JP2023546284A - ポイントオブニード診断のための等温核酸増幅方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、DNA及びRNAを含む核酸を等温増幅するための、迅速で、任意選択でマルチプレックス又はマルチマー方法に関する。詳細には、本発明は、例えば、対象とする生体プローブ中の少なくとも2種の感染性物質、又は同じ感染性物質中の少なくとも2種の異なる標的を速やかに診断するための診断方法に関する。本発明は更に、検査室及び非検査室環境で増幅方法を実施するための、手持ち式かつ携帯可能な診断システムにも関する。適した酵素配列、キット、並びに上記方法及びシステムの使用も更に提供する。JPEG2023546284000005.jpg76170
Description
本発明は、DNA及びRNAを含む核酸を等温増幅するための、迅速な、任意選択でマルチプレックス又はマルチマーの方法に関する。詳細には、本発明は、例えば、対象とする生体試料中の少なくとも2種の感染性物質、又は同じ感染性物質における少なくとも2種の異なる標的を速やかに診断するための診断方法に関する。本発明は更に、検査室及び非検査室環境で増幅方法を実施するための、手持ち式かつ携帯可能な診断システムにも関する。適した酵素配列、キット、並びに上記方法及びシステムの使用も更に提供する。
2020年3月にWHOによって世界的パンデミックと宣言されたSARS-CoV-2ウイルスアウトブレークは、信頼でき、迅速な診断、とりわけ、予防ワクチンも治療薬も利用可能でない新興感染症の診断の必要性を際立つ形で実証した。これまでのところ、短時間に高信頼性でSARS-CoV-2ウイルスを同定する高感度で迅速な診断ツールは、利用可能ではない。試験と試験結果の利用可能性の間にかなりの時間的ギャップがあり、その結果、感染個体の隔離は、さらなるウイルス拡散が起こった後にのみ開始可能であることが多いので、これは大きな問題である。それでもなお、これは、様々な種類の病原体(ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫)の存在についての試験及び診断は信頼できる結果が利用可能になるまで現在あまりに多くの時間がかかることを例示する、際立った1つのシナリオにすぎない。例えば、多剤耐性菌によって引き起こされたる感染は臨床のセッティング及び家畜生産における治療を難しくしている、個人旅行及び仕事での旅行からの帰国者は、潜在的感染を帰還後に社会環境に広げる前に、潜在的感染の早期診断を受けることを望む可能性がある、易感受性の免疫防御を有する妊娠女性及び/又はリスク群に属する個体は、自分の健康状態について早期に確信を得ることを望む可能性がある、等である。
これらの全てのシナリオは、通常、様々な感染性物質の2つ以上の核酸配列の存在及び/又は2つ以上の標的配列の存在に関する情報が必要であるという共通点を有し、この情報が緊急に必要である。感染性物質の場合、可能な限り早期に感染個体を隔離すること及び可能な限り早期にそれぞれの疾患の特異的治療レジメンを提供することが極めて重要である。しかし、任意の種類のケア領域(臨床、老人ホーム)においても、迅速で信頼できるマルチプレックス試験が容易に利用可能でないという事実に鑑みて、患者の体表面若しくは体内又は潜在的に汚染された表面における特定の感染性物質の存在について試験することは、現在においてなお問題である。
分子リアルタイムPCRアッセイのような核酸増幅技法(NAAT)は、通常、極めて高感度かつ特異的であるが、結果までの時間ということになると、PCRには、設備の良い検査室及びよく訓練された人員を必要とするという固有の不都合がまだある。それゆえ、特異性及び感度が高く、信頼できる結果を試験地でその場で提供することができる新しい携帯可能な診断ソリューションが緊急に必要である。
核酸ベースの調製、クローニング、及び診断技法に関しては、後にノーベル賞を受賞するKary Mullisのチームによる1980年代のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の、DNAを増幅するための速やかで信頼できる方法としての開発により、科学者が突然、短時間に対象とするDNA標的分子を何百万コピーも得る機会を得たため、分子生物学が全般的に革新された。簡単かつ効率的であること(例えば、最近では、単一分子/細胞のPCRを実施することが可能となっている)は、PCR技法の大きな利点となっている。
それでもなお、PCRには、熱サイクルラウンドの反復及び異なる温度間のシフト(増幅プロセス中における2又は3ステップの温度依存ステップの反復サイクル)並びに高温(>90℃)の使用を本来的に必要とする必要性を含む、ある種の欠点がある。これらの欠点により、代替の増幅方法の開発が行われてきた。
PCR代替手段の重要な1クラスは、いわゆる等温増幅方法(概説には、Zanoli及びSpoto、Biosensors (Basel), 2012 3(1):18-43)を参照のこと)と呼ばれる。PCRに優る大きな利点は、等温核酸増幅方法が、熱サイクルを全く必要とせず、定温で行うことができるという事実である。これは、増幅プロセスの操作及び制御をはるかに容易にする。更に、迅速な加熱及び冷却ステップを本来的に必要とするPCR法より少ないエネルギーが必要である。等温方法が定温であることは更に、その中で等温増幅の実施が試料汚染のリスクを低減する完全に封入された微細構造化装置を可能にし、少ない試料消費、マルチプレックスDNA分析、統合、及び携帯可能な装置の実現を意味する。最後に、定温であることは、本出願者(参照により本明細書に組み込まれているDE10 2020 109 744.1)によって最近開発されたポイントオブニード(point-of-need)及び/又は携帯可能な診断装置に極めて好ましいであろう。
現在までに利用可能な等温増幅ストラテジーには、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、多重置換増幅(MDA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)(再度、Zanoli及びSpoto、2012、同上:最近のRPA技法についての包括的調査について、Liら、Analyst、2019、144、31、31~67頁)、又はストランド侵入ベースの増幅(SIBA(登録商標)-下記のSIBA)(Hoserら、PLoS ONE、9(11):e112656、doi:10.1371/journal.pone.0112656)が含まれる。なお、PCRの等温技術と同じく、主要な短所として、非特異的な増幅産物が生成される傾向がある。
一方、例えば、NASBA、RPA、及びHDA(並びにある特定の種類の定量的PCR)は、反応の特異性を高くするのに標的特異プローブの使用に依存する。LAMPは、プローブの代わりに追加のプライマーを、鎖置換ポリメラーゼ(Notomiら、2000、Nucleic Acids Research、28: e63)と共に用いる。しかし、少なくとも30分のインキュベーションで多数の大きなプライマーを用いることは、診断応用中、特に感染症を診断するためには確実に回避すべき帰結である擬陽性結果を生むことが示されている。更に、LAMP反応は65℃という高温を必要とするという問題がある。そのような高温は、規制上及び実用上の問題のため、家庭環境で用いるための診断装置には好ましくない。その結果、LAMPは、診断用核酸増幅結果が、非検査室での使用に適するための特定の規制上の要求を満たさなければならない手持ち式装置で短時間に必要である場合には、選択する方法とはならない。
RPA及びSIBA技術は両方とも、結合及び増幅プロセス中におけるリコンビナーゼの使用に依存する。最初、RPAタイプ及びSIBAタイプの核酸増幅ストラテジーのために、オリゴヌクレオチドプライマー及びリコンビナーゼタンパク質で構成される核タンパク質複合体が形成され、これらの複合体が、プライマーが鋳型DNAに結合するのを容易にする。それらの実行時間は短い(約15分)ため、非特異的増幅は観察されていない。確かな利点は、反応を開始させるのに必要なストランド侵入を妨げずに、リコンビナーゼが少なくとも1つの不正確な塩基を許容できるという事実である。全体的に見て、全てのプライマー及びプローブ配列全体にわたって、RPAアンプリコンが最大9つのミスマッチを許容できることが示されている(Boyleら、2013、doi:10.1128/mBio.00135-13:Daherら、2014、DOI: 10.1016/j.mcp.2014.11.005参照)。これは、1塩基又は数塩基の相違がある密接に関連した標的の検出が必要である状況では、利点でありうるだろう。このセッティングの原型となる例は、感染性物質、とりわけウイルス性物質を検出するための反応の使用であり、そのような感染性物質については、感染性物質又は病原体が突然変異の急速なラウンドを経ることが知られている。したがって、実際、1個の診断キットが、対象とするウイルスの核酸配列を増幅し、それによってそれを高特異性で検出することができ、しかし、同時に、偽陰性の結果を回避するように、ある種の変異を許容するとしたら、それは極めて好都合であるだろう。
核酸増幅における生化学の進歩と平行して、核酸増幅を最適化された方法で実施するのに適した反応及び検出チャンバーを含む装置の開発も着実に開発された。大きなトレンドは、マイクロ流体装置の開発となっており、一般に、小型化又は「反応チャンバーのナノ化」、すなわちそれらをナノ形態にすることのトレンドが、試料容量、したがって試薬の必要量を低減するため、生化学的検出の利点、結果までの時間、熱転移の迅速化を実現するため、並びに自動化及び統合の可能性を有するため、更には、マルチプレックス試験及びマルチマー試験の可能性を有するための大きな関心となっている。この場合、マルチマーは、別々の(位置が離れた)反応チャンバーで行われる平行反応という意味におけるマルチプレックスを意味する。
2020年のコロナパンデミック中に明らかに例示されたように、専門化された診断センターのみでは実施できないが、分析される人から生体試料が得られる現場で直ちに実施することができる、迅速で信頼できる核酸増幅技法の進行中の世界的な必要がある。更に、厳格な予防的検疫ルールを適用しない限り、無症候の感染患者が、現在のところ24~36時間又はそれを超える時間がかかる可能性がある(信頼できる)検査結果を受け取るまで感染を広げる可能性があるという巨大なリスクがあるので、結果までの時間が最も重要であることが世界的な規模で観察された。
複数の病原体又は標的配列の速やかな試験は、例えば、SARS-CoV-2及び季節性インフルエンザについて陽性の患者と陰性の患者を識別するのに極めて重要となることが観察される。費用上の理由で、通常、呼吸器疾患の疑いのある症状を有する患者を診断する最初の医師である一般開業医は、二重の試験を通常は行わない。潜在的に汚染されている表面又は海外旅行からの帰国者の予防的試験に関しても、試験の実施が遅すぎる(疾患の症状が明らかになったときに)、又は表面等の標的汚染除去を可能にするだろう標準化された試験が、PCR試験に関する費用に鑑みて、定期的には実施されないということが頻繁に観察される。最後に、試験する所与のパネルの標的(例えば、季節性インフルエンザ株及びSARS-CoV-2)を直近の通知で適合させる(新興ウイルス株を新たに加える又は代わりに使用する)場合に、反応フォーマットを容易に適合させることができる多用途の試験システム及び装置は現在のところ存在しない。
したがって、本発明の一目的は、家庭環境下でも感染のポイントオブケア診断を可能にし、いくつかの潜在的感染及び/又は標的核酸、好ましくは診断装置に直接的に適用される1つの同じ試験試料中のものを診断するための迅速で信頼できる診断結果を提供する好ましくは手持ち式、又は少なくとも携帯可能な診断装置で、非検査室条件下及び検査室条件下で行うのに適し、かつ特異的に最適化されている新しいマルチプレックス等温核酸増幅方法を提供することであった。上記装置は、少なくとも2つの標的配列についての容易にカスタマイズ可能な試験が提供されるであろうように構成されるべきであり、上記装置は、実施される生化学反応を、関連する結果に関心を持っている顧客の診断ニーズに適合させられるように容易に交換できることを可能にする。
Zanoli及びSpoto、Biosensors (Basel), 2012 3(1):18-43
Liら、Analyst、2019、144、31、31~67頁
Hoserら、PLoS ONE、9(11):e112656、doi:10.1371/journal.pone.0112656
Notomiら、2000、Nucleic Acids Research、28: e63
Boyleら、2013、doi:10.1128/mBio.00135-13:Daherら、2014、DOI: 10.1016/j.mcp.2014.11.005
本発明は、添付の特許請求の範囲に定義される。
等温増幅ストラテジーを含むNAATが直近10年間に大きく進歩したにも関わらず、そして、核酸増幅技法に必要な高度に特異的なプライマー及びプローブを迅速に提供することができることを更に考慮に入れても、2020年における全核酸増幅インフラストラクチャは、専門化された検査室での試験に限られている。更に、マルチプレキシングが理論的に可能であり、マルチプレックスPCRキットが市販されているが、試験するのに必要な装置及びシステムでは、パラメータ(ここでは、スクリーニングで求める標的)をオンデマンドで、迅速に交換することが可能ではないので、試験のための現行のインフラストラクチャでは、容易にカスタマイズ可能な「オンデマンド試験」ストラテジーが可能ではない。
現在の試験と関連する別の問題は、ヒト又は動物対象から採取することができるか、又は非生物の表面から採取することができる、試験する試料が、感染性又は有害な物質を含有している可能性があることである。したがって、交差汚染を回避し、伝染可能性の低減するために、試料抽出と分析の間のステップを低減することが最も重要である。最後に、検査結果は、可能な限り速く利用可能であるべきである。
本発明は、ここで、あつらえの個別試験パネルを作成することができるように、可能な限り多くの平行試験を可能にする、ナノスケール増幅チャンバーで提供することができる、マルチプレックスカスタマイズ性に基づいた統合ソリューションを提供する。携帯可能で生化学の全自動の試験反応により、非検査室環境で試験を実施することができる。これは、検査室の負担を取り除くだけではなく、潜在的に伝染性の試料物質の輸送に関連する費用及びリスクを下げることができる。最後に、このストラテジーは、標的核酸決定のために用いられる生化学が、通常、正しいプライマー及びプローブの設計が提供され、特異性及び感度が抗原ベースの試験より優れていることが知られている等温核酸増幅反応に基づいているので、高信頼性かつ迅速な試験結果を可能にする。
本発明者らは、ここで、十分な設備を有する検査室の外である、現場条件下又は家庭環境で、携帯可能な増幅装置で増幅することができるので、よく使用されているストラテジーより優れたいくつかの利点を有し、RPAのような等温アッセイで完全に相互作用する新しい等温核酸増幅ストラテジーを提供する。最も重要なことに、本明細書で提供される方法は、マルチプレキシング、すなわち、任意の生体試料中の少なくとも2つの標的配列の同時増幅を可能にし、迅速かつロバストであり、特定の変異に許容性があるリコンビナーゼに依存し、新しい方法を、臨床セッティング、又は家庭環境、又は空港等における通常の診断にとって完全なものにする。
特定のリスク/患者/家畜群について標的配列のパネルをスクリーニングするのに容易に適合させることができるカスタマイズ可能な診断又は非生物的エリアから採取された試料の汚染の分析用の装置が、短時間に、診断試験結果からそれぞれの結論を得るのに有利な態勢にある、短時間に、複数の標的核酸配列についての信頼できて迅速な鑑別診断を提供するのに緊急に必要である。
したがって、本発明の一態様では、好ましくは生体試料中の又は表面若しくは検出される標的配列を潜在的に含む任意の別の供給源(土、空気等)から得られる試料中の少なくとも2つの標的配列の核酸増幅の等温方法であって、(a) (i) 少なくとも1種のリコンビナーゼ、任意選択で少なくとも1種のリコンビナーゼ補助因子、及び少なくとも1種の一本鎖結合タンパク質、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つの標的配列特異的プライマー、少なくとも1種のDNAポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを用意し、任意選択で少なくとも1種の逆転写酵素及び/又は少なくとも1種のエネルギー再生酵素を、適した反応成分と共に用意する工程であって、(ii) 前記酵素の少なくとも1つの活性に必須な少なくとも1種の補助因子が用意されないか、又は前記少なくとも1種のリコンビナーゼの活性を遮断する少なくとも1種の阻害剤が用意される、工程と、(b) 前記少なくとも1つの標的配列の存在について分析される少なくとも1つの生体試料を用意し、任意選択で前記生体試料を得るための好ましくは無菌の抽出キットを用意する工程と、(c) 任意選択で、少なくとも1種のプローブを用意し、任意選択で、検出可能なシグナルが生成されるように、前記プローブを活性化する少なくとも1種の酵素を用意する工程と、(d) 開始試薬を添加して増幅反応を開始させる工程と、(e) 少なくとも1つの増幅された標的配列を取得し、かつ/又は各シグナルが、増幅されたそれぞれの標的配列の良好な増幅を示す少なくとも1種の検出可能なシグナルを取得する工程とを含み、任意選択で、上記酵素の少なくとも1つ、より好ましくは上記酵素の少なくとも2つ、最も好ましくは使用される酵素の全てが、37℃超から約85℃、好ましくは約39℃から約60℃、最も好ましくは約40℃から約55℃の温度で最適活性を有する熱安定酵素である、方法を提供することができる。
一実施形態では、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、又は7つ以上の異なる標的配列を、好ましくは使用される同じ試料中で増幅することができる。この実施形態では、装置又はシステムは、個別のカスタマイズ可能なプライマー及び任意選択でプローブを含む別々の反応環境を表す複数の増幅チャンバーを備えることになる。各増幅チャンバーは、個々に、試料、好ましくは溶解又は別様に前処置され、任意選択で不活性化された(汚染除去された)試料を受けることができる。したがって、1回の試料抽出のみが必要であり、これは、検査室への試料輸送中の交差汚染又は感染のリスクをかなり低減する。家庭試験又は空港等で実施される試験の例では、さらなる方策(検疫、薬物投与)を直ちに、試験により、マルチマー試験される全ての試料について、信頼できる結果が、20分未満に提供されしだい、開始することができるように、感染性物質で潜在的に感染している人が直ちに特定の関連する1パネルの可能な感染性物質について試験されうる。
