CN104745459A - 葡萄球菌药敏板条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄球菌药敏板条，通过下列步骤制得：（1）配置抗生素的稀释液；（2）分装；（3）配置原液；（4）分装液料；（5）加样分装板条；（6）板条干燥和（7）真空包装。本发明的药敏板条中加入了抗生素、抗氧化剂，延长药敏板条的保存期。另外，在包装时采用真空包装，能防止抗生素的氧化，使其能在2—25℃条件下保存，使产品的储存更方便，并节约能源。本发明产品可以减少耐药菌株的滋生，有利于患者的治疗。本发明用于统计分析系统可根据不同的统计条件，在一段时期内，对各地区、各医院作出流行病学上的分析，对特殊耐药菌株的变异及疾病的防治起到监控的作用，对临床具有重要的指导意义，有较大的应用价值。

Description

葡萄球菌药敏板条及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制剂。具体涉及一种葡萄球菌药敏板条及其制备方法。

背景技术

近20年来，由于临床上广泛大量使用种类繁多的抗菌药物，细菌的耐药性越来越普遍，有的细菌可同时耐2-7种药物，耐药菌株的广泛传播给临床治疗带来了很大的困难，加之临床诊治手段不断更新，虽然提高了诊断和治疗效果，但也带来了更多的交叉感染机会，使机体的免疫状态趋于低下。尤其引人注目的是感染类型发生了很大的变迁，而且还处于变化之中，为了适应这种新的变化，对于临床微生物鉴定和药敏的检测具有重要的指导意义。目前，国际上同类产品主要有：法国生物-梅里埃公司的VITEK2微生物分析系统、美国Dade-MicroScan公司的MicroScanWalkAway4.0自动微生物鉴定和药敏系统以及英国Trek Diagnostic System Ltd.的Senstitre荧光法快速微生物鉴定和药敏分析系统。这类产品主要是根据细菌理化性质的差异，采用光电比色（药敏是比浊），测定细菌生长分解底物导致PH值改变而产生的不同颜色和浊度变化来判断反应情况，从而给出鉴定药敏结果。

另外，为适应临床实验室对微生物鉴定药敏设备的专业要求，市场对微生物系统产品的功能提出更高的要求，开发操作简便、鉴定范围广、药敏MIC值准确实用、并可以快速给出实验结果的微生物产品已成为一种迫切要求。BIOLOG公司的微生物鉴定系统虽然可以较为准确地鉴定微生物菌种，但缺少药敏（抗生素）检测，而在微生物检验产品时，一般都要求系统同时具备鉴定菌种和检测抗生素的MIC（最小抑菌浓度）值两种功能，该方法也存在一定缺陷。

由于现有的药敏检测系种类较少，不能满足葡萄球菌及多种种类型细菌的药敏试验，另外板条中抗生素的浓度梯度较少，大部分只可报告定性的敏感、中度敏感和耐药结果，而不能准确的报告出定量的MIC值，因此，需要不断研究新的药敏板条。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种快速准确的，满足多种类型细菌的药敏试验的药敏检测系统。

本发明提供了一种葡萄球菌药敏板条。

本发明的药敏检测试验基于下列原理：

根据每一种药物生长斜率于MIC（最小抑菌浓度）的线性关系，选择适当数目的稀释度，加入待检细菌的菌悬液，经4-15h孵育后，应用光电比浊原理，即可得到待检菌在各浓度的斜率，与阳性对照斜率相比，并计算出待检菌的复合斜率，经回归分析得到MIC值，并根据CLSI标准获得相应敏感（S）、中度敏感（I）和耐药（R）的结果。

