CN108251292B - 一种药敏测试板及其制备方法 - Google Patents

一种药敏测试板及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种药敏测试板及其制备方法，该药敏测试板包括测试板本体、板盖体，测试板本体上设置有测试孔，测试孔底部覆盖有药物，药物使用含有非还原性二糖和乙醇的包被液进行包被后干燥处理，可以使药物在检测孔底部更加稳定存在，同时对药物的敏感性实验基本无影响。本发明测试板制作方法简单，使用简便，可快速实现病原菌药敏检测。本发明中的抗结核药物药敏测试板可应用于快速培养并检测出分枝杆菌药敏培养基敏感性试验，能够快速培养并指示出分枝杆菌的药物敏感性，一般在7～10天即可完成检测。

Description

一种药敏测试板及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药敏测试板及其制备方法以及使用该方法制得的药敏测试板。
背景技术
抗菌药物对细菌引起的疾病的控制起到了非常重要的作用，但是由于病原菌的不断变迁，抗菌药物的广泛应用，尤其是不管有无指征的滥用，造成细菌耐药性的迅速产生，给疾病控制造成困难。通过药敏测试可以少选出细菌耐药种类，减少治疗错误，便于医生选择个体化治疗方案、减少病人痛苦、节省费用；可以为疾病控制部门提供防治依据，为经验用药提供可靠依据；可以利用耐药监测结果控制抗菌药物滥用，减少耐药菌株的出现，延长新药使用寿命；也可以为新药的研究与评估提供有价值的信息。
分枝杆菌是引起人类许多疾病的一种病原菌，如常见的结核分枝杆菌是引起结核病的一种病原体，结核病至今仍是严重威胁人类健康的主要传染病，据WHO报道，每年全球有800万新病例发生，造成一百多万人死亡，居各种传染性疾病死亡原因之首。
传统的分枝杆菌固体药敏培养基，是利用罗氏培养基或改良罗氏培养基等把抗结核药物进行混合配置，虽然抗结核药物种类基本齐全，但是做多种抗结核药敏实验，需要制备多种药敏培养基，工作繁琐而且所需要培养箱的空间也大，相对成本比较高，使用该方法的检测所需时间大致为4～8周。近些年，临床上出现专业用于分枝杆菌培养鉴定药敏系统，如BACTEC-960系统或BacT/ALERT 3D系统，其培养基中含有多种抗结核药物，营养成分高，培养速度快，缺点是设备价格昂贵，且药物的种类只存在于一线药，抗结核药物的可选择性很少，操作上也是相对繁琐，属于单次培养。这两种方法还有一个共同的缺点就是一些抗结核药物存在固体或者是液体中，抗结核药物的一些效价会随着时间的增长而降低，大多数的有效期不会超过半年，如果不使用新制药敏培养基，会对药物敏感试验结果产生影响。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种新的药敏测试板及其制备方法和应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种药敏测试板，包括测试板本体、板盖体，测试板本体上设置有测试孔，测试孔底部覆盖有药物，测试板的制备具体步骤如下：
1)包被液的配置：称取二糖完全溶于纯化水，加入无水乙醇，混合均匀后，除菌过滤；
2)药物溶液配置：准确称量各种药物，根据各种药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，除菌过滤；
3)使用包被液将药物溶液稀释成梯度浓度；
4)将稀释好的药物溶液加到测试孔中，并进行干燥处理；
5)无菌封装。
进一步地，二糖为非还原性二糖。
进一步地，包被液中二糖的质量分数为0.33％～1％。
进一步地，包被液中无水乙醇的体积分数为16.67％～33.33％。
进一步地，干燥处理的温度不超过50℃。
进一步地，干燥处理的温度为35～45℃。
进一步地，干燥处理的时间为10～15h。
进一步地，二糖选自蔗糖、海藻糖中的至少一种。
进一步地，药物为抗结核药物。
进一步地，抗结核药物选自利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、莫西沙星、卡那霉素、对氨基水杨酸、利福喷丁、利福布丁、克拉霉素、氯法齐明、力克肺疾、阿奇霉素、头孢西丁、妥布霉素、加替沙星、多西环素、米若环素、磺胺甲唑、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、亚胺培南、利奈唑胺和吡嗪酰胺中的一种或几种。
本发明的有益效果是：
本发明技术利用二糖包被干燥的方法，使药物在检测孔底部更加稳定存在，同时对药物的敏感性实验基本无影响。
本发明测试板制作方法简单，使用简便，可快速实现病原菌药敏检测。
本发明中的抗结核药物药敏测试板可应用于快速培养并检测出分枝杆菌药敏培养基敏感性试验，能够快速培养并指示出分枝杆菌的药物敏感性，一般在7～10天即可完成检测。该技术方案解决了固体罗氏培养基检测过程繁琐以及药物有效时间问题，还解决了分枝杆菌培养鉴定药敏系统设备昂贵，可同时检测药物种类少的问题，为临床、CDC实验室进行药敏试验工作提供了便利，大大节省了实验室的空间以及工作压力和减少了生物危害。
具体实施方式
实施例1
一种抗结核药物药敏测试板的制备方法，包括以下步骤：
1)包被液的配置：称取海藻糖10g，溶解在2500mL的纯化水中，充分溶解后加入500mL的无水乙醇，最终配置成3000mL的包被液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
2)抗结核药物浓度配置：准确称量抗结核药，根据各种抗结核药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，配置成浓度为0.1g/10mL的母液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
3)用包被液按每种抗结核药物所需要的浓度稀释成所需要的浓度，浓度根据WHO、CLSI、中国防痨协会等推荐药物浓度标准稀释成梯度浓度；
4)把稀释好的抗结核药物按照每孔20μL量加入到96孔测试板的微孔中，并进行烘干处理，温度设定为35℃，烘干时间为15h；
5)在百级洁净环境条件下，采用铝箔袋进行包装。
其中，使用的抗结核药如下：链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星；具体的稀释浓度如下：
Figure BDA0001575406760000031
Figure BDA0001575406760000041
实施例2
一种抗结核药物药敏测试板的制备方法，包括以下步骤：
1)包被液的配置：称取蔗糖15g，溶解在2100mL的纯化水中，充分溶解后加入900mL的无水乙醇，最终配置成3000mL的包被液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
2)抗结核药物浓度配置：准确称量各种抗结核药物0.1g，根据各种抗结核药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，配置成浓度为0.1g/10mL用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
3)用包被液按每种抗结核药物所需要的浓度稀释成所需要的浓度，浓度根据WHO、CLSI、中国防痨协会等推荐药物浓度标准稀释成梯度浓度；
4)把稀释好的抗结核药物按照每孔20μL量加入到96孔测试板的微孔中，并进行烘干处理，温度设定为40℃，烘干时间为12h；
