CN106955361B - 一种含有结核病变态反应原ce的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有结核病变态反应原CE的药物组合物及其制备方法和用途。所述组合物包括结核病变态反应原CE、结构保护剂、表面活性剂、缓冲剂等。本发明的组合物对结核病的检测灵敏度高，具有良好的物理和化学稳定性，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种含有结核病变态反应原CE的药物组合物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有结核病变态反应原CE的药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，是当前急需解决的重要公共健康难题之一。我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2010年第五次全国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，现有肺结核病人500－600万，其中传染性肺结核病人86万；全国肺结核发病人数和死亡人数位于各种法定传染病的首位。结核病是通过呼吸道传播的传染性很强的疾病，我国约有三分之一人口感染了结核菌，其中5％可能早期发病，5％在其一生中的任何时候可能发病。因此，结核高危人群的主动发现、动态监测和预防治疗可有效减少肺结核的发病率，结核病的早期诊断、发现传染源、有效化疗对于控制结核病及结核菌传播都有极其重要的意义。

目前临床上常规应用的结核病诊断方法中，用于检测排菌肺结核患者的临床标本涂片的灵敏度低，阳性率只有20-30％；传统的罗氏培养的阳性率也只有30％左右，而且需4-8周时间；国际认可的分枝杆菌快速培养系统一般也需2周以上，而且试剂昂贵，检测成本高而难以普及。用于检测结核感染者、辅助菌阴肺结核病患者的诊断的结核菌素皮肤试验方法的灵敏度低、特异性差，不能鉴别卡介苗接种者；血清结核抗体检测的灵敏度和特异性不理想；近两年开发的γ干扰素释放试验试剂昂贵，技术复杂，不适合于基层或现场应用。显然目前临床上常规应用的诊断方法不能满足临床医疗的需求，尤其是基层医疗单位可用的检测方法极少。

结核菌素是结核分枝杆菌培养滤液蛋白，其作用于人体会激发已致敏机体产生细胞免疫反应，激活T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，释放大量细胞因子，并使这些细胞增殖、聚集，包裹抗原形成结节，这就是迟发型变态反应，其反应强度与细胞免疫呈平行关系。结核菌素皮肤试验已成为目前临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法，反应越强，表示结核感染可能性越大，我国一直使用硬结≥5mm为阳性，≥20mm或有水泡、坏死、淋巴结炎等为强阳性，3岁以下儿童≥15mm为强阳性的标准。用于结核病皮肤试验的主要试剂有以下几种：(1)旧结核菌素：不易标准化和易发生非特异性反应，目前已经很少使用。(2)人型PPD：结核分枝杆菌强毒株培养滤液的纯蛋白衍化物(PPD)，由于生产菌株具有很强的传染性，国家要求该PPD的制备需在副压车间进行，因此，北京密云的生产厂家已停产很多年，目前国内没有厂家生产结核分枝杆菌PPD。(3)卡介菌PPD：是卡介苗菌株的培养滤液纯蛋白衍化物，主要用于检测卡介苗接种是否成功。但人型PPD停产后，临床上用卡介菌PPD暂时替代人型PPD进行皮肤试验，但两者PPD成份并不完全一样，因此，卡介菌PPD皮肤试验辅助结核病诊断的价值尚需进一步研究。而目前国内只有成都生物制品所生产，供不应求。(4)结核分枝杆菌重组38KD蛋白：是由解放军第三零九医院结核病研究所研发的皮试抗原，已获得新药证书，转让给广东东莞的公司，目前正在建厂投产，尚未用于临床。该产品有以下特点：(1)它刺激产生的皮肤反应较轻，一般不会产生水泡和淋巴管炎等副作用；(2)它的制备无传染性，生产不需要P3条件；(3)该蛋白存在于结核分枝杆菌复合群中，结核感染者反应强，卡介苗接种者反应弱，因此，它不能完全鉴别结核感染者和卡介苗接种者。

由于PPD中含有许多分枝杆菌(包括致病性分枝杆菌、环境中非致病性分枝杆菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌复合群感染，还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。因此，PPD皮试诊断结核病的特异性差，用该方法进行结核病流行病学抽样调查获得的结核菌感染率是不准确的，并不能真正反映人群中结核菌感染的实际状况。目前国内外学者通过动物模型或临床试验研究纯化抗原、合成多肽和重组蛋白，筛选致病性结核分枝杆菌表达而卡介菌不表达的、诱导皮肤迟发型变态反应的特异抗原，以期建立新的结核皮肤诊断试剂。

因此，如何开发一种价格便宜，应用简便，无需特殊仪器，适合于基层医疗单位广泛应用于结核高危人群的筛查，菌阴肺结核和肺外结核的辅助诊断及流行病学的调查的新的结核特异的皮肤诊断试剂是亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种含有结核病变态反应原CE的药物组合物，该组合物在较长的时间内和剧烈破坏条件下仍能维持药物组合物的物理和化学稳定性，并且具有非常适合于皮下施用的pH、粘度和渗透压。

本发明提供了一种含有结核病变态反应原CE的药物组合物，其中包括：

a.结核病变态反应原CE；

b.至少一种结构保护剂；

c.至少一种表面活性剂；

d.至少一种缓冲剂；

pH为4.0-8.0。

在一个优选的实施方案中，本发明所述药物组合物包括：

a.1μg/ml-10mg/ml的结核病变态反应原CE；

b.1mg/ml-500mg/ml的结构保护剂；

c.0.01mg/ml-5mg/ml的表面活性剂；

d.1mM-100mM的缓冲液；

pH为4.0-8.0。

在一个优选的实施方案中，本发明所述结核病变态反应原CE是选自a)或b)的蛋白：

a.SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b.将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

本发明所述的结构保护剂选自糖类、多元醇、氨基酸或聚乙二醇类(PEG)。其中所述糖类选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、甘露糖、麦芽糖、山梨糖、葡聚糖、糊精、环糊精、羟乙基淀粉或其任意混合物；多元醇选自甘露醇、甘油、山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、丙二醇或其任意混合物；氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其相应的盐类或其任意混合物；聚乙二醇类选自PEG3000、PEG3500、PEG4000或PEG6000。

本发明所述的表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯21、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯61、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81、聚山梨酯85或其任意混合物，以及泊洛沙姆、triton、十二烷基硫酸钠、月桂硫酸钠、辛基糖苷钠、月桂基-磺基甜菜碱、聚乙二醇、聚丙二醇或其任意混合物。

本发明所述的缓冲液选自乙酸/乙酸盐、琥珀酸/琥珀酸盐、葡萄酸/葡萄酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、酒石酸/酒石酸盐、顺丁烯二酸/顺丁烯二酸盐、乳酸/乳酸盐、碳酸/碳酸氢盐、苯甲酸/苯甲酸盐、咪唑、磷酸/磷酸盐、tris/tris盐酸盐，以及丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其相应的盐类或混合物；或其任意混合物。

本发明所述的药物组合物可以进一步含有抗氧化剂，其中所述的抗氧化剂优选抗坏血酸、色氨酸、蛋氨酸、谷胱甘肽、硫代硫酸钠、过氧化氢酶及螯合剂等；其中螯合剂选自由氨基多羧酸，羟基氨基羧酸、N-取代甘氨酸、柠檬酸、烟酰胺、 去铁胺和去氧胆酸盐及其混合物，优选乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)及它们的盐。本发明中使用的螯合剂可以化合物的游离酸或者游离碱或者盐的形式存在，也可以化合物或者相应盐的无水、水合或者其他溶剂化物的形式存在。