本发明一种葡萄球菌药敏板条通过下列方法制得：

（1）配置抗生素的稀释液

对蒸馏水加入鼠尾草抗氧化剂，浓度为质量分数为0.02%，进行121℃,15min灭菌处理，等冷却后作为抗生素的稀释液待用；

（2）分装

将配置好的的稀释液分装为每试管15mL待用；

（3）配置原液

根据稀释要求配置各种抗生素的原液；

（4）分装液料

根据板条浓度稀释要求，将步骤（3）的抗生素原液加入到相应的分装好的（2）试管中；

（5）加样分装板条

使用分装系统在96孔的相应位置对指定的药敏板条加样，每孔加50μL;

（6）板条干燥

上述板条真空干燥16-18小时；

（7）真空包装。

本发明的另一目的是提供所述一种葡萄球菌药敏板条的制备方法，该方法包括下列步骤：

（1）配置抗生素的稀释液

对蒸馏水加入鼠尾草抗氧化剂，浓度为质量分数为0.02%，进行121℃,15min灭菌处理，等冷却后作为抗生素的稀释液待用；

（2）分装

将配置好的的稀释液分装为每试管15mL待用；

（3）配置原液

根据稀释要求配置各种抗生素的原液；

（4）分装液料

根据板条浓度稀释要求，将步骤（3）的抗生素原液加入到相应的分装好的（2）试管中；

（5）加样分装板条

使用分装系统在96孔的相应位置对指定的药敏板条加样，每孔加50μL;

（6）板条干燥

上述板条真空干燥16-18小时；

（7）真空包装。

所述步骤（4）分装液料和（5）加样分装板条中，各抗生素稀释时原液用量和在96孔的分装位置如下：

原液：药品经配制后的初始溶液

一次稀释液：原液稀释10倍所得溶液，即100μL原液与900μL原液混合而成；

根据本发明的一种葡萄球菌药敏板条的制备方法，通过该方法制得的葡萄球菌药敏板条在进行细菌操作加入100μL的细菌菌悬液后，板条中抗生素最终浓度如下：单位为：ug/mL

葡萄球菌药敏板浓度梯度表

注：下列表中列出了CLSI（美国临床实验室标准委员会标准与指南）建议的判读标准，是基于CLSI文件M100-S23中说明的判读折点，主要针对金黄葡萄球菌、路登葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌。

MIC结果的判读

本发明人经过大量的试验研究，对药敏板条的稳定性进行了改进。在本发明的药敏板条中加入了抗生素，同时加入抗氧化剂来抑制抗生素发生氧化，延长药敏板条的保存期，利于药敏板条的存贮。另外，在包装时采用真空包装机进行真空包装，真空包装的除氧功能，能防止抗生素的氧化。确保有效的延长药敏板条的保存期，使其能在2—25℃条件下保存，对于产品的储存更方便，并节约能源。

本发明产品与已有的微生物检验产品相比，具有新的临床用药指导意义，可以减少耐药菌株的滋生，更好的治疗患者。统计分析系统科根据不同的统计条件，在一段时期内，可以对各地区、各医院作出流行病学上的分析，并对特殊耐药菌株的变异及疾病的防治起到监控的作用，对临床具有重要的指导意义，有较大的应用价值。

具体实施方式：

实例1

葡萄球菌药敏板条300块产品的生产（每批生产最少量为100块，如生产200块，则配药量为100块所需药量的2倍，依次类推）:

a)配置鼠尾草水溶液

称取0.04g鼠尾草（质量分数为0.02%）充分溶解到2000mL蒸馏水中。

将配置好的溶液高压灭菌，然后均匀分装到消毒好的96跟试管中，每管分装15mL。

b)配置各抗生素初始液。

按照下表的浓度配置各抗生素的初始液：

抗生素名称	药品编号	初始浓度（μg/mL）
			氨苄西林	1	0.00133
青霉素	2	0.00266
			苯唑西林	3	0.00133
米诺环素	4	0.00133
			利奈唑胺	5	0.00133
加替沙星	6	0.00133
			左氧沙星	7	0.00133
红霉素	8	0.00133

