IT202000011701A1 - Metodo e kit diagnostico per l'individuazione multipla di virus della famiglia coronaviridae: sars-cov2, sars-cov, hcov e mers-cov - Google Patents

Description

Descrizione di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

?Metodo e kit diagnostico per l'individuazione multipla di virus della famiglia Coronaviridae: SARS-CoV-2, SARS-CoV, HCoV e MERS-CoV?

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce sotto un profilo pi? generale, alle metodologie ed ai dispositivi diagnostici destinati alla rilevazione dei virus della famiglia Coronaviridae.

Come ? purtroppo noto da recenti fatti di cronaca legati alla pandemia attualmente in corso detta Covid-19, la gestione delle emergenze sanitarie su larga scala presenta delle criticit? che richiedono ai servizi sanitari pubblici e privati che devono fronteggiarle, una capacit? di risposta in tempi rapidi.

Infatti, nei casi di epidemie o di pandemie come quelle causate da virus della famiglia Coronaviridae (detti anche Coronavirus), quali SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV, ? importante poter stabilire le condizioni di salute di potenziali casi sospetti in modo rapido ed efficace, non solo per poter salvare vite umane ma anche per avere una conoscenza della diffusione dell?infezione e prendere i necessari provvedimenti sanitari.

Per questo scopo, come in passato, sono state sviluppate delle tecnologie diagnostiche ed ? altres? nota l?utilit? di incrementare/potenziare gli strumenti esistenti attraverso delle prove strumentali e/o test diagnostici che consentano di dare una prima indicazione la quale, generalmente insieme ad una valutazione di tipo clinico della sintomatologia, permetta di fornire una risposta sulle condizioni di salute di un paziente in tempi relativamente rapidi oltre che in sicurezza e con alta sensibilit? e specificit?.

Tuttavia, l'emergere di agenti patogeni nocivi mutanti recenti o meno recenti provoca sempre una minaccia a livello globale.

Gli ultimi due decenni hanno visto la minaccia di ceppi di virus influenzali mutati particolarmente pericolosi; 6 sono stati identificati e quattro di essi sono noti per causare lievi sintomi respiratori in individui immunocompetenti, coronavirus dell?uomo HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 mentre gli altri due, il coronavirus della sindrome respiratoria mediorientale (Middle East respiratory syndrome, MERS-CoV) e il coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (Severe acute respiratory syndrome - SARS) (SARS-CoV), hanno causato epidemie internazionali con un alto tasso di mortalit?.

Tutti i membri della famiglia dei Coronavirus sono caratterizzati da una struttura biochimica unica composta da virus della diarrea epidemica del suino, (Porcine Epidemic Diarrhea Virus - PEDV) a singolo filamento di acido ribonucleico (RNA). I nuovi ceppi mutati rappresentano un grave rischio a causa dell'ampia distribuzione della diversit? genetica del coronavirus, con frequenti ricombinazioni genomiche. Il coronavirus umano HCoV-229E che dopo essere originato da un Alphacoronavirus dei pipistrelli ? passato nuovamente ad un ospite animale generando il virus della diarrea epidemica del suino (PEDV), o ancora il pi? importante coronavirus umano, il SARS-CoV, che sembra avere nei pipistrelli il suo reservoir. Questa propensione ad adattarsi rapidamente a nuovi ospiti o tessuti o nicchie ecologiche ? dovuta all?elevata diversit? genomica che caratterizza i coronavirus e consente l?originarsi di nuove specie.In particolare, i pipistrelli sono il serbatoio naturale di numerosi Alpha- e Betacoronavirus, tra cui virus strettamente correlati geneticamente all?agente eziologica della sindrome respiratoria acuta severa (SARS), che emergendo nel 2002 nella provincia del Guangdong (Canton) in Cina si ? diffusa in tutto il mondo con i caratteri di una epidemia . Questi coronavirus dei pipistrelli correlati al virus della SARS, i SARS-like coronavirus (SARS-like CoV), sono stati riscontrati in Asia, Africa ed Europa. Sono state avanzate diverse teorie sulla loro origine, tra cui una possibile emergenza nei pipistrelli africani a cui sarebbe seguita la diffusione ad Europa ed Asia.

Tra novembre e dicembre 2019, un nuovo tipo di coronavirus chiamato Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), l'agente causale della malattia da Coronavirus 2019 altrimenti nota come COVID-19, inizialmente chiamato 2019-nCoV, ha rapidamente iniziato a diffondersi incontrollabilmente nella provincia di Wuhan in Cina ed a seguire in tutto i Continenti causando una Pandemia a livello globale. Il virus estratto dai campioni del tratto respiratorio inferiore di diversi pazienti infettati, ha confermato i segni genetici della famiglia dei coronavirus. I pazienti presentavano i sintomi tipici di una grave polmonite che comprendeva febbre, debolezza fisica e stanchezza, tosse secca e difficolt? respiratorie.

La natura aggressiva della SARS-CoV-2 ? particolarmente evidente in individui con comorbidit? preesistenti. Le evidenze hanno dimostrato che la SARS-CoV-2 utilizza l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) come recettore preferito per entrare ed iniziare l'infezione. L'RNA messaggero ACE2 ? altamente espresso e stabilizzato da un trasportatore neutro di aminoacidi (B0AT1) nel sistema gastrointestinale che fornisce un prerequisito per l'infezione da SARS-CoV-2.

L'aumento del numero di pazienti infetti e di decessi ? di grande preoccupazione soprattutto perch? i sintomi sono vaghi e simili a quelli di altre forme di infezione influenzali.

Secondo le ultime linee guida pubblicate dall'Organizzazione Mondiale della Sanit? (OMS), la diagnosi di COVID-19 deve essere confermata per mezzo di reazione a catena quantitativa della polimerasi con trascrizione inversa (nel seguito brevemente rRT-PCR) o dal sequenziamento genico di campioni ottenuti da campioni molecolari orofaringei, dell'espettorato o del sangue.