一実施形態では、標的配列又は複数の標的配列が、エボラウイルス、スーダンウイルス、マールブルグウイルス、ブンディブギョウイルス、サル痘ウイルス、黄熱病ウイルスから、若しくは好ましくはジカウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルスから独立に選択される少なくとも1つのアルボウイルスから選択されるか、若しくは狂犬病ウイルス、H5N1、H7N9、若しくはH9N2を含むインフルエンザウイルスA(FluA)若しくはB(FluB)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、アデノウイルス1、4、7を含むアデノウイルス、パラインフルエンザウイルス3、MERS CoV、SARS-CoV-2、パルボウイルスB19、ウエストナイルウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ノロウイルス、ウシコロナウイルス、口蹄疫ウイルス、ランピースキン病ウイルス、アフリカブタ熱ウイルスから選択されるウイルスの標的配列を含む、又は抗菌薬耐性遺伝子を含む黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む細菌の標的配列を含む、又はマイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、野兎病菌(Fransciella tularensis)、pacA/capCを含むバチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、tcdB/tcdAを含むクロストリジウム・ディフィシル(Clostridum difficile)、全リケッチア'(Pan-Ricketsia)、チフス菌(Salmonella typhi)若しくはパラチフス菌(Salmonella paratyphi)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ヨーネ菌(Mycobacterium avium subs. Paratuberculosis)、サイトメガロウイルス(CMV)、若しくはエンテロウイルス、例えば、フランシセラ・ノウタエニス・オリエンタリス(Francisella noutaenis orientalis)、ホワイトスポット症候群ウイルス、及び伝染性皮下造血器壊死症(IHHN)(ブルーシュリンプデンソウイルス[PstDNV]による感染としても知られている)を含む水産養殖衛生に関連する少なくとも1つの感染性物質の標的配列を含む、感染性物質の標的配列からなる群から個々に選択されうる。
特定の実施形態では、上記少なくとも2つの標的配列が、急性伝染病パネル、髄膜脳炎パネル、重症呼吸器疾患パネル、アルボウイルスパネル、抗生物質耐性遺伝子パネル、国特異的旅行帰国者パネル、妊娠中スクリーニングのための特異的パネル、計画入院若しくは緊急入院前の個体を試験するための特異的なパネル、紅斑症に関連する小児科疾患を含む、感染性小児科疾患についてのスクリーニングのためのパネル、並びに/又は家畜動物を試験するためのパネル、並びに/又は例えば、小エビ、サケ、及び/若しくはティラピアの感染を含む水産養殖感染を試験するためのパネルからなる群から選択される、体系的パネルの一部として用意されうる。
したがって、ユーザー(医学又は公共セクター)の必要性及び技術に基づいて、様々な容易にカスタマイズ可能なバリエーションが可能である。例えば、髄膜脳炎パネルは、個々にHSV、VMV、VZV、及び第4のチャンバーとして少なくとも1つのエンテロウィルスの標的配列を検出するように装備された増幅チャンバーを含むものでもよい。
小児科医は、小児科患者を正しく処置するための迅速な態勢にあるため、及びそれ相応に両親及び接触者に知らせるために、紅斑症に関連する小児科疾患を含む、感染性小児科疾患についてのスクリーニングのためのパネル又は関連する下痢性疾患(ノロウイルス及びロタウイルス)のためのスクリーニングのためのパネルを必要とする可能性がある。臨床意義がある別のキットが、その核酸配列を1つの同じプローブ又は試料から平行して個々にスクリーニングするFluA、FluB、SARSウイルス、及び/又はRSVを標的として含む重症呼吸器感染症パネルであってもよい。最後に、特に、それぞれの疾患が頻繁に起こる国からの帰国者については、チクングニアウイルス、ジカウイルス、デングウイルス、及び任意選択でウエストナイルウイルス標的配列を含むアルボウイルスパネルが重要でありうる。
更に、本明細書に開示するマルチプレックス試験システム、キット、及び方法は、抗生物質耐性遺伝子保持生物について、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)について、個体及び潜在的に汚染されている表面をスクリーニングするのに特に適している可能性がある。
そうすることによって、病院又は高齢者用住居での衛生管理をかなり改善することができる。
簡潔には、従来技術の等温DNA/RNA増幅方法、より詳細には「古典的」RPAは、通常、ローディング因子として作用するT4 UvsYによって補助された、中心的リコンビナーゼであるファージ由来T4 UvsXタンパク質がプライマー(フォワード及びリバースプライマー)に結合して、反応を開始させる核タンパク質フィラメントを形成し、増幅される標的核酸の到達性を保証することから始まる。得られた複合体は、標的を通常に形成する二本鎖DNA内の相同配列を、言わば「検索」する。ひとたび相同性が位置づけられたならば、複合体は、二本鎖(ds)DNAに侵入し、いわゆるDループ構造を形成する。このDループの片側は二本鎖であり、そこでプライマーが鋳型鎖とハイブリッド形成し、鎖交換反応を開始する。一方、Dループの反対側は一本鎖のままである。この巻き戻された相補鎖は、一本鎖結合(SSB)タンパク質によって安定化され、通常、そこで、T4由来gp32タンパク質が使用される。続いて、リコンビナーゼは、核タンパク質フィラメントから解離し、新しいプライマーとの別の鎖置換反応等を開始するのに直ちに利用可能となる。pp.プライマー取込みは、通常はBsu(枯草菌(Bacillus subtilis)由来)又はSau(黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来)ポリメラーゼ、通常はポリメラーゼIのラージフラグメントが使用されるDNAポリメラーゼがプライマーの端のフリーの3'-OHから合成を開始するのを可能にする。重合が続くにつれて、こうして2本の親鎖が分離し続ける。次いで、フォワードプライマー及びリバースプライマー両方の取込みが、鎖合成が両方向に同時に起こるのを可能にし、最終的に、フォワードプライマー及びリバースプライマーの間の配列からなる増幅された二本鎖DNAの指数関数的な蓄積をもたらす。
RPAは、当初、DNAの核酸増幅方法であることが実証された。次いで、本明細書に開示の方法にも特に重要なことに、後に、RPAは、同じ反応コンパートメント内に追加の酵素、逆転写酵素(例えば、マウス白血病ウイルス(MuLV)逆転写酵素由来のもの)を添加することにより、鋳型としてRNAにも適した反応であることが示された。核酸鋳型のタイプにかかわらず、推奨されるRPAアンプリコンの長さは、効率的な増幅のためには500ヌクレオチド未満であるべきである。現在発行されているRPA論文のほとんどが、通常は迅速で効率的な増幅をもたらす長さ100~250ヌクレオチドのアンプリコンを用いている。しかし、それより短いアンプリコン(79ヌクレオチド: 94ヌクレオチド)及び最大1500ヌクレオチドまでのそれより長いアンプリコンも報告されている(Liら、Analyst、2019、同上)。本発明の目的では、増幅の効率を増加させるので、通常のRPA反応の限界内の短いアンプリコンの長さが通常は好ましい。今なお、プライマーと及び任意選択でプローブの設計は、本明細書に開示の方法が、信頼できる診断結果を提供するために実施する場合には、特に重要である。PCR用とは異なり、RPAプライマーの長さは、通常、比較的長い(推奨最短長は30ヌクレオチドであるが、約32~35ヌクレオチドの範囲である)。それより短いPCRプライマー(典型的には18~25ヌクレオチド)も、RPA反応で使用することができるが、反応速度及び感度を低減させる可能性があり、これは、診断セッティングでは回避すべきである。本発明の方法による好ましい実施形態では、特に診断目的で使用される場合、対応するプライマー設計によって影響を受ける可能性のある一般的なアンプリコンの長さは、通常約50から約400塩基対(bp)、好ましくは100から約200bp、最も好ましくは約120から約150bpの範囲となる。アンプリコン長がアンプリコン増幅の効率への影響があり、したがって、反応の分析感度に直接的につながるので、200bp未満のアンプリコン長が診断目的には好ましいと考えられている。それより長い非効率的なアンプリコンは、反応時間も少し長くなり、これは一般に回避すべきである。好ましい実施形態では、本発明の方法の少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、又は更に全ての酵素が熱安定酵素である。
歴史的には、RPAアッセイは、これらの酵素の機能性、すなわち、特異的な触媒活性を焦点にして、ファージ由来の酵素で確立された。最近でさえ、「標準的な」RPA酵素は、通常、T4又はT6のような中温性ファージ(Liら、2019、同上参照)、すなわち、腸細菌である大腸菌(Escherichia coli)に特異的なファージであり、したがって、細菌の生活環、したがってファージの生活環が標準温度(体温周辺)に適応しているという意味の中温性のファージに由来する。それでもなお、これらの酵素は、その機能性により、40℃を超える温度を必要とする方法で一般に使用されてはいるが、これらの酵素は特に熱安定性ではないので、これらの酵素にはある種の不都合がある。本明細書で使用される「熱安定性」又は「熱安定な」は、標準温度を超えた高い相対温度で、その化学又は物理構造の不可逆的変化に抵抗する折りたたまれたタンパク質又は酵素の質、酵素については、分解又は重合に抵抗することによって、生体触媒として活性な三次元の折りたたまれた状態について記載するものであり、標準温度を代表する関連する参照温度は37℃である。したがって、本明細書で使用される「熱安定酵素」は、約70℃、71℃、72℃、73℃、74℃を超える温度、好ましくは約75℃を超える温度、及び/又は37℃から約85℃、好ましくは約38℃から約80℃、最も好ましくは約40℃から約65℃の最適活性温度でのみ変性を示すことを特徴とすることができる。この最適活性温度で、上記少なくとも1種の酵素が、速くて信頼できる結果を提供するための本明細書に開示の携帯可能な診断装置で行う方法に完全に適していることになる。最後に、熱安定酵素は、生理的pH又はその周辺に最適pHを有するものでもよい。ただし、これは厳格な必要条件ではない。ある実施形態では、最適pHが約pH6.0から約pH9.0の範囲内、より好ましくは約pH6.5から約pH8.5の範囲内、最も好ましくは約7.0から8.0の範囲内にある。同じ反応環境で相互作用するように選ばれた酵素が、全ての酵素が活性でありえ、その触媒活性を発揮するように、適した緩衝系で提供されることが保証されるべきである。
安価で容易にカスタマイズ可能な試験装置又はシステムを提供するために、本明細書で使用されるマルチプレキシング又はマルチマー適合性のシステムは、等温核酸増幅方法を補助する任意の種類の化学を備えることができる。様々な増幅チャンバーでの大規模平行増幅が必要である場合、それが、確立された容易に利用可能な酵素を使用するのに適している可能性がある。
ある実施形態では、熱安定酵素の使用は、標準的なRPA反応と比較して、より簡単な等温核酸増幅反応の温度制御を可能にすることができる。更に、反応を、より良好に制御可能なように実施することができ、酵素活性、したがって信頼できて速い試験結果必要条件である、貯蔵後及び再構成後の酵素安定性を保証することができる。最後に、反応添加剤を劇的に低減し、更に反応を改善することができる。RPAとは対照的に、例えば、標準的なRPAアッセイで必ず使用されるクラウディング剤の添加は、回避するか、最小量まで低減することができる。好ましい一実施形態では、本発明による等温核酸増幅反応に、クラウディング剤が別に添加されず、凍結乾燥プロセスで使用されるクラウディング剤(例えば、PEG又はグリセロール)による必然的な不純物を克服する。この態様は、少なくとも1種の熱安定酵素の使用と好ましく組み合わせることができるか、従来のセットの酵素を使用することができる。本明細書に開示する全ての方法について、当業者ならば、本明細書に開示のいずれの熱安定酵素についても、本発明の趣旨から逸脱することなく、その別の生物由来の熱安定性の機能的等価物又は組換え改変変異体も使用できることを認識する。
「生体試料」は、広義に理解すべきであり、生物から単離される任意の物質に関し、この生物由来及び/又は(加えて)その生物に感染若しくは侵入しているか、この生物と共生している病原体(病原性原核生物又は真核生物)若しくはウイルス(一本鎖又は二本鎖のRNA又はDNAゲノムを有するか、レトロウイルス)由来等の遺伝物質を含有する。生体試料には、例えば、鼻咽頭及び口咽頭スワブ又は唾液を含むスワブ及び唾液試料が含まれ、痰、血液、尿、糞便等も含まれる。好ましくは、非検査室環境で試験される生体試料は、訓練された医療従事者の支援なしに回収することができるスワブ、唾液、尿、又は糞便等である。
注目すべきことに、本発明は、非生物的な、ただし、例えば、MRSAで潜在的に汚染されている表面から得られる試料に由来する少なくとも2つの標的核酸配列を検出するのにも完全に適している。
酵素反応に適した反応成分並びにその濃度及び配合は、これらの適した反応成分が意図されている酵素及び反応が知られている場合、当業者ならば容易に決定することができる。本発明の方法に特に関連する特定の態様を以下に詳細に開示する。詳細には、分析される対象とする標的配列のそれぞれに必要なプライマー及び任意選択の対象とするプローブは、当業者ならば、本明細書に提供する開示と、当業者の共通の一般知識とに基づいて用意することができる。関連する感染性因子のゲノム配列及び/又は様々な抗生物質耐性遺伝子の配列(Sabinoら、Nature Comm、10、5252(2019)を参照)がオンラインで利用可能であるという事実に鑑みて、当業者はならば、関連情報を使用し、適したプライマー及び/又はプローブを本明細書に開示の方法で使用するための本明細書に開示のシステムに添加することができる。
様々な方法による、本明細書で使用する「開始試薬」は、この試薬が反応の正確かつ制御可能な開始を可能にするので、特に適している可能性がある。開始試薬は、少なくとも1種の酵素の必須な補助因子であって、それなしでは酵素反応が開始できない補助因子でもよい。例えば、開始試薬は、マグネシウム若しくはその塩又はマグネシウム含有溶液、例えば酢酸マグネシウムであってもよい。濃度は、多様でありえ、約5nMから20mMの間でありえる。開始試薬は、反応の開始の厳格な制御を可能にするように、個別のコンパートメント内で、活性化可能な形態又は熱活性化可能な方法で提供することができる。本発明の方法が非検査室環境で実施される場合、開始試薬は、ユーザーの単純な行為(ボタンをクリックするか、試験試料の添加後に自動起動)で反応を開始することができるように提供される。
更に、核酸増幅反応は、dNTP(ヌクレオチド三リン酸)、例えば、dATP、dGTP、dCTP、及びdTTPを必要とする。リーディング及びラギング鎖増幅では、RNAプライマーの合成のためにATP、GTP、CTP、及びUTPを含めてもよい。加えて、フラグメントラダーを生成するのにddNTP(ddATP、ddTTP、ddGTP、及びddGTP)を使用することができる。dNTPは、各NTP種について1μMから200μMの間の濃度で使用できる。dNTPとddNTPの混合物は、dNTP(1μMから200μM)の濃度の1/100から1/1000のddNTP濃度で使用することができる。UTPの使用は、キャリーオーバー予防キット(例えば、いわゆるAmpEraseを使用するThermo Fisher社)が使用される場合、特に適している可能性がある。これらの実施形態では、増幅産物が後続の反応で再び増幅されるのを防止するために、適した、通常は組換え体のウラシルN-グリコシラーゼ(UNG)を使用することができる。このために、より迅速に反応を行うことができ、偽陽性結果を回避することができる。
更に、還元剤を使用することができ、使用される還元剤には、ジチオスレイトール(DTT)が含まれる。DTT濃度は、1mMから10mMの間であってもよい。
明らかに、本明細書に開示の方法は、DNAを増幅するのに適しているだけではなく、RNAを増幅するのにも適しており、したがって、対象とする生物試料中のRNAウイルス物質を検出するのに適している。
ある実施形態では、本明細書に開示の方法、特に、異なる光源及び少なくとも1種のプローブ媒介シグナルを検出する光センサーを含むように特に構成されている本明細書に開示及び特許請求される診断装置で実施される方法において、プローブを使用することができ、好ましくは少なくとも2種の異なるプローブ、すなわち増幅される標的核酸と結合する1種のプローブ及び陽性対照と結合する1種のプローブを使用することができる。陽性対照はそのような反応が起こるかどうかの結論を可能にするので、現在利用可能な試験キットに含まれない、信頼できる陽性対照の使用、特に診断の分野での使用、より詳細にはSARS-CoV-2のような感染性物質の診断の分野での使用が非常に有用である。これは、試験が、訓練された専門家によって検査室で行われるのではなく、家庭環境又は試験ステーションで行われる場合、特に重要であり、大きな利点である。
本明細書で使用される「プローブ」という用語は、分子生物学で、特に本明細書に開示の方法で、対象とする別の分子又は構造の特性、又は診断セッティングでは量を研究するために、使用される分子又は原子を広く指す。当業者には、本明細書に開示の方法と容易に組み合わせることができる様々な異なるプローブが利用可能である(Molecular Probe Techniques社、TreeNumber E05.601、固有ID D015336、RDF固有識別子、http://id.nlm.nih.gov/mesh/D015336を参照)。本明細書に開示の特定の装置で本明細書に開示の方法を使用するため、例えばフェルスター/蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)プローブ等、検出可能及び/又は定量化可能なシグナルを提供するプローブ、任意選択で活性化可能なプローブが好ましい可能性がある。本明細書に開示の装置の特別な構成に鑑みて、これは、迅速な診断結果を可能にしうる。様々な光源、センサー、及び検出器が提供されるので、これは、1つのプローブと結合した陽性対照及び実際の標的配列と結合する異なるプローブを含む利点を与え、このことが、診断結果の信頼性を劇的に増加させることができる。
本発明との関連において、対象とする増幅結果を迅速かつ確実に検出するのに、任意のルミネッセンス検出システムを使用することができる。ルミネッセンスは、熱から生じるのではなく、物質による任意の種類の光の自然放出を表す包括的な用語である。ルミネッセンスは、様々なタイプのルミネッセンスを含み、本明細書に開示の装置は、数種類のルミネッセンスプローブ又は分析物を容易に検出するために適切な設備を備えることができるので、本発明の目的に最も関連しているのは、バイオルミネッセンス及びエレクトロルミネッセンスを含む化学ルミネッセンス並びに蛍光及び燐光を含むフォトルミネッセンスである。