本发明所述的药物组合物可以进一步含有等渗调节剂，其中所述的等渗调节剂优选氯化钠、氯化钾、糖类、多元醇、氨基酸；其中糖类选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、乳糖、甘露糖、麦芽糖、山梨糖、葡聚糖、糊精、环糊精、羟乙基淀粉或其任意混合物；多元醇选自甘露醇、甘油、山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇、丙二醇或者其任意混合物；氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其相应的盐类或其任意混合物。

本发明的药物组合物可以进一步含有防腐剂，所述防腐剂优选间甲酚、苯酚、苯甲醇、苯扎氯铵、苯氧乙醇和对羟基苯甲酸甲酯的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，本发明所述药物组合物包括：

a.5μg/ml-1mg/ml的结核病变态反应原CE，

b.20mg/ml-200mg/ml的二糖或多元醇或其混合物，

c.0.05mg/ml-1mg/ml的聚山梨酯20，

d.5mM-40mM柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液，

pH为6.0-6.6。

在一个优选的实施方案中，本发明所述药物组合物包括：

a.10μg/ml-200μg/ml的结核病变态反应原CE，

b.20mg/ml-100mg/ml的海藻糖或蔗糖或甘露醇或其任意混合物

c.0.1mg/ml-1mg/ml的聚山梨酯20，

d.5mM-40mM柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液，

pH为6.3。

本发明选择两种只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌)中，而不存在于所有卡介苗菌株及绝大部分环境分枝杆菌基因组中的CFP10抗原和ESAT6抗原，经基因工程方法构建融合表达载体pET-30a-CFP10-ESAT6，并在大肠杆菌工程菌中高效表达(表达产物简称重组融合蛋白CE)，表达产物经破碎超滤浓缩，经离子交换DEAE-FF，AB-FF，和Q-HP纯化后，得到SEC-HPLC单体纯度>99％、RP-HPLC纯度>95％的结核病变态反应原CE。由于选择的CFP10和ESAT6抗原是中国人群的优势抗原融合表达，含有较多的T细胞抗原决定簇，有较强的免疫原性， 能特异地诱导不同结核感染人群产生较强的迟发型变态反应，而使检测的灵敏度提高，可鉴别结核感染者和卡介苗接种者，这对于广泛接种卡介苗的国家是非常有益的。

本发明所述的结核病变态反应原CE的编码基因和氨基酸序列如下：

编码基因：

5’-CATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAG-3’(SEQ ID No.1)

氨基酸序列：

MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFGGGGSGGGMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQ ID No.2)

本发明的药物组合物可以为水针制剂、冻干制剂或者由冻干粉末和注射用水通过双腔卡氏瓶(dual-chamber cartridge)配制得到的制剂形式。所得药物组合物的制剂优选通过皮下注射(s.c.)、皮内注射(i.d.)、静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)或其它非肠胃(parenteral)形式给药实施。

本发明的药物组合物可用于制备诊断结核病的药物制剂，尤其适用于鉴别结核感染者和卡介苗接种者。

本发明还提供了所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

a.将处方量的结构保护剂、表面活性剂、缓冲盐溶解于适量的注射用水中， 搅拌溶解，使用酸/碱调节至pH为4.0-8.0，优选pH为6.0-6.6，更优选6.3；所述的酸优选盐酸，所述的碱优选氢氧化钠；

b.将处方量的结核病变态反应原CE加入至a步骤所得的缓冲液中，搅拌均匀；

c.将b步骤所得溶液过滤除菌，分装，加塞，轧盖得到液体制剂；或者将b步骤所得溶液过滤除菌，分装，半加塞，冷冻干燥，再加塞，轧盖得到冻干粉针制剂。

本发明的有益效果为：将所得高灵敏度、高度表达的结核病变态反应原CE制成药物组合物，通过加入结构保护剂及其他辅料，改善了生物药物的微环境，大大提高了药物组合物的在高温、及长期储存时的稳定性，因此具有非常广阔的市场应用前景。

附图说明

图1为C基因第二轮PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2为E基因第二轮PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图3为CE基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图4为pET-30a(+)载体质粒及含有CE基因的片段的酶切产物及回收产物琼脂糖凝胶电泳图。

图5为pET-30a(+)载体质粒及重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图。

图6为重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。

图7为重组质粒CE/pET-30a测序结果。

图8为CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后的SDS-PAGE结果。

图9为CE/pET-30a大肠杆菌工程菌表达形式鉴定的SDS-PAGE结果。

图10为CE/pET-30a大肠杆菌工程菌发酵诱导时间与表达量关系的SDS-PAGE结果。

图11为重组融合蛋白CE纯化过程中DEAE sepharose Fast Flow柱纯化洗脱液主峰的RP-HPLC分析结果。

图12为重组融合蛋白CE纯化过程中Aminobutyl Sepharose 6 Fast Flow柱纯化洗脱液主峰的RP-HPLC分析结果。

图13为重组融合蛋白CE纯化过程中Q Sepharose High Performance柱纯化洗脱液主峰的RP-HPLC分析结果。

图14为不同pH条件下制剂溶液的Tm。

图15为高温试验中不同pH处方样品的单体相对含量。

图16为冻干试验中不同处方样品的单体相对含量。

图17为冻干试验中不同处方样品的主峰纯度。

图18为高温试验中不同处方水针样品的单体相对含量。

图19为高温试验中不同处方粉针样品的单体相对含量。

图20为高温试验中不同处方水针样品的主峰纯度。

图21为高温试验中不同处方粉针样品的主峰纯度。

图22为复溶后不同处方样品的单体相对含量。

图23为复溶后不同处方样品的主峰纯度(RP-HPLC)。

图24为高温试验中不同处方样品的单体相对含量。

图25为高温试验中不同处方样品的主峰纯度。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进一步进行说明。必须指出，这些实施例是用于说明本发明，而不应理解为对本发明的限制。

处方工艺研究概述

我们从制剂pH、表面活性剂、缓冲液、结构保护剂等几个重要方面来研究处方组成，并进行处方及剂型的筛选和优化，确定最终的制剂处方和剂型。选用2ml中性硼硅玻璃管制注射剂瓶(肖特玻璃科技(苏州)有限公司)和13mm注射用冷冻干燥无菌粉末用溴化丁基橡胶塞(West Phamaceutical Services Singapore Pte.Ltd.)作为内包装材料。

我们选择pH范围2.6～8.0、不同结构保护剂(甘露醇、蔗糖、海藻糖、盐酸精氨酸、甘氨酸)及表面活性剂聚山梨酯20，进行本品的处方研究并最终确认用于临床前研究和拟临床研究的处方。分别配置好含有各种辅料的缓冲液，使用较高蛋白浓度的原液直接稀释得到各种制剂。

分别使用微热差示扫描量热技术(μCal differential scanning calorimetry，DSC)测量热稳定性、分子排阻液相色谱法(SEC-HPLC)和反相液相色谱法(RP-HPLC)来监控其物理和化学稳定性。