Tuttavia, le limitazioni dovute alla logistica, cos? come la bassa sensibilit? e gli strumenti diagnostici di specificit? attualmente disponibili, sono stati segnalati come la causa principale dell'alta incidenza di risultati falsi negativi o positivi. Attualmente, nel caso della pandemia del COVID-19, la procedura di esame diagnostico utilizzata ? analoga a quella applicata quasi un ventennio fa nel caso della SARS-CoV, che richiedeva la raccolta di campioni preferibilmente dal sistema respiratorio come gli aspirati nasofaringei, il plasma o il siero da analizzare. L?World Health Organization (WHO/OMS) ha diffuso, lo scorso 22 marzo, l?interim guidance ?Laboratory testing strategy recommendations for COVID-19?.

tra cui l'esame di elite risulta la rRT-PCR che pu? confermare la presenza di RNA virale in campioni clinici valutando con tale metodica sia l'attivit? del virus che la progressione della malattia.

Tuttavia, la SARS-CoV-2 ? ancora in una fase di evoluzione e attualmente, come per la precedente infezione da coronavirus pandemico SARS-CoV, i test disponibili hanno mostrato alcuni limiti.

Le principali preoccupazioni sono principalmente legate ai risultati falsi negativi/positivi, ai rischi legati alla scarsa sensibilit? delle procedure di screening, alle incongrue misure di raccolta dei campioni, al tempo di campionamento e agli errori di elaborazione.

Ulteriormente, seguendo le raccomandazioni dell'OMS di applicare una procedura simile a quella adottata durante la pandemia di SARS-CoV quasi due decenni fa, i campioni sequenziali dei pazienti sospetti dovrebbero essere conservati per un uso futuro.

Ci? implica pertanto che le autorit? sanitarie dovrebbero raccogliere e conservare i dati sull'anamnesi clinica e sui contatti, per generare un chiaro algoritmo che mostri i tratti e i modelli specifici del virus e il suo modo di trasmissione.

I campioni dei pazienti dovrebbero essere disponibili per l'analisi rRT-PCR, la coltura del virus, la rilevazione dell'antigene, ed i test sierologici degli anticorpi. L'OMS sostiene caldamente i governi locali nella creazione di una rete capillare di task force sanitarie designate che includono centri di prevenzione e trattamento e laboratori per l'indagine e/o l'invio di campioni di possibili pazienti COVID-19.

Pertanto, alla luce della situazione e delle imprevedibili manifestazioni della nuova infezione, si pu? ritenere che scopo principale della presente invenzione sia quello di proporre una nuova metodologia analitica per la diagnosi rapida e affidabile del COVID-19 (SARS-CoV-2) oltre che per MERS-CoV, SARS-CoV ed HCoV.

L?idea alla base dell?invenzione si basa sull'ausilio del test rRT-PCR, per la rilevazione quantitativa dell'acido nucleico di una pluralit? di virus rappresentativi di alcune patologie collegate alla famiglia Coronaviridae, quali SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV e HCoV in campioni respiratori del tratto superiore ed inferiore (come tamponi nasofaringei ovvero orofaringei), espettorato, aspirato delle vie respiratorie inferiori, lavaggio bronco alveolare e lavaggio/aspirato nasofaringeo o aspirato nasale, raccolti da individui sospettati di COVID-19 dal loro operatore sanitario.

L'RNA del virus SARS-CoV-2 ? generalmente rilevabile nei campioni respiratori durante la fase acuta dell'infezione. In accordo con i dati di laboratorio della presente invenzione, i risultati positivi o negativi sono indicativi dell'infezione da SARS-CoV-2; la correlazione clinica con i sintomi e le informazioni cliniche possono confermare la condizione di infezione del paziente.

In caso di risultati positivi, la procedura secondo l?invenzione non esclude l'infezione batterica, tuttavia si pu? valutare la co-infezione con altri virus appartenenti alla famiglia dei Coronavirus e l'agente patogeno individuato pu? essere definito come la causa della malattia.

La presente invenzione, attraverso la multiplex (MPL) rRT-PCR, richiede un controllo negativo (senza template) per eliminare la possibilit? di contaminazione del campione quando il test viene eseguito e dovrebbe essere preferibilmente usato ogni volta su ogni campione di prova.

Questo controllo non deve essere amplificato in quanto ? di elevato grado di purezza molecolare e privo di nucleasi; di preferenza il controllo avviene in due fasi MPL1, MPL2 per mezzo della rRT-PCR.

Il kit proposto rileva e amplifica l?acido nucleico virale che ? stato isolato con kit standard di estrazione e purificazione. Dopo la purificazione, l?acido nucleico ? pronto per essere amplificato nella reazione di PCR Real-Time. Ogni RNA target viene quindi rilevato grazie ad uno specifico fluoroforo (o fluorocromo) verde, giallo, arancione o rosso; i segnali di fluorescenza vengono misurati dallo strumento Real-Time PCR che fornisce infine il risultato finale. I canali da settare sul Plate Editor della strumentazione Real-Time PCR Canale sono verde (FAM), giallo (HEX.), arancione (TexasRED (R) e rosso (Cy5).

Nella prima fase di MPL1, tutti i geni target N1, N2, N3 della SARS-CoV-2 devono essere amplificati con il segnale per amplificazione nel canale FAM (N1), TexasRED (N2) e HEX (N3). L'amplificazione di Ribonucleasi P (RNase P-RP) (CY5) che appartiene alle cellule epiteliali ospiti pu? avvenire a seconda della quantit? di SARS-CoV-2 rivelata nel campione testato.

Nella seconda fase MPL2, il gene E (FAM) della SARS-CoV e la SARS-CoV-2, il gene N (HEX) della PEDV deve essere amplificato. Pertanto, sono necessari modelli positivi (COVID-19 N 1-2-3) in quanto il controllo verifica che il test sia eseguito come previsto e viene utilizzato su ogni piastra di saggio a partire dall'aggiunta di Master Mix ad una concentrazione di 10 copie/uL.

Le caratteristiche dell?invenzione sono enunciate specificamente nelle rivendicazioni annesse a questa descrizione.