克林霉素	9	0.00133
			万古霉素	10	0.01064
头孢西丁	11	0.00133
			达托霉素	12	0.00133

c)配置各孔抗生素溶液

按照下表的抗生素浓度稀释表按表中显示的体积加入板条的96根分装待用的15mL试管中。

上述A-H表示(表示孔位的位置)

备注

1.以上单位全部是μL

2.黑体字表示用原液稀释10倍：即100μL原液+900μL鼠尾草配置液。

d)加样分装板条

将配置好的96根试管装在加样机上，使用加样机对指定的药敏板条加样，每孔加50μL。

（在这之前要先运行分装系统：整个过程大约需要3个小时）。

e)将加样好的板条放入干燥间的真空泵中进行真空抽干，24小时后板条可干燥完毕。

f)板条包装

将干燥好的板条从干燥间传递窗送值包装间，使用真空包装机对板条进行真空包装。

g)板条存贮

包装完毕的板条放入-20℃冰箱冷酷中进行保存。

实施例2抗氧化剂试验研究

常见的抗氧化剂有Vc、Ve、丁香、山苍籽、马玉兰、肉豆蔻、姜黄、鸢尾根、迷迭香、鼠尾根、蒜、荠宁、薰衣草、黄荆、茴香芹、姜、丁香罗勒、茶叶类黑精类、红辣椒提取物、糖醇类抗氧化剂等抗氧化剂。近年来开发的大量天然抗氧化剂主要产品有天然VE、类黑精类、红辣椒提取物、香辛料提取物等等。

红辣椒提取物红辣椒中含有大量的抗氧化物质，是vE和香草酰胺的混合物。如能将其中辣味去掉，则是一种极好的抗氧化剂。

香辛料提取物中抗氧化性能最好的是迷迭香和鼠尾草。这类产品多含有黄酮类、类萜、有机酸等多种抗氧化成分，能切断油脂的自动氧化链、螯合金属离子，并起到与有机酸的协同增效作用。法国从迷迭香干叶粉中提取出两种晶体抗氧化物质一鼠尾草酚和迷迭香酚，它们比人工合成的氧化剂BHT和BHA的抗氧化能力强4倍多。

茶多酚类即从茶叶中提取的抗氧化物质，含有4种组分：表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯以及儿茶素。它的抗氧化能力比vE、Vc、叔丁基羟基茴香醚（BHA）、二叔丁基对甲酚（BHT）强几倍。

本发明人通过下列试验，对抗氧化剂的使用进行了选择：

h)试验方法

分别采用红辣椒提取物、迷迭香、鼠尾草和茶多酚类做为抗氧化剂配置成水溶液和不加抗氧化剂的水溶液加入抗生素中置成药敏板条，进行普通包装和真空包装，4℃和25℃进行贮存。选取标准菌株ATCC29212和ATCC29213配置成0.5麦氏加入到药敏板条进行测试，初次测试4种板条的抗生素MIC值全部在规定范围内。依次每月测试依次，至到所有抗生素均失效。每次测试每种板条共测试10次。

i)板条操作方法（使用时临床情况）

（1）取ATCC29212用生理盐水配置成0.5麦氏菌悬液，将菌悬液与肉汤培养液按1：200倍进行稀释（即每12mL中加入60μL菌悬液）；

（2）将配置好的菌液用移液器加入药敏板条中，每孔加100μL；

（3）将板条放置35℃培养箱16-24h；

（4）读取板条结果，若孔中出现浑浊为生长，若不浑浊为不生长，每种抗生素第一个不生长孔的浓度值即为正确的MIC值。

j)试验结果

k)本次试验共进行了15个月，试验结果如下表所示：

l)

