色，对照Hela细胞则在中心体处有明显的聚集荧光，说明该抗体对于CDK5RAP2蛋白具有明显的特异性。

三、CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体在制备免疫组化检测试剂中的应用：

1.细胞及乳腺癌切片制备

载玻片泡酸，清洗，干烤消毒，备用。取MCF-7细胞加入少量培养基，混匀，从中吸出100ul点于载玻片上，置于无菌的平皿中37℃，培养8小时后，各片补充100ul培养基，过夜。将载玻片从平皿中取出，浸泡于0.9％NaCl中，洗净血清。置于冷丙酮中固定20分钟，-20℃保存。

乳腺癌切片取自天津肿瘤医院乳腺病理室，常规脱蜡。

2.免疫组化步骤

将载玻片取出置于500ml甲醇+15ml 3％H2O2溶液中，浸泡15分钟，去除内源性过氧化物酶。浸入柠檬酸缓冲液(PH＝6.0)中，微波炉抗原修复12分钟。每片点1滴正常羊血清，37℃温浴20分钟。应用CDK5RAP2单抗1∶5000稀释，4℃过夜。PBS漂洗3遍，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育15分钟，DAB显色，常规复染与封片。

3.结果判定

MCF-7细胞染色表明CDK5RAP2蛋白着色清晰，位于胞浆。见附图5。

乳腺导管原位癌染色显示，在阳性细胞胞浆内呈均匀着色的棕/黄色颗粒，阳性细胞密集或(和)散在分布，部分阳性样本中存在有部分细胞核着色，纤维间质细胞，淋巴细胞等不着色，背景清晰。正常乳腺很少着色。见附图6、7。

SEQUENCE LISTING

<110>天津医科大学附属肿瘤医院

<120>抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体及其应用

<130>蛋白质

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>70

<212>PRT

<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221>Protein

<222>(1)..(70)

<223>

<400>1

Met Met Asp Leu Val Leu Glu Glu Asp Val Thr Val Pro Gly Thr Leu

1               5                   10                  15

Ser Gly Cys Ser Gly Leu Val Pro Ser Val Pro Asp Asp Leu Asp Gly

            20                  25                  30

Ile Asn Pro Asn Ala Gly Leu Gly Asn Gly Leu Leu Pro Asn Val Ser

        35                  40                  45

Glu Glu Thr Val Ser Pro Thr Arg Ala Arg Asn Met Lys Asp Phe Glu

    50                  55                  60

Asn Gln Ile Thr Glu Leu

65              70

Claims (2)

1.一种抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体，其特征是：该抗体能特异性识别人CDK5RAP2蛋白1-70位点氨基酸，氨基酸序列如图8所示；杂交瘤保藏号为：CGMCC2293。

2.权利要求1所述的抗人CDK5RAP2蛋白的单克隆抗体在制备免疫组化检测试剂中的应用，用来检测人体组织特别是肿瘤组织细胞中CDK5RAP2的表达与定位。

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