Tali caratteristiche risulteranno maggiormente alla luce delle spiegazioni qui di seguito riportate, relativamente ad un esempio indicativo e non limitativo di attuazione del ritrovato, illustrato con l?ausilio di alcune figure nelle quali:

- Figura 1 mostra schematicamente la replicazione della SARS-CoV-2, in cui la via infettiva della SARS-CoV-2 dipende dall'RNA del virus;

- Figura 2 mostra un diagramma che illustra la sensibilit? della fase con ausilio di strumentazione rRT-PCR per il rilevamento del gene N1 della SARS-CoV-2, in accordo con l?invenzione;

- Figura 3 mostra una diagramma che illustra la sensibilit? della fase rRT-PCR per il rilevamento del gene N2 della SARS-CoV-2, in accordo con l?invenzione;

- Figura 4 mostra un diagramma che illustra la sensibilit? della fase rRT-PCR per il rilevamento del gene N3 della SARS-CoV-2, in accordo con l?invenzione;

- Figura 5 mostra un diagramma che illustra la sensibilit? della fase rRT-PCR per il rilevamento del gene E della SARS-CoV e della SAR-CoV-2, in accordo con l?invenzione;

- Figura 6 mostra un diagramma che illustra la sensibilit? della fase rRT-PCR per il rilevamento del gene upE di MERS-CoV, in accordo con l?invenzione;

- Figura 7 mostra un diagramma che illustra la sensibilit? della fase rRT-PCR per il rilevamento del gene dell'HCoV (CY5);

- Figura 8 mostra un diagramma che illustra la sensibilit? della rRT-PCR per il rilevamento del Coronavirus intatto dal campione di espettorato;

- Figura 9 mostra un diagramma che illustra tutti i geni RNAseP che sono stati rilevati in MPL1;

- Figura 10 sono dei diagrammi che illustrano il controllo negativo che non mostra alcun segnale di amplificazione in MPL1 e MPL2;

- Figura 11 sono dei diagrammi che illustrano il controllo positivo che ha mostrato il segnale di amplificazione di FAM (N1), TexasRED (N2), HEX (N3) in MPL1 e MPL2; FAM (E), HEX (PEDV), TexasRED (upE), CY5 (HCoV);

- Figura 12 mostra dei diagrammi che illustrano campioni negativi con ogni agente patogeno del coronavirus, i quali non hanno indicato alcuna amplificazione di tutti i geni bersaglio correlati;

- Figura 13 mostra dei diagrammi che illustrano campioni positivi per la SARS-CoV-2 con tutti i geni target dei patogeni del coronavirus, tra cui N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1 ed E (FAM) sono stati amplificati in MPL1, mentre in MPL2 anche il gene N (HEX) di PEDV ? stato amplificato;

- Figura 14 mostra dei diagrammi che illustrano campioni positivi di SARS-CoV che non hanno mostrato alcuna amplificazione dei geni bersaglio della SARS-CoV-2, N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1; in cui il gene SARS-CoV e la SARS-CoV 2 (FAM) sono stati amplificati in MPL2, ed anche il gene N (HEX) del coronavirus PEDV in MPL2 e il gene RP (CY5) della cellula epiteliale ospite in MPL1 sono stati amplificati;

- Figura 15 mostra dei diagrammi che illustrano campioni positivi a MERS-CoV indicati dalla mancanza di amplificazione di tutti i geni bersaglio della SARS-CoV-2, tra cui N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1, dove la Ribonucleasi P (RNase P-RP) (CY5) della cellula epiteliale ospite ? stata amplificata; in MPL2 non vi ? stata alcuna amplificazione per il gene E (FAM) di SAR-CoV e SARS-CoV-2, cos? come per il gene replicasi (CY5) di HCoV, anche se il gene upE (TexasRED) di MERS-CoV e il gene N (HEX) del coronavirus PEDV sono stati amplificati;

- Figura 16 mostra dei diagrammi che illustrano campioni positivi con HCoV indicati senza l'amplificazione di tutti i geni bersaglio della SARS-CoV-2 compresi N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1, ad eccezione della RP (CY5) della cellula epiteliale ospite che ? stata amplificata; in MPL2, il gene E (FAM) di SAR-CoV e SARS-CoV-2 e il gene upE (TexasRED) di MERS-CoV non sono stati amplificati, anche se il gene della replicasi (CY5) dell'HCoV e il gene N (HEX) del PEDV sono stati amplificati.

- Figura 17 mostra i diagrammi di due RNA estratti da 2 pazienti che risultavano positivi per la SARS-CoV-2 (COVID-19), in cui i geni PEDV ed E sono stati amplificati in ogni MPL2 dei pazienti (a sinistra e a destra), mentre la MPL1 del paziente 1 e 2 ha mostrato l'amplificazione dei target specifici dei geni N1, N2 e N3 di COVID-19;

- Figura 18 mostra i diagrammi di due RNA estratti da 2 pazienti che risultavano negativi per la SARS-CoV-2 (COVID-19), in cui MPL1 ha rilevato solo la presenza di cellule epiteliali dell'ospite, mentre MPL2 ha rilevato solo la presenza del PEDV;

- Figura 20 mostra schematicamente un kit diagnostico in accordo con l?invenzione ed il suo utilizzo.

Con riferimento alle figure sopra elencate, nella prima di esse si pu? osservare schematicamente come il virus si leghi al bersaglio con le sue proteine spike di superficie e lo usa come ancoraggio.

La proteina di superficie prende di mira il recettore cellulare ACE2 ed entra nelle cellule utilizzando un enzima speciale (TMPRSS2); una volta che il virione ? tranquillamente accomodato, rilascia il suo RNA.

L?apparato del DNA delle cellule ospiti viene poi utilizzato per produrre proteine virioni che vengono utilizzate per replicare l'RNA pi? infettivo. Le proteine e l'RNA sono utilizzati nell'apparato di Golgi per produrre pi? virus che pu? essere rilasciato all'esterno.

La carica virale relativa al numero di particelle virali attivamente presenti in un organismo ? legata ad un'elevata prognosi sfavorevole nei pazienti anziani, allergici e immunitari compromessi. Le prime fasi dell'infezione sono risultate spesso asintomatiche e, i primi sintomi clinici potrebbero essere facilmente confusi con i comuni sintomi della malattia del raffreddore. Le prove hanno mostrato la capacit? del virus di contaminare le cellule e i tessuti in altre parti del corpo come l'intestino, il fegato, lo stomaco e i reni. Un recente rapporto ha mostrato SARS-CoV-2 RNA in un campione di feci, avvisando su una nuova possibile via di diffusione virale attraverso il tratto fecale-orale-gastrointestinale. Inoltre, il periodo di incubazione pu? richiedere fino a diversi giorni prima che la malattia si manifesti completamente. Non ? raro incontrare persone che diventano completamente sintomatiche tra i 10 e i 15 giorni dopo la prima esposizione.