（8）结果分析

试验结果表明：

i.使用红辣椒提取物和茶多酚类抗氧化剂，板条在第5个月、第6个月时某些抗生素就出现了失效，表明此两种抗生素不仅不能延长药敏的保存期，反而会影响抗生素的性能，缩短了板条的贮存时间，故此两种抗氧化剂不能选用。

ii.使用鼠尾草和迷迭香抗氧化剂抗生素分别第12个月和第10个月以后才有些抗生素出现失效，明显比不加抗氧化剂的板条保存期长，而且鼠尾草的抗氧化效果明显好于迷迭香。故使用迷迭香作为抗氧化剂加入药敏板条来延长药敏板条的保存期是可行的。

iii.对比四种抗氧化剂的普通包装和真空包装，发现真空包装比普通包装

的保存期能延长1-2个月。因此采取真空包装可以延长药敏的保存期。在上述实验的基础上，本发明选用了鼠尾草抗氧化剂，并采取真空包装的方法来增强药敏板条的稳定性，延长药敏板条的保存期。

实施例3抗生素选择试验

本发明根据CLSI M100-S23（美国临床实验室标准委员会标准与指导）选取临床常用抗生素，并及时更新抗生素折点。

葡萄球菌药敏板浓度梯度表

注：下列表中列出了CLSI（美国临床实验室标准委员会标准与指南）建议的判读标准，是基于CLSI文件M100-S23中说明的判读折点，主要针对金黄葡萄球菌、路登葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌。

MIC结果的判读

上述结果表明，根据CLSI（美国临床实验室标准委员会标准与指南）选取临床上常用抗生素，并根据CLSI中文件M100-S23判断抗生素的折点，又选用了鼠尾草抗氧化剂，并采取真空包装的方法能增强药敏板条的稳定性，延长药敏板条的保存期。

Claims (4)

1.葡萄球菌药敏板条，其特征在于，所述葡萄球菌药敏板条通过下列方法制得：

（1）配置抗生素的稀释液

对蒸馏水加入鼠尾草抗氧化剂，浓度为质量分数为0.02%，进行121℃,15min灭菌处理，等冷却后作为抗生素的稀释液待用；

（2）分装

将配置好的的稀释液分装为每试管15mL待用；

（3）配置原液

根据稀释要求配置各种抗生素的原液；

（4）分装液料

根据板条浓度稀释要求，将步骤（3）的抗生素原液加入到相应的分装好的（2）试管中；

（5）加样分装板条

使用分装系统在96孔的相应位置对指定的药敏板条加样，每孔加50μL;

（6）板条干燥

上述板条真空干燥16-18小时；

（7）真空包装。

2.一种如权利要求1所述的葡萄球菌药敏板条的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

（1）配置抗生素的稀释液

对蒸馏水加入鼠尾草抗氧化剂，浓度为质量分数为0.02%，进行121℃,15min灭菌处理，等冷却后作为抗生素的稀释液待用；

（2）分装

将配置好的的稀释液分装为每试管15mL待用；

（3）配置原液

根据稀释要求配置各种抗生素的原液；

（4）分装液料

根据板条浓度稀释要求，将步骤（3）的抗生素原液加入到相应的分装好的（2）试管中；

（5）加样分装板条

使用分装系统在96孔的相应位置对指定的药敏板条加样，每孔加50μL;

（6）板条干燥

上述板条真空干燥16-18小时；

（7）真空包装。

3.根据权利要求2所述的葡萄球菌药敏板条的制备方法，其特征在于其中所述步骤（4）分装液料和（5）加样分装板条中，各抗生素稀释时原液用量和在96孔的分装位置如下：

原液：药品经配制后的初始溶液

一次稀释液：原液稀释10倍所得溶液，即100μL原液与900μL原液混合而成；

4.根据权利2所述的葡萄球菌药敏板条的制备方法，其特征在于通过该方法制得的葡萄球菌药敏板条在进行细菌操作加入100μL的细菌菌悬液后，板条中抗生素最终浓度如下：单位为：ug/mL

葡萄球菌板条板药敏浓度梯度表

下列表中列出了CLSI美国临床实验室标准委员会标准与指南建议的判读标准，是基于CLSI文件M100-S23中说明的判读折点，金黄葡萄球菌、路登葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌MIC结果的判读：