CN116323000A - 用于即时需求诊断的等温核酸扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于核酸(包括DNA和RNA)等温扩增的快速且可选的多路复用或多重方法。特别是，本发明涉及用于在目标生物探针中快速诊断例如至少两种感染原或同一感染原中的至少两个不同靶标的诊断方法。本发明进一步涉及用于在实验室以及非实验室环境中执行扩增方法的手持式和便携式诊断系统。还提供了合适的酶序列、试剂盒以及该方法和系统的用途。

Description

用于即时需求诊断的等温核酸扩增方法

技术领域

本发明涉及一种用于核酸(包括DNA和RNA)等温扩增的快速且可选的多路复用或多重方法。特别是，本发明涉及用于快速诊断，例如目标生物样品中的至少两种感染原或同一感染原中的至少两个不同靶标的诊断方法。本发明进一步涉及用于在实验室以及非实验室环境中执行扩增方法的手持式和便携式诊断系统。还提供了合适的酶序列、试剂盒以及该方法和系统的用途。

背景技术

世界卫生组织于2020年3月宣布SARS-CoV-2病毒爆发为世界大流行病，其非常引人注目地证明了对可靠和快速诊断的需求，特别是对于没有预防性疫苗或治疗药物的新出现的传染病。迄今为止，还没有能够在短时间内可靠地识别SARS-CoV-2病毒的灵敏快速的诊断工具。这是非常有问题的，因为在测试和测试结果的可用性之间存在很大的时间间隔，因此通常只能在可能发生进一步的病毒传播后才开始隔离受感染的个体。尽管如此，这仅仅是一个引人注目的场景，说明目前对各种病原体(病毒、细菌、真菌或寄生虫)的检测和诊断需要花费太多时间才能获得可靠的结果。例如，由多重耐药菌引起的感染在临床环境和畜牧业生产中都代表着治疗挑战，私人和商务旅行返回者可能希望在返回后将潜在感染传播到社会环境之前接受潜在感染的早期诊断，孕妇和/或属于易感免疫防御风险人群的个人可能希望及早确定其健康状况等。

所有这些情况的共同点是，通常需要不同感染原的不止一种核酸序列的存在和/或关于存在多于一种靶序列的信息，并且迫切需要该信息。在感染原的情况下，尽快隔离受感染的个体并尽快为相应疾病提供特定的治疗方案非常重要。但是，在任何类型的护理区(诊所、养老院)中，鉴于快速可靠的多重测试不易获得这一事实，测试患者身上或体内或潜在污染表面上是否存在某些感染原仍然是一个问题。

核酸扩增技术(NAAT)与分子实时PCR测定法一样，通常非常灵敏和特异，但在获得结果的时间方面，PCR仍然存在固有的劣势，需要装备精良的实验室和训练有素的人员。因此，迫切需要具有良好特异性和灵敏度并能够在检测地点原位提供可靠结果的新型便携式诊断解决方案。

关于基于核酸的制备、克隆和诊断技术，后来的诺贝尔奖获得者Kary Mullis及其团队在1980年代开发的聚合酶链反应(PCR)作为快速可靠的DNA扩增方法彻底改变了分子生物学，因为科学家们突然有机会在短时间内获得数百万拷贝的目标DNA靶分子。简单性和效率(例如，现在可以进行单分子/细胞PCR)代表了PCR技术的显著优势。

尽管如此，PCR仍存在某些缺点，包括本质上需要反复进行热循环和不同温度之间的转换(在扩增过程中重复循环两个或三个依赖于温度的步骤)和使用高(>90℃)温度。这些缺点导致了替代扩增方法的发展。

一类重要的PCR替代方法称为等温扩增方法(有关综述，参见Zanoli和Spoto，Biosensors(Basel)，2012 3(1):18-43))。与PCR相比的巨大优势在于，等温核酸扩增方法根本不需要任何热循环，而是可以在恒定温度下进行。这使得扩增过程更容易操作和控制。此外，与PCR方法相比，需要更少的能量，后者本质上需要快速加热和冷却步骤。等温方法的恒温还允许完全封闭的微结构装置，在其中进行等温扩增可降低样品污染的风险，并意味着低样品消耗、多重DNA分析、集成和便携式装置实现。最后，如本申请人最近开发(DE 102020 109 744.1，其通过引用并入本文)，恒温将非常优选用于即时需求和/或便携式诊断装置。

目前可用的等温扩增策略包括基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)(再次参见：Zanoli和Spoto，2012年，同上；关于现今RPA技术的综合调查：Li等，Analyst，2019，144，31，第31至67页)，或基于链侵入的扩增(

-下列SIBA)(Hoser等，PLoS ONE 9(11):e112656.doi:10.1371/journal.pone.0112656)。尽管如此，正如PCR等温技术一样，往往会产生非特异性扩增产物作为主要缺点。

然而，例如，NASBA、RPA和HDA(以及某些类型的定量PCR)依赖于使用目标特异性探针来提供更高的反应特异性，而LAMP使用额外的引物而不是探针以及链置换聚合酶(Notomi等，2000，Nucleic Acids Research 28:e63)。然而，在至少30分钟的温育中使用大量大引物已被证明会产生假阳性结果——在诊断应用中绝对要避免这种结果，特别是在诊断传染病时。此外，LAMP反应需要65℃的高温，由于监管和实际问题，这不利于诊断装置在家庭环境中使用。因此，如果需要在短时间内在手持装置中需要诊断性核酸扩增结果，LAMP将不是首选方法，手持装置必须满足某些监管要求才能适合非实验室使用。

RPA和SIBA技术都依赖于在结合和扩增过程中使用重组酶。最初，形成由寡核苷酸引物和重组酶蛋白构成的核蛋白复合物以用于RPA和SIBA型核酸扩增策略，这些复合物促进引物与模板DNA的结合。由于运行时间短(约15分钟)，未观察到非特异性扩增。一个特定的优势是重组酶可以容忍至少一个不正确的碱基，而不会阻止启动反应所需的链侵入。总体而言，已表明RPA扩增子可以容忍所有引物和探针序列中多达9个错配(参考Boyle等，2013，doi:10.1128/mBio.00135-13；Daher等，2014，DOI:10.1016/j.mcp.2014.11.005)。在需要检测相差一个或几个碱基的密切相关靶标的情况下，这可能是一个优势，其中此设置的原型实例是使用该反应检测感染原，特别是病毒病原体，已知感染原或病原体会经历快速突变。在实践中，如果一种诊断试剂盒能够扩增并因此以高特异性检测目标病毒的核酸序列，但同时容忍某些突变以避免假阴性结果，那将是非常有利的。

与核酸扩增的生化进步并行，包括用于以优化方式进行核酸扩增的合适的反应和检测室的装置的开发也在稳步发展。一个很大的趋势是微流体装置的发展，一般来说，小型化或“纳米化反应室”的趋势，即，将它们变成纳米形式，对于减少样品体积和因此减少所需的试剂量，并在生化检测、取得结果的时间、更快的热转移方面取得优势，以及具有自动化和集成的潜力，以及更重要的是具有多路复用或多重测试的可能性。在这种情况下，多重意味着在单独(局部不同的)反应室中进行的平行反应意义上的多路复用。

正如2020年新冠病毒大流行期间的明确例证，全球仍然需要提供快速可靠的核酸扩增技术，这不仅可以在专门的诊断中心进行，而且可以在从待分析的人身上获取生物样品的现场立即进行。此外，在全球范围内观察到，取得结果的时间至关重要，因为除非实施严格的预防性隔离规则，否则存在在收到(可靠的)测试结果之前，受感染但无症状的患者传播传染病的巨大风险，其目前可以持续24-36小时以上。

据观察，对多于一种病原体或靶序列的快速检测变得非常重要，例如，用于区分SARS-CoV-2和季节性流感的阳性和阴性患者。出于成本原因，双重检测通常不由全科医生进行，而全科医生通常是诊断出疑似呼吸道疾病症状患者的第一医生。此外，关于可能受污染的表面或出国旅行返回者的预防性检测，经常观察到检测进行得太晚(当疾病症状变得明显时)，或者鉴于PCR测试所涉及的成本，不会定期执行允许对表面等进行有针对性的净化的标准化测试。最后，目前缺少多功能测试系统和装置，其中在短时间内调整一组给定的待测试靶标(例如，季节性流感病毒株和SARS-CoV-2)的情况下，可以轻松调整反应形式(新出现的毒株或交替使用)。

因此，本发明的一个目的是提供一种新型的多重等温核酸扩增方法，其适合并特别优化以在非实验室条件下以及在实验室条件下在优选手持式或至少便携式诊断装置中进行以使得即使在家庭环境下也能进行即时需求诊断感染，并提供快速可靠的诊断结果，以诊断多种潜在感染和/或靶标核酸，优选是直接应用于诊断装置的同一个测试样品。该装置应该以这样一种方式配置，即应该提供针对至少两种靶序列的易于定制的测试，其中该装置允许执行的生化反应可以很容易地交换以适应对相关结果感兴趣的客户的诊断需求。

发明内容

本发明如所附权利要求书中所定义。

附图说明

图1显示了根据本发明的检测系统(10)，为此开发并优化了生物样品中至少两种靶序列的核酸等温扩增方法。该装置在例如DE 10 2020 109 744.1中进一步详细公开。

图2显示了与图1的检测系统一起使用的一组容器的实施方式。

图3显示了另一种检测装置的示意图。

图4显示了检测装置的电子元件的示意框图。

图5为另一种检测装置的示意图

图6是根据本发明的测试装置的替代实施方式的俯视图；

图7a图6的测试装置的侧视图；

图7b是图6的测试装置的正视图；

图8是图6的测试装置的剖视图；

图9是图6的测试装置的分解等距图；

图10是图6的测试装置的分解侧视图；和

图11a是一组容器的等距图，其形成与图6至10的检测系统一起使用的流体密封组件；

图11b是图11a的具有打开盖子的流体密封组件的等距视图；

图12a是图11的流体密封组件的俯视图；

图12b是图1的流体密封组件的仰视图；和

图13(13a和b)是图11和12的流体密封组件的剖视图。

图14(图14)显示了如下面的实施例2中进一步详述的移动手提箱实验室(BodoKoennecke，Berlin，Germany)。

图15显示了RdRP-、E-和N-RT-RPA测定的概率单位回归分析，如下面实施例中所述。RdRP RT-RPA检测(灰色三角形)的检测限为2个RNA分子/反应，E和NRT-RPA检测(黑色圆圈)的检测限为每个反应15个RNA分子。

图16与实时RT-PCR相比，RdRP、E和N RT-RPA检测的灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。N是样品数，如以下实施例中详述。

图17显示了具有指定量的靶RNA的使用对称引物浓度(420nM：420nM)的SARS-CoV-2RdRP-RT-RPA的结果。信号强度针对温育时间作图，NTC(无模板对照)表示不使用靶RNA的阴性对照。

图18显示了有指定量的靶RNA的使用不对称引物浓度(420nM：480nM)的SARS-CoV-2RdRP-RT-RPA的结果。信号强度针对温育时间作图，NTC(无模板对照)表示不使用靶RNA的阴性对照。

图19显示了使用对称和不对称引物浓度进行的SARS-CoV-2RdRP-RT-RPA结果的比较。阈值时间(TT)针对用于检测的靶RNA的量绘制。

图20显示了可能用于等温扩增反应的热稳定单链DNA结合蛋白的候选实例。蛋白质显示为系统发育树(基于氨基酸序列并使用Clustal Omega(EMBL-EBI)创建，单个蛋白质使用UniProt数据库标识符表示。包括T4 Gp32(P03695)和RB69 Gp32(Q7Y265)以供参考。

具体实施方式

尽管包括等温扩增策略的NAAT，在过去几十年取得了巨大进步，并进一步考虑到可以同时快速提供核酸扩增技术所需的高度特异性引物和探针，整个核酸扩增基础设施在2020年仍仅限于在专业实验室进行测试。此外，虽然多重在理论上是可行的并且市场上有多重PCR试剂盒，但目前用于测试的基础设施不允许易于定制的“按需测试”策略，因为目前测试所需的设备和系统不允许参数(此处：待筛选的靶标)按需快速交换。

与现今测试相关的另一个问题是，可能取自人类或动物受试者，或者可能取自非生物表面的待测样品可能含有传染性或有害物质。因此，为避免交叉污染并降低潜在的传染性，减少样品提取和分析之间的步骤至关重要。最后，应尽快获得测试结果。

本发明现在提供基于多重可定制性的集成解决方案，其可以由纳米级扩增室提供，以允许尽可能多的并行测试，从而可以创建定制的单独测试组。由于便携式和生化全自动测试反应，测试可以在非实验室环境中进行。这不仅可以减轻测试实验室的负担，还可以降低与潜在传染性样品材料的运输相关的成本和风险。最后，这种策略允许高度可靠和快速的测试结果，因为用于靶核酸测定的生物化学通常基于等温核酸扩增反应，提供正确的引物和探针设计，已知在特异性和灵敏度方面优于基于抗原的测试。

本发明人现在提供了一种新的等温核酸扩增策略，其在如RPA的等温测定中完美地相互作用，并且与常用策略相比具有几个优点，因为可以在野外条件下或在设备齐全的实验室外的家庭环境中在便携式扩增装置中进行扩增。最重要的是，本文提供的方法允许多路复用，即在任何生物样品中同时扩增至少两种靶序列，这是快速和稳健的，并且依赖于对某些突变具有耐受性的重组酶，使新方法成为临床环境、家庭环境或机场等常规诊断的完美方法。

迫切需要可定制的诊断装置，它可以很容易地适应特定风险/患者/牲畜群体的靶序列筛选组，或分析从非生物区域采集的样品的污染，以在短时间内对多于一个的靶核酸序列提供可靠和快速的差异性诊断，以便能够在短时间内从诊断测试结果中得出相应的结论。

因此，在本发明的一个方面，可以提供至少两种靶序列的核酸等温扩增方法，所述靶序列优选在生物样品中，或在从表面获得的样品中，或从可能包含待检测的靶序列的任何其他来源(土壤、空气等)，该方法包括以下步骤：(a)提供(i)至少一种重组酶，可选地：至少一种重组酶辅助因子、和至少一种单链结合蛋白、至少一种、优选至少两种靶序列特异性引物、至少一种DNA聚合酶，优选链置换聚合酶，以及可选地：提供至少一种逆转录酶和/或至少一种能量再生酶，以及合适的反应组分，其中(ii)不提供对至少一种酶的活性必不可少的至少一种辅助因子；或者其中提供了至少一种阻断至少一种重组酶活性的抑制剂；(b)提供至少一种生物样品以分析至少一种靶序列的存在，并可选地提供优选无菌的提取试剂盒以获得生物样品；(c)可选地：提供至少一种探针并可选地提供至少一种激活探针的酶以便产生可检测信号；(d)加入起始试剂启动扩增反应；(e)获得至少一种扩增的靶序列和/或获得至少一种可检测信号，每个信号指示所扩增的相应靶序列的成功扩增，可选地，其中至少一种上述酶，更优选至少两种酶，最优选所有使用的酶是在高于37℃至约85℃，优选约39℃至约60℃，最优选约40℃至约55℃的温度下具有最佳活性的热稳定酶。

在一个实施方式中，可以扩增至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或多于六个不同的靶序列，优选地在所使用的相同样品中。在该实施方式中，装置或系统将配备多于一个的扩增室，代表独立的反应环境，其包括单独的和可定制的引物和可选的探针。每个扩增室可以接收样品，优选单独地裂解或以其他方式预处理和可选地灭活(去污染)的样品。因此，只需要一次样品提取，这显著降低了将样品运送到实验室过程中交叉污染或感染的风险。在家庭测试或在机场进行的测试等实例中，可以立即对可能感染感染原的人进行检测，并针对可能的感染原的某个相关小组进行检测，以便可以立即启动进一步的方法(隔离、药物治疗)，因为该测试在不到20分钟的时间内为所有多个测试样品提供了可靠的结果。

在一个实施方式中，靶序列或多于一个靶序列可以是单独选自感染原的靶序列，包括选自下组的病毒的靶序列：埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、本迪布焦病毒、猴痘病毒、黄热病病毒，或至少一种虫媒病毒，优选独立选自寨卡病毒、日本脑炎病毒、裂谷热病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒，或选自狂犬病病毒、包括H5N1、H7N9或H9N2的甲型流感病毒(FluA)或乙型流感病(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒，包括腺病毒1、4.7、副流感病毒3、MERS CoV、SARS-CoV-2、细小病毒B19、西尼罗河病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、诺如病毒、牛冠状病毒、口蹄疫病毒、结节性皮肤病病毒、非洲猪瘟病毒，或者包括细菌的靶序列，其包括包含抗菌素抗性基因的金黄色葡萄球菌，或包括以下的靶序列：溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、土拉弗朗西拉菌(Fransciella tularensis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)，包括pacA/capC、艰难梭菌，包括tcdB/tcdA、泛立克次氏体(Pan-Ricketsia)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或副伤寒杆菌(Salmonella paratyphi)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subs.Paratuberculosis)、巨细胞病毒(CMV)或肠道病毒，至少一种与水产养殖健康相关的传染原，包括例如东方弗朗西斯菌(Francisellanoutaenis orientalis)、白斑综合征病毒和传染性皮下和造血组织坏死(IHHN)(也称为细角滨对虾浓核病毒(Penaeus stylirostris densovirus)[PstDNV]感染)。

在一个具体实施方式中，至少两个靶序列可以作为系统组的一部分提供，其中该组选自急性传染病组、脑膜脑炎组、严重呼吸道疾病组、虫媒病毒检测组、抗生素耐药基因检测组、特定国家/地区旅行返回者组、孕期筛查特异性组、计划住院或急性住院前个体检测特异性组、用于筛查包括与红斑相关的儿科疾病的传染性儿科疾病的筛查组，和/或家畜动物测试组和/或包括例如虾、鲑鱼和/或罗非鱼的感染的水产养殖感染测试组。

基于用户(医疗或公共部门)的需求和技能，因此多种易于定制的变化成为可能。例如，脑膜脑炎组可包含单独配备以检测HSV、VMV、VZV的靶序列的扩增室，以及作为至少一种肠道病毒的第四室。

儿科医生可能需要用于筛查传染性儿科疾病的组，包括与红斑相关的儿科疾病，或用于筛查相关腹泻病(诺如病毒和轮状病毒)的组，以便能够快速正确地治疗儿科患者，并相应地通知父母和联系人。另一个具有临床意义的试剂盒可以是包括FluA、FluB、SARS病毒和/或RSV作为靶标的严重呼吸道感染组，其核酸序列将从一个和相同的探针或样品中单独平行筛选。最后，特别是对于从各种疾病频繁发生的国家的返回者来说，虫媒病毒组可能会引起人们的兴趣，包括基孔肯雅病毒、寨卡病毒和登革热病毒，以及可选地西尼罗河病毒靶序列。

此外，如本文所公开的多重测试系统和试剂盒和方法可能特别适用于针对携带抗生素抗性基因的生物体筛选个体以及可能被污染的表面，例如针对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。

通过这样做，可以显著改善医院或养老院的卫生管理。

简而言之，现有技术的等温DNA/RNA扩增方法，更具体地说是“经典”RPA，通常以辅以作为加载因子的T4 UvsY的作为中央重组酶的噬菌体衍生的T4 UvsX蛋白结合到引物(正向和反向引物)开始，以形成核蛋白丝，开始反应并保证待扩增的靶核酸的可及性。由此产生的复合物可以说是在通常形成靶标的双链DNA中“搜索”同源序列。一旦找到同源性，复合物就会侵入双链(ds)DNA，形成所谓的D环结构。该D环的一侧是双链，其中引物与模板链杂交，启动链交换反应，而D环的另一侧保持单链。这种解开的互补链由单链结合(SSB)蛋白稳定，其中通常使用T4衍生的gp32蛋白。随后，重组酶从核蛋白丝上分解，并立即可用以用新引物等pp.启动另一链置换反应。引物掺入允许DNA聚合酶，其中通常是Bsu(枯草芽孢杆菌衍生的)或Sau(金黄色葡萄球菌衍生的)聚合酶，通常使用聚合酶I的大片段，用于从引物末端的游离3'-OH开始合成。随着聚合继续进行，两条母链将因此继续分离。然后，正向和反向引物的结合使链合成能够同时在两个方向发生，并最终导致扩增的双链DNA呈指数积累，由正向和反向引物之间的序列组成。

RPA最初被证明是一种DNA的核酸扩增方法。反过来，对于本文公开的方法也特别重要，RPA后来也被证明是通过在同一反应室中添加额外的酶，逆转录酶(例如，来自小鼠白血病病毒(MuLV)逆转录酶)，以RNA作为模板的合适反应。无论核酸模板类型如何，推荐的RPA扩增子长度应低于500个核苷酸以实现高效扩增。目前发表的大多数RPA论文都应用了100至250个核苷酸的扩增子长度，这通常会导致快速有效的扩增。然而，也报道了较短的扩增子(79个核苷酸；94个核苷酸和长达1,500个核苷酸的较长扩增子)(参见Lit等，Analyst，2019，同上)。出于本发明的目的，在通常的RPA反应范围内的短扩增子长度通常是更可取的，因为它提高了扩增效率。尽管如此，当实施本文公开的方法以提供可靠的诊断结果时，引物和可选的探针的设计将特别重要。与PCR不同，RPA引物的长度通常相对较长(建议最少30个核苷酸，但范围在32至35个核苷酸之间)。较短的PCR引物(通常在18至25个核苷酸之间)也可用于RPA反应，但可能会降低反应速度和灵敏度，这在诊断环境中应避免。在根据本发明方法的优选实施方式中，特别是如果用于诊断目的，可受相应引物设计影响的一般扩增子长度通常在约50至约400个碱基对(bps)的范围内，优选100至约200bp，最优选约120至约150bp。低于200bps的扩增子长度被认为有利于诊断目的，因为扩增子的长度会影响扩增子扩增的效率，因此与反应的分析灵敏度直接相关。低效的较长扩增子也会导致反应时间稍长，这通常应该避免。在优选的实施方式中，本发明方法的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或甚至所有酶是热稳定酶。

从历史上看，RPA检测是用噬菌体衍生的酶建立的，重点是这些酶的功能，即特异性催化活性。即使在今天，“标准”RPA酶通常也源自T4或T6等嗜温噬菌体(参见Li等，2019，同上)，即噬菌体对肠道细菌大肠杆菌具有特异性，因此在细菌和噬菌体生命周期适应标准温度(体温左右)的意义上是嗜温的。然而，这些酶具有某些缺点，因为这些酶不是特别热稳定的，尽管这些酶由于其功能性而通常用于需要高于40℃的温度的方法中。如本文所用，“热稳定性”或“热稳定的”是指描述折叠蛋白质或酶抵抗其化学或物理结构不可逆变化的质量，对于酶，其三维折叠状态在高于标准温度的较高相对温度下通过抵抗分解或聚合而具有作为生物催化剂的活性，其中代表标准温度的相关参考温度为37℃。因此，本文使用的“热稳定酶”的特征在于仅在高于约70℃、71℃、72℃、73℃、74℃和优选高于75℃和/或37℃至约85℃，优选约38℃至约80℃，最优选约40℃至约65℃的最佳活性温度时显示变性。有此最佳活性温度，至少一种酶将完全适用于在本文公开的便携式诊断设备中执行的方法，以提供快速和可靠的结果。最后，热稳定酶的最适pH值可能在生理pH值或附近，但这不是严格的先决条件。在某些实施方式中，最佳pH将在约pH 6.0至约pH 9.0的范围内，更优选在约pH6.5至约pH 8.5的范围内，最优选在约7.0至8.0的范围内。应保证选择在相同反应环境中相互作用的酶将在合适的缓冲系统中提供，以便所有酶都具有活性并发挥其催化活性。

为了提供廉价且易于定制的测试装置或系统，本文所用的多路复用或多重兼容系统可以配备支持等温核酸扩增方法的任何种类的化学物质。如果需要在各种扩增室中进行大规模平行扩增，则可能适合使用已建立且易于获得的酶。

在某些实施方式中，与标准RPA反应相比，使用热稳定酶可以更容易地控制等温核酸扩增反应的温度。此外，反应可以以更好的可控方式进行，并且可以保证储存和重建后的酶稳定性——这是酶活性的重要先决条件，因此可以保证可靠和快速的测试结果。最后，可以显著减少反应添加剂，进一步改善反应。例如，与RPA相比，在标准RPA测定中必须使用的拥挤剂(crowding agent)的添加可以避免或者减少至最低。在优选的实施方式中，除了在冻干过程中使用的拥挤剂(例如，PEG或甘油)的不可避免的杂质之外，根据本发明的等温核酸扩增反应中没有单独添加的拥挤剂。该方面可以有利地与至少一种热稳定酶的使用结合，或者它可以与一组常规的酶一起使用。对于本文公开的所有方法，技术人员将认识到，对于本文公开的任何热稳定酶，在不背离本发明的要旨的情况下，也可以使用来自另一生物体的热稳定功能等同物或其重组修饰的突变体。

“生物样品”应广义理解并涉及从活生物体分离的任何材料，其包含来自该生物体和/或(另外)来自已感染或渗透生物体的病原体(致病性原核生物或真核生物)或病毒(具有RNA或DNA基因组，单链或双链的，或逆转录病毒)，或与该生物体共生等。生物样品包括，例如，拭子和唾液样品，其包括鼻咽和口咽拭子或唾液，还有痰液、血液、尿液和粪便等。优选地，要在非实验室环境中测试的生物样品将是拭子、唾液、尿液或粪便等，其无需受过训练的医务人员的帮助即可取回。

值得注意的是，本发明还完全适用于从非生物表面获得、但可能被例如MRSA污染的样品中检测至少两个靶核酸序列。

如果酶和这些合适的反应组分预期用于的反应是已知的，技术人员可以容易地确定用于酶促反应的合适的反应组分及其浓度和配合。与本发明的方法特别相关的某些方面将在下文中详细公开。具体地，技术人员可以基于本文提供的公开内容并基于技术人员的公知常识来提供用于每个待分析的目标靶序列的必要的引物和可选的目标探针。鉴于相关感染原的基因组序列和/或各种抗生素抗性基因的序列(参见Sabino等，Nature Comm.，10，5252(2019))可在线获得，技术人员可以使用相关信息并将合适的引物和/或探针添加到本文公开的系统以用于本文公开的方法。

根据各种方法，如本文所用的“起始试剂”可能是特别合适的，因为该试剂允许准确且可控地启动反应。起始试剂可以是至少一种酶的必需辅助因子，没有它酶促反应就不能开始。例如，起始试剂可以是镁或其盐或含镁溶液，例如乙酸镁。浓度可以变化，可以在大约5nM和20mM之间。起始试剂可以以可激活的形式，在单独的隔室中或以可热激活的方式提供，以便可以严格控制反应的开始。如果本发明的方法要在非实验室环境中进行，起始试剂将以反应可以通过用户的简单动作开始(点击按钮，或在应用测试样品后自动开始)的方式提供。

此外，核酸扩增反应将需要dNTP(核苷酸三磷酸)，例如dATP、dGTP、dCTP和dTTP。在前导链和滞后链扩增中，也可以包括ATP、GTP、CTP和UTP以用于RNA引物的合成。此外，ddNTP(ddATP、ddTTP、ddGTP和ddGTP)可用于生成片段梯。每种NTP种类的dNTP可以以1μM至200μM之间的浓度使用。可以使用dNTP和ddNTP的混合物，其中ddNTP浓度为dNTP浓度的1/100至1/1000(1μM至200μM)。在使用防残留试剂盒(例如，使用被称为AmpErase的Thermo Fisher)的情况下，使用UTP可能特别合适。在这些实施方式中，可以使用合适的(通常是重组的)尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)来防止扩增产物在后续反应中再次扩增。为此，反应可以进行得更快并且可以避免假阳性结果。

此外，可以使用还原剂，其中使用的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)。DTT浓度可以在1mM和10mM之间。

显然，本文公开的方法不仅适用于扩增DNA，也适用于扩增RNA，从而检测目标生物样品中的RNA病毒材料。

在某些实施方式中，探针可用于本文公开的方法，特别是在本文公开和要求保护的诊断设备上执行的那些方法中，其具体配置为包括不同的光源和光传感器以检测至少一种探针介导的信号，并且优选地至少两种不同的探针：一种与待扩增的靶核酸相关，一种与阳性对照相关。使用可靠的阳性对照，特别是在诊断领域，更特别是像SARS-CoV-2这样的感染病原体的诊断，是非常有帮助的，并且不包括在目前可用的检测试剂盒中，因为阳性对照可以得出这样的反应是否有效的结论。如果测试不是由训练有素的专家在实验室中进行，而是在家庭环境中或在测试站中进行，这一点尤为重要并且具有巨大优势。

本文所用的术语“探针”广义上指分子生物学中使用的分子或原子，特别是本文公开的方法中，用于研究性质或用于诊断设置的另一目标分子或结构的量。技术人员可以获得多种不同的探针，这些探针可以很容易地与本文公开的方法结合(参见Molecular ProbeTechniques，树号E05.601，唯一ID D015336，RDF唯一标识符，http://id.nlm.nih.gov/mesh/D015336)。为了在本文公开的特定装置上使用本文公开的方法，可以优选提供可检测和/或可量化信号的探针，可选地可激活探针，例如，

/荧光共振能量转移(FRET)探针等。鉴于本文所公开的装置的特殊配置，这可以允许快速诊断结果。由于提供了不同的光源、传感器和检测器，这提供了包括与一个探针相关联的阳性对照和与实际靶序列相关联的不同探针的优势，这可以大大提高诊断结果的可靠性。

在本发明的上下文中，可以使用任何发光检测系统来快速且可靠地检测感兴趣的扩增结果。发光是任何一种非由热产生的物质自发发射光的总称。发光包括各种类型的发光，其中与本发明的目的最相关的是化学发光，包括生物发光和电致发光，以及光致发光，包括荧光和磷光，作为本文公开的装置，可以适当地配备以容易地检测多种发光探针或分析物。

可以在RPA反应期间掺入的探针包括，例如，市售的TwistAmp^TMexo探针(通常具有约46至52个核苷酸的长度)和

fpg探针(通常具有32至35个核苷酸)，这些探针用于荧光实时检测。这两种探针通常用荧光团、靠近荧光团的淬灭剂(例如BlackHole淬灭剂)，以暂时阻止荧光信号，以及位于3'端的阻断剂(例如C3-间隔子、磷酸盐、生物素-TEG或胺)，用于防止聚合酶从3'端延伸(再次参见Li等，Analyst，2019，同上，特别是图3A和B)。实时检测基于荧光探针在荧光团和淬灭剂之间的脱碱基位点处的切割(也称为脱嘌呤/脱嘧啶位点，是DNA中的一个位置(较少见于RNA)，既没有嘌呤也没有嘧啶碱基)。无碱基位点可以是四氢呋喃(THF)或dSpacer(THF的衍生物)或dR基团(通过C-O-C接头的无碱基位点的脱氧核糖)。例如，大肠杆菌核酸外切酶III在THF或dSpacer位点切割TwistAmp^TMexo探针，而大肠杆菌糖基化酶/裂解酶大肠杆菌在dR位置切割TwistAmp^TMfpg探针。酶切后，/>

exo探针可用作正向引物。然而，由于大肠杆菌糖基化酶/裂解酶fpg蛋白的不同催化模式(β-消除)，TwistAmp^TMfpg探针不能用作引物，它不产生可延伸的3'-OH基团，而是产生3'-磷酸基团。只要有至少一个合适的光源和同源检测装置通过产生可检测信号特异性地检测探针和/或标记的存在，用于用可检测标记物标记目标核酸碱基或核苷酸的各种不同的探针或标记(包括不需要添加至少一种激活酶的探针)是可以想象的。

在另一实施方式中，可以使用另外的发光团染料(参见Roy等，BiosensBioelectron.2016Dec 15；doi:10.1016/j.bios.2016.06.065.)。

本文公开的方法中使用的所有引物或探针可以是天然存在的DNA和/或RNA序列，或包括天然存在的碱基和/或主链的合成引物或探针，或包括共价和/或非共价连接到引物或探针的标记的合成元件，或包括至少一个硫代磷酸酯主链以增加引物或探针的稳定性，或通过具有校对活性的DNA聚合酶提高DNA序列的扩增(Skerra，Nucleic Acids Res 20，3551-3554，doi:10.1093/nar/20.14.3551(1992))，及其任何组合。

根据本发明的装置在其总体配置中可以容易地适应以适合于检测各种荧光团、发色团、发光团或其他探针和/或分析物或染料以通过光源可视化。在一个具体实施方式中，可视化是由扩增反应期间发生的pH值下降引起的，如果将合适的pH敏感性染料添加到反应混合物中，例如酚红或甲酚红-允许用肉眼比色区分阳性和阴性结果。在这种情况下，检测室(42)可以被配置成包括透明窗口，使得可以容易地用肉眼检索由简单配色方案(一种颜色＝阳性；另一种颜色＝阴性)证明的扩增反应的结果。以下公开了可能容易适用于本发明目的的技术：Huang等，Microb Biotechnol 13，950-961，doi:10.1111/1751-7915.13586(2020)，或Lu等，Int J Mol Sci 21，doi:10.3390/ijms21082826(2020)。

如本文所用，“拥挤剂”是指有助于为酶促反应提供最佳反应环境的任何试剂。拥挤剂的作用方式是产生更小的反应室，从而增加底物和同源酶之间反应的可能性。通常主动添加到RPA反应中的拥挤剂包括，例如，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖和聚蔗糖。拥挤剂的浓度通常可为反应体积的1％至12％或反应重量的1％至12％。尽管所有PEG都是有用的，但公开的优选PEG包括PEG1450、PEG3000、PEG8000、PEG10000、分子量为15000至20,000的PEG化合物(也称为Carbowax 20M)及其组合。尽管如此，添加额外的试剂(如拥挤剂)会增加反应的复杂性。在本文公开的方法中，用于扩增方法的酶的热稳定性以及另外用于进行扩增反应的特定装置的事实允许最佳反应环境，其中反应伙伴与分析物、待分析的生物探针在专门的诊断装置中和/或酶可以在高温下使用而不失去活性的事实结合在一起，组分的反应性通常随着温度的升高而增加。因此，本发明的方法可以在不主动添加拥挤剂的情况下进行。

作为另一种选择或另外，纳米结构元素可用于本发明的反应混合物中以进一步优化扩增结果，例如，ZnO纳米结构(Ma等，Virus Res.，2017，232:34-40.doi:10.1016/j.virusres.2017.01.021.)。

本发明的等温方法中的缓冲溶液可以是Tris-HCl缓冲液、Tris-乙酸缓冲液或其组合，但其他缓冲系统也是合适的。缓冲液可以以约10nm至100mM之间的浓度存在，这将取决于所使用的缓冲系统和要实现的反应的pH值。后者受目标酶的最佳活性的影响，如本领域技术人员所知。

为了本发明的目的而测试的所有热稳定性酶以具有相当均一的最佳pH活性范围在约pH 6.0至约9.0之间，优选在pH 7.0和8.5范围内的方式进行选择。因此，缓冲的pH值可以在6.0至9.0之间。缓冲液还可以含有浓度在5nm至100mM之间的Mg离子(例如，以乙酸镁的形式)，优选浓度在5至15mM之间。一种优选的Mg浓度是10mM(Mg浓度或乙酸镁浓度)。

通常，RPA反应可温育5分钟至16小时，例如15分钟至3小时或30分钟至2小时。可进行温育直至达到所需程度的扩增(参见EP 2 336 361 A2)。本文公开的方法的巨大优势在于如下事实，即考虑到特定便携式系统或设备中使用的热稳定生化成分的特殊配置，结合某些检测技术，如通过可由便携式系统检测的至少一种发光、优选至少一种荧光信号，这些方法的扩增速度极快。因此，该方法在几分钟后，例如2分钟后、3分钟后、4分钟后、5分钟后、6分钟后、7分钟后、8分钟后、9分钟后或最迟约10分钟后为阳性对照提供可靠的结果，进而为生物样品的分析提供阳性或阴性结果。

在本发明方法的某些实施方式中，优选在步骤(d)之前，可另外提供至少一种重组酶辅助酶(生物学或生化因子)或因子(此处：化学因子)。这样的酶或化学品实现主力的辅酶的功能，重组酶和/或化学因子激活、稳定或以其他方式增强重组酶的活性。对于RPA反应，UvsY是一种重组酶辅助酶或加载因子，有助于启动核蛋白丝构建，或用任何种类的重组酶稳定核蛋白复合物(Li等，同上，或EP 1 759 012 A2)。另一种感兴趣的重组酶辅助酶可以是一种可以在DNA合成启动后促进重组酶/dsDNA复合物有效分解的酶。这些辅助酶包括那些能够刺激3'到5'分解的酶和那些能够支持5'到3'分解的酶。进一步的重组酶辅助酶可以包括几种聚合酶，它们可以在3'到5'方向上取代RecA或等效的、优选热稳定的重组酶，并且可以刺激重组酶-dsDNA复合物从3'到5'的分解。这些DNA聚合酶优选包括大肠杆菌PolV的热稳定等同物和其他物种的同源聚合酶。其他重组酶辅助酶包括一类称为解旋酶的酶，其可用于促进重组酶从dsDNA上分解。这些促进5'到3'和3'到5'方向的分解。解旋酶是体内重组过程的必须组分，其功能是将重组中间体的分支点从一处移动到另一处，以分离链，以及分解和回收与DNA结合的成分。其他重组酶辅助酶包括大肠杆菌RecG同系物并且优选热稳定酶。RecG可以刺激分支结构的分解。在其自然环境中，这种酶通过解开前导链和滞后链来逆转DNA损伤位点处的复制叉，从而驱动复制叉返回以产生4路连接。

对于SIBA型反应，可以提供蔗糖磷酸化酶作为额外的重组酶辅助酶(参见Hoser等，同上)。

本文公开的方法的中心热稳定酶是重组酶，优选热稳定重组酶(参见SEQ ID NO:1)。重组酶是一种可以包裹单链DNA(ssDNA)以形成细丝的酶，其然后可以扫描双链DNA(dsDNA)以寻找序列同源区域。当定位到同源序列时，核蛋白丝(包含重组酶试剂)链侵入dsDNA，产生短杂交体和被称为D环的置换链泡。长期已知的重组酶包括大肠杆菌RecA蛋白或来自任何类群的任何同源蛋白或蛋白复合物。这些RecA同系物通常以该组中第一个被识别的成员命名为Rad51。可以使用其他重组酶试剂代替RecA，例如RecT或RecO。重组酶试剂通常需要ATP或其他核苷三磷酸及其类似物的存在才能发挥活性。

同样对于本文所公开的方法，优选在合适的反应条件下在反应环境中使用至少一种热稳定重组酶试剂，在该反应条件下靶向位点的再生可以在一轮D-环刺激合成后不久发生。这将避免因从一端到另一端的振荡单边合成而导致的ssDNA扩增停滞或低效线性扩增。

在本文公开的方法的一个实施方式中，所提供的至少一种，优选至少两种，最优选所有的酶可以独立地选自SEQ ID NO:1至8，或其催化活性片段，或与相应参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列，或编码其的核酸序列。

对于多重或多路复用方法，也可以使用具有与本文公开的用于等温核酸扩增的热稳定酶相当的功能的常规酶。

在又一个实施方式中，提供了根据SEQ ID NO:1至8中任一个的酶的功能等同物。如技术人员已知的，细菌、病毒和古细菌序列的序列在进化过程中可能只具有差的保守性。因此，如上文所用的上下文中的“功能等同物”意指一种酶，其是热稳定的并且具有相当的功能，意味着酶功能或催化活性，作为与SEQ ID NO：1至8中任一个的相应酶直接比较的功能等价物。当然，这些功能等价物也可以根据本发明的方法使用。

如下详述，在寻找用于核酸扩增的温度和非实验室环境可传导等温方法的候选者的计算机研究之后，鉴定了SEQ ID NO:1至8的序列。目的是获得一组酶，其工作快速可靠，但具有更好的稳健性，以便实验室外未经培训的人员也可以轻松进行反应。令人惊讶的是，如果单独使用或与RPA/SIBA反应中使用的标准酶结合使用，所鉴定的候选物显示出非常有前途的酶活性，但总的来说，这些酶和反应更适合非实验室使用。基于酶更稳健和热稳定这一事实，现在可以跳过经典RPA/SIBA反应的某些试剂和步骤。降低反应的复杂性和提高温度(不降低灵敏度等)对于诊断用途非常重要，对于非实验室诊断用途更是如此。此外，如果降低驱动反应的生物化学的复杂性，则可以降低生产成本。

在本文公开的方法的另一个实施方式中，提供了至少一种能量再生酶系统。通常，如所描述的，作为本文公开的扩增方法的能源的ATP的存在是相关的。ATP再生系统早先被描述为RPA反应的关键，以允许持续的重组反应，因为重组酶在与核酸结合时具有极高的ATP水解率(参见EP1 789 012A2)。特别是，UvsX蛋白被描述为具有比recA高10-20倍的水解速率，并且每个单体每分钟可消耗200个ATP分子。许多系统是可用的，同时通常用于在等温RPA反应和类似反应中回收能量，因为ATP再生不良可能会降低反应速率，并可能在产物达到可检测水平之前停止反应。其中一个系统是肌酸激酶/磷酸肌酸系统，或鸡肌激酶，它将一个AMP分子和一个ATP分子转化为两个ADP分子。然后使用肌酸激酶/磷酸肌酸系统将ADP转化为ATP(Li等，同上)。对于这些酶，磷酸肌酸二(三)盐或缓冲液可能是合适的(1mM至100mM)。

本发明人发现提供能量再生酶或系统可以与本文公开的使用热稳定酶的方法完美兼容。尽管如此，还发现提供简单的ATP过剩将完全足以在短时间内在单个小瓶中进行可靠的扩增反应，从而提供可靠的结果。因此，特别是如果本发明的试剂盒和/或诊断手持系统用于执行本文公开的方法，则可能优选提供超过1mM至100mM的量的过剩ATP。对于制备目的(例如，DNA合成)，需要比诊断目的更高浓度的ATP，在诊断目的中，将扩增两个引物之间确定数量的相当短的片段。发现提供高浓度的ATP足以成功地驱动扩增反应，这可能是优选的，原因有以下几个：(i)反应会更便宜，因为不需要额外的酶，以及(ii)系统将不那么复杂，因此更加稳定和(iii)在使用中稳健，如果在家庭环境中使用并且几乎自动执行，而不是由实验室领域训练有素的专家执行，这将是一个特别的优势。

在本文公开的方法的某些实施方式中，至少一种酶包含至少一个标签和/或标记。

蛋白质标签，即添加到目标蛋白质或酶的编码序列的人工序列，是生物技术和分子生物学相关技术领域的技术人员所熟知的。这些标签被添加到蛋白质中以促进其重组生产后的纯化(所谓的亲和标签)、蛋白质的可视化、溶解度等。

根据本发明的各种实施方式，根据本文所要求保护和公开的方法使用的每一种酶都可以包含至少一个标签，或者在N端，或者在C端，或者也在蛋白质序列内(在不干扰蛋白质的功能的情况下，优选地在存在的各个结构域之间)或其任何组合(例如，N-末端和C-末端标签，它们通常是不同的，例如两个不同的亲和力标签，或溶解度标签和可视化标签的组合等)。因此，术语“标签”或“蛋白质标签”是指各种不同的多肽序列或编码它们的相应核酸序列，它们可以在不同位置纳入目标蛋白质中，优选地在N-和/或C端，或不同的功能域之间，并履行几种不同的功能。例如，蛋白质标签可以区分为亲和标签，例如甲壳素结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Strep-标签和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或His-标签。亲和标签可用于专门纯化目标蛋白质。蛋白质标签的另一实例是增溶标签，它允许获得可溶形式的目标蛋白质，尤其是在细菌细胞培养中。表位标签可用于具有用于分析抗体和发光的结合位点，优选荧光标签提供检测细胞培养物中目标蛋白质的可能性。标签或标记也可用于标记目标蛋白质或酶或其片段以允许容易识别的目的。这在诊断目的中可能特别有用。

在某些实施方式中，至少一种本文公开的热稳定酶将优选地根本不包含亲和标签，因为可以在不使用亲和标签的情况下生产和纯化热稳定酶。尽管具有显著优势，例如，通过亲和标签增强蛋白质纯化，同时标签对蛋白质功能没有影响或影响很小，但特别是亲和标签可能具有标签可能对蛋白质活性产生影响的缺点，因此必须单独测试标签在哪个位置对蛋白质活性的影响很小。此外，标签需要用于亲和层析的高材料成本。此外，一些标签可能导致蛋白质失活。即使可以使用可切割标签，这也会导致额外的工作，因为必须添加合适的蛋白酶，然后必须在单独的工艺步骤中再次将其去除。

“标记”可以是化学修饰或同位素取代，这使得在分子、部分或原子的整个代谢转化或运输过程中，或特别是在核酸扩增的诊断或制备测定过程中，鉴定分子、部分或原子成为可能。

用于本文公开的等温方法的标准合适的反应条件和试剂浓度(例如，酶、引物、探针、dNTP、ATP、缓冲液、pH等)是技术人员已知的并且可以取自例如，Li等，Analyst，2019，同上，而要考虑的特殊条件在本文中针对特殊实施方式公开。

在本发明方法的一个实施方式中，其中提供至少一种正向引物和至少一种反向引物作为靶序列特异性引物，其中至少一种这些引物，优选反向引物，以相对于其他引物更高的量或浓度提供。通常，多重分析的引物或一组引物或几组引物是感兴趣的，可以根据本文公开的方法提供，其中通常以等摩尔比提供引物。尽管如此，还是发现对于某些目的，例如，对于RNA病毒的诊断，提供更高比例的一种引物可能是合适的(取决于它是(+)还是(-)ssRNA病毒)以获得更多的cDNA用于后续的扩增步骤，这将提高反应的性能。这种不对称性代表了优于传统对称或等摩尔设置的显著优势(参见实施例8和图17至19)。