I controlli di DNA positivi sono stati fatti da frammenti sintetizzati di DNA mirato, appositamente creato per la PCR in tempo reale.

L'intento principale di utilizzare i controlli positivi N1-C[+], N2-C[+], N3-C[+], E-C[+], upE-C[+], HCoV-C[+] e PEDV-C[+], ? quello di valutare esattamente il grado di sensibilit? relativo all'amplificazione del DNA mirato.

Le sequenze di questi C[+] sono state sintetizzate con ausilio di Integrated DNA Technologies (IDT) in una scala di 100nM. Un controllo interno mirato alla Ribonucleasi P (RNase P-RP) ? necessario per verificare che l'acido nucleico sia presente in ogni campione e sia utilizzato per ogni campione trattato. Questo serve anche come controllo di estrazione per garantire che i campioni che risultano negativi contengano acido nucleico per i test.

Per l'estrazione dell'RNA ? stato utilizzato <NK>DNA-RNAprep-COLUMN per 50 preparati (fornito da Nam Khoa Biotek, H? Ch? Minh, Vietnam), che ? un kit che comprende la colonna di centrifugazione, una proteinasi K pronta all'uso, una soluzione tampone di legame, una soluzione tampone di lavaggio 1? soluzione, una soluzione tampone di lavaggio 2? soluzione, una soluzione tampone di lavaggio 3? soluzione e il tampone di eluizione.

- MATERIALI

Per le prove sono stati utilizzati i seguenti componenti e prodotti.

Campioni clinici da espettorato da casi sospetti per SARS-CoV/SARS-CoV-2 sono stati prelevati nel corso del 2020, presso la

Sono state preparate due master mix multiplex (MPL) rRT-PCR, MLP1 e MLP2 con i reagenti e metodiche elencati nella Tabella I

Il test ha utilizzato tre set di primer e sonde per rilevare 3 regioni nel nucleocapside SARS-CoV-2 (N1-F,R,P; N2-F,R,P; N3-F,R,P), 1 regione nel gene SARS-CoV upE (E-F1,R2,P1), 1 regione nel gene MERS-CoV HKU (HKURP-1F, RP-1R, RP-1Pr), 1 regione nel gene PEDV-Virus N (NF, NR, PR); il test ha utilizzato un set di primer e sonde per rilevare la RNase P (RP) umana in campioni clinici. L'RNA isolato da campioni respiratori ? stato trascritto complementare per il cDNA e successivamente amplificato utilizzando AgPath-ID? One-Step RT PCR

Durante il processo di amplificazione, le sonde sono state ridotte alla specifica sequenza target situata tra i c.d. primer "forward" e "reverse". Durante la fase di estensione del ciclo di PCR, l'attivit? per 5? della nucleasi della polimerasi Taq

degrada la sonda legata, causando la separazione del colorante del reporter (FAM/HEX/TexasRED/CY5) dal colorante del quencher (BHQ1/ BHQ2/BHQ3), generando un segnale fluorescente. L'intensit? della fluorescenza ? monitorata per ogni rRT-PCR con l'ausilio della CFX 96

Tabella I. Formula per preparare la multiplex rRT-PCR master mix.

*Il "path-ID RT-PCR buffer 2X", l'"Apath-ID RT-PCR enzyme 25X" erano del "AgPath-ID? One-Step RT-PCR"

Primers and Probes . Lo "Stabilizzatore enzimatico" ? stato fornito da questo ? per stabilizzare l'enzima nella miscela preparata per la rRT-PCR.

La fase MPL1 ? stata implementata per rilevare i target SARS-CoV-2 e per il controllo della presenza delle cellule epiteliali dell'ospite nei campioni; la MPL2 ? stata utilizzata per rilevare la SARS-CoV, SARS-CoV-2, HCoV, MERS-CoV, e anche come controllo per il riconoscimento del coronavirus integrale (PEDV).

Le multiplex MPL1 e MPL2 preparate sono state aliquotate in provette e ciascuna ha ricevuto 120 ?l per un totale di 8 mix per PCR (15 ?l/mix) e conservate a -20 ?C fino al momento dell'utilizzo.

I primer e le sonde elencati nelle Tabelle II-III-IV sono stati utilizzati per preparare la miscela principale (master mix) per le fasi MPL1-2 per rRT-PCR. Questi primer e sonde sono stati sintetizzati da IDT (Singapore e USA) in una scala di 100 nM.

Tabella II. Primer e sonde utilizzate per preparare la miscela master rRT-PCR. *PEDV Porcine Epidemic Diarrhea virus.

Tabella III. Sequenze di primer e sonde MPL1 utilizzate per preparare la master mix rRT-PCR.

Tabella IV. Sequenze di primer e sonde MPL2 utilizzate per preparare la master mix rRT-PCR.

- CONTROLLI POSITIVI

I controlli del DNA positivo sono stati ottenuti da frammenti sintetizzati del DNA mirato specificamente per l'analisi rRT-PCR. I controlli positivi, N1-C[+], N2-C[+], N3-C[+], E-C[+], upE-C[+], HCoV-C[+] e PEDV-C[+] sono stati utilizzati per verificare la sensibilit? dell'amplificazione del DNA target. Le sequenze di questi C[+] sono state sintetizzate da IDT su scala di 100 nM. Tutti i controlli del DNA positivo sono stati preparati nella soluzione stock di 100 pm/?l e poi diluiti in soluzione di lavoro di 10 mM Tris: 0,1 mM EDTA; pH 8,0 ottenendo una soluzione finale di TE 1x (10fm/?l). Tutti i controlli positivi al DNA erano aliquotati in provetta Eppendorf a basso legame , con volume di 200 ?l/ciascuna, e mantenuti a -20 ?C fino all'uso.

Il PEDV C[+] ? un controllo positivo che svolge il ruolo di controllo interno per la capacit? di rilevamento del coronavirus reale nei campioni. ? stato utilizzato un prodotto liofilizzato, conservato a -20 ?C. ? stato diluito in 200 ?l di TE 1X, poi aliquotato in 20 ?l e conservato a -20 ?C.