RPA反応中に組み込むことができるプローブには、例えば、市販のTwistAmp(商標)エキソプローブ(典型的には、約46から52ヌクレオチドの長さを有する)及びTwistAmp(登録商標)fpgプローブ(典型的には32から35ヌクレオチド)が含まれる。これらのプローブは、蛍光発生リアルタイム検出に使用する。これらの2つのプローブは、通常、蛍光色素、一時的に蛍光シグナルを抑止する、蛍光色素に近いクエンチャー(例えばBlackHole Quencher)、及び3'末端からのポリメラーゼ伸長を防止するのに働く3'末端の遮断薬(例えば、C3-スペーサー、リン酸、ビオチン-TEG、又はアミン)で標識される(Liら、Analyst、2019、同上、特に図3A及び図3Bを再度参照)。リアルタイム検出は、蛍光体とクエンチャーの間の無塩基部位(プリン塩基もピリミジン塩基も有しないDNA中(RNA中の頻度は低い)の一位置であるアプリン/アピリミジン部位としても知られている)における蛍光発生プローブの切断に基づいている。無塩基部位は、テトラヒドロフラン(THF)又はdSpacer(THFの誘導体)若しくはdR基(C-O-Cリンカーを介した無塩基部位のデオキシリボース)とすることができる。例えば、大腸菌エキソヌクレアーゼIIIは、THF又はdSpacer部位でTwistAmp(商標)エキソプローブを切断し、一方、大腸菌グリコシラーゼ/リアーゼは、dR位置でTwistAmp(商標)fpgプローブを切断する。酵素切断後、TwistAmp(登録商標)エキソプローブは、フォワードプライマーとして働きうる。しかし、TwistAmp(商標)fpgプローブは、大腸菌グリコシラーゼ/リアーゼfpgタンパク質の触媒様式が異なり(β脱離)、伸長可能な3'-OH基を生成せず、3'リン酸基を生成するため、プライマーとして働くことができない。少なくとも1つの適した光源及び検出可能なシグナルを生成することによって、プローブ及び/又は標識の存在を特異的に検出する同系の検出装置がある限り、少なくとも1つの活性化酵素の添加を必要としないプローブを含む、対象とする核酸塩基又はヌクレオチドを検出可能な標識でマーキングするための様々な異なるプローブ又は標識も考えられる。
別の実施形態では、さらなるルミネッセンス発光団色素を使用してもよい(Royら、Biosens Bioelectron、2016年12月15日、doi: 10.1016/j.bios.2016.06.065を参照)。
本明細書に開示の方法で使用される全てのプライマー又はプローブが、天然存在のDNA及び/若しくはRNA配列、又は天然存在の塩基及び/若しくはバックボーン、若しくはプライマー若しくはプローブに共有結合及び/若しくは非共有結合によって結合した標識を含むか、プライマー若しくはプローブの安定性を増大させるための少なくとも1つのホスホチオエートバックボーンを含むか、プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼによってDNA配列の増幅を改善する合成エレメント(Skerra, Nucleic Acids Res 20, 3551-3554, doi:10.1093/nar/20.14.3551 (1992))を含む合成のプライマー若しくはプローブ、又は任意のこれらの組合せであってもよい。
その全体的構成において、本発明による装置は、光源によって可視化される様々な蛍光色素、発色団、発光団、又は他のプローブ及び/若しくは分析物若しくは色素を検出するのに適するように容易に適合させることができる。特定の実施形態では、可視化は、増幅反応中に起こるpH低下によって引き起こされるものであり、これが、適したpH感受性色素、例えばフェノールレッド又はクレゾールレッドが反応混合物に添加されることを条件として、陽性結果と陰性結果の肉眼での比色識別を可能にする。この場合、検出チャンバー(42)は、単純な色スキーム(1つの色=陽性:別の色=陰性)によって明らかにされる増幅反応の結果を肉眼で容易に得ることができるように、透明の窓を含むように構成することができる。本発明の目的に容易に適合される可能な技法は、Huangら、Microb Biotechnol 13、950-961、doi: 10.1111/1751-7915.13586 (2020)又はLuら、Int J mol Sci 21、doi:10.3390/ijms21082826(2020)に開示されている。
本明細書で使用される「クラウディング剤」は、酵素反応に最適な反応環境を提供するのを補助する任意の物質を指定するものである。クラウディング剤の作用様式は、基質と同系の酵素の間の反応の蓋然性が増大するように、より小さな反応コンパートメントを生み出すことである。通常、RPA反応に能動的に添加されるクラウディング剤には、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、及びフィコールが含まれる。クラウディング剤は、通常、反応物の1容量%から12容量%又は1質量%から12質量%の間の濃度とすることができる。全てのPEGが有用であるが、好ましいPEGは、PEG1450、PEG3000、PEG8000、PEG10000、分子量15000~20000のPEG化合物(Carbowax 20Mとしても知られている)、及びその組合せを含むように開示された。なお、クラウディング剤のような追加物質の添加は、反応にさらなる複雑さを添加する。本明細書に開示の方法において、増幅方法に使用される酵素の熱安定性及び増幅反応を実施するための特定の装置が、専門化した診断装置内で、反応パートナーが、分析される生物学的プローブである分析物と一緒にされる最適な反応環境を可能にするというさらなる事実及び/又は活性を失わずに酵素を高温で使用することができ、成分の反応性は、一般に温度の上昇に従い増大するという事実から、本発明の方法は、クラウディング剤の能動的添加なしに進行することができる。
代替又は追加に、増幅結果を更に最適化するために、ナノ構造エレメント、例えば、ZnOナノ構造(Maら、Virus Res.、2017、232: 34-40、doi: 10.1016/j.virusres.2017.01.021)を本発明の反応混合物中で使用してもよい。
本発明の等温方法における緩衝溶液は、Tris-HCl緩衝液、Tris-酢酸緩衝液、又はこれらの組合せであってもよいが、他の緩衝系も適している。緩衝液は、約10nMから100mM間の濃度で存在してもよく、これは、使用される緩衝系及び実現する反応物のpHに依存する。当業者には知られているように、後者は、対象とする酵素の最適活性の影響を受ける。
本発明の目的で試験される全ての熱安定酵素が、約pH6.0から約9.0の間、好ましくはpH7.0から8.5の範囲でかなり均質な最適pH活性範囲を有するように選ばれた。したがって、緩衝液のpHは6.0から9.0の間とすることができる。緩衝液は、更にMgイオン(例えば、Mgアセテートの形態)を5nMから100mMの間の濃度で含有していてもよく、5から15mMの間の濃度が好ましい。Mgの好ましい一濃度は10mM(Mg濃度又はMgアセテート濃度)である。
通常、RPA反応は、15分間から3時間の間又は30分間から2時間の間等、5分間から16時間の間インキュベートすることができる。インキュベーションは、所望の程度の増幅が実現されるまで実施することができる(EP2 336 361A2を参照)。本明細書に開示の方法の大きな利点は、携帯可能なシステムで検出可能な少なくとも1種のルミネッセンス、好ましくは少なくとも1種の蛍光シグナルによって可能になるある種の検出技法と組み合わせた特定の携帯可能なシステム又は装置で使用される熱安定性の生化学成分の特別な構成に鑑みて、これらの方法は増幅が極めて速いという事実である。それゆえ、当該方法は、数分後、例えば、2分後、3分後、4分後、5分後、6分後、7分後、8分後、9分後、又は遅くとも10分後に、陽性対照について、次いで、陽性又は陰性として分析される生物試料について、信頼できる結果を提供する。
本発明の方法の特定の実施形態では、少なくとも1種のリコンビナーゼを補助する酵素(生物学的又は生化学的因子)又は因子(ここでは化学因子)を追加して、好ましくはステップ(d)の前に提供することができる。そのような酵素又は化学物質は、主要なワーキングホース(working horse)、リコンビナーゼの補酵素の機能を果たし、かつ/又は化学因子は、リコンビナーゼの活性を活性化、安定化、又は他の様式で増強する。RPA反応については、UvsYが、そのようなリコンビナーゼ補助酵素、又は核タンパク質フィラメント構築の開始を助けるか、任意の種類のリコンビナーゼとの核タンパク質を安定化するローディング因子である(Li他、同上又はEP 1 759 012A2)。対象とする別のリコンビナーゼ補助酵素は、DNA合成開始後にリコンビナーゼ/dsDNA複合体の効率的な分解を促進することができるものでありうる。これらの補助酵素には、3'から5'の分解を刺激することができるもの及び5'から3'の分解を補助することができるものが含まれる。さらなるリコンビナーゼ補助酵素として、RecA又は等価物を置換することができるいくつかのポリメラーゼ、好ましくは熱安定性の3'から5'方向のリコンビナーゼを含めることができ、それらは、リコンビナーゼ-dsDNA複合体の3'から5'の分解を刺激することができる。これらのDNAポリメラーゼには、好ましくは、大腸菌PolVの熱安定性等価物及び他の種の相同ポリメラーゼが含まれる。他のリコンビナーゼ補助酵素には、ヘリカーゼと呼ばれる酵素のクラスが含まれ、これは、dsDNAからのリコンビナーゼの分解を促進するのに使用することができる。これらは、5'から3'及び3'から5'の両方向で分解を促進する。ヘリカーゼは、インビボの再結合プロセスの必須成分であり、組換え中間体の枝分かれ部位をある場所から別の場所に動かして、鎖を分離し、DNAに結合した成分を分解し、リサイクルするのに機能する。なおさらなるリコンビナーゼ補助酵素には、大腸菌RecG相同体、好ましくは熱安定酵素が含まれる。RecGは、枝分かれ構造の分解を刺激することができる。自然環境では、この酵素は、リーディング及びラギング鎖の両方を巻き戻すことにより、DNA損傷の部位で複製フォークを逆戻りさせ、4方向接合部を生じるように複製フォークを逆に動かすのに機能する。
SIBA型反応には、追加のリコンビナーゼ補助酵素としてスクロースホスホリラーゼを提供してもよい(Hoserら、同上参照)。
本明細書に開示の方法の中心的熱安定酵素は、リコンビナーゼ、好ましくは熱安定リコンビナーゼ(配列番号1参照)である。リコンビナーゼは、一本鎖DNA(ssDNA)をコーティングして、フィラメントを形成することができる酵素であり、その後、配列相同性の領域について、二本鎖DNA(dsDNA)をスキャンすることができる。相同配列が位置づけられると、核タンパク質フィラメント(リコンビナーゼ物質を含む)鎖がdsDNAに侵入し、短いハイブリッド及びDループとして知られる置換鎖バブルを生み出す。古くから知られているリコンビナーゼには、大腸菌 RecAタンパク質又は任意の門の任意の相同タンパク質若しくはタンパク質複合体が含まれる。これらのRecA相同体は、同定されたこの群の最初のメンバーに因んで、一般にRad51と呼ばれる。RecAに代わって、他のリコンビナーゼ物質を、例えばRecT又はRecOとして用いてもよい。リコンビナーゼ物質は、一般に、ATP又は他のヌクレオシド三リン酸及び活性であるそれらの類似体の存在を必要とする。
本明細書に開示の方法についても、Dループで刺激される1ラウンドの合成のすぐ後にターゲッティング部位の再生が起こりうる適した反応条件下の反応環境で、少なくとも1種の熱安定リコンビナーゼ物質が使用されることが好ましい。これは、一端から他端への振動性一方向合成(oscillating single-sided synthesis)で引き起こされるssDNAの増幅の停止又は非効率的な線形増幅を回避する。
本明細書に開示の方法の一実施形態では、提供される酵素のちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは全てを、配列番号1~8、又はその触媒活性断片、又はそれぞれの参照配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは少なくとも99%を有する配列、又はそれをコードする核酸配列からなる群から独立に選択することができる。
別の態様では、等温核酸増幅方法で使用するための熱安定酵素又は好ましくは少なくとも2種の熱安定酵素の組合せであって、上記少なくとも1種の酵素が、配列番号1から8、又はその触媒活性断片、又はそれぞれの参照配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは少なくとも99%を有する配列、又はそれをコードする核酸配列からなる群から独立して選択される、熱安定酵素又はその組合せを提供することができる。
マルチマー又はマルチプレキシング方法には、本明細書に開示の等温核酸増幅のための熱安定酵素として匹敵する機能性を有する従来の酵素も使用できる。
更に別の実施形態では、配列番号1~8のいずれか一項による酵素の機能的等価物を提供する。当業者には知られているように、細菌の配列、ウイルス及び古細菌配列は、進化の過程での保存が不十分でしかない可能性がある。したがって、上記に使用したこの文脈における「機能的等価物」は、配列番号1~8のいずれか1つのそれぞれの酵素又は直接比較される機能的な等価物として、熱安定性であり、酵素機能又は触媒活性を意味する匹敵する機能を有する酵素を指すことが意図されている。当然ながら、これらの機能的等価物は、本発明の方法によって使用することができる。
以下に詳述するように、配列番号1~8の配列は、温度及び非検査室環境で実施できる、核酸増幅の等温方法の候補を探索するインシリコ研究の後に同定された。目的は、迅速かつ確実に機能するが、検査室の外の未熟な人員でも反応を容易に実施することができるようにロバストネスが向上した1セットの酵素を得ることであった。驚いたことに、同定された候補は、単独で使用した場合、又はRPA/SIBA反応で使用される標準酵素と組み合わせて、極めて有望な酵素活性を示したが、酵素及び反応は、全体として(in toto)非検査室使用にはるかに適していた。これらの酵素は、ロバストネスが向上しており、熱安定性であるという事実に基づいて、今では古典的なRPA/SIBA反応の特定の物質及びステップを飛ばすことができる。反応の複雑さを低減させること及び温度を強化すること(感度等の減失なしで)は、診断上の使用に、更に非検査室の診断使用にさえ極めて重要である。更に、反応を駆動する生化学の複雑さを低減すれば、生産費用を低減することができる。
本明細書に開示の方法のさらなる実施形態では、少なくとも1種のエネルギー再生酵素系を提供する。一般に、記載の通り、本明細書に開示の増幅方法のためのエネルギー源としてのATPの存在が重要である。ATP再生系は以前に、核酸に結合した場合にリコンビナーゼは極めて高いATP加水分解率を有するので、持続的組換え反応を可能にするためにRPA反応に決定的に重要であると記載された(EP1 789 012A2を参照)。特に、UvsXタンパク質は、recAの10~20倍高い加水分解速度を有し、1モノマーあたり1分間あたり200分子のATPを消費できることが記載された。多くの系が、利用可能であり、一方、ATPの不十分な再生が反応速度を低減し、検出可能なレベルの産物が生成される前に、おそらく反応を停止させる可能性があるので、等温RPA反応及び類似の反応でエネルギーをリサイクルするのに慣行的に使用される。それらの系の1つは、クレアチンキナーゼ/ホスホクレアチンシステム、又はニワトリミオキナーゼであり、これが、1分子のAMと1分子のATPを2分子のADPに変換する。その後、クレアチンキナーゼ/ホスホクレアチンシステムを用いて、ADPがATPに変えられる(Liら、同上)。これらの酵素には、ホスホクレアチンジ(トリス)塩又は緩衝液(1mMから100mM)が適している可能性がある。
本発明者らは、エネルギー再生酵素又は系の提供が、熱安定酵素を用いた、本明細書に開示の方法と完全に適合しうることを見出した。なお、ATPの単純な余剰が、信頼できる増幅反応を1本のバイアル内で短時間に実施するのに完全に十分であり、信頼できる結果をもたらすことも見出された。それゆえ、特に本発明のキット及び/又は診断用手持ち式システムが本明細書に開示の方法を実施するのに使用される場合、1mMから100mMを超える量のATPの余剰を提供することが好ましい可能性がある。調製目的(例えばDNA合成)には、2つのプライマーの間のかなり短いフラグメントが規定量増幅される診断目的より高濃度のATPが必要となる。高濃度のATPを与えることが、増幅反応が良好に駆動するのに十分であることが見出された。このことは、以下のいくつかの理由で好ましい可能性がある。(i) 追加の酵素が必要ないため、反応が安く、(ii) 系がそれほど複雑でなく安定性が高く、(iii) その使用がロバストである。(iii)は、家庭環境で使用する場合及び検査分野の訓練された専門家によって実施するのではなく、ほぼ自動的に実施する場合に特に利点となる。
本明細書に開示する方法の特定の形態では、少なくとも1種の酵素が少なくとも1種のタグ及び/若しくは標識を含む。
タンパク質タグ、すなわち、対象とするタンパク質又は酵素のコード配列に付加される人工の配列は、バイオテクノロジー及び分子生物学の関連する技術分野の当業者にはよく知られている。これらのタグは、その組換え体生成の後に精製(いわゆるアフィニティータグ)、可視化、タンパク質の溶解等を容易にするためにタンパク質に付加される。
本発明の様々な実施形態によれば、本明細書に特許請求され、開示されている方法に従って使用されるあらゆる酵素が、少なくとも1種N末端若しくはC末端のいずれかに、又はタンパク質配列中(本発明のタンパク質の機能を妨げずに、好ましくは個々のドメイン間)にも、又は任意のこれらの組合せ(例えば、通常は異なるものになるN末端及びC末端タグ、例えば2つの異なるアフィニティータグ、又は溶解性タグと可視化タグ等の組合せ等)のタグを含むことができる。したがって、「タグ」又は「タンパク質タグ」という用語は、対象とするタンパク質に様々な位置、好ましくはN及び/又はC末端、又は別個の機能ドメイン間に組み込み、いくつかの異なる機能を果たすことができる、様々な異なるポリペプチド配列又はそれをコードする対応する核酸配列を指す。タンパク質タグは、例えば、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Strepタグ及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、又はHisタグ等のアフィニティータグに区別することができる。アフィニティータグは、対象とするタンパク質を特異的に精製するのに使用することができる。タンパク質タグの別の例は、対象とするタンパク質をその可溶型で、特に細菌細胞培養物中で得ることを可能にする可溶化タグである。エピトープタグは、分析的に抗体及びルミネッセンス、好ましくは蛍光タグの結合部位を有するのに使用することができ、細胞培養物中の対象とするタンパク質を検出する可能性を提供する。タグ又は標識は、簡単な同定を可能にするために、対象とするタンパク質若しくは酵素、又はその断片を標識する目的で機能することができる。これは、診断目的で特に興味深い可能性がある。
特定の実施形態では、熱安定酵素を、アフィニティータグを使用せずに生成し、精製することができるので、本明細書に開示の少なくとも1種の熱安定酵素が、好ましくはアフィニティータグを含まない。タンパク質機能に及ぼすタグの影響はないか小さく、例えばアフィニティータグを介したタンパク質精製の強化のようなかなりの利点を有するけれども、特にアフィニティータグは、タグがタンパク質活性に影響を与える可能性があるだろうという不利を有する可能性があり、それゆえ、どの位置で、タグがタンパク質活性にわずかな影響しか与えないかを個々に試験しなければならない。更に、タグは、要求されるアフィニティークロマトグラフィーの物質的コストが高い。加えて、いくつかのタグはタンパク質不活性化をもたらす可能性がある。切断可能なタグを使用することができる場合でさえ、これは、適したプロテアーゼを添加し、その後、別々のプロセスステップで再度除去しなければならないことになるので、追加の労力を引き起こすことになる。
「標識」は、その代謝変換若しくは輸送、又はとりわけ核酸増幅の診断用又は調製用アッセイ全体を通して、分子、部分、又は原子の同定を可能にする化学修飾又は同位体置換でありうる。