在本发明方法的某些实施方式中，一种引物相对于另一种以约1:1.1至约1:10的比例提供，例如，以约1:1.1，1:1.2，1:1.3，1:1.4，1:1.5，1:1.6，1:1.7，1:1.8，1:1.9，1:2，1:2.1，1:2.2，1:2.3，1:2.4，1:2.5，1:2.6-1:3，或1:3-1:5，或1:2至1:10的比例提供。优选地，一种引物相对于另一种以约1:1.2-1:6的比例提供；更优选地，以约1:1.4-1:5的比例，最优选地，以约1:1.5-1:4的比例。

在某些实施方式中，本发明的方法可用于靶序列，其是单链或双链(c)DNA和/或RNA核酸序列。反过来，该方法可用于各种核酸材料的各种扩增反应。

正如在包括使用PCR和等温方法的分子检测技术领域中已知的那样，存在使扩增反应的结果可视化的多种方式。这些技术是本领域技术人员已知的并且可以用于本文公开的方法。

在一个实施方式中，例如，包括单链和部分双链引物的至少一种引物，其本身标记有可检测标记。应当注意的是，荧光猝灭剂也被认为是可检测标记。例如，可以使荧光猝灭剂与荧光染料接触并检测猝灭量。为了不干扰反应，可检测标记应该不干扰扩增反应。当引物是部分双链且具有侵入链和非侵入链时，可检测标记应以不会干扰侵入链的扩增反应的方式连接。部分双链引物的非侵入链不会延长，因此对非侵入链的标记没有限制，唯一的例外是非侵入链上的标记不应干扰侵入链的延伸反应。标记的引物提供了更快速地检测扩增产物的优势。此外，检测未掺入的标记，即未延伸的标记寡核苷酸，将允许监测反应状态。

在另一实施方式中，可以标记双链引物，使得可以检测引物两条链的分离。如上所述，在多轮扩增之后，部分双链引物的侵入链和非侵入链被分离。分离后，非侵入链不参与扩增反应，可用于在线检测和监测扩增反应的结果。

在本文公开的方法的某些实施方式中，提供至少一种探针和/或标记，其中至少一种探针和/或至少一种标记包含可直接或间接检测的部分。

此外，可检测标记可以是荧光标记或酶，标记猝灭剂(也称为标记抑制剂)可以是荧光猝灭剂或酶抑制剂。在这些情况下，标记通过荧光或酶抑制来检测。如果使用荧光标记，则标记的可检测性将是荧光，如果使用酶，则标记的可检测性是酶活性。

在优选的实施方式中，提供了单独的探针，该探针可以是靶序列特异性的。此外，探针可用于提供可检测或可见信号以方便的方式监测扩增反应的结果。探针可以携带可激活标记或提供信号的组分，其可以例如通过添加酶激活，例如外切核酸酶III(Exo III，本文exo)，如在Twist-RPA反应中使用的。在某些实施方式中，标记还可与至少一种引物相关联。尽管可检测部分可选自荧光染料、酶、荧光淬灭剂、酶抑制剂、放射性标记、显色剂及其组合，对于本文公开的系统中本发明的方法的非实验室使用，应避免使用放射性材料和/或通常使用有害物质(化学和/或生化试剂)。

在本发明的另一方面，提供了一种用于检测生物样品或从表面获得的样品中的至少一个靶序列的系统，优选便携式系统，例如便携式诊断系统或装置，所述系统包括：至少一个裂解室(12)、至少两个扩增室(14；例如14.1和14.2)和发光、优选荧光检测装置(16)，其中至少一个裂解室(12)包含裂解液，扩增室(14)包含包括如权利要求1至10所定义的一组酶和合适的反应组分的混合物，并且发光、优选荧光检测装置(16)，包含配置成接收扩增室(14)或扩增室的内容物的检测室(42)、光源(44)、光学传感器(46)、能量供应装置(48)、无线数据接口(52)和控制器(50)，其中该系统被配置为执行根据权利要求1至10中任一项所述的方法并且因此允许并行地进行诊断多重分析。

在一个实施方式中，该系统可以被配置成使得它可以被组合以形成单个流体密封组件(34)，其中至少一个第一裂解室(12)包括第一组化学品和/或试剂，所述第一室在使用前关闭，优选地，其中第一组化学品和/或试剂允许待扩增的至少一个靶核酸序列的可接近性和/或样品中潜在传染性物质的灭活，并且其中至少两个扩增室(14)中的第二扩增室(14.1或14.2)各自包括第二组化学品和/或试剂，所述第二组化学品和/或试剂至少部分不同于第一组的化学品和/或试剂，并且至少不同于设置在对靶基因特异性具有决定性的部分中的至少一个另外的第二扩增室的化学品和/或试剂，并且其中至少一个第一裂解室包括盖子(26)，当至少一个第一裂解室(12)和至少两个第二室(14.1或14.2)之一组合形成单个流体密封组件(34)时可以打开，以便允许至少一个第一裂解室(12)的内容物单独进入至少两个第二室(14)中的每一个。

因此，本系统的一个巨大优势在于，待测试至少两个目标核酸靶序列的存在的潜在危险样品仅需被提取并提供给如本文公开的系统或装置一次。此外，样品可以在进行扩增反应和后续诊断的地方直接原位获得或提取。通过这样做，这当然会大大降低污染或潜在传染性或危险样品传播的风险，因为样品不必运送到实验室。因此，多路复用方法允许将目标样品直接分布在扩增室上，其中每个扩增室包含检测目标靶序列的必要试剂。

系统的这种特定的安排和配置允许巨大的优势以包括控制反应，例如阳性对照，在系统用作诊断装置的情况下，如果提供标准化对照，通常不需要单独的裂解，。对于这种用途，系统的不同隔室或腔室特别适合与本发明的试剂盒组件一起执行本发明的方法，所述试剂盒组件优选与系统一起提供，以便仅需添加待分析的生物样品。在另一实施方式中，甚至可以增加一组腔室以提供可严格控制的诊断装置，该诊断装置提供并行多重分析，同时提供高卫生标准。

在一个实施方式中，该系统可以额外地包括发光、优选荧光检测装置(16)，该发光、优选荧光检测装置(16)包括：配置成接收扩增室或扩增室的内容物的检测室(42)，配置成激发发光并且特别是荧光的光源(44)，配置成捕获发光并且特别是荧光的光学传感器(46)，能量供应装置(48)、无线数据接口(52)和控制器(50)。

该实施方式可以与本发明的方法完美结合，其中使用荧光或可激活荧光探针或引物，使得扩增产物将产生可检测信号，立即显示反应的定量和定性结果。该系统将优选地包括发光、优选荧光检测装置，其允许识别不同的发光信号，使得至少两个信号，例如待分析的探针的电位信号，以及与标准化阳性对照相关的信号，可以被检测到。

重要的是，本文公开的用于等温核酸扩增的方法已经被特别优化以与本申请人设计的系统兼容，该系统或装置也在非实验室条件适用于快速检测生物样品中的靶DNA或RNA。特别适用于执行本文公开的方法的本发明的该系统描述如下并参考图1至4：

根据针对所述系统的第一方面，提供了一种系统，其包括至少一个裂解室、至少两个扩增室和至少一个发光、优选荧光检测装置。单独的裂解室可包含裂解液，其导致样品中的细胞裂解从而释放目标生物样品的核酸(DNA或RNA)。裂解液可以包含酸，例如HCl、醋酸钾或弱碱，以及表面活性剂。

扩增室可以优选包含用于进行本发明的等温方法的混合物。有利地，该装置的布置允许容易地集成一个以上的扩增室，这提供了对提供给至少一个裂解室的一种和相同样品的快速多重分析。

待分析的生物样品可在获得样品后直接提供给腔室，以保证(i)在运输过程中没有污染和(ii)立即分析样品。如果使用用于实时荧光检测的“外切探针(exo probe)”，则扩增室可以进一步含有外切核酸酶III(参见下面的实施例)。此外，可以至少存在第二扩增室。使用本文详述的核酸外切酶III+探针设置被证明是特别有效和快速的：在实时设置中，因为它们将存在于本文公开的便携式系统中以使用本文公开的方法进行诊断反应。然后可将裂解或以其他方式预处理的样品通过装置中的无菌通道单独转移至单独的扩增室。

在某些优选的实施方式中，镁(Mg)，例如乙酸镁，可以添加到裂解缓冲液或另一种缓冲液或固体试剂中以溶解在缓冲液中，其中重要的是Mg与驱动扩增反应的酶分开保存，因此可以通过以可控方式添加Mg按需启动反应。

当本发明的扩增方法在如本文所要求保护和公开的装置或系统上进行时，应用简单的旋转运动，或按下放置在装置外表面上的按钮可以帮助用户添加起始剂，其包括Mg和对于反应室所有进一步必要的试剂，以分析目标生物样品。优选地，不需要训练有素的分子生物学家的专业知识或技能来启动反应，这与高度专业化实验室中的当前测试系统相比具有显著优势。

在另一实施方式中，内部阳性对照(IPC)可以包含在裂解缓冲液中。在另一实施方式中，可以提供IPC并且可以在单独的腔室中进行对照反应。

当将本发明的试剂盒与本发明的方法和装置/系统一起使用时，该试剂盒将包括用于提取目标生物样品的无菌装置，优选地以非侵入方式，使得样品可以由用户/潜在患者转移到设备/系统的上部腔室中，使得生物样品可以然后与裂解缓冲液等接触，从而可以在设备内自动实现/进行潜在传染性物质的灭活、遗传物质的释放和扩增反应。

裂解室和活塞的组合被布置成使得在活塞移动到裂解室中的情况下可以通过排气释放压力。通气装置被配置成防止裂解室或扩增室或两者的内容物从相应的一个或多个室中逸出。

该系统被配置成实施诸如RPA和SIBA以及其他方法等等温扩增方法，优选等温方法。扩增方法(使用标准RPA或SIBA)通常配置为在大约25℃和大约47℃之间的温度范围内进行。尽管如此，某些实际问题表明，高于37℃的更高温度可能更适合获得更快的反应动力学——从而更快地获得结果，后者对诊断应用非常有利。因此，一个全新的生化反应设计被证明是重要的，它可以在扩增过程中在约37℃至约85℃，优选约39℃至约60℃，最优选约40℃至约55℃的等温温度下工作。由于实际原因，后一个最佳范围可能很重要，仅考虑到系统被额外配置为作为便携式手持设备工作的事实，必须考虑监管问题才能使设备安全使用。

在各种实施方式中，可以应用初始加热。在某些实施方式中，可以施加电加热。在其他实施方式中，系统可以另外地，用于便携式使用，

在另一个实施方式中实施连续加热。在一个或多个方法步骤中，也存在没有任何外部加热的实施方式。

发光、优选荧光检测装置可以包括：

-配置成接收扩增室或扩增室的内容物的检测室，

-至少一个光源，

-至少一个光学传感器

-能量供应

-无线数据接口和

-控制器。

控制器可以是微控制器和/或状态机。

发光、优选地荧光检测装置可以进一步包括加热装置，其允许插入发光(优选荧光检测装置)的扩增室的加热。

该系统可以是即时护理(POC)系统，其中发光、优选荧光检测装置被布置在即时护理处，例如医生办公室。作为另一种选择，该系统可以是个人系统，其中发光、优选荧光检测装置是独立的和可移动的，特别是便携式的。

本发明的另一方面是一组至少两个不同的腔室，它们可以组合以形成单个流体密封组件，其中第一室包括第一组化学品和/或试剂，所述第一室在使用之前关闭，并且其中第二室包含第二组化学品和/或试剂，其至少部分地不同于第一组的化学品和/或试剂，并且其中第一室包含盖子，其可以在第一室和第二室结合形成单个流体密封组件的情况下打开，以允许第一室的内容物进入第二室。

优选地，每个腔室是一体的单体。在替代实施方式中，第一室和第二室的组件是一体式单体。

优选地，腔室可以通过流体密封卡扣配合连接来连接，从而形成单个流体密封组件。作为卡扣配合连接的替代方案，可以提供类似于鲁尔锁的螺纹锁连接，用于紧密连接腔室。另一种选择是腔室之间的压配合连接。

至少两个腔室的流体密封组件的优点是可以容易地布置组件而没有污染的风险，因为组件的内容物被牢固地固定在组件内。

优选地，第二室具有允许激发和检测发光(特别是荧光)的透明壁。

包含两个最初独立的腔室和具有可以容纳用于发光检测的组件的容器的发光、优选荧光检测装置的组件，使得可以执行包括两个连续的化学或生化方法步骤的测试方法——例如裂解和扩增——以及以简单、清洁和安全的方式进行的发光测试步骤，可最大限度地降低污染和感染的风险，同时提供易于处理的方法。作为另一种选择，如果不需要裂解，因为DNA或RNA材料直接以不含细胞碎片或材料的相当纯净的状态提供，则两个腔室可用于平行扩增反应以实现多重目的，或者在诊断设置中，可以包括有价值的对照，或其任意组合。发光、优选荧光检测装置可以重复使用，因为在使用中它不与样品或任何试剂或化学品接触，因为它们被紧密地封闭在腔室组件中。腔室组件及其内容物在使用后可以安全处置，因为内容物可靠地保存在组件内部。

根据第一实施方式，用于检测靶分析物的系统10包括裂解室12、扩增室14、活塞18和发光、优选荧光检测装置16；参见图1至4。

第一容器12是裂解容器，其封闭包含用于裂解样品的流体和/或试剂的第一室。第二容器14是测试容器14，其封闭包含试剂的第二室，例如用于扩增在裂解容器12中裂解的样品中的核酸的酶；参见图1。

这组两个容器12和14还包括允许流体从第一室有限地转移到第二室中的装置。在图1和2所示的实施方式中，用于将流体从第一容器12有限地转移到第二容器14的装置包括活塞18。

优选地，提供两个以上扩增或测试室14.1和14.2；参见图2。测试室14.1和14.2可以是一个整体的第二容器的一部分，该第二容器可以与例如第一裂解容器组合。如图11至13所示，第一容器和第二容器可各自仅具有一个腔室，即分别为裂解室12'和测试室14'。

值得注意的是，具有多个测试室的装置的这种配置对于任何用于核酸扩增的多聚体测定特别重要，这在诊断和预后实践中目前非常需要，但不能可靠地实现。在图2所示的设置中，至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个以上测试(即扩增)室中的每一个都可以预先配备用于扩增目标靶序列的特异性引物和/或探针，而整体反应组分是相同的，因为基本的生化检测机制是相同的。考虑到本发明的系统和相关反应室可以进行额外的纳米化，可以进行超过五个平行反应。

这种设计的一个巨大优势是潜在的传染性材料不必从患者或非生物表面获取两次或多次，从而降低污染风险(分析物或待分析的样品，以及接触所述材料的人)。此外，分析物或样品可以在短时间内直接在原位进行分析，并允许采用多重方法同时鉴定一组靶核酸序列，从而使测试具有更好的意义和有效性。此外，同时测试可能是成本敏感的，因为在第一靶序列的第一测试是阴性的，但是患者仍然表现出疾病的症状的情况下，不必进行后续测试系列，所述疾病之前尚待准确确定以提供适当的措施。

裂解室12包含裂解液，其导致待测样品中的细胞或病毒裂解。通过裂解，DNA或RNA等核酸通过分解待测样品中的细胞或病毒而释放出来。裂解可通过包含诸如盐酸等酸或弱碱的裂解液实现。裂解室12具有盖子20，因此可以打开裂解室12并且可以将待测试的样品放入裂解室12中。裂解室12的内容物约为100μl(最多550μl)，但可以变化。裂解室组合物也可以是这样一种类型，如果目标生物样品包含潜在传染性材料，则实现传染性/传染性材料的快速灭活。