Il kit di estrazione dell'RNA comprendeva la colonna di centrifugazione, una proteinasi K pronta per l'uso, il tampone legante, il tampone di lavaggio 1?, il tampone di lavaggio 2?, il tampone di lavaggio 3? e il tampone di eluizione. Questo kit era fornito da <NK>DNARNAprep-COLUMN per 50 preparati (Nam Khoa Co. LTD, H? Ch? Minh, Vietnam), conservato a temperatura ambiente.

Il ciclo termico ? stato impostato nella macchina Real Time (rRT-PCR) come segue: 1 ciclo a 45 ?C per 10 minuti; 1 ciclo a 95 ?C per 10 minuti; e 40 cicli a 95 ?C per 15 secondi e a 60 ?C per 1 minuto. Sono stati selezionati anche quattro canali: FAM, HEX, TexasRED e CY5.

METODI E RISULTATI

Per quanto riguarda la sensibilit? in vitro della miscela MPL rRT-PCR, la procedura basata sull'uso di 3 provette di MPL1 e 3 provette di master mix MPL2 (ognuna da 0,1 ml) da inserire nella rRT-PCR e poi scongelate a temperatura ambiente.

Le provette sono state infine agitate per 8-10 volte, una volta finita ogni rRT-PCR la miscela principale ? stata ripartita in 24 provette (Strip) per PCR da 0,1ml bianche a basso profilo (Eppendorf, Amburgo, Germania) e conservate in ambiente freddo.

? stato preparato un gradiente 10X di diluizioni del DNA positivo ai controlli, poi sono stati aggiunti 5 ?l di ogni diluizione tra 10<-7 >e 10<-14 >alla miscela MPL per rRT-PCR. La MPL1 ha ricevuto la N1-C[+], N2-C[+], N3-C[+], N1-C[+]. Per la MPL2 sono stati aggiunti E-C[+], upE-C[+], HCoV-C[+]. Le provette PCR sono state chiuse e spostate nel termo-ciclatore CFX-96 per la procedura.

I risultati sono mostrati nelle figure da 2 a 7.

La sensibilit? della fase rRT-PCR per il rilevamento di tutti i geni bersaglio del coronavirus ? stata riassunta nella Tabella V, di seguito riportata.

Tabella V. Il limite di rilevazione (LOD) dei controlli del DNA positivo per controllare la sensibilit? della fase rRT-PCR del test.

Per quanto riguarda la sensibilit? in vitro della reazione a catena di polimerasi Multiplex (MPL in rRT-PCR) per il rilevamento del coronavirus intatto nel campione di espettorato, si consideri quanto segue.

Due provette, una di miscela principale (master mix) MPL1 e MPL2 per rRT-PCR sono state scongelate a temperatura ambiente. I campioni sono stati fortemente agitati per circa 8-10 volte e lasciati riposare per qualche istante e condivisi in 8 provette PCR 0.1 (bianco profilo basso). La MPL rRT-PCR ? stata tenuta in ambiente freddo. Il PEDV liofilizzato ? stato reidratato con 200 ?l di TE 1X ed ? stato mescolato bene e diluito (diluizione in 10 volte) in TE 1X da 10<-6 >a 10<-13>.

Ogni diluizione di 20 ?l ? stata aggiunta in 200 ?l di espettorato. L'espettorato ? stato conservato in laboratorio dopo l'esame batterico di routine.

L'estrazione dell'RNA dall'espettorato ? stata effettuata utilizzando il kit <NK>DNARNA prep-COLUMN seguendo le istruzioni del kit. Sono stati aggiunti 5 ?l di ogni RNA estratto in una miscela MPL1 e MPL2 realtime PCR.

Successivamente, tutte le provette sono state messe nel termo-ciclatore CFX-96, quindi processate (Figure 8 e 9).

Per quanto concerne il protocollo di rilevamento per SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV e HCoV dal campione, si ? proceduto come segue:

I campioni analizzati sono stati raccolti da espettorato, tampone della gola e tampone post-nasale. Tuttavia, in fase acuta, ? stato possibile raccogliere anche il plasma del sangue, in questo caso in contenitori di acido etilen-diamina-tetra-acetico (EDTA), utilizzato per isolare il plasma. I campioni sono stati conservati a 4 ?C per un periodo massimo di 48 ore, o a -70 ?C per un periodo pi? lungo a seconda delle necessit?.

Per il campione raccolto in orofaringe e nasale il tampone ? stato eluito in TE 1X per ottenere 200 ?l. La stessa procedura ? stata eseguita con plasma. Ogni campione di plasma ? stato quindi eluito in TE 1X per ottenere 200 ?l. Il campione di espettorato deve essere omogeneizzato in rapporto 1:1, 1 volume di espettorato per 1 volume di TE 1X e centrifugato per 15 secondi e raccolto. Poi 20 ?l del PEDV C [+] ? stato aggiunto in 200 ?l di campione preparato con un ulteriore 20 ?l di proteinasi K a 56 ?C per 15 minuti. Al termine dei 15 minuti il campione era pronto per l'estrazione dell'RNA utilizzando il kit <NK>DNA RNAprep-COLUMN, seguendo le istruzioni del kit.

La miscela principale (master mix) Multiplex (PCR MPL), ? stata incorporata a temperatura ambiente e miscelata agitando verso l?alto e verso il basso pi? volte per 15 secondi. La master mix, poi ? stata versata in una provetta di PCR (15 ?l/miscela) e conservato in un luogo freddo. L'RNA ? stato aggiunto ai campioni estratti insieme al DNA C[+] il TE 1X come controlli negativi e inserito nella miscela per rRT-PCR (5 ?l per ogni real-time PCR mix come indicato nella Tabella VI). Le provette PCR sono state inserite nel termo-ciclatore CFX-96.

Tabella VI. L'ingresso dei campioni estratti dall'RNA (2 campioni), il DNA C [+], il controllo negativo nella miscela MPL rRT-PCR.

*DNA-C[+] 1 ? la miscela di N1-C[+], N2-C[+], N3-C[+]; **DNA-C[+] 2 ? la miscela di E-C[+], PEDV-C[+], upE-C[+], HCoV-C[+].

I controlli negativi non sono stati amplificati (Figura 10). Questi risultati indicano che i campioni non sono stati contaminati.