本明細書に開示の等温方法のための物質の標準的な適した反応条件及び濃度(例えば、酵素、プライマー、プローブ、dNTP、ATP、緩衝液、pH等)は、当業者には知られており、例えば、Liら、Analyst、2019、同上から取ることができ、一方、考慮に入れられるべき特別な状態は、特別な実施形態について本明細書に開示される。
本発明の方法の一実施形態では、少なくとも1つのフォワードプライマー及び少なくとも1つのリバースプライマーが、標的配列特異的プライマーとして用意され、これらのプライマーの少なくとも1つ、好ましくはリバースプライマーが、もう一方のプライマーと比較して多くの量若しくは濃度で用意される。通常、対象とするマルチプレックス分析のプライマー、又はプライマーの1セット、又はプライマーのいくつかのセットは、本明細書に開示の方法に従って用意することができ、プライマーは、通常、等モル比で用意する。なお、特定の目的のため、例えば、RNAウイルスの診断のために、1つのプライマーを他より高い比率で用意して、以降の増幅ステップのためにより多くのcDNAを得ることが適している可能性がある(それが(+) ssRNAウイルスであるか、(-) ssRNAウイルスであるかに応じて)ことを見出した。これは、反応の性能を増大する。この非対称性は、従来の対称又は等モルのセッティングに優る、かなりの利点となった(実施例8及び図17から図19を参照)。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、1つのプライマーをもう一方と比較して、1:1.1又は約1:1.1の比から1:10又は約1:10の比、例えば、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6~1:3、若しくは1:3から1:5、若しくは1:2から1:10又は約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6~1:3、若しくは1:3から1:5、若しくは1:2から1:10の比で用意する。好ましくは、1つのプライマーをもう一方と比較して、1:1.2~1:6又は約1:1.2~1:6の比、より好ましくは1:1.4~1:5又は約1:1.4~1:5の比、最も好ましくは1:1.5から1:4又は約1:1.5から1:4の比で用意する。
特定の実施形態では、本発明の方法は、一本鎖又は二本鎖(c)DNA及び/又はRNA核酸配列である標的配列用に使用することができる。次に、上記方法は、全ての種類の核酸物質についての全ての種類の増幅反応用に使用することができる。
PCR及び等温方法の使用を含む分子検出技法の分野で知られているように、増幅反応の結果を可視化する様々な方法がある。これらの技法は当業者には知られており、本明細書に開示の方法に使用することができる。
一実施形態では、例えば、一本鎖及び部分的に二本鎖のプライマーを含む少なくとも1つのプライマーが検出可能な標識で標識される。蛍光クエンチャーも検出可能な標識であることに留意すべきである。例えば、蛍光クエンチャーは、蛍光色素に接触させてもよく、クエンチングの量が検出される。反応を妨げないように、検出可能な標識は、増幅反応を妨げないようなものであるべきである。プライマーが部分的に、侵入鎖及び非侵入鎖を有する二本鎖である場合、検出可能な標識は、侵入鎖の増幅反応を妨げないであろうように付けられているべきである。部分的に二本鎖のプライマーの非侵入鎖は、伸長せず、非侵入鎖の標識は侵入鎖の伸長反応を妨げるべきではないということを唯一の例外として、非侵入鎖の標識化には制限がない。標識されたプライマーは、増幅された産物の検出がそうでないものより速いという利点を提供する。加えて、組み込まれている標識の検出、すなわち、伸長しなかった標識オリゴヌクレオチドは、反応の状態のモニタリングを可能にする。
別の実施形態では、二本鎖プライマーは、プライマーの二本鎖の分離が検出されるように標識することができる。上記に論じた通り、複数ラウンドの増幅の後に、部分的に二本鎖のプライマーの侵入鎖と非侵入鎖が分離される。この分離の後、非侵入鎖は、増幅反応に参加せず、今度は増幅反応の結果をオンラインで検出及びモニターするのに使用することができる。
本明細書に開示の方法の特定の実施形態では、少なくとも1つのプローブ及び/又は標識が用意され、上記少なくとも1つのプローブ及び/又は少なくとも1種の標識は、直接的若しくは間接的に検出可能な部分を含む。
更に、検出可能な標識は、蛍光標識又は酵素であってもよく、標識クエンチャー(標識阻害剤とも称する)は、蛍光クエンチャー又は酵素阻害剤であってもよい。これらの場合、標識は、蛍光又は酵素の阻害によって検出される。標識の検出は、蛍光標識が使用される場合、蛍光であるか、酵素が使用される場合、酵素活性であるだろう。
好ましい一実施形態では、特異的な標的配列でありうる別々のプローブが用意される。更に、プローブは、好都合なように増幅反応の結果をモニターする検出可能又は可視的なシグナルを提供する目的を果たしうる。プローブは、例えば酵素、例えば、Twist-RPA反応で使用されるエキソヌクレアーゼIII(本明細書ではエキソIII、エキソ)の添加により、活性化することができる、活性化可能な標識又はシグナルを与えるコンポーネントを保持しうる。標識は、特定の実施形態では、少なくとも1つのプライマーと結合してもよい。検出可能な部分が、蛍光色素、酵素、蛍光クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、色素物質、及びこれらの組合せからなる群から選択されるものであってもよいが、本明細書に開示のシステムにおける本発明の方法の非検査室使用には、放射性物質の使用、及び/又は一般に危険物質の使用(化学及び/又は生化学物質)は回避すべきである。
本発明の更に別の態様では、生体試料中の又は表面から得られた試料中の少なくとも1つの標的配列を検出するためのシステム、好ましくは携帯システム、例えば、携帯可能な診断システム又は装置であって、少なくとも1つの溶解チャンバー(12)と、少なくとも2つの増幅チャンバー(例えば14:14.1及び14.2)と、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置(16)とを含み、上記少なくとも1個の溶解チャンバー(12)が溶解液を含有し、増幅チャンバー(14)が、請求項1から10に規定の酵素のセット及び適した反応成分を含む混合物を含有し、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置(16)が、増幅チャンバー(14)又は増幅チャンバーの含有物を受け取るように構成された検出チャンバー(42)、光源(44)、光学センサー(46)、エネルギー供給手段(48)、無線データインタフェース(52)、及びコントローラ(50)を含み、システムが、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成され、したがって、平行する診断用マルチプレキシング分析を可能にする、システムを提供する。
一実施形態では、システムは、システムが合体して単一の液密アセンブリ(34)を形成することができるように構成されており、上記少なくとも1つの第1の溶解チャンバー(12)が第1のセットの化学物質及び/又は作用物質を含み、前記第1のチャンバーが使用前に閉じられ、好ましくは第1のセットの化学物質及び/又は作用物質が、増幅する少なくとも1つの標的核酸配列の到達性及び/又は試料中の潜在的に伝染性の物質の不活性化を可能にし、上記少なくとも2個の増幅チャンバー(14)の第2の増幅チャンバー(14.1又は14.2)が、第1のセットの化学物質及び/又は作用物質とは少なくとも部分的に異なり、標的遺伝子の特異性について決定的な部分において上記少なくとも1つのさらなる第2の増幅チャンバーセットの化学物質及び/又は作用物質とは少なくとも異なるそれぞれ第2のセットの化学物質及び/又は作用物質を含み、上記少なくとも1個の第1の溶解チャンバーがふた(26)を含み、ふた(26)は、上記少なくとも1個の第1の溶解チャンバー(12)及び上記少なくとも2個の第2のチャンバーの1つ(14.1又は14.2)が合体して単一の液密アセンブリ(34)を形成したときに、上記少なくとも1個の第1の溶解チャンバー(12)の含有物が個々に上記少なくとも2個の第2のチャンバー(14)のそれぞれに入るのを可能にするために、開けることができる。
したがって、対象とする少なくとも2つの核酸標的配列の存在について試験する潜在的に危険な試料を1回抽出し、本明細書に開示のシステム又は装置に提供するだけでよいことが本システムの大きな利点である。更に、試料を、増幅反応及び部分配列診断が実施される場所でその場で直接的に取得又は抽出することができる。そうすることによって、これは、試料を検査室に輸送する必要がないので、当然ながら、汚染のリスク又は潜在的に感染性若しくは危険な試料の拡散を劇的に低減する。したがって、マルチプレキシングアプローチは、対象とする試料が直接的に増幅チャンバー全体に分配され、各増幅チャンバーが、対象とする標的配列を検出するのに必要な物質を含むことを可能にする。
システムのこの特定の配置及び構成は、対照反応、例えば陽性対照を含む大きな利点を可能にし、対照反応は、通常、システムが診断装置として使用される場合、標準化された対照が提供されるなら、別の溶解を必要としない可能性がある。この使用には、システムの異なるコンパートメント又はチャンバーが、本発明のキットのコンポーネントと共に本発明の方法を実施するのに特に適しており、分析される生体試料のみを添加すればよいように、前記キットコンポーネントが、好ましくはシステムと共に提供される。別の実施形態では、チャンバーのセットを増加させられることさえできる。平行に提供されるしっかり制御可能な診断装置を提供するために、分析を多重送信する。高い衛生的な標準物質を提供する同一の時間に、及び。
一実施形態では、システムが、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置(16)を追加して含むことができ、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置(16)が、増幅チャンバー又は増幅チャンバーの含有物を受け入れるように構成された検出チャンバー(42)、ルミネッセンス、特に蛍光を励起するように構成された光源(44)、ルミネッセンス、特に蛍光を捕捉するように構成された光学センサー(46)、エネルギー供給手段(48)、無線データインタフェース(52)、及びコントローラ(50)を含む。
この実施形態は、本発明の方法と完全に結組み合わせることができ、増幅産物が、反応の定量的及び定性的結果を直ちに示す検出可能なシグナルを生成するように、蛍光若しくは活性化可能な蛍光、プローブ、又はプライマーが使用される。システムは、少なくとも2種のシグナル、例えば、分析されるプローブの潜在的シグナル及び標準化された陽性対照に関係するシグナルを検出することができるように、異なるルミネッセンスシグナルの同定を可能にする好ましくはルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置を含む。
重要なことに、本明細書に開示の等温核酸増幅の方法は、本出願者によって設計されるシステムと適合するように特に最適化されており、システム又は装置が、非検査室条件下でも、生体試料中で標的DNA又はRNAを迅速に検出するのに適している。本明細書に開示の方法を実施するのに特に適した本発明のこのシステムは、添付の図1から図4を参照した以下の通り記載のものとすることができる。
システムを対象とする第1の態様によれば、少なくとも1個の溶解チャンバー、少なくとも2個の増幅チャンバー、及び少なくとも1個のルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置を含むシステムが提供される。個々の溶解チャンバーは、試料中の細胞の溶解を引き起こし、それによって対象とする生体試料の核酸(DNA又はRNA)を放出させる溶解液を含有してもよい。溶解液は、酸、例えば、HCl、Kアセテート、又は弱アルカリ及び表面活性剤を含みうる。
増幅チャンバーは、好ましくは、本発明の等温方法を実施するための混合物を含有してもよい。好ましくは、装置の配置が、複数の増幅チャンバーの簡単な統合を可能にし、これが、上記少なくとも1個の溶解チャンバーに提供される1つの同じ試料のマルチプレックス分析を提供する。
(i) 輸送中の汚染がないこと、及び(ii) 試料の即座の分析を保証するために、分析される生体試料を、試料が得られた後に、チャンバーに直接的に提供することができる。リアルタイム蛍光検出に「エキソプローブ」が使用される場合、増幅チャンバーは、更にエキソヌクレアーゼIIIを含有してもよい(下記の実施例を参照)。更に、少なくとも第2の増幅チャンバーが存在してもよい。本明細書に詳述するエキソヌクレアーゼIII+プローブセッティングの使用は、リアルタイムセッティングで特に効率的かつ迅速であることが判明した。そのため、それらは、本明細書に開示の方法を使用する診断反応を実施するための本明細書に開示の携帯可能なシステムで存在する。その後、溶解させたか、別の方法で前処置した試料を個々に、装置内の無菌チャネルを介して個々の増幅チャンバーに移してもよい。
特定の好ましい実施形態では、マグネシウム(Mg)、例えば酢酸マグネシウムを溶解緩衝液若しくは別の緩衝液又は緩衝液に溶解する固体物質に添加することができ、Mgを制御可能なように添加することによって、オンデマンドで反応を開始することができるように、増幅反応を駆動する酵素からMgを分離しておくことが重要である。
本発明の増幅方法が本明細書に特許請求され、開示されている装置又はシステムで実施される場合、単純な円運動を施すか、装置の外表面に配置したボタンを押すことで、Mg及び対象とする生体試料を分析するための反応チャンバーへの全てのさらなる必要な試薬を含む開始物質をユーザーが添加するのが補助されるようにしてもよい。好ましくは、訓練された分子生物学者の専門知識も技術も反応を開始させるのに必要なく、このことは、高度に専門化された検査室での現在の試験システムに優るかなりの利点である。
別の実施形態では、内部陽性対照(IPC)を溶解緩衝液中に含有させることができる。別の実施形態では、IPCを提供することができ、対照反応を別々のチャンバーで行うことができる。
本発明の方法及び装置/システムと共に本発明のキットを使用する場合、キットは、対象とする生体試料を、好ましくは非侵襲的方法で抽出して、次いで、ユーザー/潜在的患者によって、装置/システムの上部チャンバー内に試料を移すことができるようにし、次いで、生体試料を溶解緩衝液等と接触させることができるようにし、潜在的に伝染性の物質の不活性化、遺伝物質の放出、及び増幅反応を装置内で自動的に実現/実施することができるようにするための無菌セットを含む。
溶解チャンバー及びピストンの組合せは、溶解チャンバー内にピストンが動く際に、通気を介した圧力解放が可能であるように配置する。通気手段は、溶解チャンバー若しくは増幅チャンバーのいずれか又は両方の含有物が、それぞれの1又は複数個のチャンバーから漏れるのを防止するように構成される。
システムは、RPA及びSIBA並びに他の方法、好ましくは等温方法等の等温増幅方法を実装するように構成する。増幅方法(標準的なRPA又はSIBAを用いた方法)は、通常、約25℃から約47℃の間の温度範囲で実行するように構成した。それでもなお、37℃を超える、より高い温度が、より速い反応動態を得、それゆえ、より迅速な結果を得るのに好ましいことがあり、後者は、診断応用において極めて好ましいというある種の実際的な問題を示した。それゆえ、約37℃から約85℃、好ましくは約39℃から約60℃、最も好ましくは約40℃から約55℃の等温増幅中温度で機能するであろう生化学反応の完全に新しい設計が重要であると判明した。単純に、システムが、装置を安全に使用するために規制問題を考慮に入れなければならない携帯可能な手持ち式装置として働くように更に構成されたという事実に鑑みて、実際的な理由により、後者の最適範囲が重要でありうる。
様々な実施形態において、初期加熱を適用することができる。特定の実施形態では、電気熱を適用することができる。他の実施形態では、システムは更に、携帯使用用でありうる。
別の実施形態は、連続加熱を実装する。方法工程の1つ又は複数において、外部加熱なしの実施形態もある。
上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置は、
- 増幅チャンバー又は増幅チャンバーの含有物を受け入れるように構成された検出チャンバー、
- 少なくとも1つの光源、
- 少なくとも1つの光学センサー、
- エネルギー供給源、
- 無線データインタフェース、及び
- コントローラ
を含みうる。
- 増幅チャンバー又は増幅チャンバーの含有物を受け入れるように構成された検出チャンバー、
- 少なくとも1つの光源、
- 少なくとも1つの光学センサー、
- エネルギー供給源、
- 無線データインタフェース、及び
- コントローラ
を含みうる。
コントローラは、マイクロコントローラ及び/又はステートマシンとすることができる。
上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置は、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置に挿入される、増幅チャンバーの加熱を可能にする加熱手段を更に含むことができる。
システムは、ポイントオブケア(POC)システムとすることができ、その場合、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置は、ポイントオブケア、例えば医師の診療室に配置される。代替的に、システムは、パーソナルシステムをすることができ、その場合、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置は、自己充足性かつ可搬性、特にポケッタブルである。
本発明のさらなる態様は、合体して単一の液密アセンブリを形成することができる少なくとも2個の異なるチャンバーのセットであり、第1のチャンバーが、第1のセットの化学物質及び/又は作用物質を含み、前記第1のチャンバーが使用前に閉じられ、第2のチャンバーが、第1のセットの化学物質及び/又は作用物質と少なくとも部分的に異なる第2のセットの化学物質及び/又は作用物質を含み、第1のチャンバーは、第1のチャンバー及び第2のチャンバーが合体して単一の液密アセンブリを形成する場合に、第1のチャンバーの含有物が第2のチャンバーに入るのを可能にするために、開くことができるふたを含む。
好ましくは、各チャンバーが、一体型のユニボディである。代替の一実施形態では、第1のチャンバー及び第2のチャンバーのアセンブリが一体型のユニボディである。
好ましくは、チャンバーは、液密なスナップフィット連結によって連結して、それにより単一の液密アセンブリを形成することができる。チャンバーを密接に連結するために、スナップフィット連結の代替として、ルアーロックと類似のスクリューロック連結を設けることもできる。別の代替は、チャンバー間のプレスフィット連結である。
少なくとも2個のチャンバーの液密アセンブリの利点は、アセンブリの含有物がアセンブリ内に厳重に確保されるので、汚染のリスクなしにアセンブリを容易に配置できることである。
好ましくは、第2のチャンバーは、ルミネッセンス、特に蛍光の励起及び検出を可能にする透明な壁を有する。