裂解室的盖子优选是可以被具有样品的棉签刺穿的膜20。

检测系统10还包括两个扩增室14.1和14.2，它们是一个第二容器14的一部分。

每个扩增室14.1和14.2包括所需测试分析物的重组酶聚合酶扩增(RPA)所需的特定酶混合物。优选地，该混合物以包含在扩增室14中的干燥颗粒22.1和22.2的形式提供。

一个或多个扩增室优选为比色杯形并且可以插入到发光、优选荧光检测装置16体的容器24中。容器24是发光、优选荧光检测装置16的检测室26的一部分。

每个扩增室14的尺寸被设计成允许以紧密且限定的方式将相应的裂解室12插入相应的扩增室14中。基台28限制插入深度。一旦裂解室12完全插入到包含一个或多个扩增室14.1和14.2的测试容器14中，活塞18可用于将流体从裂解室12转移到扩增室14.1和14.2中并允许重组酶聚合酶扩增以在扩增室14.1和14.2中工作。为了允许将裂解室12的内容物转移到扩增室14.1和14.2中，在裂解室12的底部布置了另外的薄盖28。薄盖28的尺寸被设计成在由活塞18引起的流体压力下破裂。可选地，活塞18和薄盖28可以被设计成使得活塞18的尖端(未示出)可以刺穿薄盖28。

裂解室12、第二容器14和活塞18被配置成当完全插入时以流体密封方式接合。这种流体密封接合可以通过卡扣配合连接实现，其中裂解室12和第二容器14之一的环形突起30接合在相应的另一部分的环形槽中。同样，活塞18和裂解室12之一的环形突起32接合在相应的另一部分的环形槽中。环形突起30和32用作密封件并且可以与相应腔室或活塞的其余部分一体地形成。

作为卡扣配合连接的替代方案，可以提供类似于鲁尔锁的螺纹锁连接，用于紧密连接裂解室12和第二容器14。

为了允许将裂解室12插入到第二容器14中以及将活塞18插入到裂解室12中，提供排出装置(未显示)。

一旦完全接合，第二容器14、裂解室12和活塞18形成紧密组件34，其可作为单个流体密封单元处理。

扩增室14.1和14.2的壁36是透明的以允许光进入扩增室14.1和14.2并离开扩增室14.2和14.2。扩增室14.1和14.2的透明壁36使得可以将扩增室14.1和14.2的内容物暴露于可引起发光的出射光。在这种情况下，每个扩增室的内容物是发光的，可以通过扩增室14.1或14.2的透明壁36检测相应扩增室14.1或14.2中的样品的发光。

包含四种重组酶聚合酶扩增的酶混合物的每个沉淀物22优选包含重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换聚合酶、核酸外切酶III，在检测RNA的情况下是逆转录酶。

使用时，首先将待测样品装入裂解室12，待测生物样品中的细胞裂解后，通过活塞18将裂解室12的全部内容物转移至扩增室14.1和14.2中，使得重组酶聚合酶扩增可以在扩增室14中发生。

一旦重组酶聚合酶扩增在扩增室14.1或14.2中发生——通常在将裂解室12的内容物填充到扩增室14.1和14.2中后10至15分钟之间——扩增室14.1和14.2——或者仅是内容物——可以进入发光、优选荧光检测装置16。

在图示的优选实施方式中，整个组件34被插入发光、优选荧光检测装置16的容器24中。为了处理组件34，在活塞18的近端提供把手38。

一旦组件34完全插入容器24中，为了防止例如杂散光等外部光进入容器，提供了形成容器24的盖子的轴环40。

发光、优选荧光检测装置16，优选包括两个检测室42.1和14.2，其被配置为容纳扩增室14.1和14.2。在检测室42.1和42.2内或邻近于检测室42.1和42.2布置光源44.1和44.2以及光学传感器46.1和46.2，例如，用于每个检测室42.1和42.2的一个或多个光源和一个光学传感器。每个光源44.1和44.2被配置为分别用可以在待测样品经历重组酶聚合酶扩增期间和之后引起发光的光照亮检测室42.1或42.2的内容物。每个光学传感器46.1和46.2被布置和配置为在发生发光的情况下检测相应检测室42中的发光体。

光源44.1和44.2以及光学传感器46.1和46.2优选地被配置为分别发射和感测具有用于引起发光的带宽和至少一个另外的带宽的光。

检测室42.1和42.2由至少一个不透明壁70隔开，该不透明壁70防止来自一个检测室42.1或42.2的光进入相应的另一检测室42.2或42.1。

为了给光源44.1和44.2以及光学传感器46.1和46.2供电，提供能量供应48。能量供应48可以包括电池，优选地是可充电电池。作为另一种选择或附加地，能量供应48可以包括用于将发光(优选荧光检测装置16)连接到外部电源的电源接口。电源接口可以是有线或无线的。能量供应48还可以包括用于提供光伏电源的太阳能电池。

光源44.1和44.2以及光学传感器46.1和46.2还连接到控制器50，控制器50配置为控制光源44.1和44.2以及光学传感器46.1和46.2的操作并进一步读出由光学传感器46.1和46.2提供的传感器输出信号。控制器50可以是微控制器或状态机。

控制器50可操作地连接到无线数据接口52，无线数据接口52被配置为允许微控制器50与诸如移动电话等外部设备或用于数据通信和数据处理的其他设备之间的数据通信。

优选地，无线数据接口52可操作地连接到控制器50、能量供应48和数据存储器54并且被配置为提供能量收集数据存储和数据通信。具体而言，无线接口52实现近场通信(NFC)，并包括用于与控制器50通信的数据总线，如I2C数据总线56。无线数据接口52优选被配置为允许双向数据通信，以便将由发光、优选由荧光检测装置16产生的数据传输到外部装置，并从外部装置接收控制命令和/或软件更新，使得可以通过外部装置控制和更新发光、优选荧光检测装置16。

无线数据接口52还可以实现WIFI通信作为近场通信的替代。另一种选择是蓝牙通信。

优选地，实现无线数据接口52、控制器50和数据存储器54的所有电子元件都布置在平面印刷电路板60上。平面印刷电路板60可以是层压卡的一部分，其中电子元件布置在两个层压盖板62之间。一个或两个盖板60表面上的电触点64允许电子元件和诸如光源44或光学传感器46等其他元件之间的通信和能量传递。作为另一种选择，在其他实施方式中，印刷电路板可以是柔性的、半柔性的或刚性-柔性板。印刷电路板可以是常规电路板或通过印刷或其他加法方法制造的电路板，或它们的组合。

除了电子元件之外，可层压在两个盖板62之间的印刷电路板60还包括至少一个用于无线数据通信的天线66。

可选地，可以提供加热装置。加热装置可以包括集成到发光、优选荧光检测装置16中并且可以加热组件34及其内含物从而启动和/或促进扩增过程的电加热装置。优选地，发光、优选荧光检测装置16被配置为在组件34被插入容器24时自动开始电加热。组件34的插入可以通过专用传感器检测，例如开关，或者通过光学传感器46。特别是，光学传感器46可以感测到组件被插入到容器24中，因为一旦组件被插入到容器24中，轴环40就防止外部光进入检测室42。因此，将组件34插入到容器24中导致由光学传感器46感测到的光强度下降。这种光强度下降可以被检测到并且可以产生用于电加热的启动信号。

作为另一种选择或附加地，加热装置可以由扩增室14.1和14.2中的化学物质提供，一旦样品被填充到扩增室14.1和14.2中，这些化学物质就会经历放热反应。裂解室12包含第一组分并且扩增室14.1和14.2包含第二组分也是可能的，其中这两种组分可以发生放热反应。当裂解室12的内容物被转移到扩增室14.1和14.2中时，放热反应开始。

作为另一种选择或附加地，加热装置可以由一旦样品被引入到容器中就经历放热反应的化学物质提供。这些化学品被布置在扩增室14.1和14.2附近，处于包含加热化学品的单独密封布置中。一旦触发，就会开始放热化学反应。这在系统用作例如便携式诊断工具时可能是合适的。

允许加热发光、优选荧光检测装置的另一种替代方案是在荧光检测装置的外部呈现深色，例如黑色。因此，例如，荧光检测装置连同扩增室可以被太阳能加热。优选地，提供指示荧光检测装置连同扩增室的潜在过热的温度控制装置。温度控制装置可以包括在超过预定温度的情况下改变其颜色的墨水或涂料。因此，在一定温度下改变其颜色并且施加到荧光检测装置外部的指示剂可以是温度控制装置。

检测室42.1和42.2布置在外尺寸小于10cm×10cm×4cm的检测室外壳72中。优选地，整个发光体、优选荧光检测装置16的体积小于200cm²，甚至更优选小于100cm²。在优选的实施方式中，最长的外部尺寸是最短的外部尺寸的至少两倍长。

荧光检测装置16'可以提供第二容器68，其中裂解室12可以在与扩增室14连接之前放置；参见图5。第二容器68也可以在使用前容纳扩增室14和裂解室12。

根据该系统的另一实施方式，测试装置16”'具有如图6和7所示的外形。容器24'容纳在测试装置16”(也容纳检测室42')的顶侧的截锥形突起72中，因此是检测室外壳72。

测试装置16”具有两部分式壳体74，具有顶部74.1和底部74.2，其通过四个螺钉76拧在一起；参见图9和10。

壳体74内设有可充电电池78、主印刷电路板(主PCB)80、辅助PCB82、NFC(近场通信)天线84和检测室外壳86。参见图8至10。

主PCB 80和辅助PCB 82通过软排线88电连接；参见图12。主PCB 80带有用于为电池78充电的USB-C端口90。USB-C端口可从测试装置16'的正面访问；参见图8。电池78是测试装置16”的能量供应48的一部分；参见图8至10。

辅助PCB 82带有两个照明光源，特别是作为检测室42'的光源44的发光二极管(LED)92。辅助PCB 82还具有布置在LED 92中央的光学传感器46。插入测试装置16”时，检测室包封体(enclosure)86覆盖LED 92和光学传感器46并且提供光路94和96到用于测试室14的容器24'(扩增室14)。

截锥形突起72匹配包括裂解室12'和测试室14'的流体密封组件34'的形状。截锥形状防止杂散光进入容器24'。同样，检测室包封体86进一步防止杂散光进入容器24'。

如图11至13所示，检测室42可以容纳比色皿或流体密封组件34'。比色皿(未显示)或流体密封组件34'的测试室14'具有封闭测试室的透明壁。在测试室中，比色杯中包含用于重组酶聚合酶扩增的酶混合物，其包括重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换聚合酶、核酸外切酶iii，如果要检测RNA，则是逆转录酶。通过这种酶混合物，可以通过重组酶聚合酶扩增(RPA)的方式在样品中扩增靶分析物，特别是诸如DNA或RNA等核酸。为了检测样品中靶核酸的存在，可以使用荧光检测技术。特定波长的光源照射靶核酸后，核酸的DNA结合染料或荧光结合探针发生反应，发出荧光信号。荧光信号指示靶核酸的存在。

光源92布置成照亮比色皿的测试室中的探针。包围检测室42的壁86是不透明的。光源92发出的照明光可以通过光通道94和96，通过比色皿的透明壁照亮比色皿的测试室中的样品。比色皿的测试室中的样品发射或散射的任何光都可以被光传感器46记录。光通道20防止光源92发射的光直接撞击光传感器46。优选地，每个光源92发射不同带宽的光，例如分别是蓝光和绿光。

光传感器46是能够同时记录不同光带(波长范围)中的光的多通道光传感器。例如，光传感器16能够同时记录四个、六个或八个光带。光传感器46连接到控制器50。控制器50布置在PCB 80上并且被配置为随时间记录和存储由光传感器46提供的输出信号。因此，控制器50可以为每个通道生成代表由光传感器46随时间记录的光强度的数据。例如，可以记录六个不同的曲线，代表六个不同光带(即六个不同波长范围)中的光强度。

如图11至13所示，检测装置16”'被配置为匹配流体密封组件34'。流体密封组件34'包括裂解室12'和测试室14'。

裂解室12'和测试室14'保持在外壳104中，外壳104由两部分组成，下部外壳部分104.1和上部外壳部分104.2。下部外壳部分104.1具有向外壳104底部加宽的扩口侧壁106。扩口侧壁106被配置为配合检测装置16”'的截锥形突起72(参见图7至10)。

外壳104的顶部由盖子105封闭，该盖子105可以旋转到打开位置(参见图11b)以选择性地打开中心开口102以将拭子插入裂解容器12'的裂解室13'中。

在外壳104的上部，裂解容器12'通过可释放的卡扣配合连接固定，通过围绕裂解容器外壁上部的向外延伸的圆周轴环108和外壳104上部的内壁上的两个向内延伸的圆周裂口110实现卡扣配合连接。裂解容器12'的向外延伸的圆周轴环108保持在外壳104内壁上两个向内延伸的周向裂口110之间的凹槽中。裂解室12'和外壳104之间的卡扣配合连接可以通过在轴向方向上作用在裂解室12'上的力释放，该力超过由卡扣配合连接的设计所提供的预定阈值，尤其是通过匹配的形状以及材料和形状的弹性特性。

在裂解容器12'的底部112中布置有空心针114。针114优选地由不锈钢制成。

包括裂解容器底部112的裂解容器12'的下部被布置成延伸到裂解容器容器116中，裂解容器容器116由从测试容器14*的上部向上延伸的测试容器延伸部118形成。裂解容器12'下部的外径对应于裂解容器116的内径。

外壳104相对于封闭测试室15'的测试容器14'的旋转引起测试容器14'的相对轴向运动。这是通过至少一个螺旋槽120实现的，该螺旋槽120在外壳104的壁的内侧形成。在所示实施方式中，提供了三个螺旋槽120。测试容器延伸部118上的径向突出部122径向延伸到凹槽120中。因此，凹槽120用作测试容器延伸部118上的径向突出部122的螺旋槽连杆导向。当外壳104旋转而测试容器14'不旋转时，螺旋槽120导致测试容器14'的轴向移动。

为了在外壳104旋转时防止测试容器14'旋转，提供了从测试容器14'的壁沿径向方向延伸的短纵向裂口124。当流体密封组件34'的测试容器14'插入检测装置16”的容器22'时，裂口124与检测装置16”的容器22'的凹口98接合。容器24'的圆周内边缘100处的凹口98被配置为与测试室14'上的侧向突起相互作用，当用手旋转流体密封组件34'的外扩口侧壁106以便将测试室14'移向裂解室12'时，防止测试室14'旋转。

外壳104相对于测试容器14'的旋转引起测试容器14'朝向裂解容器12'的轴向移动。这又导致针头114刺穿测试容器14'的弹性体隔膜28'(即盖子)。一旦裂解容器12'底部112处的针头114刺穿最初关闭测试容器14'中的第二室的弹性体隔膜28'(用作测试容器的盖子的分隔壁，可以被针刺穿)，流体可以从裂解容器12'转移到测试容器14'中。

测试容器14'朝向裂解容器12'的轴向运动进一步引起裂解容器12'的压缩并且因此将流体从裂解室13'转移到测试室15'中。外壳104的进一步旋转导致裂解容器12'的进一步压缩，直至裂解容器12'上的轴向力导致裂解容器12'的压缩超过使裂解容器12'从被外壳104内壁上两个向内延伸的圆周裂口110之间的凹槽中的裂解容器12'的向外延伸的圆周轴环108的保持中释放所需的力。一旦释放，裂解容器12'可以自由向上移动(即，在朝向外壳104顶部的中心开口102的方向)并且裂解容器12'不被进一步压缩。因此，停止将流体从裂解室13'进一步转移到测试室15'中。裂解容器12'的压缩因此受到将裂解容器12'的向外延伸的圆周轴环108推出外壳104内壁上的两个向内延伸的圆周裂口110之间的凹槽所需的力的限制。

为了结合检测装置16”使用流体密封组件34'，首先将带有待测样品的交换物经由中心开口102插入裂解室13'。接下来，盖子105被关闭并且裂解可以在裂解室13'中发生。一旦发生裂解，流体密封组件34'可以通过将测试容器14'插入检测装置16”的容器22'而与检测装置16”接合。这通过外壳104下部的扩口侧壁106来促进。

为了进一步促进流体密封组件34'与检测装置16”在允许测试容器14'的短纵向裂口124与检测装置16”的容器22'的凹口98接合的正确方向上接合，壳体104的外表面设有可感知的凸条palpable(raised rip)126。该可感知的凸条126沿壳体104的纵向延伸。

在检测装置16”的截锥形突出物72旁边的检测装置16”上的可感知的突出物128是进一步的可感知的特征，其有助于正确地定向可感知的凸条126并因此正确地定向流体密封组件34'。

一旦与检测装置16”接合，流体密封组件34'的外壳104可以旋转以引起测试容器14'相对于裂解容器12'和外壳104的相对轴向运动。通过在将流体密封组件34'与测试装置16”接合后立即使测试容器14'已经完全插入到容器22'中，因此对于检测装置16”的检测室42'，外壳104与检测装置16”轴向间隔开。通过相对于检测装置16”并因此相对于测试容器14'旋转外壳104，外壳104和检测装置16”之间的轴向距离被最小化，直到外壳104接触检测装置16”并且针114已经刺穿测试容器14'的隔膜28'。从外面看，在顺时针旋转外壳104的同时，外壳104向下移动从而接近检测装置16”。

一旦外壳104旋转到其最终位置，检测装置16”的截锥形突起72与外壳104的扩口侧壁106相结合的进一步效果是防止杂散光进入检测装置16”的检测室42'的改进保护。

荧光检测装置16”的检测室42'被配置为接收测试容器14'。容器22'是检测室42'的一部分。

提供承载照明发光二极管(LED)92和光学传感器46的主印刷电路板(主PCB)80和单独的辅助PCB 82具有的优点是由于主PCB 80和辅助PCB 82通过柔性扁平电缆88连接，当测试容器14°插入检测室42时作用在检测室外壳86上的力不能传递到主PCB 80。

在本发明的又一方面，提供了用于执行如本文所公开的方法的试剂盒，优选在如本文所公开的系统上，其中该试剂盒包括(i)至少一种重组酶，至少一种单链结合蛋白，至少一种DNA聚合酶，和可选地：至少一种逆转录酶和/或至少一种能量再生酶，以及合适的反应组分，其中(ii)至少两种靶序列特异性引物；(iii)合适的反应组分，其包括至少一种酶的至少一种辅助因子，dNTP或dNTP和ddNTP的混合物，至少一种缓冲系统，至少一种还原剂，和三磷酸腺苷；(iv)至少一套无菌套件，其用于提取待分析的生物探针，并包含至少一种配置为应用于本文公开的系统的组件，优选应用于系统的裂解室(12)；(v)可选地：至少一种探针和可选地至少一种激活探针的酶；(vi)可选地：至少一种抑制剂，其阻断至少一种重组酶和/或可选地：至少一种重组酶辅助因子的活性；(vii)可选地：其中所述试剂盒还包含第二部分，所述第二部分包含(i)至(v)，其中所述第二部分包含用作阳性对照的预定第二靶序列和至少一个，优选至少两个第二靶序列的特异性引物，优选第二探针。可选地，所述试剂盒还可以包括使用说明书。

在又一方面，提供了一组试剂盒，其中这些试剂盒的总和构成了易于定制的诊断组。每个单独的扩增室所需的所有成分都可以作为该组套件中的单独试剂盒提供。单独的部分可以作为颗粒提供，即，例如，冻干的，和/或作为部分液体的部分。在某些实施方式中，液体可以单独提供，或作为单独的隔室提供，使得生化机制的激活仅在将样品提供给装置，特别是提供给至少一个裂解室之后才开始。

优选地，本发明的装置或试剂盒的所有组件都以无菌形式提供。

在实验室中，熟练的分子生物学家或训练有素的人员可以容易地进行本文公开的方法，设计用于待扩增的靶核酸的引物和/或探针，并且如果需要的话可以容易地改变合适的反应条件。当然，在非实验室环境中执行该方法是一个更大的挑战。特别是在后一种情况下，提供下述试剂盒可能是有利的，该试剂盒包含现成的无菌小瓶或试管中的所有必需成分，以便可以轻松地重新激活(生物)化学试剂和成分(例如，对于酶，冻干后)，并可以以方便的方式开始反应。

在提供本发明的系统以在便携式装置中执行本发明的诊断方法的实施方式中，试剂盒包含优化的引物以以高度特异性的方式检测试剂的遗传物质可能是非常合适的，通常是感染原作为靶序列。此外，提供包括手套在内的无菌组从而以优选的非侵入方式提取生物样品将是有用的。

如本文所用的感染原可包括所有类群的感染原，包括病毒。因此，感染原可以包括病毒、细菌，但也可以包括任何种类的真核生物，包括酵母、真菌、线虫等。术语感染原还可以包括感染原的元件，例如编码抗微生物抗性(AMR)成分的元件或质粒介导代表不断升级的威胁的抗生素抗性。在优选的实施方式中，试剂盒的无菌提取部分将被配置成使得样品取回装置将与本发明系统的至少一个腔室，优选裂解室兼容，使得包括待分析的生物样品的样品取回装置可以容易地应用于装置的相应腔室。

详细描述了本发明的方法，这些方法的设计方式比如SIBA或RPA等早期等温扩增方法需要更少的酶和化学试剂。该方法的这种简单性和降低的复杂性也具有优势，因为在样品上的相关生化反应能够以更稳定和更容易的方式进行的情况下，可以减少所需试剂盒的各个部分。

在另一方面，可以提供本发明方法的至少一种热稳定酶的用途，或至少一种编码其的核酸序列的用途，可选地与如上所定义的试剂盒组合使用，用于执行至少一个靶序列的核酸扩增的等温方法。如本文所公开的至少一种热稳定酶的使用在实验室及即时需求和/或甚至家庭环境条件下进行的各种等温核酸扩增测定中可能特别令人感兴趣。

现在将参照以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例

实施例1：为SARS-CoV-2建立RT-RPA

最初，建立了针对SARS-CoV-2的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、包膜蛋白(E)和核衣壳(N)基因的实时逆转录RPA(RT-RPA)以确定与实时RT-PCR相比的检测限，交叉反应性和临床表现(Abd El Wahed等，Suitcase lab for rapid detection of SARS-CoV-2based onrecombinase polymerase amplification assay，J.Clin.Virol.，审查中)。

对于测定验证，基于RdRP-、E-和N-基因(登录号：NC_045512，核苷酸：分别为14977-15975、26112-26479和28280-29536)的分子RNA标准由GenExpress(柏林，德国)合成。RdRP和E基因的寡核苷酸是根据我们之前针对SARS-CoV-1和MERS CoV的设计(未发表的数据)更新的，而N基因扩增子是根据之前发表的文章改进的(Behrmann，O.等Rapiddetection of SARS-CoV-2by low volume real-time single tube reversetranscription recombinase polymerase amplification using an exo probe with aninternally linked quencher(exo-IQ).Clin Chem，doi:10.1093/clinchem/hvaa116(2020))。(表1)。所有寡核苷酸均由TIB MOLBIOL GmbH(柏林，德国)合成。

表1.RT-RPA检测寡核苷酸：

/>

BHQ1-dt(bT)，四氢呋喃(X)，Fam-dT(fT)，硫代磷酸酯主链和PH:3′磷酸盐以阻断延伸。

实施例2：RT-RPA反应条件

对于RT-RPA，将TwistAmp外切试剂盒(TwistDx，Cambridge，UK)与冻干RevertAid逆转录酶(Life Technologies，Darmstadt，Germany)组合使用。对于每个反应，将29.5μl再水化缓冲液、2.5μl RevertAid逆转录酶(200U/μl)、9.7μl H₂O、2.1μl正向引物(10pmol/μl)、2.1μl反向引物(20pmol/μl)、0.6μl exo-探针(10pmol/μl)、2.5μl280mM乙酸镁和1μl模板添加到含有冻干沉淀的反应管的盖子中。将试管关闭、离心、混合、离心并立即放入T8(Axxin，Fairfield，Australia)等温荧光读数器中。反应在42℃温育15分钟。对于RdRP和ERT-RPA测定，在230秒后进行混合步骤，对于N RT-RPA测定，在320秒后进行混合步骤。所有程序均在移动手提箱实验室中执行(图14，Bodo Koennecke，Berlin，Germany)。在T8桌面软件(Axxin，Fairfield，Australia)中的一阶导数分析中，阈值时间(TT)计算为扩增曲线高于阴性对照阈值(水作为模板)的起点。

实施例3：RT-RPA分析灵敏度和特异性

在相应的RT-RPA测定中筛选分子标准品的连续稀释液(10⁶-10⁰个RNA分子/每个反应)。为了确定在95％的情况下检测到的RNA分子反应的最小数量，使用STATISTICA软件(StatSoft，Hamburg，Germany)对来自具有完整标准稀释范围的RPA反应的五个数据集进行概率回归分析，并且该图是由GraphPad PRISM 6.07版软件(GraphPad Software Inc.，SanDiego，California)创建。使用表2中列出的病毒的病毒基因组测试了RT-RPA测定的分析特异性。核酸提取物由CharitéMedical University(Berlin，Germany)、Robert KochInstitute(Berlin，Germany)、Landesgesundheitsamt Niedersachsen(Hannover，Germany)、Quality Control for Molecular Diagnostics(Glasgow，Scotland)和Friedrich-Loeffler-Institute(Greifswald-Insel Riems，Germany)提供。

通过实时RT-PCR(基于E的检测作为筛选检测，RdRP作为确认检测)，使用Leipzig大学医院诊断出的疑似COVID19病例的剩余RNA提取物对这三种RT-RPA检测进行了验证。总共测试了18个阳性样品和18个阴性样品(盲法)。相对于作为参考测试的实时RT-PCR，使用标准公式计算RT-RPA检测的诊断灵敏度和特异性、阳性预测值和阴性预测值(Altman，D.G.&Bland，J.M.：诊断测试2：预测值。BMJ 309，102，doi:10.1136/bmj.309.6947.102(1994))。

然后使用结合商业SARS-CoV-2-E寡核苷酸(TIB MOLBIOL GmbH，Berlin，Germany)和Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR试剂盒(Life Technologies，Darmstadt，Germany)的实时PCR测定法在Agilent Technologies Stratagene Mx3000pReal-Time PCR系统上使用以下温度曲线测试从患者材料中提取的RNA：50℃持续15分钟，95℃持续2分钟，然后40个95℃持续15秒和60℃持续30秒的循环。

分析灵敏度和特异性

为了确定RdRP、E和N RT-RPA分析的分析灵敏度，每个分析都用10⁶-10⁰个RNA分子/相应分子RNA标准反应的连续稀释进行了五次重复测试。在三个RT-RPA测定的所有五个RPA运行中检测到浓度为10⁶至10²个分子/反应的分子RNA标准品。E和N RT-RPA在3/5RT-RPA运行中鉴定100个RNA分子，而在RdRP-RT-RPA中，所有5次运行均为阳性。只有RdRP RT-RPA在2/5RT-RPA运行中扩增了一个RNA拷贝。使用该数据集，进行概率单位回归分析，揭示了RdRPRT-RPA测定的2个RNA分子及E和N RT-RPA测定的15个RNA分子的95％检测限(图15)。

因此，RdRP-和E-RT-RPA分析能够扩增SARS-CoV-1和-2的基因组RNA，而N-RT-RPA分析仅识别SARS-CoV-2RNA。没有一种检测显示与表2中列出的其他呼吸道病毒的核酸提取物有交叉反应。

表2：通过三种SARS-CoV-2RT-RPA检测分析病毒基因组的交叉反应性。

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实施例4：对临床样品的进一步测试

所有提取的RNA样品都储存在-80℃，首先通过三种RT-RPA检测进行测试，然后通过实时RT-PCR重新测试以确认之前的结果。靶向RdRP基因的RT-RPA测定产生了最好的临床性能(图16)。所有RT-RPA测定在最长12分钟内检测到CT>30的样品(此处未显示数据，参见Abd El Wahed等，同上)。为了确定高度敏感和特异的SARS-CoV-2RPA检测，评估了三种靶向SARS-CoV-2基因组的RdRP、E和N基因的RT-RPA检测。RdRP RT-RPA检测在不到15分钟的时间内产生了类似于实时RT-PCR的灵敏度和特异性。RT-RPA检测的速度和临床准确性使其成为理想的即时需求候选分子检测。

因此可以证明，等温核酸扩增方法可以在SARS-CoV-2感染的诊断中提供高度可靠的结果，其中实时RT-PCR目前是分子实验室筛查疑似COVID-19患者样品的首选方法。一般来说，发达国家的国家和商业诊断实验室拥有实时RT-PCR的所有基础设施。在新兴国家，通常只有参考实验室才具备足够的装备来执行具有高可靠性的实时RT-PCR分析，因此迫切需要替代测试形式。

尽管经典的RPA检测可能非常适合在实验室环境中由受过训练的人员进行SARS-CoV-2的诊断，但我们进一步尝试优化该方法，使当任何感兴趣的个体进行时，它将适用于非实验室环境中的高通量可靠测试，同时仍然保证结果快速可靠。

实施例5：SARS-CoV-2特异性优化

首先，在开发SARS-CoV-2的特异性RPA检测过程中必须引入某些改进。经过几轮测试，首先使用双倍浓度的反向引物实现了最佳检测灵敏度。冠状病毒具有正义单链RNA基因组，更多的反向引物会产生更多的cDNA，以用于后续的扩增步骤。其次，在寡核苷酸设计过程中，任何与人类基因组配对的序列都被严格排除，以避免出现一些实时RT-PCR检测所报告的问题。第三，为避免引物二聚体和非特异性扩增，在选定的RPA引物中引入了硫代磷酸酯核苷酸。

除了扩增和检测外，病毒灭活和提取通常是SARS-CoV-2诊断的关键步骤，为了确保医护人员或实验室技术人员的安全，通常建议在BSL-2柜中和现场条件下在移动手套箱中进行样品灭活。为提取冠状病毒开发了几种快速简单的提取程序(Fomsgaard&Rosenstierne，2020年3月.Euro Surveill 25，doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.14.2000398)。

尽管如此，对于在家庭环境中进行的测试，我们推测确保病毒灭活并不那么重要。更重要的是要保证一种简单的方法来提取可能包含可检测病毒遗传物质的样品，并具有更高的稳定性和简单性，更重要的是：更快地获得检测结果。因此，测试了新的选项以设计一种超越RPASARS-CoV-2测试的新的等温核酸扩增方法，因此被证明非常适合RNA病毒检测。

实施例6：用于等温核酸扩增测定的热稳定生物催化剂的分析和测试

为了建立足够稳健的等温反应，让外行人可以在早期开发的特定手持诊断设备中进行，据推测可以选择一组完全不同的酶来进行等温扩增反应。这些想法背后的驱动因素是目前可用的SARS-CoV-2诊断测试仍然很耗时。因此，增加测试到结果的时间对于减少隔离时间和病毒传播的风险至关重要。

因此，进行了几轮计算机搜索以鉴定具有允许进行可靠且快速的等温扩增反应的酶促功能的热稳定酶。酶的热稳定性在实践中有两个主要优势：在进行测试之前酶不会轻易降解，并且反应时间可以增加，因为酶在高于标准体温(约37℃)的温度下具有最佳活性，大多数酶在本质上都针对其进行了优化，因此可以更快地扩增靶DNA或RNA序列，进而得出诊断结果。

搜索热稳定噬菌体酶相当麻烦，因为相关基因组目前的注释很差。最终，确定一整套酶，其具有适用于等温扩增反应的功能，并且最适温度在37℃以上，某些酶的最适温度甚至在37℃以上至约55℃，甚至更高，(即：手持诊断装置的最佳温度)。

这些酶主要来源于已知热稳定的细菌和/或古细菌。此外，在对于RNA靶标需要逆转录酶，市场上有几种市售的热稳定酶，并且还鉴定了一种新的病毒衍生逆转录酶。

新鉴定的酶总结在下表3中：

发现地热异常球菌酶和上表4中详述的其他酶在40℃和60℃之间或甚至更高温度下具有最佳活性，这清楚地表明这些酶是热稳定的。

此外，酶的重组生产和纯化具有一定的优势(此处未显示细节)。对于最终测定，这意味着这些酶可以以足够的量和足够的纯度在无亲和标签的情况下产生，而无需切割亲和标签或使用亲和标签。

最后，考虑到酶的功能并受其热稳定性的帮助，这些酶甚至适合在“经典”RPA反应的42℃标准以上进行等温扩增反应，因此，经过完美配置，可以在最近开发的手持式诊断装置上表现更好。在第一个实验中，阳性结果可以通过已经低于10分钟的同源荧光通道检测到。这与同时进行可靠的阳性对照标准进一步提高安全性和可靠性的事实相结合，为新一代SARS-CoV-2和其他传染病的诊断铺平了道路。

最初，可以证明——已经在扩增分析之前，并且对于非实验室使用和与运输、储存等相关的困难很重要——热稳定生物催化剂的稳定性增加允许在4℃冻干之前进行短期储存。因此，避免了添加对冻干过程产生负面干扰的补充剂(例如甘油)。此外，这保证了在将包含生化成分的装置交付给非实验室实践熟练从业者时通过药房和其他零售贸易渠道进行可靠的营销。

现在转向所述方法，我们观察到与如RPA等经典等温反应相比具有显著优势，因为热稳定酶的性质允许不太严格的温度控制，但同时允许减少反应时间，同时显示出与SARS-CoV-2的RPA检测相当的灵敏度和灵敏度，如下所述。当然，在提供用于执行诊断性等温核酸扩增反应的试剂盒时，这些因素非常重要，在这种情况下，快速测试结果——在实验室和家庭环境中——是最重要的。

进一步的工作正在进行中，另外，使用热稳定酶优化新测定法也适用于实验室环境，独立于手持装置，因为这种测定法在某些方面比标准等温核酸扩增技术表现更好(并且更便宜)。

预期使用热稳定酶的酶混合物将提供更高稳定性的反应混合物，以适应长期冷链独立储存，并在约30至约40℃范围内的环境温度下使用。

实施例7：模拟扩增子的设计

为了构建用于测试目的的模拟扩增子，以在使用新型热稳定酶的同时在特定的便携式诊断装置上建立新的反应，将上述SARS CoV 2-RdRP检测的探针序列打乱两次，直到它在BLAST算法测试时不再产生命中。SARS CoV 2-RdRP的侧翼引物(分别为SEQ ID NO:18(正向)和19(反向))位于探针序列(SEQ ID NO:20)的上游和下游，探针序列的每一侧散布着5nt间隔子。

上述模拟扩增子已被用作有价值的内部阳性对照，以使用Twist RPA检测和具有优化酶和反应条件的新实验来测试扩增反应的效率，结果证明具有高度特异性和可靠性。此外，模拟扩增子提供有价值的抑制对照，这意味着扩增子作为从一开始就添加的过程或扩增对照，以检查整体扩增参数和性能是否良好。特别是对于诊断应用，作为刚才描述的模拟扩增子的对照显然是最重要的。

实施例8：使用不对称引物浓度进行扩增

为了比较使用对称引物浓度的RPA反应(即正向和反向引物以等摩尔浓度提供)与使用不对称引物浓度的RPA反应(即两种引物之一的浓度高于另一个引物)，使用SARS-CoV-2RdRP RNA作为模板进行RT-RPA反应。每个RPA提供1至10⁶个拷贝的模板RNA，并与补液缓冲液(例如TwistDx)、乙酸镁(例如TwistDx)、正向和反向引物、检测探针和逆转录酶(Thermofisher或BioTechRabbit)混合。在标准等温扩增平台上使用15分钟标准RT-RPA程序进行温育。使用对称引物浓度(420nM:420nM)的RPA反应相比于使用不对称引物浓度(420nM:840nM)的RPA反应的结果分别如图17和18所示。

两种方法的比较清楚地表明，通过使用不对称引物浓度可显著提高性能。图19显示不对称引物浓度的阈值时间相当低，特别是对于较低量的靶RNA。因此，它表明RPA反应检测靶核酸所需的温育时间(特别是如果靶核酸的量和/或浓度低)，可以通过使用不对称引物浓度而显著减少。

实施例9：Gp32的热稳定变体

来自噬菌体RB69的Gp32蛋白似乎是一种单链DNA结合蛋白，在RPA和RPA相关等温扩增反应中具有特别高的效率。因此，开始分析以鉴定Gp32蛋白变体，这些变体既热稳定又与用作功能和结构种子参考序列的RB69 Gp32具有高度结构和/或功能相似性，与例如T4GP32相比，优选与RB69 Gp32具有增加的结构相似性。由于此类分析的重点之一是鉴定热稳定变体，因此分析扩展到来自热稳定细菌和噬菌体的蛋白质。由于已知热稳定的噬菌体数量有限，已知宿主热稳定的噬菌体也包括在这些分析中。除了热稳定细菌，主要的焦点是芽孢杆菌噬菌体和聚球藻噬菌体。

几种具有潜在热稳定性的单链DNA结合蛋白被确定为可能的候选者。蛋白质候选物的示例性集合如图20中的系统树所示。注意图20表示使用UniProt数据库标识符的不同蛋白质，其中A0A0C4K635对应于SEQ ID NO:21，A0A2I5ARD7对应于SEQ ID NO:22，F4YCU4对应于SEQ ID NO:23，Q38504对应于SEQ ID NO:24，Q9MCD0对应于SEQ ID NO:25，Q9MCD1对应于SEQ ID NO:26，P06953对应于SEQ ID NO:27，Q37885对应于SEQ ID NO:28，A0A6M3ZIA8对应于SEQ ID NO:29，Q1J216对应于SEQ ID NO:30，T4噬菌体的P03695对应于SEQ ID NO:31，埃希氏杆菌噬菌体RB69 Gp32的Q7Y265对应于SEQ ID NO:32并用作参考序列，Q1J1N6对应于SEQ ID NO:4。由于长度可变性高，并且通常单链DNA结合蛋白的氨基酸序列存在高度异质性，因此必须基于结构和功能模型评估与RB69 Gp32的相似性。

此类结构分析将作为3D结构模拟的计算机模拟(包括AI辅助方法)以及结构和功能比较和评估进行。作为下一步，可以将编码这种计算机分析的有希望的候选物的DNA序列克隆到载体中。这些将用于纯化候选单链DNA结合蛋白，然后对其进行功能测试和优化。测试和优化将包括候选蛋白质及其可能的变化，以及其他可变条件(如温度、盐和pH)，以在等温扩增反应中实现最佳性能。

SEQUENCE LISTING

<110> midge medical GmbH

<120> Isothermal nucleic acid amplification methods for point-of-need

diagnosis of emerging infectious diseases

<130> MB 1559-02WO

<150> EP20201885.9

<151> 2020-10-14

<150> EP20204790.8

<151> 2020-10-29

<150> EP20206553.8

<151> 2020-11-09

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 358

<212> PRT

<213> Deinococcus geothermalis

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<212> PRT

<213> Deinococcus geothermalis

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<212> PRT

<213> Geobacillus stearothermophilus

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50 55 60

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Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Val Glu Pro Asn Leu Gln

610 615 620

Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe

625 630 635 640

Val Pro Ser Glu Pro Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln

645 650 655

Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Ile

660 665 670

Glu Ala Phe Arg Arg Gly Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp

675 680 685

Ile Phe His Val Ser Glu Glu Asp Val Thr Ala Asn Met Arg Arg Gln

690 695 700

Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly

705 710 715 720

Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile

725 730 735

Glu Arg Tyr Phe Ala Ser Phe Pro Gly Val Lys Gln Tyr Met Asp Asn

740 745 750

Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu His

755 760 765

Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val Arg

770 775 780

Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala

785 790 795 800

Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Ser Val Arg Leu Arg

805 810 815

Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu

820 825 830

Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Ile Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val

835 840 845

Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Ala Leu Arg Val Pro Leu Lys Val

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Asp Tyr His Tyr Gly Pro Thr Trp Tyr Asp Ala Lys

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<210> 6

<211> 560

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<400> 6

Pro Ile Ser Pro Ile Ala Pro Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met

1 5 10 15

Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu Lys Ile Glu

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Ala Leu Thr Ala Ile Cys Gln Glu Met Glu Gln Glu Gly Lys Ile Ser

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65 70 75 80

Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His

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Pro Gly Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly

100 105 110

Asp Ala Tyr Phe Ser Cys Pro Leu Asp Pro Asp Phe Arg Lys Tyr Thr

115 120 125

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Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp Pro Phe Arg Lys Asp Asn Pro

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Gly Ile Arg Ile Arg Glu Leu Cys Lys Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ser

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Asn Glu Lys Ile Asp Lys Leu Val Ser Lys Asp Ile Arg Arg Val Leu

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<210> 7

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<212> PRT

<213> Deinococcus geothermalis

<400> 7

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1 5 10 15

Ala Glu Pro Ser Ile Ser Pro Ala Pro Glu Val Ala Ala Pro Ala Thr

20 25 30

Gln Gly Thr Arg Arg Lys Lys Ala Ala Arg Thr Ala Ala Leu Pro Ala

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Glu Ala Gln Asp Pro Arg Asn Pro Pro Leu Glu Arg Leu Lys Tyr Ala

85 90 95

Ala Ile Cys Gly Ser Asn Leu Asp Glu Phe Phe Met Val Arg Val Ala

100 105 110

Gly Ile His Arg Gln Ile Ala Ala Gly Val Asn Thr Pro Gly Pro Asp

115 120 125

Gly Leu Leu Pro Arg Glu Thr Leu Ala Leu Val Arg Glu Arg Thr His

130 135 140

Ile Met Leu Arg Gln Ile Glu Lys Ala Ala Arg Arg Asn Leu Lys Asp

145 150 155 160

Leu Val Ala Gln Gly Val Arg Leu Val Arg Val Ala Asp Leu Gly Lys

165 170 175

Arg Ala Arg Ala Ala Leu Arg Glu His Tyr Leu Ser Glu Ile Gln Pro

180 185 190

Val Leu Thr Pro Leu Val Val Asp Pro Ser His Pro Phe Pro Tyr Leu

195 200 205

Ser Asn Leu Ser Leu Asn Leu Ala Val Leu Leu Asp Gly Gly Glu Gly

210 215 220

Glu Asp Pro Glu Phe Ala Arg Val Lys Val Pro Val Gly Val Leu Pro

225 230 235 240

Arg Val Val Lys Val Gly Asp His Leu Leu Leu Leu Glu Asp Val Ile

245 250 255

Ala Ala His Leu Asp Asp Leu Phe Lys Gly Arg Arg Val Leu Ala Ala

260 265 270

His Thr Phe Arg Val Thr Arg Asn Thr Asp Tyr Glu Phe Glu Glu Glu

275 280 285

Glu Ala Glu Asp Leu Leu Ala Thr Ile Glu Asp Gly Leu Arg Arg Arg

290 295 300

Arg Phe Gly Ser Ala Val Arg Leu Glu Val Val Gln Asp Thr Pro Pro

305 310 315 320

Arg Ile Ile Thr Phe Leu Gln Glu Arg Leu Arg Leu Ala Ala Glu Asp

325 330 335

Val Phe Leu Leu Glu Gly Pro Leu Gly Thr Ala Asp Leu Met Ala Leu

340 345 350

Pro Val Asp Arg Pro Asp Leu Ser Phe Pro Pro Tyr Val Pro Ala Val

355 360 365

Pro Asp Leu Asp Gly Asp Glu Glu Asn Gly Ile Phe Asp Thr Leu Arg

370 375 380

Gln Gly Asp Val Leu Leu His His Pro Tyr Asp Gly Phe Thr Asn Val

385 390 395 400

Leu Asn Phe Leu Glu Glu Ala Ala Arg Asp Pro Gln Val Leu Ala Ile

405 410 415

Lys Gln Thr Leu Tyr Arg Thr Gly Asp Asp Pro Arg Leu Leu Ser Ala

420 425 430

Leu Arg Thr Ala Ala Glu Asn Gly Lys Gln Val Val Ala Leu Ile Glu

435 440 445

Leu Lys Ala Arg Phe Asp Glu Gln Arg Asn Ile Ser Trp Ala Arg Lys

450 455 460

Leu Glu Arg Ala Gly Ala His Val Val Tyr Gly Met Ala Gly Leu Lys

465 470 475 480

Thr His Ala Lys Val Thr Leu Val Val Arg Arg Glu Glu Gly Gly Leu

485 490 495

Arg Arg Tyr Val His Ile Gly Thr Gly Asn Tyr Asn Pro Lys Thr Ala

500 505 510

Arg Leu Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Leu Ser Ala Asp Pro Asp Leu Gly

515 520 525

Ala Asp Val Ser Glu Leu Phe Asn His Leu Thr Gly Tyr Ala Glu Ala

530 535 540

Thr Tyr Thr Arg Leu Leu Val Ala Pro Asp Thr Ala Arg Ala Asp Leu

545 550 555 560

Glu Ala Leu Leu Asp Arg Glu Ala Gln His Ala Arg Thr Gly Gln Glu

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Ala Trp Val Arg Val Lys Val Asn Gln Leu Thr Asp Pro Gly Met Ile

580 585 590

Glu Ala Leu Tyr Arg Ala Ser Gln Ala Gly Val Arg Val Glu Leu Ile

595 600 605

Ile Arg Gly Val Cys Cys Leu Arg Pro Gly Val Pro Asp Leu Ser Glu

610 615 620

Thr Val Arg Val Arg Ser Leu Leu Gly Arg Tyr Leu Glu His Ala Arg

625 630 635 640

Ile Tyr Ala Phe Ala Asn Ala Gly Ser Pro Glu Val Tyr Phe Gly Ser

645 650 655

Ala Asp Trp Met Ser Arg Asn Leu Asp Arg Arg Val Glu Val Ile Ala

660 665 670

Pro Val Leu Asp Asp Arg His Arg Asp Glu Leu Leu Arg Leu Leu Ala

675 680 685

Thr Glu Trp Ala Asp Glu Arg Gly Ser Trp Glu Leu His Ala Asp Gly

690 695 700

Ile Tyr Gln Lys Leu Pro Gly Asp Phe Ser Ala Gln Gln Ala Phe Ala

705 710 715 720

Glu Ala Arg His Pro Gly

725

<210> 8

<211> 257

<212> PRT

<213> Archaeoglobus fulgidus

<400> 8

Met Leu Lys Ile Ala Thr Phe Asn Val Asn Ser Ile Arg Ser Arg Leu

1 5 10 15

His Ile Val Ile Pro Trp Leu Lys Glu Asn Lys Pro Asp Ile Leu Cys

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Met Gln Glu Thr Lys Val Glu Asn Arg Lys Phe Pro Glu Ala Asp Phe