实施例1、重组融合蛋白CE的编码基因的克隆及重组融合蛋白CE的表达和纯化

一、两个蛋白抗原表位融合的设计

分析结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序，根据大肠杆菌的密码子使用频率，选择其中高频率的密码子即最佳密码子或偏爱密码子，去除一些稀有或利用率低的密码子，通过同义密码子替换原有密码子进行优化，以便所设计的基因在大肠杆菌中高水平地表达，提高蛋白产量，使蛋白生产更有效和经济。

设计得到SEQ ID No.1所示的序列。SEQ ID No.1中第1-6位为限制性核酸内切酶Nde I酶切识别位点5’-CATATG-3’(包括起始密码子5’-ATG-3’)，第4-303位为CFP10蛋白抗原表位的编码基因(以下简称为C基因)序列，第304-327位为连接臂的编码基因序列5’-GGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGT-3’，第328-612位为优化后的ESAT6蛋白抗原表位的编码基因(以下简称为E基因)序列，第613-615位为终止密码子5’-TAA-3’，第617-622位为限制性核酸内切酶Xho I酶切识别位点5’-CTCGAG-3’。

根据SEQ ID No.1得到CFP10和ESAT6蛋白抗原表位依次连接形成的重组融合蛋白CE，CFP10蛋白的抗原表位位于重组融合蛋白CE的氨基端，ESAT6蛋白的抗原表位位于重组融合蛋白CE的羧基端。重组融合蛋白CE的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2中第1-100位为CFP10蛋白抗原表位序列，第101-108位为连接臂，第109-203位为ESAT6蛋白抗原表位序列。

重组融合蛋白CE的编码基因(以下简称为CE基因)序列如SEQ ID No.1中第4-612位所示。

5’-CATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAG-3’(SEQ ID No.1)

MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAG TAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF GGGGSGGGMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQ ID No.2)

二、通过基因工程技术克隆重组融合蛋白CE的编码基因

1、根据重组融合蛋白CE的编码基因序列，设计并合成表1所示的引物，用于扩增CE基因。

表1用于扩增CE基因的引物

2、含有C基因的片段KC的全基因合成PCR

(1)以表1中的C101F、C101R、C102F、C102R、C103F、C103R、C104F、C104R、C105F、C10BAMH这10条引物互相作为引物和模板，进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。

具体原理如下：

引物C101F和C101R互相作为引物和模板扩增出片段1：5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGT AACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATC-3’；

引物C102F和C102R互相作为引物和模板扩增出片段2：5’-GTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTAC-3’；

引物C103F和C103R互相作为引物和模板扩增出片段3：5’-GCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACA-3’；

引物C104F和C104R互相作为引物和模板扩增出片段4：5’-CTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGC-3’；

引物C105F和C10BAMH互相作为引物和模板扩增出片段5：5’-GCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCCTAATAAACTCGAGCGG-3’；

以片段1和片段2为模板，以C101F和C102R为引物，扩增出片段1+2：5’-CAATTCCAT ATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTAC-3’；

以片段1+2和扩增片段3为模板，以C101F和C103R为引物，扩增出片段1+2+3：

5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACA-3’；

以扩增片段1+2+3和扩增片段4为模板，以C101F和C104R为引物，扩增出片段1+2+3+4：

5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGC-3’；

以扩增片段1+2+3+4和扩增片段5为模板，以C101F和C10BAMH为引物，扩增出片段1+2+3+4+5(该片段含有C基因和部分连接臂)：

5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATC-3’。

第一轮PCR的反应体系：10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物C101F 5μl、引物C101R 0.5μl、引物C102F 0.5μl、引物C102R 0.5μl、引物C103F 0.5μl、引物C103R 0.5μl、引物C104F 0.5μl、引物C104R 0.5μl、引物C105F 0.5μl、引物C10BAMH 5μl、PyrobestTMDNA聚合酶1μl、无菌水26μl，总计50μl。

第一轮PCR的反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；16℃降温2min。

(2)以1μl第一轮PCR扩增产物作为模板，用表1中的C10FF和C10BAMRR为引物，进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(即，含有C基因的片段KC),序列如下：

5’-CCAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCCTAATAAACTCGAGCGG-3’。

第二轮PCR的反应体系：第一轮PCR扩增产物1μl、10×PCR缓冲液

5μl、dNTPs 4μl、引物C10FF 5μl、引物C10BAMRR 5μl、DNA聚合酶

1μl、无菌水29μl，总计50μl。

(3)电泳回收目的片段

将步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。

图1中，1：DNA分子量标准(由上至下条带大小依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp)；2：步骤(2)得到的第二轮PCR扩 增产物；箭头所指为含有C基因的片段KC。

在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收的含有C基因的片段KC的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收该片段并进行测序，测序结果正确，定量后，将其贮存于-20℃备用。

3、含有E基因的片段KE的全基因合成PCR

(1)以表1中的E6BGLF、E61F、E61R、E62F、E62R、E63F、E63R、E64F、E64R、E65F、E65R这11条引物互相作为引物和模板，进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。

具体原理如下：

引物E61F和E61R互相作为引物和模板扩增出片段6：

5’-AATTCCATATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTC-3’；

引物E62F和E62R互相作为引物和模板扩增出片段7：

5’-TATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGG-3’；

引物E63F和E63R互相作为引物和模板扩增出片段8：

5’-CTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCAC-3’；

引物E64F和E64R互相作为引物和模板扩增出片段9：

5’-AACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACT-3’；

引物E65F和E65R互相作为引物和模板扩增出片段10：

5’-TCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’；

以扩增片段6为模板，以E6BGLF和E61R为引物，扩增出片段11：

5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTC-3’；

以扩增片段11和扩增片段7为模板，以E6BGLF和E62R为引物，扩增出片段11+7：

5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGG-3’；

以扩增片段11+7和扩增片段8为模板，以E6BGLF和E63R为引物，扩增出片段11+7+8：

5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCAC-3’；

以扩增片段11+7+8和扩增片段9为模板，以E6BGLF和E64R为引物，扩增出片段11+7+8+9：

5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACT-3’；

以扩增片段11+7+8+9和扩增片段10为模板，以E6BGLF和E65R为引物，扩增出片段11+7+8+9+10(该片段含有E基因)：

5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’。

第一轮PCR的反应体系：10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物E6BGLF 5μl、引物E61F 0.5μl、引物E61R 0.5μl、引物E62F 0.5μl、引物E62R 0.5μl、引物E63F 0.5μl、引物E63R 0.5μl、引物E64F 0.5μl、引物E64R 0.5μl、引物E65F 0.5μl、引物E65R 5μl、DNA聚合酶1μl、无菌水26μl，总计50μl。

第一轮PCR的反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；16℃降温2min。

(2)以1μl第一轮PCR扩增产物作为模板，用表1中的E6BGLFF和E65R为引物，进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(即，含有E基因的片段KE)，序列如下：

5’-GCAATTCCATATGAGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’。

第二轮PCR的反应体系：第一轮PCR扩增产物1μl、10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物E6BGLFF 5μl、引物E65R 5μl、DNA聚合酶1μl、无菌水29μl，总计50μl。

(3)电泳回收目的片段：

将步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。

图2中，1：DNA分子量标准(由上至下条带大小依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp)；2：步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物；箭头所指为含有E基因的片段KE。

在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收的含有E基因的片段KE的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收该片段并进行测序，测序结果正确，定量后，将其贮存于-20℃备用。