2個の最初は別々のチャンバーを含むアセンブリ及びルミネッセンス検出のためにアセンブリを受け入れることができる入れ物を有するルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置は、簡単な取り扱いを提供しながら、汚染及び感染のリスクを最小限にする単純で、クリーンで、安全なように、2つの連続した化学的又は生化学的方法工程、例えば溶解及び増幅、並びにルミネッセンス試験工程を含む試験方法を実施することを可能にする。代替的に、溶解が必要でないなら、DNA又はRNA物質が、細胞片又は物質的が含まれないかなり高純度な状態で直接的に用意されるので、マルチプレキシング目的の平行増幅反応に、2個のチャンバーを使用することができるか、診断セッティングにおいて、貴重な対照又は任意のこれらの組合せを含めることができる。試料や、任意の作用物質又は化学物質が、チャンバーのアセンブリに厳密に封入されているため、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置が使用中にそれらと接触することはないので、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置は再使用することができる。含有物がアセンブリの内部に高い信頼性で保持されるので、チャンバーのアセンブリ及びその含有物を使用後に安全に廃棄することができる。
第1の実施形態によれば、標的分析物を検出するためのシステム10は、溶解チャンバー12、増幅チャンバー14、ピストン18、及びルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16を含む:図1から図4参照。
第1の容器12は、試料を溶解させるための流体及び/又は物質を含む第1のチャンバーを封入する溶解容器である。第2の容器14は、試薬、例えば溶解容器12内で溶解された試料中の核酸を増幅するための酵素を含む第2のチャンバーを封入する試験容器14である:図1参照。
2個の容器12及び14のセットは、第1のチャンバーから第2のチャンバーへの流体の限定的な移動を可能にする手段を更に含む。図1及び図2に示す実施形態では、第1の容器12から第2の容器14への流体の限定的な移動のための手段が、ピストン18を含む。
好ましくは、2個以上の増幅又は試験チャンバー14.1及び14.2を設ける:図2参照。試験チャンバー14.1及び14.2は、第1の、例えば溶解容器と合体することができる一体の第2の容器の部分であってもよい。図11から13に示す通り、第1及び第2の容器は、それぞれ1個のチャンバー、すなわち、それぞれ溶解チャンバー12'及び試験チャンバー14'のみを有していてもよい。
注目すべきことに、複数の試験チャンバーを有する装置のこの構成は、現在、診断及び予後実務で大きな必要性があるが、高信頼性に実施することができない核酸増幅のための任意のマルチマーアッセイに特に重要である。図2に示されるセッティングでは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、又は少なくとも5個以上の試験(すなわち増幅)チャンバーが、対象とする標的配列を増幅するための特異的プライマー及び/又はプローブを予め備えていることができ、一方、基本的な生化学的検出機序は同じなので、全体的な反応成分は同じである。本発明のシステム及び関連する反応チャンバーに追加のナノ化を施してもよいことを考慮に入れて、6種以上の平行反応を実施することもできる。
この設計の大きな利点は、潜在的に伝染性の物質を患者又は非生物的な表面から、二度又は数度得る必要がなく、それにより汚染(分析される分析物又は試料の汚染及び物質に接触する人の汚染)のリスクが低減するという事実である。また、上記分析物又は試料は、その場(in situ)で簡潔に直接的に分析することもでき、1パネルの標的核酸配列を同時に同定するためのマルチプレキシングアプローチを可能にし、試験のはるかに向上した有意性及び妥当性を可能にする。更に、同時試験は、例えば第1の標的配列の第1の試験が陰性であるが、まだ、適切な対策を施すために正確に決定されていない疾患の症状を患者が依然として示している場合に、後続の試験シリーズを行う必要がないので、コスト感受性でありうる。
溶解チャンバー12は、試験する試料中の細胞又はウイルスの溶解を引き起こす溶解液を含有する。溶解によって、試験する試料中の細胞又はウイルスの破壊により、DNA又はRNA等の核酸を放出する。溶解は、塩酸等の酸又は弱アルカリを含む溶解液によって実現することができる。溶解チャンバー12を開けることができ、溶解チャンバー12内に試験する試料が入ることができるように、溶解チャンバー12はふた20を有する。溶解チャンバー12の含有物は、約100μl(最大550μl)であるが、様々でありうる。溶解チャンバーの組成も、対象とする生体試料が潜在的に伝染性の物質を含む場合、感染性又は伝染性の物質の急速な不活性化が実現されるような種類のものでありうる。
溶解チャンバーのふたは、好ましくは、試料付きの綿棒で貫くことができる膜20である。
検出システム10は、1個の第2の容器14の部分である2個の増幅チャンバー14.1及び14.2を更に含む。
各増幅チャンバー14.1及び14.2は、所望の試験分析物のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)に必要である酵素の特定の混合物を含む。好ましくは、混合物は、増幅チャンバー14内に含有されている乾いたペレット22.1及び22.2の形態で用意する。
1つ又は複数の増幅チャンバーは、好ましくは、キュベットの形をしており、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16の入れ物24に挿入することができる。入れ物24は、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16の検出チャンバー26の部分である。
各増幅チャンバー14は、それぞれの溶解チャンバー12をそれぞれの増幅チャンバー14に、密接かつ規定の方法で挿入することを可能にするような寸法にされる。アバットメント28は、挿入の深さを限定する。ひとたび溶解チャンバー12が、1又は複数個の増幅チャンバー14.1及び14.2を含む試験容器14内に完全に挿入されたならば、ピストン18は、溶解チャンバー12から増幅チャンバー14.1及び14.2内に流体を移し、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅が各増幅チャンバー14.1及び14.2で機能するのを可能にするように使用することができる。増幅チャンバー14.1及び14.2内への溶解チャンバー12の含有物の移動を可能にするために、更に薄いふた28は、溶解チャンバー12の底部に配置される。薄いふた28は、ピストン18によって引き起こされる流体圧を受けて破れる寸法にされる。代替的に、ピストン18及び薄いふた28は、ピストン18の先端(図示せず)が薄いふた28を貫くことができるように設計することができる。
溶解チャンバー12、第2の容器14、及びピストン18は、完全に挿入した場合、液密に係合するように構成される。そのような液密な係合は、スナップフィット連結によって実現することができ、溶解チャンバー12の環状突起30及び第2の容器14が他のそれぞれの部分の環状溝に係合する。同様に、ピストン18及び溶解チャンバー12の1つの環状突起32は、他のそれぞれの部分の環状溝に係合する。環状突起30及び32は、シーリングとして作用し、それぞれのチャンバー又はピストンの残部と一体型に形成されていてもよい。
スナップフィット連結の代替として、溶解チャンバー12と第2の容器14を密接に連結するために、ルアーロックに類似したスクリューロック連結を設けることができる。
第2の容器14内への溶解チャンバー12の挿入及び溶解チャンバー12内へのピストン18の挿入を可能にするために、通気手段(図示せず)を設ける。
ひとたび完全に係合したならば、第2の容器14、溶解チャンバー12、及びピストン18は、単一の液密なユニットとして扱うことができる緊密なアセンブリ34を形成する。
光が増幅チャンバー14.1及び14.2に入り、増幅チャンバー14.1及び14.2から出ることを可能にするように、増幅チャンバー14.1及び14.2の壁36は透明である。増幅チャンバー14.1及び14.2の透明な壁36が、ルミネッセンスを引き起こすことができる励起光に増幅チャンバー14.1及び14.2の含有物を曝露することを可能にする。各増幅チャンバーの含有物が発光性である場合、それぞれの増幅チャンバー14.1又は14.2内の試料のルミネッセンスを、増幅チャンバー14.1又は14.2の透明な壁36を通して検出することができる。
4種のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅の酵素の混合物を含有する各ペレット22は、リコンビナーゼ、一本鎖DNA結合性タンパク質(SSB)、及び鎖置換ポリメラーゼであるエキソヌクレアーゼIII、RNAを検出する場合は逆転写酵素を含むことが好ましい。
使用の際、試験する試料は、最初に溶解チャンバー12に満たされる。試験する生体試料内の細胞を溶解した後、増幅チャンバー14内でリコンビナーゼポリメラーゼ増幅が起こることができるように、溶解チャンバー12の全含有物を増幅チャンバー14.1及び14.2内にピストン18によって移す。
溶解チャンバー12の含有物を増幅チャンバー14.1及び14.2内に満たした後、典型的には10分間から15分間の間に、増幅チャンバー14.1又は14.2内で、ひとたびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅が起こったならば、増幅チャンバー14.1及び14.2、又は代替的にその含有物のみをルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16に入れることができる。
例示の好ましい実施形態では、全アセンブリ34が上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16の入れ物24内に挿入される。アセンブリ34を取り扱うために、ピストン18の近位末端にグリップ38を設ける。
ひとたびアセンブリ34が入れ物24内に完全に挿入されたならば、外部光、例えば迷光が容器内に入らないようにするために、入れ物24のふたを形成するカラー40を設ける。
ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16は、増幅チャンバー14.1及び14.2を受け入れるように構成された好ましくは2個の検出チャンバー42.1及び14.2を含む。検出チャンバー42.1及び42.2内に、又は検出チャンバー42.1及び42.2に隣接して、光源44.1及び44.2並びに光学センサー46.1及び46.2、例えば各検出チャンバー42.1及び42.2に対する1又は複数個の光源及び1個の光学センサーが配置されている。各光源44.1及び44.2は、検出チャンバー42.1又は42.2の含有物をそれぞれ、試料がリコンビナーゼポリメラーゼ増幅を受けている間及び後に、試験する試料中でルミネッセンスを引き起こすことができる光で照らすように構成される。各光学センサー46.1及び46.2は、ルミネッセンスが生じた場合に、それぞれの検出チャンバー42内のルミネッセンスを検出するように配置及び構成される。
光源44.1及び44.2並びに光学センサー46.1及び46.2は、好ましくは、ルミネッセンスを引き起こすためのバンド幅及び少なくとも1つのさらなるバンド幅を有する光をそれぞれ放出及び感知するように構成される。
検出チャンバー42.1及び42.2は、1個の検出チャンバー42.1又は42.2からの光が他のそれぞれの検出チャンバー42.2又は42.1に入るのを防止する少なくとも1個の不透明な壁70で分離される。
光源44.1及び44.2並びに光学センサー46.1及び46.2に動力を供給するために、エネルギー供給源48を設ける。エネルギー供給源48は、バッテリー、好ましくは再充電バッテリーを含んでもよい。代替又は追加に、エネルギー供給源48は、外部動力供給源にルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16を連結するための動力インタフェースを含んでもよい。動力インタフェースは、有線でも、無線でもよい。エネルギー供給源48は、光起電力供給を提供するための太陽電池を含んでもよい。
光源44.1及び44.2並びに光学センサー46.1及び46.2は、光源44.1及び44.2並びに光学センサー46.1及び46.2の動作を制御し、光学センサー46.1及び46.2によって提供されるセンサー出力シグナルを更に読み出すように構成されたコントローラ50に更に連結される。コントローラ50は、マイクロコントローラ又はステートマシンとすることができる。
コントローラ50は、マイクロコントローラ50と、携帯電話又はデータ通信及びデータプロセシングのための別の装置等との外部装置の間のデータ通信を可能にするように構成される無線データインタフェース52に作動的に連結される。
好ましくは、無線データインタフェース52は、コントローラ50、エネルギー供給源48、及びデータメモリー54に作動的に連結され、エネルギーハーベスティングデータストレージ及びデータ通信を提供するように構成される。特に、無線インタフェース52は、近距離無線通信(NFC)のための手段を実装し、コントローラ50との通信のためのI2Cデータバス56等のデータバスを含む。外部の装置によってルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16を制御及びアップデートすることが可能なように、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16によって生成されたデータを外部の装置に送り、外部装置から制御コマンド及び/又はソフトウェアアップデートを受け取るために、無線データインタフェース52は、好ましくは、双方向データ通信を可能にするように構成される。
無線データインタフェース52は、近距離無線通信の代替としてWIFI通信を実装してもよい。別の代替はブルートゥース通信である。
好ましくは、無線データインタフェース52、コントローラ50、及びデータメモリー54を実装する全ての電子部品は、平らなプリント板60上に配置される。平らなプリント板60は、ラミネートされたカードの部分でもよく、電子部品は、2枚のラミネートされたカバーシート62の間に配置される。カバーシート60の一方又は両方の表面にある電気接点64は、電子部品と、光源44又は光学センサー46等のさらなる部品との間の通信及びエネルギー移動を可能にする。代替的に、他の実施形態では、プリント回路基板は、フレキシブル、セミフレキシブル、又はリジッドフレキシブルボードであってもよい。プリント回路基板は、従来の回路基板でも、プリンティング若しくは他のアディティブ法、又はその組合せにより製造される回路基板でもよい。
電子部品に加えて、2枚のカバーシート62間にラミネートすることができるプリント回路基板60は、無線データ通信のための少なくとも1個のアンテナ66も含む。
任意選択で、加熱手段を設けることもできる。加熱手段は、上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置内に組み込まれ、アセンブリ34と、それにより増幅プロセスを開始及び/又は促進するその含有物とを加熱することができる電熱器を含んでもよい。好ましくは、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16は、電熱を自動的に開始するように構成される。ひとたびアセンブリ34が入れ物24に挿入されたならば、アセンブリ34の挿入は、専用のセンサー、例えばスイッチにより、又は光学センサー46により検出することができる。ひとたびアセンブリが容器24に挿入されたならば、外部光が検出チャンバー42に入るのを、カラー40が防止するので、特に、光学センサー46は、アセンブリが入れ物24に挿入されたことを感知することができる。したがって、入れ物24内へのアセンブリ34の挿入は、光学センサー46で感知される光強度の低下を引き起こす。光強度のそのような低下を検出することができ、それが、電熱の開始シグナルを引き起こすことができる。
代替又は追加に、加熱手段は、ひとたび試料が増幅チャンバー14.1及び14.2内に満たされたならば、増幅チャンバー14.1及び14.2内にある発熱反応を行う化学物質によって提供されてもよい。溶解チャンバー12が第1の成分を含み、増幅チャンバー14.1及び14.2が第2の成分を含むことも可能であり、これら2種の成分が発熱反応することもできる。溶解チャンバー12の含有物が増幅チャンバー14.1及び14.2内に移されるときに、発熱反応が始まる。
代替又は追加に、加熱手段は、ひとたび試料が入れ物に導入されたならば、発熱反応を行う化学物質によって提供されてもよい。これらの化学物質は、加熱化学物質を含有する別々に密封された配置で、増幅チャンバー14.1及び14.2の近くに配置される。トリガーによって、発熱化学反応が開始する。これは、システムが例えば携帯可能な診断ツールとして使用される場合に、適したものでありうる。
上記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置の加熱を可能にする別の代替は、蛍光の検出装置の外側を暗色、例えば黒色にすることである。それにより、例えば、増幅チャンバーと共に蛍光の検出装置を太陽で加熱することができる。好ましくは、増幅チャンバーと共に蛍光の検出装置の潜在的な過熱を示す温度制御手段を提供する。温度制御手段は、予め定義された温度は超えた場合に、その色を変えるインク又はペンキを含んでもよい。したがって、特定の温度で色を変え、蛍光の検出装置の外側に塗られる指示薬を温度制御手段としてもよい。
検出チャンバー42.1及び42.2は、4cm×10cm×10cmより小さい外寸法を有する検出チャンバーハウジング72内に配置される。好ましくは、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置16全体の容積が200cm2より小さく、更に好ましくは100cm2より小さい。好ましい一実施形態では、最も長い外寸法は、最も短い外寸法の少なくとも2倍の長さである。
蛍光の検出装置16'は、第2の入れ物68を提供してもよく、溶解チャンバー12は、増幅チャンバー14との連結の前に配置することができる:図5参照。第2の入れ物68は、使用前に、増幅チャンバー14及び溶解チャンバー12をホストすることができる。
システムの別の実施形態によれば、試験装置16'''は、図6及び図7に示す外形を有する。入れ物24'は、検出チャンバー42'も収容する試験装置16''の最上面上の円すい台形の突起72に収容され、したがって検出チャンバーハウジング72である。
試験装置16''は、4個のスクリュー76によって1つにねじ止めされた最上部パート74.1及び底部パート74.2を有する2パートケース74を有する:図9及び図10を参照。
内部ケース74、再充電バッテリー78、メインプリント回路基板(メインPCB)80、補助PCB82、NFC(近距離無線通信)アンテナ84、及び検出チャンバー筐体86が配置されている:図8から図10参照。
メインPCB80及び補助PCB82は、フレキシブルフラットケーブル88によって電気的に連結される:図12参照。メインPCB80は、バッテリー78を充電するのに使用されるUSB-Cポート90を保持する。USB-Cポートは、試験装置16'の前面からアクセス可能である:図8参照。バッテリー78は、試験装置16''のエネルギー供給源48の部分である:図8から図10参照。