Per il controllo positivo, invece, nella Multiplex MPL1, il C[+]1 aveva l'amplificazione nel canale FAM (N1), TexasRED (N2) e HEX (N3). In MPL2, il C[+]2 aveva l'amplificazione nel canale FAM (E), TexasRED (upE), HEX (PEDV) e CY5 (HCoV). Questo risultato indicava che la fase di amplificazione ? sensibile nella rilevazione di tutto il DNA target.

Questa situazione ? riportata in Figura 11, dove si vede che il controllo positivo ha mostrato il segnale di amplificazione di FAM (N1), TexasRED (N2), HEX (N3) in MPL1 e MPL2; FAM (E), HEX (PEDV), TexasRED (upE), CY5 (HCoV).

Per quanto concerne i risultati negativi della SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV e HCoV, gli agenti patogeni del DNA bersaglio non sono stati amplificati.

Tuttavia, in MPL1 la RP (CY5) ? stata amplificata per rilevare la presenza di cellule epiteliali del paziente. Nella MPL2 il PEDV (HEX) ? stato amplificato per confermare che il kit poteva estrarre l'RNA del coronavirus intatto con la procedura di amplificazione di rRT-PCR. Questa procedura di MLP1 e MLP2 ha confermato la capacit? di escludere i falsi negativi come indicato in Figura 12.

Quest?ultima mostra che i campioni negativi con ogni agente patogeno del coronavirus non hanno indicato alcuna amplificazione di tutti i geni target correlati. Questo risultato non ? falso negativo, in quanto l'MLP1 deve avere l'amplificazione del gene RP (CY5) della cellula epiteliale ospite e l'MLP2 deve avere l'amplificazione del controllo interno nel PEDV.

In relazione ai campioni risultati positivi alla SARS-CoV-2, nella MPL1 tutti i geni bersaglio N1, N2, N3 della SARS-CoV-2 sono stati amplificati rispettivamente nei canali FAM (N1), TexasRED (N2) e HEX (N3). L'amplificazione di RP (CY5) delle cellule epiteliali dell'ospite potrebbe essere presente anche se questo dato ? strettamente dipendente dalla quantit? di campione raccolto.

Nella MPL2, il gene E (FAM) di SARS-CoV e SARS-CoV-2 e il gene N (HEX) di PEDV sono stati amplificati. I risultati sono mostrati in Figura 13.

Come si vede, i campioni positivi per la SARS-CoV-2 tutti i geni bersaglio dei patogeni del coronavirus tra cui N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1 e E (FAM) sono stati amplificati in MPL1. In MPL2, anche il gene N (HEX) di PEDV ? stato amplificato.

Relativamente ai campioni che sono risultati positivi alla SARS-CoV, nella MPL1 il gene RP delle cellule epiteliali ? stato amplificato. Nella MPL2, il gene E (FAM) della SARS-CoV e della SAR-CoV-2 ? stato amplificato ed anche il gene N (HEX) della PEDV ? stato amplificato, come mostrato nella figura 14.

Quest?ultima fa vedere campioni positivi di SARS-CoV non hanno mostrato alcuna amplificazione dei geni bersaglio della SARS-CoV-2, N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1. Il gene SARS-CoV E e la SARS-CoV 2 (FAM) sono stati amplificati in MPL2. Anche il gene N (HEX) del coronavirus PEDV in MPL2 e il gene RP (CY5) della cellula epiteliale ospite in MPL1 sono stati amplificati.

Per quanto riguarda i campioni che sono risultati positivi al MERS-CoV, nella MPL1 il gene RP per rilevare le cellule epiteliali dell'ospite ? stato amplificato nella MPL2; il gene upE (TexasRED) della MERS-CoV e il gene N (HEX) della PEDV sono stati amplificati come indicato in Figura 15.

In figura 15 i campioni positivi a MERS-CoV sono indicati dalla mancanza di amplificazione di tutto il gene target della SARS-CoV-2 compresi N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1; la RP (CY5) della cellula epiteliale ospite ? stata amplificata. In MPL2, non vi ? stata alcuna amplificazione per il gene E (FAM) di SAR-CoV e SARS-CoV-2 cos? come per il gene replicasi (CY5) di HCoV.

Tuttavia, il gene upE (TexasRED) di MERS-CoV e il gene N (HEX) del coronavirus PEDV sono stati amplificati.

Relativamente ai campioni che sono risultati positivi all'HCoV, nella MPL1 ? stato amplificato solo il gene RP delle cellule epiteliali dell'ospite. Nella MPL2 ? stato amplificato il gene della replicasi (CY5) dell'HCoV e il gene N (HEX) del PEDV.

Con i risultati mostrati in Figura 16, i campioni positivi per HCoV sono indicati senza l'amplificazione di tutto il gene target della SARS-CoV-2 compresi N1 (FAM), N2 (TexasRED), N3 (HEX) in MPL1, ad eccezione della RP (CY5) della cellula epiteliale ospite che ? stata amplificata. In MPL2, il gene E (FAM) di SAR-CoV e SARS-CoV-2 e il gene upE (TexasRED) di MERS-CoV non sono stati amplificati. Tuttavia, il gene della replicasi (CY5) dell'HCoV e il gene N (HEX) del PEDV sono stati amplificati.

Da quanto esposto sopra, emerge che gli attuali risultati positivi del test diagnostico sono indicativi della presenza di SARS-CoV-2 RNA, in quanto questa procedura ha mostrato una sensibilit? e una specificit? sufficienti per essere potenzialmente indipendente dall'anamnesi clinica del paziente e da altre informazioni diagnostiche per determinare lo stato di infezione del paziente.

I risultati positivi hanno escluso l'infezione batterica o la co-infezione con altri coronavirus. Inoltre, i risultati negativi escludono inequivocabilmente l'infezione da SARS-CoV-2. Tuttavia, i risultati devono sempre essere combinati con le osservazioni cliniche attuali, le comorbilit? secondarie dei pazienti e le informazioni epidemiologiche. Nelle figure 17 e 18 abbiamo riportato quattro casi in vivo rispettivamente positivi e negativi per la SARS-CoV-2. I pazienti sono stati diagnosticati in un laboratorio autorizzato nella citt? del Vietnam collegato alla University Pham Chau Trinh, Danang City e l'RNA estratto ? stato ricontrollato dal kit per il controllo di qualit? in vivo.