5)在百级洁净环境条件下，采用铝箔袋进行包装。
其中，使用的抗结核药如下：左氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、利福布丁；具体的稀释浓度如下：
Figure BDA0001575406760000042
实施例3
一种抗结核药物药敏测试板的制备方法，包括以下步骤：
1)包被液的配置：称取蔗糖30g，溶解在2000mL的纯化水中，充分溶解后加入1000mL的无水乙醇，最终配置成3000mL的包被液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
2)抗结核药物浓度配置：准确称量各种抗结核药物0.1g，根据各种抗结核药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，配置成浓度为0.1g/10mL,用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
3)用包被液按每种抗结核药物所需要的浓度稀释成所需要的浓度，浓度根据WHO、CLSI、中国防痨协会等推荐药物浓度标准稀释成梯度浓度；
4)把稀释好的抗结核药物按照每孔20μL量加入到96孔测试板的微孔中，并进行烘干处理，温度设定为45℃，烘干时间为10h；
5)在百级洁净环境条件下，采用铝箔袋进行包装。
其中，使用的抗结核药如下：利福喷丁、对氨基水杨酸、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、环丝氨酸、力克肺疾、克拉霉素、利奈唑胺、氯法齐明、环丙沙星、阿莫西林克拉维酸钾、吡嗪酰胺；具体的稀释浓度如下：
Figure BDA0001575406760000051
实施例抗结核药敏板稳定性测试
将标准结核分枝杆菌ATCC25277菌液与含有杂菌抑制剂的培养基混匀。
按照实施例1、2、3中的方法制备抗结核药敏测试板，将菌液与培养基混合物加入到当天制作完成的抗结核药敏测试板中以及保存一个月、三个月、六个月年、十二个月的抗结核药敏测试板中，盖好测试板盖，置于37℃温箱培养。保存一个月、三个月、六个月、十二个月的抗结核药敏测试板是经过加速试验得到的。
培养10天后观察结果，孔底出现白色菌体沉淀且菌圈大于2mm的为阳性，则表示在该孔有细菌生长，根据各含药孔、对照孔的生长结果读出相应的孔的浓度。
菌种判定标准：
对照 TCH PNB
人型结核分枝杆菌 + + -
牛型结核分枝杆菌 + - -
NTM + + +
实验结果表明：新制的抗结核药敏测试板、保存一个月、三个月、六个月、十二个月的药敏测试板所检测出来的菌株结果一致，具体如下：
Figure BDA0001575406760000061
Figure BDA0001575406760000071
对比例1
1)包被液的配置：称取葡萄糖15g，溶解在2100mL的纯化水中，充分溶解后加入900mL的无水乙醇，最终配置成3000mL的包被液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
2)抗结核药物浓度配置：准确称量抗结核药，根据各种抗结核药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，配置成浓度为0.1g/10mL的母液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
3)用包被液按每种抗结核药物所需要的浓度稀释成所需要的浓度，浓度根据WHO、CLSI、中国防痨协会等推荐药物浓度标准稀释成梯度浓度；
4)把稀释好的抗结核药物按照每孔20μL量加入到96孔测试板的微孔中，并进行烘干处理，温度设定为35℃，烘干时间为15h；
5)在百级洁净环境条件下，采用铝箔袋进行包装。
抗结核药物的选择和浓度设置与实施例1相同。
对比例2
1)包被液的配置：称取蔗糖45g，溶解在2100mL的纯化水中，充分溶解后加入900mL的无水乙醇，最终配置成3000mL的包被液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
2)抗结核药物浓度配置：准确称量抗结核药，根据各种抗结核药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，配置成浓度为0.1g/10mL的母液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
3)用包被液按每种抗结核药物所需要的浓度稀释成所需要的浓度，浓度根据WHO、CLSI、中国防痨协会等推荐药物浓度标准稀释成梯度浓度；
4)把稀释好的抗结核药物按照每孔20μL量加入到96孔测试板的微孔中，并进行烘干处理，温度设定为40℃，烘干时间为20h才让微孔板所包被的药物完全干燥；
5)在百级洁净环境条件下，采用铝箔袋进行包装。
抗结核药物的选择和浓度设置与实施例2相同。
对比例3
1)包被液的配置：无水乙醇和纯化水的比例为1：1进行配置，配置成3000mL的包被液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
2)抗结核药物浓度配置：准确称量抗结核药，根据各种抗结核药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，配置成浓度为0.1g/10mL的母液，用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤；
3)用包被液按每种抗结核药物所需要的浓度稀释成所需要的浓度，浓度根据WHO、CLSI、中国防痨协会等推荐药物浓度标准稀释成梯度浓度；
4)把稀释好的抗结核药物按照每孔20μL量加入到96孔测试板的微孔中，并进行烘干处理，温度设定为45℃，烘干时间为10h；
5)在百级洁净环境条件下，采用铝箔袋进行包装。
抗结核药物的选择和浓度设置与实施例3相同。
对比例抗结核药敏板稳定性测试
将标准结核分枝杆菌ATCC25277菌液与含有杂菌抑制剂的培养基混匀。
按照对比例1中的方法制备抗结核药敏测试板，将菌液与培养基混合物加入到当天制作完成的抗结核药敏测试板中以及保存一个月、三个月、六个月、十二个月的抗结核药敏测试板中，盖好测试板盖，置于37℃温箱培养。保存一个月、三个月、六个月、十二个月的抗结核药敏测试板是经过加速试验得到的。
培养10天后观察结果，孔底出现白色菌体沉淀且菌圈大于2mm的为阳性，则表示在该孔有细菌生长，根据各含药孔、对照孔的生长结果读出相应的孔的浓度。结果如下：
Figure BDA0001575406760000081
Figure BDA0001575406760000091
使用相同的方法检测对比例2药敏板的稳定性，结果如下：
Figure BDA0001575406760000092
使用相同的方法检测对比例3药敏板的稳定性，结果如下：
Figure BDA0001575406760000093
Figure BDA0001575406760000101
通过以上测试结果，可以发现使用本发明中的包被液和包被方法可以使抗结核药物在较长时间内保持药效稳定。在包被液中不使用非还原性二糖或者非还原性二糖的含量不在本发明限定范围内时，抗结核药物无法长时间保持药效稳定或者受干燥时间的影响不能有效稳定存在于微孔板底，这都会影响到药敏检测的精确性。

Claims (1)

1.一种药敏测试板，包括测试板本体、板盖体，测试板本体上设置有测试孔，测试孔底部覆盖有药物，测试板的制备具体步骤如下：
1)包被液的配置：称取二糖完全溶于纯化水，加入无水乙醇，混合均匀后，除菌过滤；
2)药物溶液配置：准确称量各种药物，根据各种药物的溶解性选择不同的溶剂进行完全溶解，除菌过滤；
3)使用包被液将药物溶液稀释成梯度浓度；
4)将稀释好的药物溶液加到测试孔中，并进行干燥处理；
5)无菌封装；
所述包被液中二糖的质量分数为0.33%～1%；
所述药物为抗结核药物；
所述抗结核药物选自利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、莫西沙星、卡那霉素、对氨基水杨酸、利福喷丁、利福布丁、克拉霉素、氯法齐明、力克肺疾、阿奇霉素、头孢西丁、妥布霉素、加替沙星、多西环素、米若环素、磺胺甲唑、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、亚胺培南、利奈唑胺和吡嗪酰胺中的一种或几种；
所述二糖为非还原性二糖；
所述包被液中无水乙醇的体积分数为16.67%～33.33%；
所述干燥处理的温度为35～45℃；
所述干燥处理的时间为10～15 h；
所述二糖选自蔗糖、海藻糖中的至少一种。
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