4、含有C基因的片段KC与含有E基因的片段KE的连接

(1)用BamH I酶切步骤2得到的含有C基因的片段KC，得到酶切产物1。酶切体系如下：含有C基因的片段KC 15μl、10×K缓冲液3μl、BamH I 1μl、无菌水11μl，总计30μl。

(2)用BglII酶切步骤3得到的含有E基因的片段KE，得到酶切产物2。酶切体系如下：含有E基因的片段KE 15μl、10×H缓冲液3μl、Bgl II 1μl、无菌水11μl，总计30μl。

(3)将酶切产物1和酶切产物2用T4DNA连接酶连接，获得连接产物。 连接体系如下：酶切产物1 10μl、酶切产物2 10μl、10×连接缓冲液3μl、T4 DNA连接酶1μl、无菌水6μl，总计30μl。

(4)用步骤(3)得到的连接产物作为模板，用表1中的C101F和E65R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(含有CE基因的片段KCE)。PCR的反应体系：连接产物1μl、10×PCR缓冲液5μl、dNTPs 4μl、引物C101F 1μl、引物E65R 1μl、DNA聚合酶1μl、无菌水37μl，总计50μl。

含有CE基因的片段KCE序列如下：

5’-CAATTCCATATGGCAGAGATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGATCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGCAGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCAGGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGTTACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGTTCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGGCTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCGAGCGG-3’(SEQ ID No.3)

该片段也可直接人工合成。

(5)电泳回收目的片段

将步骤(4)得到的PCR扩增产物(含有CE基因的片段KCE)进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。

图3中，1：步骤(4)得到的PCR扩增产物(含有CE基因的片段KCE)；2：DNA分子量标准(由上至下条带大小依次为10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、250bp)。

在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收的含有CE基因的片段KCE的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收该片段并进行测序，测序结果正确，定量后，贮存于-20℃备用。

5、表达载体的构建

将步骤4获得的含有CE基因的片段KCE克隆至pET-30a(+)(invitrogen 公司产品)载体中，再将其转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(大连TaKaRa公司产品)，经筛选获得表达重组融合蛋白CE的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌。

具体步骤如下：

(1)酶切

将步骤4获得的含有CE基因的片段KCE和pET-30a(+)表达载体分别用Nde I和XhoI进行双酶切。

两个酶切体系分别如下：

酶切体系1：含有CE基因的片段KCE 3μl、10×H缓冲液8μl、Nde I2μl、Xho I 2μl、无菌水65μl，总计80μl。

酶切体系2：pET-30a(+)3μl、10×H缓冲液8μl、Nde I 2μl、Xho I 2μl、无菌水65μl，总计80μl。

将两个酶切体系置于37℃孵育3h，分别得到含有CE基因的片段KCE的酶切产物和pET-30a(+)质粒的酶切产物。

(2)电泳回收目的片段

将步骤(1)得到的pET-30a(+)质粒的酶切产物和含有CE基因的片段KCE的酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书分别回收得到615bp的含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段和5234bp的pET-30a(+)质粒的酶切回收片段。

将pET-30a(+)质粒、pET-30a(+)质粒的酶切产物、pET-30a(+)质粒的酶切回收片段、含有CE基因的片段KCE、含有CE基因的片段KCE的酶切产物、含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。

图4中，1：DNA分子量标准；2：pET-30a(+)质粒；3：pET-30a(+)质粒的酶切产物；4：pET-30a(+)质粒的酶切回收片段；5：含有CE基因的片段KCE；6：含有CE基因的片段KCE的酶切产物；7：含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段。

图4表明，pET-30a(+)及含有CE基因的片段KCE的酶切产物均得到回收，且纯度较好。

(3)基因片段连接

将步骤(2)回收纯化的含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段与pET-30a(+)质粒的酶切回收片段定量后，按1:1的摩尔比混合，进行如下连接反应， 得到连接产物。

连接反应体系(10μl)：2×连接缓冲液5μl、A/pET-30a(+)质粒的酶切回收片段1μl、B/含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段1μl、T₄DNA连接酶1μl、无菌水补至10μl。混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

(4)连接产物的转化

次日取步骤(3)得到的连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育过夜至单菌落生长。

(5)质粒的提取

根据蓝白斑筛选，随机挑取2个白色单菌落，分别命名为pET-30a-CE-1菌落和pET-30a-CE-2菌落，并分别接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养过夜。根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒，分别得到重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2。将重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图5所示。

图5中，1：DNA分子量标准；2：载体质粒pET-30a(+)；3：重组质粒pET-30a-CE-1；4：重组质粒pET-30a-CE-2。

图5表明，重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2的大小均与预期相符。将重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2进一步测序，测序结果表明重组质粒的大小均为5857bp。

(6)重组质粒的鉴定

①酶切鉴定

分别以重组质粒pET-30a-CE-1和pET-30a-CE-2为模板，用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定。将酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，结果如图6所示。

图6中，M：DL2000 DNA Marker；1：含有CE基因的片段KCE的Nde I+Xho I双酶切产物；2：重组质粒pET-30a-CE-1的Nde I+Xho I双酶切产物；3：重组质粒pET-30a-CE-2的NdeI+Xho I双酶切产物。

图6表明，重组质粒的酶切片段大小与预期相符(含有CE基因的片段大小为615bp)，为阳性重组质粒。将该种质粒命名为CE/pET-30a，其来源的菌命名为CE/pET-30a大肠杆菌工程菌。

②序列测定

挑选一个CE/pET-30a大肠杆菌工程菌克隆送上海生工生物技术有限公司进行T7通用引物正向测序，测序图谱如图7所示。

测序结果如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.4中，第54-59位为限制性核酸内切酶Nde I酶切识别位点5’-CATATG-3’(包括起始密码子5’-ATG-3’)，第57-356位为CFP10蛋白抗原表位的编码基因(C基因)序列，第357-380位为连接臂的编码基因序列5’-GGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGT-3’，第381-665位为优化后的ESAT6蛋白抗原表位的编码基因(E基因)序列，第666-668位为终止密码子5’-TAA-3’，第670-675位为限制性核酸内切酶XhoI酶切识别位点5’-CTCGAG-3’。结果表明，CE/pET-30a质粒中的CE基因序列(即SEQ ID No.4中第57-665位)与设计的序列(SEQ ID No.1中第4-612位)完全一致。

5’-GGGCGGAACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAGAG ATGAAGACTGATGCAGCTACTCTGGCACAAGAAGCAGGTAACTTCGAACGTATCTCTGGTGACCTGAAAACCCAGA TCGATCAGGTTGAATCTACTGCAGGTTCTCTGCAGGGTCAATGGCGTGGTGCTGCAGGTACTGCTGCACAAGCTGC AGTTGTACGTTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTGGATGAAATCTCTACTAACATTCGTCAGGCA GGTGTTCAATACTCTCGTGCTGATGAAGAGCAACAGCAAGCACTGAGCTCTCAAATGGGTTTCGGTGGTGGCGGAT CTGGTGGCGGTATGACCGAACAGCAGTGGAACTTCGCAGGTATCGAAGCTGCAGCTTCTGCTATTCAGGGTAACGT TACCTCTATCCACTCTCTGCTGGATGAAGGTAAACAGTCTCTGACCAAACTGGCAGCTGCATGGGGTGGTTCTGGT TCTGAAGCTTACCAGGGTGTTCAGCAGAAATGGGATGCTACCGCAACCGAACTGAACAACGCACTGCAGAACCTGG CTCGTACCATCTCTGAAGCTGGTCAGGCTATGGCTTCTACCGAAGGTAACGTTACTGGTATGTTCGCTTAAACTCG AGCACCACCACCACCACCACTGAGATC-3’(SEQ ID No.4)