Nella Figura 17 sono mostrati due RNA estratti da due pazienti positivi alla SARS-CoV-2 (COVID-19). I geni PEDV ed E sono stati amplificati in ogni MPL2 dei pazienti (a sinistra e a destra), la MPL1 del paziente 1 e 2 ha mostrato l'amplificazione dei target specifici dei geni N1, N2 e N3 di COVID-19. I risultati in vivo hanno determinato un risultato positivo altamente sensibile relativo alla presenza di SARS-CoV-2.

Nella Figura 18, sono mostrati due RNA estratti da 2 pazienti negativi per la SARS-CoV-2 (COVID-19). La MPL1 ha rilevato solo la presenza di cellule epiteliali dell'ospite, MPL2 ha rilevato solo il PEDV. Questo indicava che questi erano risultati reali, altamente sensibili, non falsi negativi.

La SARS-CoV-2 ? ancora in una fase di evoluzione e attualmente, come per la precedente infezione da coronavirus pandemico, i test COVID-19 disponibili hanno mostrato pochi limiti. Le principali preoccupazioni sono principalmente legate ai risultati falsi negativi/positivi, ai rischi legati alla scarsa sensibilit? delle procedure di screening, alle incongrue misure di raccolta dei campioni, al tempo di campionamento e agli errori di elaborazione ed operatore dipendenti.

La raccomandazione dell'OMS segue una procedura simile adottata durante la pandemia di SARS-CoV due decenni fa. I campioni sequenziali dei pazienti sospetti dovrebbero essere conservati per un uso futuro, inoltre le autorit? sanitarie dovrebbero raccogliere e conservare i dati sull'anamnesi clinica e sui contatti, per generare un chiaro algoritmo che mostri i tratti e i modelli specifici del virus e il suo modo di trasmissione. I campioni dei pazienti dovrebbero essere disponibili per l'analisi rRT-PCR, la coltura del virus e la rilevazione dell'antigene ed i test sierologici degli anticorpi. L'OMS sostiene caldamente i governi locali nella creazione di una rete capillare di task force sanitarie designate che includono centri di prevenzione e trattamento e laboratori per l'invio di campioni di possibili pazienti COVID-19.

La presente invenzione ? basata almeno in parte sui recenti risultati positivi conseguiti dalle ricerche degli inventori contro COVID-19, al fine di produrre uno strumento diagnostico rapido affidabile basato sul saggio rRT-PCR per la rilevazione della SARS-CoV-2 nell'uomo.

I risultati degli attuali test rRT-PCR sembrano promettenti, ed il presente test pu? offrire alcuni vantaggi: (1) utilizzo di una procedura in una sola fase (one-step) con diminuzione dei tempi di diagnosi. Infatti la procedura di tempo totale, inclusa l'estrazione dell'RNA e la rRT-PCR, richiede meno di 3 ore (tempi operatore-dipendenti) e pu? essere applicata in qualsiasi laboratorio dotato di Real Time PCR; (2) con questa metodologia innovativa basata su rRT-PCR, ? possibile rilevare 4 target di Coronaviridae, in una singola procedura. Il kit permette all'utente di rilevare tutti i coronavirus che sono stati conosciuti come agenti patogeni dannosi per l'uomo, tra cui SARS-CoV che causa la SARS, SARS-CoV-2 che causa il COVID-19, MERS-CoV che causa la MERS ed HCoV che causa l'influenza; (3) ? stata impostata una procedura di controllo per rilevare la presenza di possibili contaminazioni esterne ed interne per convalidare la presenza di esiti negativi cos? come l'alto livello di sensibilit? con fase di amplificazione attraverso il controllo positivo del DNA; (4) ? stato impostato un checkstep per evitare i falsi negativi utilizzando il virus della diarrea epidemica del suino, (Porcine Epidemic Diarrhea Virus - PEDV - CoV) e il gene Ribonucleasi P (RNase P-RP) come controllo interno.

Il kit proposto rileva e amplifica l?acido nucleico virale che ? stato isolato con kit standard di estrazione e purificazione. Dopo la purificazione, l?acido nucleico ? pronto per essere amplificato nella reazione di PCR Real-Time (rRT-PCR). Ogni RNA target viene quindi rilevato grazie ad uno specifico fluoroforo (o fluorocromo) verde, giallo, arancione o rosso; i segnali di fluorescenza vengono misurati dallo strumento Real-Time PCR che fornisce infine il risultato finale. I canali da settare sul Plate Editor della strumentazione Real-Time PCR Canale sono verde (FAM), giallo (HEX.), arancione (TexasRED) (R) e rosso (Cy5). Nella prima e seconda fase di multiplex (MPL1-2) MPL1, tutti i geni target devono essere amplificati.

L'intento di includere in questa procedura diagnostica anche diversi membri della Coronaviridae come SARS-CoV, HCoV e MERS-CoV era dovuto principalmente al comportamento atipico del COVID-19. In Italia abbiamo sperimentato dall'inizio del 2019 una forma molto inusuale di malattia da influenza polmonare, un'infezione che ha mostrato molti tratti comuni con l'attuale malattia COVID-19.

L'attuale scenario "pandemico" richiede test diagnostici solidi e affidabili per poter procedere con il necessario processo decisionale. Un est affidabile e sensibile come quello della presente invenzione, faciliter? l'organizzazione e la definizione di tutte le contromisure per affrontare un'epidemia e le sue conseguenze.

Questo test ? pi? veloce rispetto a quelli noti impiegati attualmente, almeno per quattro motivi: (i) i reagenti per la procedura One-Step di rRT-PCR che abbiamo scelto di utilizzare sono tra i migliori per quanto riguarda la qualit? ("AgPath-ID? One-Step RT-PCR" prodotta da Applied Biosystems-Thermo Fisher); (ii) Utilizziamo lo stabilizzatore enzimatico che permette di premiscelare tutto nella reazione e quindi l'utente non ha bisogno di preparare la miscela per la PCR; (iii) I primer che selezioniamo sono mirati al frammento corto, non c'? bisogno di allungare i tempi della reazione di estensione del ciclo termico, e questo pu? permettere all'utente di ridurre il tempo per la fase di PCR a meno di 1 ora; (iv) Il ciclo di amplificazione dei target dell'RNA dei differenti coronavirus e tutto avviene in una precdura One-Step di amplificazione via MPL1 e MPL2. In questo unico processo vengo oltremodo identificati sia i falsi negativi, sia i falsi positivi.