補助PCB82は、2個の照射光源、特に、検出チャンバー42'の光源44である発光ダイオード(LED)92を保持する。補助PCB82は、LED92の間の中心に配置される光学センサー46を更に保持する。検出チャンバー筐体86は、LED92及び光学センサー46をカバーし、試験装置16''に挿入される試験チャンバー14'(増幅チャンバー14)の入れ物24'への光経路94及び96を提供する。
円すい台形の突起72は、溶解チャンバー12'及び試験チャンバー14'を含む液密アセンブリ34の形と一致する。円すい台形は、迷光が入れ物24'に入るのを防止する。同様に、検出チャンバー筐体86は、更に迷光が入れ物24'に入るのを防止する。
検出チャンバー42は、図11から図13に示す通り、キュベット又は液密アセンブリ34'を受け入れることができる。キュベット(図示せず)又は液密アセンブリ34'の試験チャンバー14'は、試験チャンバーを封入する透明な壁を有する。キュベットの試験チャンバー内には、リコンビナーゼを含むリコンビナーゼポリメラーゼ増幅の酵素の混合物、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)、鎖置換ポリメラーゼであるエキソヌクレアーゼIII、及びRNAを検出する場合は逆転写酵素がある。酵素のこの混合物によって、標的分析物、特にDNA又はRNA等の核酸を、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)により試料中で増幅することができる。試料中の核酸の存在を検出するには、蛍光検出技法を使用することができる。特定の波長の光源が標的核酸を照射した後に、DNA結合色素又は核酸の蛍光結合プローブが反応し、蛍光シグナルが放射するのを可能にする。蛍光シグナルは、標的核酸の存在の指標である。
光源92は、キュベットの試験チャンバー内のプローブを照射するように配置される。検出チャンバー42を封入する壁86は不透明である。光源92によって放射される照射光は、光チャネル94及び96に沿って通過して、キュベットの透明壁を通して、キュベットの試験チャンバー内の試料を照射することができる。キュベットの試験チャンバー内の試料によって放射又は散乱される任意の光を光センサー46で記録することができる。光経路20は、光源92によって放射される光が光センサー46に直接的に当たるのを防止する。好ましくは、光源92がそれぞれ異なるバンド幅、例えば、それぞれ青色光及び緑色光で発光する。
光センサー46は、様々な光バンド(波長範囲)の光を同時に記録できる多チャネル光センサーである。例えば、光センサー16は、4、6、又は8つ光バンドを同時に記録することができるものでありうる。光センサー46は、コントローラ50に連結される。コントローラ50は、PCB80上に配置され、光センサー46によって提供される出力シグナルを経時的に記録及び保存するように構成される。したがって、コントローラ50は、別々に各チャネルについて光センサー46によって経時的に記録される光の強度を表すデータを生成することができる。例えば、6つの異なる光バンド内、すなわち、6つの異なる波長範囲内の光の強度を表す6本の異なる曲線を記録することができる。
検出装置16'''は、図11から図13に示す液密アセンブリ34'を一致するように構成される。液密アセンブリ34'は、溶解チャンバー12及び試験チャンバー14'を含む。
溶解チャンバー12'及び試験チャンバー14'は、2パート、すなわち下部ハウジングパート104.1及び上部ハウジングパート104.2で構成されるハウジング104内に保持される。下部ハウジングパート104.1は、ハウジング104の底部に向かって広がるすそ広がりの側壁106を有する。すそ広がりの側壁106は、検出装置16'''の円すい台の形の突起72に適合するように構成される(図7から図10参照)。
ハウジング104の最上部は、溶解容器12'の'溶解チャンバー13'内にスワブを挿入するための中央開口部102を選択的に開くために開口位置(図11b参照)に旋回することができるキャップ105によって閉じられる。
ハウジング104の上部パート内に、溶解容器12'は、溶解容器外壁の上側セクションの周りの外向きに延びる周縁カラー108及びハウジング104の上側セクションの内壁にある内側に延びる2個の周縁裂部110によって実現される放出可能なスナップフィット連結によって保持される。溶解容器12'の外側に延びる周縁カラー108が、ハウジング104の内壁に内側に延びる2つの周縁裂部110の間の溝に保持される。溶解チャンバー12'とハウジング104の間のスナップフィット連結は、とりわけ形と物質及び形の弾性特性を一致させることによって提供されるスナップフィット連結の設計によって提供される予め決定された閾値を超える軸方向に溶解チャンバー12'に作用する力によって解放することができる。
溶解容器12'の底112に、中空針114が配置される。針114は、好ましくはステンレス製である。
溶解容器底部112を含む溶解容器12'の下部パートは、試験容器14*の上部パートから上向きに延びる試験容器伸長部118によって形成される溶解容器入れ物116内に延びるように配置される。溶解容器12'の下部パートの外径は、溶解容器入れ物116の内径に対応する。
試験チャンバー15'を封入する試験容器14'に対するハウジング104の回転は、試験容器14'の相対的軸運動を引き起こす。これは、ハウジング104の壁の内側面に形成される少なくとも1本の螺旋溝120によって実現される。例示の実施形態では、3本の螺旋溝120が設けられている。試験容器伸長部118上の放射状突起122は、溝120内に放射状に伸長する。したがって、溝120は、試験容器伸長部118の放射状突起122の螺旋スロット型リンクガイドとして働く。螺旋溝120は、試験容器14'が回転せずに、ハウジング104が回転するとき、試験容器14'の軸運動を引き起こす。
ハウジング104が回転する際の試験容器14'の回転を防止するために、試験容器14'の壁から放射方向に延びる短い縦裂部124が設けられている。検出装置16''の入れ物22'に液密アセンブリ34'の試験容器14'が挿入されるとき、裂部124は、検出装置16''の入れ物22'の切痕98と係合する。入れ物24'の周縁内縁部100の切痕98'は、試験チャンバー14'を溶解チャンバー12'に向けて動かすために、液密アセンブリ34'のすそ広がりの外側壁106(図14及び図16参照)を手で回転させた際に、試験チャンバー14の側面突起と相互作用して、試験チャンバー14が回転するのを防止するように構成される。
試験容器14'に対するハウジング104の回転は、溶解容器12'に向けた試験容器14'の軸運動を引き起こす。これは次に、針114による試験容器14'のエラストマーセプタム28'(すなわち、ふた)の貫通を引き起こす。最初は試験容器14'内の第2のチャンバーを閉鎖しているエラストマーセプタム28'(針によって貫通される試験容器のふたとして働く隔壁)を、溶解容器12'の底部112の針114が、ひとたび貫通すると、溶解容器12'から試験容器14'内に流体を移すことができる。
溶解容器12'に向けた試験容器14'の軸運動は、溶解容器12'の圧縮及びそれによる溶解チャンバー13'から試験チャンバー15'内への流体の移動を更に引き起こす。ハウジング104のさらなる回転は、ハウジング104の内壁に内側に延びる2つの周縁裂部110の間の溝の中に溶解容器12'の外側に延びる周縁カラー108によって、溶解容器12'が保持されている状態から解放されるのに必要とされる力を、溶解容器12'の圧縮を引き起こす溶解容器12'上の軸力が超えるまで、溶解容器12'のさらなる圧縮を引き起こす。ひとたび解放されたならば、溶解容器12'は上向きに自由に(すなわち、ハウジング104の最上部の中央開口部102に向かう方向に)動くことができ、溶解容器12'は更に圧縮されない。したがって、溶解チャンバー13'から試験チャンバー15'内への流体のさらなる移動が停止される。溶解容器12'の圧縮は、このように、ハウジング104の内壁に内側に延びる2つの周縁裂部110の間の溝から、溶解容器12'の外に延びる周縁カラー108を押すのに必要な力によって制限される。
検出装置16''と組み合わせて液密アセンブリ34'を使用するには、最初に、試験する試料とのスワップが中央開口部102を介した溶解キャンバ13'内に挿入される。次に、キャップ105が閉じられ、溶解チャンバー13'内で溶解が起こることができる。ひとたび溶解が起こったならば、試験容器14'を検出装置16''の入れ物22'の中に挿入することによって、液密アセンブリ34'を検出装置16''と係合させることができる。これは、ハウジング104の下部セクションのすそ広がりの側壁106によって、容易になっている。
試験容器14'の短い縦裂部124が検出装置16''の入れ物22'の切痕98と係合するのを可能にする正しい方向性における検出装置16''との液密アセンブリ34'の係合を更に容易にするために、触知可能な隆起した裂部126がハウジング104の外表面に設けられる。触知可能な隆起した裂部126がハウジング104の縦方向に沿って延びる。
検出装置16''の円すい台形突起72に隣接する検出装置16''の触知可能な突起128は、触知可能な隆起した裂部126と、したがって液密アセンブリ34'とを正しく方向づけるのを助けるさらなる触知可能な特徴である。
ひとたび検出装置16''が係合したならば、液密アセンブリ34'のハウジング104を回転させて、溶解容器12'及びハウジング104に対する試験容器14'の相対的軸運動を引き起こすことができる。試験装置16''との液密アセンブリ34'の係合直後に、試験容器14'が入れ物22、したがって検出装置16''の検出チャンバー42'内に既に完全に挿入されているため、ハウジング104は、検出装置16''から軸方向に離れている。検出装置16''、したがって試験容器14'に対してハウジング104を回転させることによって、ハウジング104が検出装置16''に接触し、針114が試験容器14'のセプタム28'を貫通するまで、ハウジング104と検出装置16''の間の軸方向距離が最小になる。外から分かるように、ハウジング104を時計回りに回転させながら、ハウジング104は、下向きに、したがって、検出装置16''に近づくように動く。
ひとたびハウジング104が最終位置まで回転されたならば、ハウジング104のすそ広がりの側壁106と組み合わせた、検出装置16''の円すい台形突起72のさらなる効果が、迷光が検出装置16''の'検出チャンバー42'に入ることに対する改善された防御となる。
蛍光の検出装置16''の検出チャンバー42'は、試験容器14'を受け入れるように構成される。入れ物22'は、検出チャンバー42'の部分である。
メインプリント回路基板(メインPCB)80、並びに照射発光ダイオード(LED)92及び光学センサー46を保持する別の補助PCB82の提供は、メインPCB80及び補助PCB82がフレキシブルフラットケーブル88によって連結されるので、試験容器14°が検出チャンバー42に挿入されたときに、検出チャンバー筐体86に作用する力がメインPCB80に移動することがないという利点を有する。
本発明のさらなる態様では、本明細書に開示の方法を、好ましくは本明細書に開示のシステムで実施するためのキットであって、(i)適した反応成分と共に、少なくとも1種のリコンビナーゼ、少なくとも1種の一本鎖結合タンパク質、少なくとも1種のDNAポリメラーゼ、並びに任意選択で少なくとも1種の逆転写酵素及び/又は少なくとも1種のエネルギー再生酵素、(ii)少なくとも2つの標的配列特異的プライマー、(iii)少なくとも1種の酵素のための少なくとも1種の補助因子、dNTP又はdNTPとddNTPの混合物、少なくとも1種の緩衝系、少なくとも1種の還元剤、及びアデノシン三リン酸を含む適した反応成分、(iv)分析される生物学的プローブを抽出するための少なくとも1つの無菌セットであって、本明細書に記載のシステム、好ましくはシステムの溶解チャンバー(12)に適用するように構成された少なくとも1種の成分を含む無菌セット、(v)任意選択で少なくとも1種のプローブ、及び任意選択で、プローブを活性化する少なくとも1種の酵素、並びに(vi)任意選択で上記少なくとも1種のリコンビナーゼの活性を遮断する少なくとも1種の阻害剤、及び/又は任意選択で少なくとも1種のリコンビナーゼ補助因子を含み、(vii)任意選択でキットが(i)から(v)を含む第2の部分を更に含み、第2の部分が、陽性対照として働く予め決定されている第2の標的配列、及び第2の標的配列に特異的な少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つのプライマー、好ましくは第2のプローブを含む、キットを提供する。任意選択で、キットは、使用するための指示を更に含むことができる。
さらなる態様では、1セットのキットであって、これらのキットの全体が、容易にカスタマイズ可能な診断用パネルを構成する、キットが提供される。個々の増幅チャンバーのそれぞれに必要な全ての成分を、上記1セットのキットの個々のキットとして提供することができる。個々の部分をペレット、すなわち、例えば、凍結乾燥及び/又は部分的に液体部分として提供することができる。特定の実施形態では、試料を装置、特に少なくとも1個の溶解チャンバーに提供した後にのみ、生化学的機序の活性化が開始されるように、液体を別々に、又は別のコンパートメントとして提供することができる。
好ましくは、本発明の装置又はキットの全成分を無菌形態で提供する。
検査室では、熟練した分子生物学者又は訓練された人員が、容易に本明細書に開示の方法を行い、増幅する標的核酸用のプライマー及び/又はプローブを設計することができ、所望の場合には、適した反応条件を容易に変えることができる。当然ながら、非検査室環境で上記方法を行うことははるかに大きな挑戦である。特に後者の状況では、(バイオ)化学物質及び成分を容易に再活性化する(酵素、例えば凍結乾燥後の酵素について)ことができ、反応を好都合なように開始することができるように、レディーメードの無菌バイアル又はチューブ内に全ての必要な成分を含むキットを提供することが好ましい可能性がある。
本発明のシステムが、本発明の診断方法を携帯可能な装置で実施するために提供される実施形態では、キットが、物質、通常は感染性物質の遺伝物質を標的配列として、高度に特異的な方法で検出するのに最適化されたプライマーを含むことが非常に適している可能性がある。更に、生体試料を、好ましくは非侵襲的に、抽出するための、手袋を含む無菌セットを提供することが有用となる。
本明細書で使用される感染性物質には、ウイルスを含む全ての分類群の感染性物質を含めることができる。したがって、感染性物質には、ウイルス、細菌を含めることができるが、酵母、真菌類、線虫等を含む任意の種類の真核生物も含めることができる。感染性物質という用語には、感染性物質のエレメント、例えば、増大中の脅威となっている抗生物質耐性を媒介する抗菌薬耐性(AMR)エレメントをコードするエレメント又はプラスミドも含めることができる。好ましい一実施形態では、分析される生体試料を含む試料回収装置を装置のそれぞれのチャンバーに容易に適用することができるように、試料回収装置が本発明のシステムの少なくとも1個のチャンバー、好ましくは溶解チャンバーと適合性となるように、キットの無菌抽出部分が構成される。
本発明の方法について詳述されているように、これらの方法は、SIBA又はRPAのような以前の等温増幅方法に必要なものより少ない酵素及び化学物質を必要とするように設計されている。試料における関連する生化学反応を、より安定で容易な方法で行うことができる場合、必要とされるキットの様々な部分を低減することができるので、上記方法のこの単純性及び複雑性の低減は利点も有する。
更に別の態様では、少なくとも1つの標的配列の核酸増幅の等温方法を実施するための、任意選択で上記に定義したキットと組み合わせて使用するための、本発明の方法の少なくとも1種の熱安定酵素の使用、又は上記酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列の使用を提供することができる。本明細書に開示の少なくとも1種の熱安定酵素の使用は、検査室下及びポイントオブケア下で、並びに/又は家庭環境条件下でさえ行う様々な等温核酸増幅アッセイにおいて、特に興味深いものでありうる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、更に例示される。
(実施例1)
SARS-CoV-2についてのRT-RPAを確立する
初めに、SARS-CoV-2のRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)、エンベロープタンパク質(E)、及びヌクレオカプシド(N)遺伝子を標的とするリアルタイム逆転写RPA(RT-RPA)を確立して、リアルタイムRT-PCRと比較して、検出限界、交差反応性、及び臨床成績を決定した(Abd El Wahedら、Suitcase lab for rapid detection of SARS-CoV-2 based on recombinase polymerase amplification assay、J. Clin. Virol.、審査中)。
SARS-CoV-2についてのRT-RPAを確立する
初めに、SARS-CoV-2のRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)、エンベロープタンパク質(E)、及びヌクレオカプシド(N)遺伝子を標的とするリアルタイム逆転写RPA(RT-RPA)を確立して、リアルタイムRT-PCRと比較して、検出限界、交差反応性、及び臨床成績を決定した(Abd El Wahedら、Suitcase lab for rapid detection of SARS-CoV-2 based on recombinase polymerase amplification assay、J. Clin. Virol.、審査中)。
アッセイ検証には、RdRP遺伝子、E遺伝子、及びN遺伝子(それぞれアクセッション番号:NC_045512、ヌクレオチド:14977-15975、26112-26479、及び28280-29536)に基づいた分子RNA標準物質をGenExpress(独国ベルリン)によって合成した。RdRP遺伝子及びE遺伝子のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-1及びMERS CoV(未発表データ)の我々の以前の設計からアップデートした。一方、N遺伝子アンプリコンは、以前に発行された論文(Behrmann, O.ら、Rapid detection of SARS-CoV-2 by low volume real-time single tube reverse transcription recombinase polymerase amplification using an exo probe with an internally linked quencher (exo-IQ)、Clin Chem、doi:10.1093/clinchem/hvaa116 (2020))から改変された。(Table 1(表1))。全てのオリゴヌクレオチドは、TIB MOLBIOL社(独国Berlin)によって合成された。
(実施例2)
RT-RPA反応条件