三、CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的诱导表达及鉴定

1、将CE/pET-30a大肠杆菌工程菌接种于6ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃、200rpm恒温振荡器培养8h后，按体积百分含量1％转种到50ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃、200rpm恒温振荡器培养至OD₆₀₀为0.6－0.9时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，诱导1-4hr，得到菌液。

将1×载样缓冲液10μl加入来自40μl菌液的沉淀样本，混悬后，置100℃ 沸水浴5min，于10000rpm离心5min后，取上清液10μl进行SDS-PAGE(分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％)，电泳条件为：积层胶恒压80V，分离胶恒压120V，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h，用脱色液脱色至条带清晰。

CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后的SDS-PAGE结果如图8所示。

图8中，1：蛋白质分子量标准；2：CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导前；3：CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导1小时；4：CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导2小时；5：CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导3小时；6：CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导4小时；箭头所指为重组融合蛋白CE的条带。

图8表明，CE/pET-30a大肠杆菌工程菌菌体在相对分子质量21035Da位置附近有浓重的表达条带出现，IPTG诱导3-4小时表达量最多。

2、表达条件及表达形式鉴定

将CE/pET-30a大肠杆菌工程菌接种于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器过夜培养后，按体积百分含量1％转种到2瓶50ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至OD₆₀₀为0.6－0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，分别于37℃与15℃进行诱导4hr，分别得到CE/pET-30a大肠杆菌工程菌37℃诱导后的菌液和15℃诱导后的菌液。分别将菌液中的菌体超声破碎，离心后，得到CE/pET-30a大肠杆菌工程菌37℃诱导后的上清和沉淀以及CE/pET-30a大肠杆菌工程菌15℃诱导后的上清和沉淀，将各上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，部分结果如图9所示。

图9中，1：蛋白质分子量标准(TaKaRa-D530A:从上至下条带大小依次为97.2,66.4,44.3,29.0,20.1kDa)；2：CE/pET-30a大肠杆菌工程菌37℃诱导后的上清；3：CE/pET-30a大肠杆菌工程菌15℃诱导后的上清。

图9表明，CE/pET-30a大肠杆菌工程菌在37℃与15℃分泌表达的重组融合蛋白CE均存在于其菌液的上清中。

四、重组融合蛋白CE的高密度、高表达发酵

1、对CE/pET-30a大肠杆菌工程菌(重组菌)进行100L发酵罐的高密度发酵，在对数生长期进行IPTG诱导，诱导后4h放罐。

发酵过程如下:

(1)种子培养

以0.1％的接种量将甘油管中保存的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌接入装有 200mlLB培养基(含50μg/ml的卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，200r/min，37℃培养8-12h至OD₆₀₀达到3.0-6.0，得到种子液。

(2)发酵罐培养

①发酵培养基和补料培养基的配方如表2所示。

表2发酵培养基和补料培养基的配方

②将步骤(1)得到的种子液按照2％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，培养温度37℃、pH6.8、控制溶氧范围在30-80％，采用指数流加补料策略(以发酵培养的培养液的糖含量小于1g/L为标准调节补料补加速度)。OD₆₀₀达到25-35时开始诱导表达，诱导剂IPTG终浓度为0.5mM，诱导4h后终止发酵培养。采用100L发酵罐连续培养5批，结果如表3所示。

表3发酵过程参数记录

2、分别取步骤1中CE/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导后1h、2h、3h和4h的发酵液和诱导前的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的发酵液进行菌体超声破碎，离心分别取CE/pET-30a大肠杆菌工程菌诱导1h、2h、3h和4h的发酵液的上清和诱导前的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的发酵液的上清进行SDS-PAGE分析，结果如图10所示。

图10中，1：蛋白分子量标准；2：诱导前的CE/pET-30a大肠杆菌工程菌的发酵液的上清；3-6分别代表CE/pET-30a大肠杆菌工程菌诱导1h、2h、3h和4h的发酵液的上清；箭头所指为重组融合蛋白CE的条带。

结果表明，IPTG诱导4h时，重组融合蛋白CE的表达量达到最大，目的蛋白表达量大于4g/L。

五、重组融合蛋白CE的纯化及鉴定

1、菌体收集及破碎

采用管式离心机收集CE/pET-30a大肠杆菌工程菌菌体，然后将菌体按体积比1∶5比例重悬于20mM Tris缓冲液(pH8.0)中，以12000psi均质压力破碎菌体2次。

2、上清液收集

采用10000rpm离心20min收集破碎后上清液。

3、超滤浓缩Ⅰ

大肠杆菌菌体破碎后，释放出大量杂质且料液的体积较大，不利于层析处理，因此首先采用超滤方法进行初步分离和浓缩。

重组融合蛋白CE蛋白理论分子量为21,035Da，因此首先选用300KD超滤膜进行透析，以截留离心残留的微量固形物及部分高分子杂质，然后采用5KD超滤膜进行浓缩以去除小分子杂质，浓缩至3-5倍体积时用3-5倍置换液Ⅰ(20mM Tris，pH8.0)进行缓冲液置换。

4、DEAE sepharose Fast Flow柱纯化

采用缓冲液C1A相(20mM Tris，pH8.0)和C1B相(20mM Tris，0.3M NaCl，pH8.0)。用C1A相平衡阴离子交换柱DEAE sepharose Fast Flow柱(柱的内径为200mm)2.0-4.0个柱体积，收集平衡液；将步骤3得到的浓缩液上柱，收集穿出液；采用0-70％B线性梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱体积为10个柱体积，流速为30L/h，检测波长为280nm。对洗脱液的主峰进行RP-HPLC分析，RP-HPLC分析条件为：C4分析柱(型号Kromasil C4 300-5C4)，温度30℃，检测波长214nm，流速1mL/min。按表4进行梯度洗脱(其中流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液， 流动相B为0.08％三氟乙酸-乙腈溶液)，得到主峰蛋白。结果如图11所示。

表4洗脱程序

5、Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱纯化

采用缓冲液C2A相(20mM Tris，pH8.0)和C2B相(20mM Tris，0.3M NaCl，pH8.0)。用C2A相平衡离子交换柱Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱(柱的内径为100mm)2.0-4.0个柱体积，将步骤4得到的主峰蛋白用C2A相稀释1-2倍上柱，采用20％C2B相预洗1.5-2.0个柱体积后20％B-70％B线性梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱体积为10个柱体积，流速为15L/h，检测波长为280nm。对洗脱液的主峰进行RP-HPLC分析，RP-HPLC分析条件为：C4分析柱(型号Kromasil C4 300-5C4)，温度30℃，检测波长214nm，流速1mL/min。按表5进行梯度洗脱(其中流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.08％三氟乙酸-乙腈溶液)，得到主峰蛋白。结果如图12所示。

表5洗脱程序

6、超滤浓缩Ⅱ

经步骤5的Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow层析后收集的主峰蛋白，采用5KD超滤膜进行缓冲液置换。首先将目的蛋白浓缩3-5倍体积后，然后用置换液Ⅱ(20mM Tris，pH8.0溶液)置换3-5倍体积至透过液电导至2.0以下。

7、Q Sepharose High Performance柱纯化

采用缓冲液C3A相(20mM Tris，pH8.0)和C3B相(20mM Tris，0.3M NaCl，pH8.0)。用C3A相平衡离子交换柱Q Sepharose High Performance柱(柱的内径 为50mm)2.0-4.0个柱体积，收集平衡液，将步骤6得到的浓缩液上柱，收集穿出液，采用0-70％B线性梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱体积为10个柱体积，流速为30L/h。检测波长为280nm。对洗脱液的主峰进行RP-HPLC分析，RP-HPLC分析条件为：C4分析柱(型号Kromasil C4 300-5C4)，温度30℃，检测波长214nm，流速1mL/min。按表6进行梯度洗脱(其中流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.08％三氟乙酸-乙腈溶液)，收集主峰蛋白。结果如图13所示。

表6洗脱程序

8、超滤浓缩Ⅲ

经步骤7的Q Sepharose High Performance层析后收集主峰蛋白，经5KD超滤膜浓缩至1.0-1.5L，用置换液III(5.488g/L柠檬酸钠(二水)、0.281g/L柠檬酸(一水)、0.4g/L聚山梨酯20，pH 6.3)置换12-15倍体积，控制最终浓缩液总体积为1-1.5L。按照设定体积加入终浓度94.5g/L海藻糖(二水)搅拌溶解，调节pH至6.3±0.1，最后用置换液III(5.488g/L柠檬酸钠(二水)、0.281g/L柠檬酸(一水)、0.4g/L聚山梨酯20，pH 6.3)补齐至设定体积。

9、除菌过滤

将步骤8得到的超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤器过滤于无菌PE瓶(Nalgene)中即为原液。于-70±10℃避光密封保存，有效期暂定为24个月。

六、重组融合蛋白CE的鉴定

1、步骤五最后纯化的重组融合蛋白CE的N端15个氨基酸分析结果为MAEMKTDAATLAQEA，与设计的重组融合蛋白CE(SEQ ID No.2所示的蛋白)N端的15个氨基酸序列完全一致。

2、纯化的重组融合蛋白CE的质谱测定分子量为21035Da，与理论计算的分子量21035Da(SEQ ID No.2所示的蛋白的分子量)非常接近。

实施例2：处方pH值研究

溶液pH是影响生物药物物理化学稳定性的重要参数之一。pH可以调节蛋白质表面的电荷分布，从而影响生物药物分子内及分子间的作用力，并直接影响蛋白质溶解度，如蛋白质在接近其等电点(pI)的pH环境中具有较小的溶解度，也可能有较低的胶体稳定性(Colloidal stability)。

一.处方设计

通过考察不同pH值对本品制剂溶液稳定性的影响来确定最佳pH。pH范围设计为2.6～8.0(20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲体系)，每隔0.2个pH设计1个处方，共制备28个不同pH的处方。

二.处方配置

分别配置好20mM的pH2.6柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液和20mM的pH8.0磷酸盐缓冲液，随后分别按照不同的比例混合配置成最终所需要的pH。各处方中结核病变态反应原CE的浓度均为200μg/ml(不含其它辅料)。

三.DSC筛选

蛋白融化温度(Melting temperature，T_m)从侧面反映了生物药物在水溶液中的稳定性，T_m越大说明生物分子发生变性的温度越高，即在实际保存条件下发生构象改变(Conformational change)的可能越低。采用DSC对28个不同pH处方溶液进行热稳定性研究。

DSC筛选结果见图14。

由图14中可以看出：T_m基本呈正态分布，pH4.4时蛋白具有最高T_m(68℃)，说明在该pH下重组融合蛋白CE抗原具有最佳构象稳定性。在pH3.2～6.6范围内，样品的T_m在60℃以上，表现出较好的热稳定性。

四.影响因素试验

根据DSC高通量数据，pH过低或过高时，结核病变态反应原重组融合蛋白CE的热稳定均较差，因此我们重点研究中间pH的样品稳定性，结合本品的等电点pI为4.7，选择部分样品(pH2.6、pH3.2、pH3.8、pH4.4、pH4.6、pH4.8、pH5.0、pH5.4、pH5.6、pH6.0、pH6.6、pH7.2、pH8.0)进行影响因素试验，SEC-HPLC方法考察目标蛋白(单体)相对含量的变化。

高温试验：将筛选后的处方样品置于40±2℃恒温箱中，于14天后取样进行检测，考察单体相对含量(SEC-HPLC)，测得单体相对含量见表7、图15。

表7高温试验结果

注：实验数据表示为平均值±SD。除非另有说明，重复次数N≥2，下同。各处方单体相对含量(％)为与0时比较的结果，样品0时单体相对含量均默认为100％，下同。

高温试验后，pH2.6～4.4和pH7.2～pH8.0的处方单体相对含量在91.7～97.9％，pH4.6～pH6.6较为稳定，处方单体相对含量均大于98.2％。

五.结论

DSC试验与影响因素-高温试验所反映的蛋白质物理稳定性趋势基本一致，即较低pH和较高pH时，单体含量较低、稳定性差，pH在中间范围时单体含量较高、稳定性好。DSC试验中，pH为4.4左右时蛋白热力学稳定性最好，但高温试验中相对较高pH处方较稳定。这可能是在pH4.4左右由于和结核病变态反应原重组融合蛋白CE的等电点(pI为4.7)接近，虽然其具有较高的构象稳定性，但是由于分子基本不带电荷，分子间的相互排斥作用较弱，即胶体稳定性较差，造成pH稳定性曲线的漂移。

由上述试验结果显示：pH为4.4～6.6时热稳定性(构象稳定性)效果较高， pH为6.0～7.2时单体含量结果较理想，因此pH6.0～6.6为最佳，最终确定采用pH6.3开展后续试验。

实施例3：处方结构保护剂筛选及剂型确认研究

蛋白质药物常用的结构保护剂有多元醇(如甘露醇、甘油)、糖类(如蔗糖和海藻糖)和氨基酸(如甘氨酸、精氨酸)等。上述结构保护剂的保护机制被称为“优先排除(Preferential exclusion)”，即在水溶液中，蛋白将保护剂分子优先排除于蛋白表面之外，加入这些保护剂会增加蛋白质的化学势能。由于蛋白质变性、去折叠后表面积增加，和辅料的相互作用增加，引起化学势能升高更大，从而蛋白质发生构象变性的活化能增大，使蛋白质天然构象和变性构象间的平衡向天然构象转移，从而增加了蛋白质的构象稳定性。

一.处方设计

处方预筛选确定本品处方的pH为6.3，蛋白含量为200μg/ml，在此基础上，对各类保护剂进行筛选研究，处方筛选设计方案见表8。

表8处方筛选设计方案

处方1只含20mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液而不含任何保护剂。其余处方在处方1的基础上分别加入不同类型的保护剂和保护剂组合(聚山梨酯20、甘露醇、蔗糖、海藻糖、盐酸精氨酸和甘氨酸)。

处方2、3、4、5和6分别含0.1mg/ml聚山梨酯20、46mg/ml甘露醇(接近等渗溶液，下同)、90mg/ml蔗糖、94.5mg/ml海藻糖、52.5mg/ml盐酸精氨酸、18.8mg/ml甘氨酸。

处方8含40mg/ml甘露醇和15mg/ml蔗糖，处方9含94.5mg/ml海藻糖和2.56mg/ml甘油，处方10含0.1mg/ml聚山梨酯20和90mg/ml蔗糖，处方11含0.1mg/ml聚山梨酯20和94.5mg/ml海藻糖，处方12含0.1mg/ml聚山梨酯20、40mg/ml甘露醇和15mg/ml蔗糖。

将配置好的各处方样品进行灌装，每组处方共灌装44支，每支1ml，其中22支经冻干制成冻干粉针，另22支为水针。灌装后即进行检测单体蛋白相对含量，作为0时检测结果，见冻干试验项下结果总结表10。

二.冻干试验

冻干样品使用冷冻干燥机(Christ 2-6D LPCplus)进行冷冻干燥，冻干工艺过程见表9。观察冻干后各处方样品的外观，再对各处方样品的冻干粉末进行复溶，检测样品的外观、可见异物、单体相对含量及主峰纯度。

表9结核病变态反应原重组融合蛋白CE小试冻干工艺

在各处方冻干样品中加入冻干过程中丢失的水量进行复溶，复溶后检测样品的外观、可见异物、单体相对含量及主峰纯度，结果见表10，单体相对含量变化见图16，主峰纯度变化见图17。

表10各处方冻干前0时及冻干后复溶检测结果

复溶后各处方的外观和可见异物检查均合格。处方1(无保护剂)、处方3(含46mg/ml甘露醇)和处方9(含94.5mg/ml海藻糖和2.56mg/ml甘油)的单体含量损失较大，含量分别为83.1％，78.6％和82.4％；其他处方无明显损失，说明这些辅料成分或组合物都能在不同程度上保护蛋白免受冻干过程中的物理破坏。RP-HPLC主峰纯度与冻干前相比基本没有变化，均约为95％。

三.影响因素试验

将各处方的冻干和水针制剂进行高温试验。将各处方水针及冻干粉针样品分别放置于40±2℃恒温箱中，第7、14天分别取样，检测样品外观、可见异物、单体相对含量(SEC-HPLC)以及主峰纯度(RP-HPLC)。样品外观检测结果见表11，可见异物检测结果见表12，单体相对含量结果见表13，主峰纯度见表14；单体相对含量变化见图18～19，主峰纯度变化见图20～21。

表11高温试验条件下水针及冻干粉针复溶后外观检测结果

水针：高温(40±2℃)条件下，14天检测期内各处方的水针样品的外观检查结果均为“无色澄明液体”。冻干粉针：高温(40±2℃)条件下，14天检测期内各处方的粉末外观没有发生显著变化，用水复溶后，只有处方1、2、11、12的外观为无色澄明液体，其他处方均出现乳光。

表12高温试验条件下水针及冻干粉针复溶后可见异物检测结果

水针：高温(40±2℃)条件下，只有处方5、7、11的可见异物在7天、14天时均符合规定。冻干粉针：高温(40±2℃)条件下，只有处方4、5、6、8、10、11、12的可见异物在7天、14天时均符合规定。

表13高温试验条件下水针及冻干粉针复溶后单体相对含量检测结果

水针：高温试验(40±2℃)条件下放置7天后，所有水针处方的单体相对含 量均在98.5％以上，放置14天后，不含保护剂的处方1和含有甘氨酸的处方7的单体含量比其他处方下降明显，分别为96.6％和96.7％。

冻干粉针：高温试验(40±2℃)条件下，经过7天和14天，各个处方的单体相对含量差异较大，但基本上都和冻干0时较接近，说明大多数的降解是由于冻干过程引起的，由于高温引起的破坏比例较低。既含有聚山梨酯20又含有结构保护剂(蔗糖、海藻糖、甘露醇)的处方10、11、12，14天检测期内单体相对含量均在99％以上。

表14高温试验条件下水针及冻干粉针复溶后主峰纯度检测结果

水针：高温试验(40±2℃)条件下，各个处方的RP-HPLC主峰纯度下降明 显；14天时各处方的水针主峰纯度为81.9％～89.3％，其中处方11和处方12纯度下降最显著，说明高温破坏下化学降解显著。

冻干粉针：高温试验(40±2℃)条件下，各处方的冻干粉针主峰纯度较稳定，14天时主峰纯度均在92.9％以上，且处方之间差异不显著。

四.结论

上述处方研究结果表明，本品水针在高温条件下物理稳定性较好，单体损失量较少；结核病变态反应原重组融合蛋白CE水针制剂化学降解较多，这些化学降解较难通过各种保护剂来抑制。而在冻干粉末中，各个处方具有较高的化学稳定性和物理稳定性。不同保护剂对结核病变态反应原重组融合蛋白CE在水针和冻干条件下的保护作用是不同的，而且针对物理稳定性(SEC-HPLC)和化学稳定性(RP-HPLC)的保护作用也不同，有些在水溶液中有保护作用，有些在冻干制剂中有保护作用，而有些保护剂均有保护作用。综合表12、13、14的数据，分别以无保护剂的处方1的实验结果为参照，将其余11个处方中结构保护剂的保护效果进行对比，所得结果如见表15。所研究的各个辅料均有某种程度上的保护作用。

表15水针制剂和冻干制剂筛选结果表

注：+表示保护剂对某项指标有保护作用，—表示没有或基本没有保护作用

而与水针相比，冻干制剂具有显著的优越性。冻干制剂的物理稳定性和保护剂相关，聚山梨酯20和结构保护剂如甘露醇、蔗糖、海藻糖等对蛋白都有非常显著的保护效果，且结核病变态反应原重组融合蛋白CE各冻干处方都具有很高的化学稳定性。综合本品特性以及稳定性数据，最终将本品剂型确定为注射用无菌粉末。

处方11(含94.5mg/ml海藻糖和0.1mg/ml聚山梨酯20)与处方12(含40mg/ml甘露醇，15mg/ml蔗糖和0.1mg/ml聚山梨酯20)的冻干制剂在各项试验中均表现出很高的稳定性，且处方11略优于处方12。因此在下轮研究中进一步分析了处方11在最终制剂蛋白浓度(10μg/ml)的稳定性。另外由于聚山梨酯20对本品冻干制剂的显著保护作用，故在下面研究中也比较了不同聚山梨酯20含量对结核病变态反应原重组融合蛋白CE稳定性的影响。

实施例4：聚山梨酯20浓度研究

一.处方设计

本轮处方筛选研究的目的是比较最终制剂蛋白浓度(10μg/ml)条件下含有不同聚山梨酯20含量的处方11的稳定性。在处方11的基础上，分别设计4种在10μg/ml蛋白浓度下不同浓度的聚山梨酯20(0.1mg/ml、0.4mg/ml、0.7mg/ml、 1.0mg/ml)冻干处方，将其分别命名为处方11-1、11-2、11-3和11-4，处方筛选设计方案见表16。对该四个处方进行稳定性对比研究，以确定最终处方中的聚山梨酯20含量。处方中本品的蛋白浓度为10μg/ml，将配置好的各处方样品进行灌装，每组处方40支，每支1ml，分装于西林瓶中。灌装后即进行外观、可见异物、单体含量和纯度检测，作为0时检测结果。

表16不同聚山梨酯20浓度处方组分配制(蛋白含量为10μg/ml)

处方编号	聚山梨酯20(mg/ml)	海藻糖(mg/ml)	柠檬酸/柠檬酸盐(mM)	pH
					处方11-1	0.1	94.5	20	6.3
处方11-2	0.4	94.5	20	6.3
					处方11-3	0.7	94.5	20	6.3
处方11-4	1.0	94.5	20	6.3

二.冻干试验

将灌装后的处方11-1、11-2、11-3、11-4样品经冻干制成冻干粉针(相应的冻干工艺见表9)，观察冻干后各处方样品的外观，再对各处方样品的冻干粉末进行复溶，检测样品的外观、可见异物、单体相对含量及主峰纯度。检测结果见表17，单体相对含量变化见图22，主峰纯度变化见图23。

冻干后，各处方都形成了坚固的外形。

表17不同聚山梨酯20含量处方冻干复溶后检测结果

由表17可知，在冻干样品中加入冻干时丢失的水量复溶后，各处方的外观和可见异物均合格。图22显示与冻干前相比，各处方冻干后复溶的单体含量没有发生显著变化。图23显示处方11-1的主峰纯度与冻干前相比略有下降(从98.2％到97.5％)，而其他处方基本没有变化，均为约97.5％。即四个处方均能能保护结核病变态反应原CE免受冻干过程中的物理和化学破坏，处方11-2，11-3和11-4略优于处方11-1。

三.影响因素试验

将上述四个处方冻干样品分别进行高温试验。将四个处方冻干粉针样品分别置于40±2℃恒温箱中，第7、14天分别取样。检测样品外观和可见异物、单体相对含量(SEC-HPLC)以及主峰纯度(RP-HPLC)。所得检测样品外观和可见异物结果见表18，单体相对含量结果见表19，主峰纯度结果见表20；单体相对含量变化见图24，主峰纯度变化见图25。

表18高温试验条件下冻干粉针复溶后外观及可见异物检测结果

高温(40±2℃)条件下，14天检测期内，所有处方样品的外观均为无色澄明液体，可见异物均符合规定。

表19高温试验条件下单体相对含量检测结果

高温(40±2℃)条件下，14天检测期内，单体相对含量变化不显著，表明提高聚山梨酯20含量并不能够进一步改善结核病变态反应原重组融合蛋白CE在高温中的稳定性。

表20高温试验条件下主峰纯度检测结果

高温(40±2℃)条件下，14天检测期内，处方11-1样品的主峰纯度与0时相比有一定降低，而其他3个处方无显著差异，同样说明0.4mg/ml以上聚山梨酯20含量能够在一定程度上改善结核病变态反应原重组融合蛋白CE在高温中的化学稳定性。在确保聚山梨酯20对本品有最佳保护效果的基础上选用最低的聚山梨酯20含量，最终将聚山梨酯20的含量确定为0.4mg/ml(即处方11-2)。

实施例5：稳定性研究

按实施例4中的处方11-2进行了3批样品的生产，对各项检测指标进行检测，各取样品进行24个月长期稳定性试验(5±3℃，避光储存)，然后取样检测，所得结果如表21所示，各项检测指标均较为稳定，表明本品所选定生产处方和制备工艺较为稳定，质量可控，可满足本品临床用药的生产、保存、运输以及临床使用的需要，生产处方以及制备工艺可行。

表21三批中试规模成品长期稳定性检验结果汇总

实施例6：制剂工艺过程

制剂处方11-2的制备工艺如下(室温)：(1)原液的制备：按照实施例1制得的含有结核病变态反应原CE的原液，其中结核病变态反应原CE浓度为9.57mg/ml，另含5.49mg/ml柠檬酸钠(二水)、0.28mg/ml柠檬酸(一水)、94.5mg/ml海藻糖(二水)、0.4mg/ml聚山梨酯20，pH 6.3。

(2)缓冲液的配置：称取柠檬酸钠(二水)30.20g、柠檬酸(一水)1.55g、海藻糖(二水)519.94g、聚山梨酯202.20g，加入约5.45L注射用水，搅拌溶解，然后滴加盐酸调节pH至6.3，再加注射用水定容至5.50L。

(3)称量取原液5.96g(密度1.036g/ml)，加入至缓冲液中，混匀，过滤除菌，分装成4700瓶，半加塞，按表10的冻干过程冷冻干燥，再加塞，轧盖，得到结核病变态反应原CE的冻干粉针制剂。

实施例7：不同pH、结构保护剂、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液及聚山梨酯20浓度的结核病变态反应原CE制剂的制备

我们设计并配制了不同pH、结构保护剂、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液浓度及聚山梨酯20浓度的结核病变态反应原CE液体制剂(表22)，并进行冷冻干燥得到相应的冻干制剂。

表22不同pH、蔗糖、结构保护剂、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液浓度及聚山梨酯20浓度的结核病变态反应原CE制剂

Claims (8)

1.一种含有结核病变态反应原CE的药物组合物，其中包括：

a.10μg/ml-200μg/ml的结核病变态反应原CE，所述结核病变态反应原CE为SEQ IDNo.2所示的蛋白质；

b.20mg/ml-200mg/ml的结构保护剂，所述结构保护剂为海藻糖或蔗糖或其任意混合物；

c.0.1mg/ml-1mg/ml的表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨酯20；

d.1mM-100mM的缓冲剂；

pH为6.0-6.6；

所述药物组合物为冻干制剂、或者由冻干粉末和注射用水通过双腔卡氏瓶配置(dual-chamber cartridge)的制剂形式。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的缓冲液选自乙酸/乙酸盐、琥珀酸/琥珀酸盐、葡萄酸/葡萄酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、酒石酸/酒石酸盐、顺丁烯二酸/顺丁烯二酸盐、乳酸/乳酸盐、碳酸/碳酸氢盐、苯甲酸/苯甲酸盐、咪唑、磷酸/磷酸盐、tris/tris盐酸盐，以及丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及其相应的盐类或混合物，或其任意混合物。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中包括：

a.10μg/ml-200μg/ml的结核病变态反应原CE，所述结核病变态反应原CE为SEQ IDNo.2所示的蛋白质；

b.20mg/ml-200mg/ml的海藻糖或蔗糖或其任意混合物；

c.0.1mg/ml-1mg/ml的聚山梨酯20；

d.5mM-40mM柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液；

pH为6.0-6.6。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中包含：

a.10μg/ml-200μg/ml的结核病变态反应原CE，所述结核病变态反应原CE为SEQ IDNo.2所示的蛋白质；

b.20mg/ml-100mg/ml的海藻糖或蔗糖或其任意混合物；

c.0.1mg/ml-1mg/ml的聚山梨酯20；

d.5mM-40mM柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液；

pH为6.3。

5.根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物在制备用于结核病诊断的药物制剂中的用途。

6.根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以皮下注射(s.c.)、或皮内注射(i.d.)、静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)或其它非肠胃(parenteral)方式给药实施。

7.一种制备如权利要求1-6任一项所述的药物组合物的方法，包括如下步骤：

a.将处方量的结构保护剂、表面活性剂、缓冲盐溶解于适量的注射用水中，搅拌溶解，使用酸/碱调节至pH为6.0-6.6；

b.将处方量的结核病变态反应原CE加入至a步骤所得的缓冲液中，搅拌均匀；

c.将b步骤所得溶液过滤除菌，分装，半加塞，冷冻干燥，再加塞，轧盖得到冻干粉针制剂；

所述结核病变态反应原CE为SEQ ID No.2所示的蛋白质。

8.如权利要求7所述的制备方法，所述的pH为6.3，所述的酸为盐酸，所述的碱为氢氧化钠。

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