Ulteriormente, il test svolto con il kit secondo la presente invenzione ? rapido ed ? in grado di fare una diagnosi certa al 99,89 % rispetto a quello attualmente sul mercato che fa una diagnosi con una certezza del 70 %. Ci? ? dovuto al fatto che la sensibilit? del test si basa su tre fattori: il primo ? il prelievo del campione (per l'espettorato la sensibilit? ? superiore al tampone nasale, il lavaggio bronchiale ? pi? sensibile dell'espettorato) e questo non ? correlato al kit del test.

Il secondo fattore ? legato alla qualit? del kit, cio? alla qualit? del kit di estrazione dell'RNA e alla qualit? della miscela di reazione (Multiplex MPL1-2) per rRT-PCR. Nella nostra procedura, per la preparazione della miscela PCR, utilizziamo la migliore qualit? di reagente e la scelta migliore per i primer e le sonde, cos? la sensibilit? come abbiamo dichiarato che pu? rilevare anche solo poche copie del genoma virale (regioni esclusive proprie) del patogeno target nel volume di reazione. Il test svolto con l?invenzione ? pi? sensibile del test tradizionale, la cui sensibilit? ? del 70% circa.

Questo valore del 70% ? riportato in molti studi ed ? legato principalmente alla qualit? del campione e alla qualit? dei kit di prova, oltre che alla qualit? del campione biologico ed alla variabile operatore-dipendente.

Nel kit secondo l?invenzione vi sono due controlli per controllare la qualit? del kit durante il test del campione: L'RNAse P (RP) per controllare la qualit? del campione e la PEDV per controllare l'elaborazione del rilevamento del coronavirus.

Abbiamo potuto accettare il risultato solo quando le due qualit? sono state superate. Questo per evitare il falso negativo e garantire l'alta sensibilit? del kit di test.

La metodica di rRT-PCR ci conferma la piena identificazione del virus stesso permettendo di escludere la presenza di contaminazioni o falsi positivi (esclusione di frammenti di virus nelle cellule endoteliali ospiti) o di falsi negativi (esclusione dei frammetti del virus non individuabili perch? in numero non individuabile di copie) . Questo ? il motivo per cui ? possibile mantenere i test svolti con il kit dell?invenzione, sempre con alta qualit? e sensibilit?.

Tutte queste caratteristiche rientrano nell?ambito delle rivendicazioni che seguono.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo diagnostico per l'individuazione di virus della famiglia Corona, quali SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV e HCoV, comprendente una fase di reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa (rRT-PCR) per determinare la presenza di RNA virale in campioni clinici, caratterizzato dal fatto che detta fase di reazione della polimerasi con trascrizione inversa (rRT-PCR) ? di tipo Multiplex (MPL1, MPL2).
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, comprendente due fasi di reazione a catena di polimerasi con trascrizione inversa Multiplex (MPL1, MPL2) per la rilevazione quantitativa dell'acido nucleico da una pluralit? di virus pi? rappresentativi con ricadute epidemiche/pandemiche della famiglia Coronaviridae, quali SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV e HCoV.
3. 3. Metodo secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui attraverso le Multiplex (MPL1, MPL2) con trascrizione inversa il multiplex (rRT-PCR) ? operato un controllo negativo, preferibilmente senza template, per eliminare la possibilit? di contaminazione del campione quando il test viene eseguito.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui il controllo negativo pu? essere preferibilmente eseguito su ogni campione di prova.
5. 5. Metodo secondo le rivendicazioni 3 o 4, in cui il controllo non ? amplificato in quanto ? di grado molecolare e privo di nucleasi.
6. 6. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui una prima fase di reazione a catena della polimerasi Multiplex (MPL1) con trascrizione inversa (rRT-PCR) ? atta a rilevare il virus bersaglio SARS-CoV 2 ed al controllo della presenza di cellule epiteliali dell'ospite nei campioni, mentre la seconda fase di reazione a catena della polimerasi Multiplex (MPL2) con trascrizione inversa (rRT-PCR) ? atta a rilevare i virus SARS-CoV, SARS-CoV-2, HCoV, MERS-CoV, e anche come controllo per il riconoscimento del coronavirus integrale (PEDV).
7. 7. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui vi sono almeno due controlli per verificare la qualit? durante il test del campione: L'RNAse P (RP) per controllare la qualit? del campione, e la PEDV per controllare l'elaborazione del rilevamento del coronavirus.
8. 8. Kit diagnostico per l?attuazione del metodo secondo le rivendicazioni precedenti, ciascun Kit utile per 50 test, in cui per l'estrazione dell'RNA sono utilizzati una colonna di centrifugazione, una proteinasi K pronta all'uso, una soluzione tampone di legame, una soluzione tampone di lavaggio 1? soluzione, una soluzione tampone di lavaggio 2? soluzione, una soluzione tampone di lavaggio 3? soluzione ed il tampone di eluizione.
9. 9. Kit secondo la rivendicazione 8, comprendente tre set di primer e sonde per rilevare 3 regioni genetiche del nucleocapside SARS-CoV-2 (N1-F,R,P; N2-F,R,P; N3-F,R,P), 1 regione genetica per SARS-CoV upE (E-F1,R2,P1), 1 regione genetica per MERS-CoV HKU (HKURP-1F, RP-1R, RP-1Pr), 1 regione genetica per PEDV-Virus N (NF, NR, PR).
10. 10. Kit secondo la rivendicazione 9, comprendente un set di primer e sonde per rilevare la RNase P (RP) umana in un campione clinico.
11. 11. Kit secondo una qualunque delle rivendicazioni da 8 a 10, comprendente i seguenti componenti:
12. 12. Kit secondo una qualunque delle rivendicazioni da 8 a 11, comprendente mezzi di controllo della qualit? del kit durante il test del campione.
13. 13. Kit secondo la rivendicazione 12, in cui i mezzi di controllo comprendono RNAse P (RP) per controllare la qualit? del campione e la PEDV per controllare l'elaborazione del rilevamento del coronavirus.