RT-RPAには、TwistAmpエキソキット(TwistDx社、英国Cambridge)を、凍結乾燥したRevertAid逆転写酵素(Life Technologies社、独国Darmstadt)と組み合わせて使用した。1単位あたり、29.5μlの再水和緩衝液、2.5μlのRevertAid逆転写酵素(200U/μl)、9.7μlのH2O、2.1μlのフォワードプライマー(10pmol/μl)、2.1μlのリバースプライマー(20pmol/μl)、0.6μlのエキソプローブ(10pmol/μl)、2.5μlの280mM酢酸マグネシウム、及び1μlの鋳型を、凍結乾燥されたペレットを含有する反応チューブのふたの中に添加した。チューブを閉じ、遠心分離し、混合し、遠心分離し、直ちにT8(Axxin社、オーストラリアFairfield)等温蛍光リーダーに入れた。反応物を15分間42℃でインキュベートした。混合ステップは、RdRP及びE RT-RPAアッセイには230秒後に、N RT-RPAアッセイには320秒後に行った。全ての手順を可搬性のスーツケース検査室(図14、Bodo Koennecke社、独国Berlin)で行った。T8デスクトップソフトウェア(Axxin社、オーストラリアFairfield)における一次微分分析で、陰性対照(水を鋳型とする)の閾値を超える増幅カーブの出発点として閾値時間(TT)を計算した。
RT-RPA反応条件
RT-RPAには、TwistAmpエキソキット(TwistDx社、英国Cambridge)を、凍結乾燥したRevertAid逆転写酵素(Life Technologies社、独国Darmstadt)と組み合わせて使用した。1単位あたり、29.5μlの再水和緩衝液、2.5μlのRevertAid逆転写酵素(200U/μl)、9.7μlのH2O、2.1μlのフォワードプライマー(10pmol/μl)、2.1μlのリバースプライマー(20pmol/μl)、0.6μlのエキソプローブ(10pmol/μl)、2.5μlの280mM酢酸マグネシウム、及び1μlの鋳型を、凍結乾燥されたペレットを含有する反応チューブのふたの中に添加した。チューブを閉じ、遠心分離し、混合し、遠心分離し、直ちにT8(Axxin社、オーストラリアFairfield)等温蛍光リーダーに入れた。反応物を15分間42℃でインキュベートした。混合ステップは、RdRP及びE RT-RPAアッセイには230秒後に、N RT-RPAアッセイには320秒後に行った。全ての手順を可搬性のスーツケース検査室(図14、Bodo Koennecke社、独国Berlin)で行った。T8デスクトップソフトウェア(Axxin社、オーストラリアFairfield)における一次微分分析で、陰性対照(水を鋳型とする)の閾値を超える増幅カーブの出発点として閾値時間(TT)を計算した。
(実施例3)
RT-RPA分析感度及び特異性
分子標準物質(1反応あたり106~100のRNA分子)の系列希釈物を、それぞれのRT-RPAアッセイでスクリーニングした。95%の症例で検出される反応の最小数のRNA分子を決定するために、完全標準希釈範囲を用いたRPA反応から得られた5つのデータセットのプロビット回帰分析を、STATISTICAソフトウェア(StatSoft社、独国Hamburg)を用いて実施し、及びGraphPad PRISMバージョン6.07ソフトウェア(GraphPad Software社、米国カリフォルニア州San Diego)によってグラフを作成した。Table 2(表2)で記載のウイルスのウイルスゲノムを用いて、RT-RPAアッセイの分析特異性を試験した。核酸抽出物は、Charite医科大学(独国Berlin)Robert Koch Institute(独国Berlin)、Landesgesundheitsamt Niedersachsen社(独国Hannover)、Quality Control for Molecular Diagnostics(スコットランドGlasgow)、及びFriedrich-Loeffler-Institute(独国Greifswald-Insel Riems)によって提供された。
RT-RPA分析感度及び特異性
分子標準物質(1反応あたり106~100のRNA分子)の系列希釈物を、それぞれのRT-RPAアッセイでスクリーニングした。95%の症例で検出される反応の最小数のRNA分子を決定するために、完全標準希釈範囲を用いたRPA反応から得られた5つのデータセットのプロビット回帰分析を、STATISTICAソフトウェア(StatSoft社、独国Hamburg)を用いて実施し、及びGraphPad PRISMバージョン6.07ソフトウェア(GraphPad Software社、米国カリフォルニア州San Diego)によってグラフを作成した。Table 2(表2)で記載のウイルスのウイルスゲノムを用いて、RT-RPAアッセイの分析特異性を試験した。核酸抽出物は、Charite医科大学(独国Berlin)Robert Koch Institute(独国Berlin)、Landesgesundheitsamt Niedersachsen社(独国Hannover)、Quality Control for Molecular Diagnostics(スコットランドGlasgow)、及びFriedrich-Loeffler-Institute(独国Greifswald-Insel Riems)によって提供された。
リアルタイムRT-PCR(スクリーニング試験としてEベースのアッセイ、確認試験としてRdRP)によってLeipzig大学病院で診断されたCOVID19疑い例からのRNA抽出物の残りを用いて、3種のRT-RPAアッセイを検証した。全部で18個の陽性試料及び18個の陰性試料(盲検)を試験した。参照試験としてリアルタイムRT-PCRに対する標準式を用いて、RT-RPAアッセイの診断感度及び特異性、陽性的中率、及び陰性的中率を計算した(Altman, D. G. & Bland, J. M.: Diagnostic tests 2: Predictive values. BMJ 309, 102, doi:10.1136/bmj.309.6947.102 (1994))。
その後、市販のSARS-CoV-2-Eオリゴヌクレオチド(TIB MOLBIOL社、独国Berlin)を合せたリアルタイムPCRアッセイ及びSuperscript III Platinum One-Step qRT-PCRキット(Life Technologies社、独国Darmstadt)を用い、以下の温度プロファイルを使用して患者物質からのRNA抽出物を試験した。すなわち、Agilent Technologies Stratagene Mx 3000pリアルタイムPCRシステムで、50℃で15分間、95℃で2分間、その後、95℃で15秒及び60℃で30秒を40サイクル。
分析感度及び特異性
そのようなRdRP、E、及びN RT-RPAアッセイの分析感度を決定するために、5回の反復において106-100 RNA分子/反応のそれぞれの分子RNA標準物質の系列希釈物を用いて各アッセイを試験した。106~102分子/反応の濃度の分子RNA標準物質を、3種のRT-RPAアッセイの全5回のRPA実施において検出した。E及びN RT-RPAは、3/5のRT-RPA実施において、100RNA分子を同定し、一方、RdRP-RT-RPAでは、全5回の実施が陽性であった。RdRP RT-RPAのみが、2/5のRT-RPA実施で1RNAコピーを増幅した。このデータセットを用いて、プロビット回帰分析を実施し、RdRP RT-RPAアッセイについては2RNA分子及びE及びN RT-RPAアッセイについては15RNA分子という95%検出限界を明らかにした(図15)。
そのようなRdRP、E、及びN RT-RPAアッセイの分析感度を決定するために、5回の反復において106-100 RNA分子/反応のそれぞれの分子RNA標準物質の系列希釈物を用いて各アッセイを試験した。106~102分子/反応の濃度の分子RNA標準物質を、3種のRT-RPAアッセイの全5回のRPA実施において検出した。E及びN RT-RPAは、3/5のRT-RPA実施において、100RNA分子を同定し、一方、RdRP-RT-RPAでは、全5回の実施が陽性であった。RdRP RT-RPAのみが、2/5のRT-RPA実施で1RNAコピーを増幅した。このデータセットを用いて、プロビット回帰分析を実施し、RdRP RT-RPAアッセイについては2RNA分子及びE及びN RT-RPAアッセイについては15RNA分子という95%検出限界を明らかにした(図15)。
したがって、RdRP-及びE-RT-RPAアッセイは、SARS-CoV-1及び-2両方のゲノムRNAを増幅することができた。一方、N-RT-RPAアッセイは、SARS-CoV-2RNAのみを認識する。どのアッセイも、Table 2(表2)に記載の他の呼吸器ウイルスからの核酸抽出物に交差反応性を示さなかった。
(実施例4)
臨床試料のさらなる試験
-80℃で保存していた全ての抽出RNA試料を最初に3種のRT-RPAアッセイで試験し、前の結果を確認するためにリアルタイムRT-PCRで再試験した。RdRP遺伝子を標的とするRT-RPAアッセイは、最良の臨床成績を生じた(図16)。全てのRT-RPAアッセイは、最大12分でCT>30で試料を検出した(ここにはデータは示されていない、Abd El Wahedら、同上参照)。高感度高特異性のSARS-CoV-2RPAアッセイを同定するために、SARS-CoV-2ゲノムのRdRP、E、及びN遺伝子を標的とする3種のRT-RPAアッセイを評価した。RdRP RT-RPAアッセイは、リアルタイムRT-PCRと同等の感度及び特異性を15分間未満で生じた。RT-RPAアッセイの速度及び臨床正確度は、それを、ポイントオブニードにおける理想的な候補分子アッセイにしている。
臨床試料のさらなる試験
-80℃で保存していた全ての抽出RNA試料を最初に3種のRT-RPAアッセイで試験し、前の結果を確認するためにリアルタイムRT-PCRで再試験した。RdRP遺伝子を標的とするRT-RPAアッセイは、最良の臨床成績を生じた(図16)。全てのRT-RPAアッセイは、最大12分でCT>30で試料を検出した(ここにはデータは示されていない、Abd El Wahedら、同上参照)。高感度高特異性のSARS-CoV-2RPAアッセイを同定するために、SARS-CoV-2ゲノムのRdRP、E、及びN遺伝子を標的とする3種のRT-RPAアッセイを評価した。RdRP RT-RPAアッセイは、リアルタイムRT-PCRと同等の感度及び特異性を15分間未満で生じた。RT-RPAアッセイの速度及び臨床正確度は、それを、ポイントオブニードにおける理想的な候補分子アッセイにしている。
したがって、現在のところリアルタイムRT-PCRがCOVID-19疑いの患者からの試料の分子検査スクリーニングのための選択される方法であるSARS-CoV-2感染の診断において、等温核酸増幅方法が高信頼性の結果を提供できることを実証できた。一般に、先進国の国家及び商業的診断検査室は、リアルタイムRT-PCRのための全インフラストラクチャを有する。しかし、新興国家では、通常、基準検査室のみが、高信頼性のリアルタイムRT-PCRアッセイを実施するのに十分な設備を備えており、したがって、代替の試験フォーマットが緊急に必要とされている。
古典的なRPAアッセイは、訓練された人員によって実施される場合、検査室環境では、SARS-CoV-2の診断に完全に適したものでありうるが、本発明者らは、関心のある任意の個人によって行われた場合に、結果が迅速で高信頼性であることを保証しながら、それが非検査室環境におけるハイスループットの高信頼性試験に適するように、この方法の最適化を更に試みた。
(実施例5)
SARS-CoV-2特異的な最適化
まず第一に、SARS-CoV-2に特異的なRPAアッセイの開発中に、ある種の改良を導入しなければならなかった。数ラウンドの試験の後に、最初に、倍の濃度のリバースプライマーを使用することで、最良のアッセイ感度が実現された。コロナウイルスは、陽方向鎖一本鎖RNAゲノムを有し、より多くのリバースプライマーを用いるほど、次の増幅工程のためのより多くのcDNAを生成する。第2に、オリゴヌクレオチド設計中、いくつかのリアルタイムRT-PCRアッセイについて報告されている問題を回避するために、ヒトゲノムと対になるいかなる配列も厳密に除去した。第3に、プライマー二量体及び非特異的増幅を回避するために、選択されたRPAプライマーにホスホチオエートヌクレオチドを導入した。
SARS-CoV-2特異的な最適化
まず第一に、SARS-CoV-2に特異的なRPAアッセイの開発中に、ある種の改良を導入しなければならなかった。数ラウンドの試験の後に、最初に、倍の濃度のリバースプライマーを使用することで、最良のアッセイ感度が実現された。コロナウイルスは、陽方向鎖一本鎖RNAゲノムを有し、より多くのリバースプライマーを用いるほど、次の増幅工程のためのより多くのcDNAを生成する。第2に、オリゴヌクレオチド設計中、いくつかのリアルタイムRT-PCRアッセイについて報告されている問題を回避するために、ヒトゲノムと対になるいかなる配列も厳密に除去した。第3に、プライマー二量体及び非特異的増幅を回避するために、選択されたRPAプライマーにホスホチオエートヌクレオチドを導入した。
増幅及び検出に加えて、ウイルスの不活性化及び抽出は、SARS-CoV-2の診断において、医療従事者又は検査技師の安全を確保するために、通常は決定的に重要な工程であり、BSL-2キャビネット内及び現場条件下では可搬性グローブボックス内での試料の不活性化が通常は推奨される。コロナウイルス抽出のためにいくつかの迅速かつ単純な抽出手順が開発された(Fomsgaard & Rosenstierne、2020年3月、Euro Surveill 25、doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.14.2000398)。
なお、本発明者らは、家庭環境での試験のためには、ウイルス不活性化を保証することはあまり重要ではないと推測した。検出可能なウイルス遺伝物質を潜在的に含む試料を抽出する簡単な方法を保証すること、安定性及び簡便性を増大させること、それ以上に、更に迅速に試験結果を得ることがはるかに重要であろう。したがって、RPA SARS-CoV-2試験を越える新しい等温核酸増幅方法を設計するために、新しい選択肢を試験し、これはRNAウイルス検出に完全に適していることが実証された。
(実施例6)
等温核酸増幅アッセイに有用な熱安定性生体触媒の分析及び試験
専門家でない人が、早期に開発された特定の手持ち式診断装置で実施するのに十分にロバストであるだろう等温反応を確立するために、等温増幅反応を実施するために、完全に異なるセットの酵素を選択することができることが推測された。これらの考えの背後にある駆動力は、SARS-CoV-2の現在利用可能な診断試験が依然として時間がかかるという事実であった。試験から結果までの時間を向上させることは、したがって、検疫の時間及びウイルスを広げるリスクを低減するのに最も重要である。
等温核酸増幅アッセイに有用な熱安定性生体触媒の分析及び試験
専門家でない人が、早期に開発された特定の手持ち式診断装置で実施するのに十分にロバストであるだろう等温反応を確立するために、等温増幅反応を実施するために、完全に異なるセットの酵素を選択することができることが推測された。これらの考えの背後にある駆動力は、SARS-CoV-2の現在利用可能な診断試験が依然として時間がかかるという事実であった。試験から結果までの時間を向上させることは、したがって、検疫の時間及びウイルスを広げるリスクを低減するのに最も重要である。
それゆえ、信頼でき迅速な等温増幅反応の実施を可能にする酵素機能を有する熱安定酵素を同定するために、数ラウンドのインシリコ探索を実施した。酵素の熱安定性は、実施における2つの主要な利点を有する。すなわち、試験が実施される前に酵素が容易に分解せず、ほとんどの酵素が本来的に最適化されるような標準体温(約37℃)を超える温度で酵素が至適活性を有するので、反応時間を向上させることができ、標的DNA又はRNA配列の増幅、及び診断結果がはるかに迅速に利用可能になりうる。
現在のところ関連するゲノムのアノテーションが不十分なものでしかないので、熱安定性のファージ酵素の探索には、かなりの手間がかかった。最終的に、等温増幅反応に適した機能性を有し、更に37℃より高い最適温度を有する酵素の完全なセットであって、いくつかの酵素は、37℃超から約55℃の間であり、又はそれを超えさえする最適温度(手持ち式の診断装置の最適温度を意味する)を有しさえするセットが同定された。
これらの酵素は、主として、熱安定性であることが知られている細菌及び/又は古細菌に由来する。更に、RNA標的に逆転写酵素が必要である場合、いくつかの商業的な熱安定酵素が市販されており、1つの追加の新しいウイルス由来逆転写酵素が同定された。
ディノコッカス・ジオサーマリス(Deinococcus geothermalis)酵素及び上記Table 4(表3)に詳細に記載したさらなる酵素は、40℃から60℃の間、又は60℃超で最適な活性を有することが見出された。このことは、これらの酵素が熱安定性であることを明らかに示している。
更に、酵素の組換え体生成及び精製は、ある種の利点(詳細はここには示されていない)を有する。最終アッセイには、これは、これらの酵素をアフィニティータグなしに、十分な量かつ十分な純度で、アフィニティータグの切断する必要性も、アフィニティータグを付けて使用する必要性もなしに生成することができることを意味する。
最後に、酵素は、それらの機能性に鑑みて、それらの熱安定性によって補助されて、「古典的な」RPA反応の42℃という標準を超える温度でさえ、等温増幅反応を実施するのに適しており、したがって、最近開発された手持ち式の診断装置でより良好に実施されるように完全に構成されている。第1の実験において、同系の蛍光チャネルを介して既に10分間未満で、陽性結果を検出することができた。これは、信頼できる陽性対照標準が同時に行われ、安全性及び信頼性を更に向上させるという事実と併せて、SARS-CoV-2及び他の感染症の新世代の診断への道を開くものである。
最初に、熱安定性生体触媒の安定性の増大は、4℃で凍結乾燥する前の短期貯蔵を可能にすることを示すことができた。これは、既に増幅アッセイの前に、非検査室使用、出荷、貯蔵等に関連する困難に重要である。したがって、凍結乾燥プロセスに負に干渉する補充物(例えばグリセロール)の添加が回避される。更に、これは、生化学的成分を含む装置を非検査室で実施する実施者に送達する場合、薬局及び他の小売り業チャネルを介した信頼できる販売を保証する。
ここで、方法論を考察すると、熱安定酵素の性質が、以下で詳述するように、SARS-CoV-2のRPAアッセイに匹敵する特異性及び感度を示しながら、温度制御の厳格性の低減を可能にし、同時に反応時間の低減を可能にするので、本発明者らは、RPAのような古典的な等温反応に優るかなりの利点を観察した。これらの要因は、検査室でも、家庭環境でも、迅速な試験結果が最も重要である診断用等温核酸増幅反応を実施するためのキットを提供する場合、もちろん傑出した重要性がある。
手持ち式装置とは独立に、熱安定酵素を使用した新しいアッセイを、特定の態様において、標準的な等温核酸増幅技法より良好に(かつ安価に)実施されるアッセイとして、検査室セッティング用にも、更に最適化するためのさらなる研究が進行中である。
熱安定酵素を使用する酵素混合物が、長期のコールドチェーン非依存的貯蔵及び約30から約40℃の範囲の常温での使用に適用できる反応混合物のより高い安定性を提供することが予測される。
(実施例7)
模倣アンプリコンの設計
新しい熱安定酵素を使用しながら、特定の携帯可能な診断装置で新しい反応を確立する試験目的の模倣アンプリコンを構築するために、上記に詳述したSARS CoV 2-RdRPアッセイのプローブ配列を、BLASTアルゴリズムで試験したときにそれ以上ヒットが生成しなくなるまで、二度スクランブルした。SARS CoV2-RdRPの隣接プライマー(それぞれ配列番号18(フォワード)及び19(リバース))をプローブ配列(配列番号20)の上流及び下流に配置し、5ntスペーサーをプローブ配列のそれぞれの側に付けた。
模倣アンプリコンの設計
新しい熱安定酵素を使用しながら、特定の携帯可能な診断装置で新しい反応を確立する試験目的の模倣アンプリコンを構築するために、上記に詳述したSARS CoV 2-RdRPアッセイのプローブ配列を、BLASTアルゴリズムで試験したときにそれ以上ヒットが生成しなくなるまで、二度スクランブルした。SARS CoV2-RdRPの隣接プライマー(それぞれ配列番号18(フォワード)及び19(リバース))をプローブ配列(配列番号20)の上流及び下流に配置し、5ntスペーサーをプローブ配列のそれぞれの側に付けた。
上記の模倣アンプリコンを、Twist RPAアッセイ及び最適化された酵素及び反応条件を用いた新しい実験を使用した増幅反応の効率を試験するための貴重な内部陽性対照として使用し、高特異性及び高信頼性であることが判明した。また、模倣アンプリコンは、貴重な阻害対照としても働く。これは、このアンプリコンが、全体的な増幅パラメータ及び良好に挙動するかをチェックするための最初から添加されるプロセス又は増幅対照として働くことを意味する。特に診断応用には、直前に記載した模倣アンプリコンのような対照は、明らかに最も重要である。
(実施例8)
非対称プライマー濃度を用いた増幅
対称プライマー濃度を使用した(すなわち、フォワードプライマーとリバースプライマーが等モル濃度で用意される)RPA反応を、非対称プライマー濃度を使用した(すなわち、2つのプライマーの一方をもう一方のプライマーより高い濃度で用意する)RPA反応と比較するために、SARS-CoV-2 RdRP RNAを鋳型として使用して、RT-RPA反応を実施した。鋳型RNAを1RPAあたり1~106コピーで用意し、再水和緩衝液(例えばTwistDx)、マグネシウムアセテート(例えばTwistDx)、フォワードプライマー及びリバースプライマー、検出プローブ、及び逆転写酵素(Thermofisher社又はBioTechRabbit社)と混合した。標準的な等温増幅プラットホーム上で15分間の標準的なRT-RPAプログラムを使用して、インキュベーションを実施した。対称プライマー濃度(420nM:420nM)を使用したRPA反応及び比較の非対称プライマー濃度(420nM:840nM)を使用したRPA反応の結果をそれぞれ図17及び図18に示す。
非対称プライマー濃度を用いた増幅
対称プライマー濃度を使用した(すなわち、フォワードプライマーとリバースプライマーが等モル濃度で用意される)RPA反応を、非対称プライマー濃度を使用した(すなわち、2つのプライマーの一方をもう一方のプライマーより高い濃度で用意する)RPA反応と比較するために、SARS-CoV-2 RdRP RNAを鋳型として使用して、RT-RPA反応を実施した。鋳型RNAを1RPAあたり1~106コピーで用意し、再水和緩衝液(例えばTwistDx)、マグネシウムアセテート(例えばTwistDx)、フォワードプライマー及びリバースプライマー、検出プローブ、及び逆転写酵素(Thermofisher社又はBioTechRabbit社)と混合した。標準的な等温増幅プラットホーム上で15分間の標準的なRT-RPAプログラムを使用して、インキュベーションを実施した。対称プライマー濃度(420nM:420nM)を使用したRPA反応及び比較の非対称プライマー濃度(420nM:840nM)を使用したRPA反応の結果をそれぞれ図17及び図18に示す。
2つのアプローチの比較は、非対称プライマー濃度を使用することにより劇的に向上した成績を明らかに示している。図19は、非対称プライマー濃度の閾値時間が、特に少ない標的RNA量について、かなり低下していることを示している。したがって、これは、非対称プライマー濃度を使用することによって、RPA反応が標的核酸を検出するのに必要なインキュベーション時間を、特に標的核酸の量及び/又は濃度が低い場合に、かなり低減できることを示している。
(実施例9)
Gp32の熱安定性バリアント
バクテリオファージRB69由来のGp32タンパク質は、RPA及びRPA関連の等温増幅反応で特に高効率な一本鎖DNA結合タンパク質のようである。したがって、同時に熱安定性であり、かつ機能的及び構造的なシード参照配列として使用されたRB69 Gp32に対する構造的及び/又は機能的類似性も高く、好ましくは、例えばT4 Gp32と比較して、RB69 Gp32への構造的類似性が増大しているGp32タンパク質バリアントを同定するための分析を開始した。そのような分析の1つの焦点は、熱安定性バリアントの同定であるので、分析は、熱安定性細菌及びファージ由来のタンパク質に及ぶ。熱安定性であることが知られているファージの数が限定されているため、宿主が熱安定性であることが知られているファージも、これらの分析に含まれる。熱安定性細菌の次の主な焦点は、バチルス属(Bacillus)ファージ及びシネココッカス属(Synechococcus)ファージである。
Gp32の熱安定性バリアント
バクテリオファージRB69由来のGp32タンパク質は、RPA及びRPA関連の等温増幅反応で特に高効率な一本鎖DNA結合タンパク質のようである。したがって、同時に熱安定性であり、かつ機能的及び構造的なシード参照配列として使用されたRB69 Gp32に対する構造的及び/又は機能的類似性も高く、好ましくは、例えばT4 Gp32と比較して、RB69 Gp32への構造的類似性が増大しているGp32タンパク質バリアントを同定するための分析を開始した。そのような分析の1つの焦点は、熱安定性バリアントの同定であるので、分析は、熱安定性細菌及びファージ由来のタンパク質に及ぶ。熱安定性であることが知られているファージの数が限定されているため、宿主が熱安定性であることが知られているファージも、これらの分析に含まれる。熱安定性細菌の次の主な焦点は、バチルス属(Bacillus)ファージ及びシネココッカス属(Synechococcus)ファージである。
潜在的な熱安定性を有するいくつかの一本鎖DNA結合タンパク質を、可能性のある候補として同定した。タンパク質候補の例示的なコレクションを図20に系統樹として示す。図20が様々なタンパク質をUniProtデータベース識別子を使用して示していることに留意。ここで、A0A0C4K635は配列番号21に対応し、A0A2I5ARD7は配列番号22に対応し、F4YCU4は配列番号23に対応し、Q38504は配列番号24に対応し、Q9MCD0は配列番号25に対応し、Q9MCD1は配列番号26に対応し、P06953は配列番号27に対応し、Q37885は配列番号28に対応し、A0A6M3ZIA8は配列番号29に対応し、Q1J216は配列番号30に対応し、T4ファージのP03695は配列番号31に対応し、エシェリヒア属(Escherichia)ファージRB69 Gp32のQ7Y265は配列番号32に対応し、参照配列として使用され、Q1J1N6は配列番号4に対応している。一本鎖DNA結合タンパク質は、長さの変動が大きく、アミノ酸配列の多様性も一般に大きいため、RB69 Gp32に対する類似性は、構造及び機能モデルに基づいて評価しなければならない。
そのような構造分析は、3D構造シミュレーションのインシリコ(AIで補助されたアプローチを含む)モデリング並びに構造及び機能の両方の比較及び評価として実施する。次の工程として、そのようなインシリコ分析の有望な候補をコードするDNA配列をベクターにクローニングする。これらは、一本鎖DNA結合タンパク質候補の精製に使用し、その後、機能を試験し、最適化する。試験及び最適化には、タンパク質候補及び可能性のあるそのバリエーション、並びに等温増幅反応における最適な実施のためのさらなる可変的な条件(温度、塩、及びpH等)を含める。
Claims (15)
- 好ましくは生体試料中の、1つ、好ましくは少なくとも2つの標的配列の核酸増幅の等温方法であって、
(a) (i) 少なくとも1種のリコンビナーゼ、少なくとも1種の一本鎖結合タンパク質、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つの標的配列特異的プライマー、少なくとも1種のDNAポリメラーゼを用意し、任意選択で少なくとも1種の逆転写酵素及び/又は少なくとも1種のエネルギー再生酵素を、適した反応成分と共に用意する工程であって、
(ii) 前記酵素の少なくとも1つの活性に必須な少なくとも1種の補助因子が用意されないか、又は前記少なくとも1種のリコンビナーゼの活性を遮断する少なくとも1種の阻害剤が用意される、工程と、
(b) 前記少なくとも1つの標的配列の存在について分析される少なくとも1種の生体試料を用意し、任意選択で前記生体試料を得るための好ましくは無菌の抽出キットを用意する工程と、
(c) 任意選択で、少なくとも1つのプローブを用意し、任意選択で、検出可能なシグナルが生成されるように、前記プローブを活性化する少なくとも1種の酵素を用意する工程と、
(d) 開始試薬を添加して増幅反応を開始させる工程と、
(e) 少なくとも1つの増幅された標的配列を取得し、かつ/又は各シグナルが、増幅されたそれぞれの標的配列の良好な増幅を示す少なくとも1種の検出可能なシグナルを取得する工程と
を含み、
好ましくは、少なくとも1種のリコンビナーゼ、少なくとも1種の一本鎖結合タンパク質、少なくとも1種のDNAポリメラーゼ、並びに任意選択で少なくとも1種の逆転写酵素及び/又は少なくとも1種のエネルギー再生酵素を含む、工程(i)で用意された酵素の少なくとも1つ、より好ましくは使用される酵素の少なくとも2つ、最も好ましくは前記酵素の全てが、37℃超から約85℃、好ましくは約39℃から約60℃、最も好ましくは約40℃から約55℃の温度で最適活性を有する熱安定酵素である、方法。 - 少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、又は7つ以上の異なる標的配列が、好ましくは使用される同じ試料中で増幅され、かつ/又は追加のクラウディング剤が用意されない、請求項1に記載の方法。
- 標的配列が個々に、エボラウイルス、スーダンウイルス、マールブルグウイルス、ブンディブギョウイルス、サル痘ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、狂犬病ウイルス、H5N1、H7N9、及びH9N2を含むインフルエンザウイルスA又はB、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス1、4、7を含むアデノウイルス、パラインフルエンザウイルス3、MERS CoV、SARS-CoV-2、パルボウイルスB19、ウエストナイルウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ノロウイルス、ウシコロナウイルス、口蹄疫ウイルス、ランピースキン病ウイルスから選択されるウイルスの標的配列を含む、又は抗菌薬耐性遺伝子を含む、黄色ブドウ球菌を含む、細菌の標的配列を含む、又はマイコバクテリウム・ウルセランス、梅毒トレポネーマ、ドノバンリーシュマニア、マイコバクテリウム・レプラエ、野兎病菌、pacA/capCを含むバチルス・アントラシス、tcdB/tcdAを含むクロストリジウム・ディフィシル、全リケッチア、チフス菌若しくはパラチフス菌、熱帯熱マラリア原虫、ヨーネ菌、サイトメガロウイルス若しくはエンテロウイルス、フランシセラ・ノウタエニス・オリエンタリス、ホワイトスポット症候群ウイルス、若しくはブルーシュリンプデンソウイルスの標的配列を含む、感染性物質の標的配列からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 少なくとも2つの標的配列が用意され、これら少なくとも2つの標的配列が体系的パネルの一部であり、前記パネルが、急性伝染病パネル、髄膜脳炎パネル、重症呼吸器疾患パネル、アルボウイルスパネル、抗生物質耐性遺伝子パネル、国特異的旅行帰国者パネル、妊娠中スクリーニングのための特異的パネル、計画入院若しくは緊急入院前の個体を試験するための特異的なパネル、紅斑症に関連する小児科疾患を含む、感染性小児科疾患についてのスクリーニングのためのパネル、並びに/又は家畜動物を試験するためのパネル及び/若しくは水産養殖感染を試験するためのパネルからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 追加のクラウディング剤が用意されず、かつ/又は少なくとも1種のリコンビナーゼ補助酵素若しくは因子が更に、好ましくはステップ(d)の前に用意される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種のエネルギー再生酵素系が用意され、かつ/又は少なくとも1つのフォワードプライマー及び少なくとも1つのリバースプライマーが、標的配列特異的プライマーとして用意され、これらのプライマーの少なくとも1つ、好ましくはリバースプライマーが、もう一方のプライマーと比較して多くの量若しくは濃度で用意される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのプローブ及び/若しくは標識が用意され、前記少なくとも1つのプローブ及び/若しくは前記少なくとも1種の標識が直接的若しくは間接的に検出可能な部分を含み、かつ/又は前記少なくとも1種の酵素が少なくとも1種のタグ及び/若しくは標識を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 用意される酵素の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つが、配列番号1から8、又は触媒として活性なその断片、又はそれぞれの参照配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは少なくとも99%を有する配列、又はそれぞれの酵素をコードする核酸配列からなる群から独立に選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 標的配列が、一本鎖又は二本鎖DNA及び/又はRNA核酸配列である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅反応中の温度が約37℃から約85℃、好ましくは約39℃から約60℃、最も好ましくは約40℃から約55℃である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 生体試料中の又は表面から得られた試料中の少なくとも2つの標的配列を検出するためのシステム、好ましくは携帯システムであって、
少なくとも1個の溶解チャンバー(12)と、1個の第2の容器(14)の一部である少なくとも2個の増幅チャンバー(14.1及び14.2)と、少なくとも1個のルミネッセンス、好ましくは少なくとも1個の蛍光の検出装置(16)とを含み、溶解チャンバー(12)が溶解液を含有し、少なくとも2個の増幅チャンバー(14.1及び14.2)のそれぞれが、少なくとも2つの標的核酸配列を増幅するための請求項1から10に規定の酵素のセット及び適した反応成分を含む混合物を含有し、前記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置(16)が、増幅チャンバー(14)又は増幅チャンバーの含有物を受け取るように構成された検出チャンバー(42)、光源(44)、光学センサー(46)、エネルギー供給手段(48)、無線データインタフェース(52)、及びコントローラ(50)を含み、システムが、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成される、システム。 - システムが合体して単一の液密アセンブリ(34)を形成することができるようにシステムが構成されており、前記少なくとも1個の第1の溶解チャンバー(12)が第1のセットの化学物質及び/又は作用物質を含み、前記第1のチャンバーが使用前に閉じられ、好ましくは第1のセットの化学物質及び/又は作用物質が、増幅する少なくとも1つの標的核酸配列の到達性及び/又は試料中の潜在的に伝染性の物質の不活性化を可能にし、前記少なくとも2個の増幅チャンバー(14)の第2の増幅チャンバー(14.1又は14.2)がそれぞれ第2のセットの化学物質及び/又は作用物質を含み、第2のセットの化学物質及び/又は作用物質が、第1のセットの化学物質及び/又は作用物質とは少なくとも部分的に異なり、標的遺伝子の特異性について決定的な部分において前記少なくとも1種のさらなる第2の増幅チャンバーセットの化学物質及び/又は作用物質とは少なくとも異なり、前記少なくとも1個の第1の溶解チャンバーがふた(26)を含み、ふた(26)は、前記少なくとも1個の第1の溶解チャンバー(12)及び前記少なくとも2個の第2のチャンバーの1つ(14.1又は14.2)が合体して単一の液密アセンブリ(34)を形成したときに、前記少なくとも1個の第1の溶解チャンバー(12)の含有物が個々に前記少なくとも2個の第2のチャンバー(14)のそれぞれに入るのを可能にするために、開けることができる、請求項11に記載のシステム。
- システムが、ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置(16)を更に含み、前記ルミネッセンス、好ましくは蛍光の検出装置(16)が、
- 増幅チャンバー又は増幅チャンバーの含有物を受け入れるように構成された検出チャンバー(42)、
- ルミネッセンス、特に蛍光を励起するように構成された光源(44)、
- ルミネッセンス、特に蛍光を捕捉するように構成された光学センサー(46)、
- エネルギー供給手段(48)、
- 無線データインタフェース(52)、及び
- コントローラ(50)
を含む、請求項11又は12に記載のシステム。 - 請求項1から10のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
(i) 少なくとも1種のリコンビナーゼ、少なくとも1種の一本鎖結合タンパク質、少なくとも1種のDNAポリメラーゼ、及び任意選択で、適した反応成分と共にある、少なくとも1種の逆転写酵素及び/又は少なくとも1種のエネルギー再生酵素と、
(ii) 少なくとも2つの標的配列特異的プライマーと、
(iii) 少なくとも1種の酵素のための少なくとも1種の補助因子、dNTP又はdNTPとddNTPの混合物、少なくとも1種の緩衝系、少なくとも1種の還元剤、及びアデノシン三リン酸を含む適した反応成分と、
(iv) 分析される生物学的プローブを抽出するための少なくとも1つの無菌セットであって、請求項11に記載のシステム、好ましくはシステムの溶解チャンバー(12)に適用するように構成された少なくとも1種の成分を含む無菌セットと、
(v) 任意選択で少なくとも1つのプローブ、及び任意選択で、プローブを活性化する少なくとも1種の酵素と
(vi) 任意選択で前記少なくとも1種のリコンビナーゼの活性を遮断する少なくとも1種の阻害剤、及び/又は任意選択で少なくとも1種のリコンビナーゼ補助因子と
を含み、
(vii) 任意選択で、キットが(i)から(v)を含む第2の部分を更に含み、第2の部分が、陽性対照として働く予め決定されている第2の標的配列、及び第2の標的配列に特異的な少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つのプライマー、好ましくは第2のプローブを含む、
キット。 - 請求項1から10のいずれか一項に記載の少なくとも1つの標的配列の核酸増幅の等温方法を実施するための、任意選択で請求項14に規定のキットと組み合わせて使用するための、請求項7又は8に規定の少なくとも1種の酵素の使用、又は前記酵素をコードする少なくとも1つの核酸配列の使用。
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