35 40 45

His Arg Ile Gly Tyr His Val Val Phe Ser Gly Ser Lys Gly Arg Asn

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Gly Val Ala Ile Ala Ser Leu Glu Glu Pro Glu Asp Val Ser Phe Gly

65 70 75 80

Leu Asp Ser Glu Pro Lys Asp Glu Asp Arg Leu Ile Arg Ala Lys Ile

85 90 95

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Lys Leu Lys Asn His Val Cys Phe His Glu Asp Ala Arg Arg Ala Tyr

165 170 175

Lys Lys Ile Leu Glu Leu Gly Phe Val Asp Val Leu Arg Lys Ile His

180 185 190

Pro Asn Glu Arg Ile Tyr Thr Phe Tyr Asp Tyr Arg Val Lys Gly Ala

195 200 205

Ile Glu Arg Gly Leu Gly Trp Arg Val Asp Ala Ile Leu Ala Thr Pro

210 215 220

Pro Leu Ala Glu Arg Cys Val Asp Cys Tyr Ala Asp Ile Lys Pro Arg

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Leu Ala Glu Lys Pro Ser Asp His Leu Pro Leu Val Ala Val Phe Asp

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Val

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward Primer

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<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse Primer

<400> 10

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<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<220>

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<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward Primer

<400> 12

gaagagacag gtacgttaat agttaatagc gta 33

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse Primer

<400> 13

aaaaagaagg ttttacaaga ctcacgttaa ca 32

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<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Exo-Probe

<220>

<221> misc_feature

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward Primer

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<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Exo-Probe

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(33)

<223> n31= BHQ1-dt (bT), n32=Tetrahydrofuran (X), n33=Fam-dT (fT)

<400> 17

tagaatggct ggcaatggcg gtgatgctgc nnnttgcttt gctgctgctt 50

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<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward Primer

<400> 18

aacatgttgt gccaaccacc atagaatttg ct 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse Primer

<400> 19

gtgcgagctc tattctttgc actaatggca ta 32

<210> 20

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mimic Probe

<400> 20

aaattctcta ttgagcataa gaatattgct gcggttacat tcttgtttgc cg 52

<210> 21

<211> 269

<212> PRT

<213> Synechococcus phage S-EIVl

<400> 21

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Asn Gln Thr Leu Ser Val Asn Thr Gly Arg Asn Gln Ala Asp Leu Phe

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Asn Phe Tyr Ala Ile Asn Ser Ala Gln Asp Met Leu Asn Asn Ala Glu

145 150 155 160

Phe Leu Val Asn Phe Thr Arg Lys Gly Val Gly Leu Thr Ile Gln Gly

165 170 175

Lys Leu Val Thr Asp Ala Trp Thr Asp Arg Glu Thr Lys Glu Lys Lys

180 185 190

Thr Ala Thr Lys Ile Gln Leu Val Ser Leu Thr Leu Ala Pro Lys Ser

195 200 205

Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ile Gln Pro Gln Thr Thr Val Ala Ser Ser

210 215 220

Ser Glu Val Val Asn Leu Trp Gly Gly Lys Lys Ala Glu Asp Asp Ser

225 230 235 240

Asp Pro Gly Thr Lys Thr Ala Gly Gly Gly Leu Pro Asp Leu Pro Gly

245 250 255

Lys Tyr Gly Pro Ala Pro Asp Met Thr Asp Glu Pro Phe

260 265

<210> 22

<211> 147

<212> PRT

<213> Synechococcus phage S-LBS1

<400> 22

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Ile Gly Arg Met Ala Arg Asp Pro Glu Leu Arg Ser Phe Asp Ser Gly

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130 135 140

Val Pro Phe

145

<210> 23

<211> 114

<212> PRT

<213> Synechococcus phage S-CBS3

<400> 23

Met Leu Asn Ile Thr Ala Val Gly Asn Leu Ala Ala Asp Pro Arg Ser

1 5 10 15

Asn Thr Val Gly Gln Ala Asp Val Thr Asn Phe Thr Ile Leu Val Asn

20 25 30

Lys Lys Met Lys Asp Gln Glu Tyr Val Thr Ala Val Asp Cys Ala Val

35 40 45

Trp Gly Ala Arg Ala Ala Val Ala Ala Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Asp Gly Ser Thr Gly Cys Lys Ile Val Leu Arg Val Thr Asp Phe Thr

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Ala Phe

<210> 24

<211> 124

<212> PRT

<213> Bacillus phage phi29 (Bacteriophage phi-29)

<400> 24

Met Glu Asn Thr Asn Ile Val Lys Ala Thr Phe Asp Thr Glu Thr Leu

1 5 10 15

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20 25 30

Phe Lys Asn Leu Pro Asp Gly Thr Ile Ile Glu Ala Asn Ala Ile Ala

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Gln Tyr Lys Gln Val Ser Asp Thr Tyr Gly Asp Ala Lys Glu Glu Thr

50 55 60

Val Thr Thr Ile Phe Ala Ala Asp Gly Ser Leu Tyr Ser Ala Ile Ser

65 70 75 80

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85 90 95

His Lys Leu Glu Thr Phe Lys Val Lys Val Val Gln Gly Thr Ser Ser

100 105 110

Lys Gly Asn Val Phe Phe Ser Leu Gln Leu Ser Leu

115 120

<210> 25

<211> 170

<212> PRT

<213> Bacillus phage GA-1 (Bacteriophage GA-1)

<400> 25

Met Ser Asn Glu Leu Lys Gln Val Glu Gln Thr Glu Glu Ala Val Val

1 5 10 15

Val Ser Glu Thr Lys Asp Tyr Ile Lys Val Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr

20 25 30

Arg Arg Lys Ala Lys Tyr Gln Gln Leu Asn Ser Met Ser His Arg Glu

35 40 45

Leu Thr Asp Glu Glu Glu Ile Asn Ile Phe Asn Leu Leu Asn Gly Ala

50 55 60

Glu Gly Ser Ala Val Glu Met Lys Arg Ala Val Gly Ser Lys Val Thr

65 70 75 80

Ile Val Asp Phe Ile Thr Val Pro Tyr Thr Lys Ile Asp Glu Asp Thr

85 90 95

Gly Val Glu Glu Asn Gly Val Leu Thr Tyr Leu Ile Asn Glu Asn Gly

100 105 110

Glu Ala Ile Ala Thr Ser Ser Lys Ala Val Tyr Phe Thr Leu Asn Arg

115 120 125

Leu Leu Ile Gln Cys Gly Lys His Ala Asp Gly Thr Trp Lys Arg Pro

130 135 140

Ile Val Glu Ile Ile Ser Val Lys Gln Thr Asn Gly Asp Gly Met Asp

145 150 155 160

Leu Lys Leu Val Gly Phe Asp Lys Lys Lys

165 170

<210> 26

<211> 122

<212> PRT

<213> Bacillus phage Nf (Bacteriophage Nf)

<400> 26

Met Thr Asn Glu Ile Lys Ala Thr Phe Asp Val Thr Thr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Arg Met Lys Ile Leu Asn Ala Lys Asn Ala Gly Gly Ala Ser Leu Lys

20 25 30

Thr Cys Glu Asp Gly Ala Ile Ile Glu Ala Val Gly Ile Ala Gln Tyr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Val Ala Glu Ala Ala Ser Glu Ile Ile Asp Leu Val Lys Glu Phe Asn

85 90 95

Leu Asp Ser Phe Lys Val Lys Val Ser Lys Gln Lys Ser Ser Lys Gly

100 105 110

Asn Glu Phe Phe Ser Leu Leu Leu Val Gly

115 120

<210> 27

<211> 124

<212> PRT

<213> Bacillus phage PZA (Bacteriophage PZA)

<400> 27

Met Glu Asn Thr Asn Ile Val Lys Ala Thr Phe Asp Thr Glu Thr Leu

1 5 10 15

Glu Gly Gln Ile Lys Ile Phe Asn Ala Gln Thr Gly Gly Gly Gln Ser

20 25 30

Phe Lys Asn Leu Pro Asp Gly Thr Ile Ile Glu Ala Thr Ala Ile Ala

35 40 45

Gln Tyr Lys Gln Val Ser Asp Thr Tyr Gly Asp Ala Lys Glu Glu Thr

50 55 60

Val Thr Thr Ile Phe Ala Ala Asp Gly Ser Leu Tyr Ser Ala Ile Ser

65 70 75 80

Lys Thr Val Ala Glu Ala Ala Ser Asp Leu Ile Asp Leu Val Thr Arg

85 90 95

His Lys Leu Glu Thr Phe Lys Val Lys Val Val Gln Gly Thr Ser Ser

100 105 110

Lys Gly Asn Val Phe Phe Ser Leu Gln Leu Ser Leu

115 120

<210> 28

<211> 122

<212> PRT

<213> Bacillus phage B103 (Bacteriophage B103)

<400> 28

Met Thr Asn Glu Ile Lys Ala Thr Phe Asp Val Thr Thr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Arg Met Lys Ile Leu Asn Ala Lys Asn Ala Gly Gly Ala Ser Leu Lys

20 25 30

Thr Cys Val Asp Gly Thr Ile Ile Glu Ala Val Gly Ile Ala Gln Tyr

35 40 45

Gln Gln Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Asp Met Lys Glu Glu Thr Val Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Val Ala Glu Ala Ala Thr Glu Ile Ile Asp Leu Val Lys Glu Phe Asn

85 90 95

Leu Asp Thr Phe Lys Val Lys Val Ser Lys Gln Lys Ser Ser Lys Gly

100 105 110

Asn Glu Phe Phe Ser Leu Leu Leu Val Gly

115 120

<210> 29

<211> 172

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis (strain 168)

<400> 29

Met Leu Asn Arg Val Val Leu Val Gly Arg Leu Thr Lys Asp Pro Glu

1 5 10 15

Leu Arg Tyr Thr Pro Asn Gly Ala Ala Val Ala Thr Phe Thr Leu Ala

20 25 30

Val Asn Arg Thr Phe Thr Asn Gln Ser Gly Glu Arg Glu Ala Asp Phe

35 40 45

Ile Asn Cys Val Thr Trp Arg Arg Gln Ala Glu Asn Val Ala Asn Phe

50 55 60

Leu Lys Lys Gly Ser Leu Ala Gly Val Asp Gly Arg Leu Gln Thr Arg

65 70 75 80

Asn Tyr Glu Asn Gln Gln Gly Gln Arg Val Phe Val Thr Glu Val Gln

85 90 95

Ala Glu Ser Val Gln Phe Leu Glu Pro Lys Asn Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Tyr Asn Glu Gly Asn Ser Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Gly

115 120 125

Gly Gly Gln Asn Asp Asn Pro Phe Gly Gly Asn Gln Asn Asn Gln Arg

130 135 140

Arg Asn Gln Gly Asn Ser Phe Asn Asp Asp Pro Phe Ala Asn Asp Gly

145 150 155 160

Lys Pro Ile Asp Ile Ser Asp Asp Asp Leu Pro Phe

165 170

<210> 30

<211> 301

<212> PRT

<213> Deinococcus geothermalis (strain DSM 11300 / AG-3a)

<400> 30

Met Ala Arg Gly Met Asn His Val Phe Leu Ile Gly Ala Leu Ala Arg

1 5 10 15

Asp Pro Glu Leu Arg Tyr Thr Pro Ser Gly Val Ala Val Phe Glu Ala

20 25 30

Thr Val Ala Gly Glu Asp His Leu Ile Gly Asn Asp Gly Arg Glu Arg

35 40 45

Lys Leu Pro Trp Tyr His Arg Val Ser Leu Leu Gly Lys Pro Ala Glu

50 55 60

Trp Gln Ala Glu Arg Asn Leu Arg Ala Gly Asp Ala Val Met Val Glu

65 70 75 80

Gly Gly Leu Glu Tyr Ser Gln Trp Glu Ala Pro Glu Gly Gly Lys Arg

85 90 95

Ser Met Val Arg Val Lys Ala Gly Arg Ile Glu Gln Leu Gly Ser Gln

100 105 110

Pro Glu Leu Val Gln Asp Ala Gly Gly Gly Val Arg Met Ala Gly Gly

115 120 125

Leu Asn Glu Val Ile Leu Ile Gly Asn Val Thr Arg Asp Pro Glu Leu

130 135 140

Arg Tyr Thr Pro Ala Gly Asp Ala Val Leu Gly Leu Gly Leu Ala Val

145 150 155 160

Asn Glu Ser Trp Gln Asp Arg Gln Gly Gln Arg Gln Glu Lys Thr His

165 170 175

Trp Val Asp Val Thr Leu Trp Arg Asp Leu Ala Glu Ala Met Lys Asp

180 185 190

Leu Arg Lys Gly Asp Pro Val Leu Val Gln Gly Arg Leu Val Asn Glu

195 200 205

Ala Trp Thr Asp Arg Asp Gly Asn Lys Arg Asn Ser Thr Lys Val Glu

210 215 220

Ala Thr Arg Val Glu Ala Leu Ser Arg Gly Ala Ala Thr Gly Ser Ala

225 230 235 240

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Pro Arg Thr Gln Thr Ala Gly Ser Thr Ala

245 250 255

Arg Pro Gln Pro Ser Ser Val Gly Val Ser Arg Thr Gln Pro Ser Arg

260 265 270

Ala Ala Asn Thr Gly Thr Arg Ser Gly Gly Leu Asp Ile Asp Gln Gly

275 280 285

Leu Asp Asp Phe Pro Pro Glu Glu Glu Asp Leu Pro Phe

290 295 300

<210> 31

<211> 301

<212> PRT

<213> Enterobacteria phage T4

<400> 31

Met Phe Lys Arg Lys Ser Thr Ala Glu Leu Ala Ala Gln Met Ala Lys

1 5 10 15

Leu Asn Gly Asn Lys Gly Phe Ser Ser Glu Asp Lys Gly Glu Trp Lys

20 25 30

Leu Lys Leu Asp Asn Ala Gly Asn Gly Gln Ala Val Ile Arg Phe Leu

35 40 45

Pro Ser Lys Asn Asp Glu Gln Ala Pro Phe Ala Ile Leu Val Asn His

50 55 60

Gly Phe Lys Lys Asn Gly Lys Trp Tyr Ile Glu Thr Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Gly Asp Tyr Asp Ser Cys Pro Val Cys Gln Tyr Ile Ser Lys Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Asn Thr Asp Asn Lys Glu Tyr Ser Leu Val Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Ser Tyr Trp Ala Asn Ile Leu Val Val Lys Asp Pro Ala Ala Pro

115 120 125

Glu Asn Glu Gly Lys Val Phe Lys Tyr Arg Phe Gly Lys Lys Ile Trp

130 135 140

Asp Lys Ile Asn Ala Met Ile Ala Val Asp Val Glu Met Gly Glu Thr

145 150 155 160

Pro Val Asp Val Thr Cys Pro Trp Glu Gly Ala Asn Phe Val Leu Lys

165 170 175

Val Lys Gln Val Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Asp Glu Ser Lys Phe Leu

180 185 190

Asn Gln Ser Ala Ile Pro Asn Ile Asp Asp Glu Ser Phe Gln Lys Glu

195 200 205

Leu Phe Glu Gln Met Val Asp Leu Ser Glu Met Thr Ser Lys Asp Lys

210 215 220

Phe Lys Ser Phe Glu Glu Leu Asn Thr Lys Phe Gly Gln Val Met Gly

225 230 235 240

Thr Ala Val Met Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Lys Lys Ala Asp

245 250 255

Lys Val Ala Asp Asp Leu Asp Ala Phe Asn Val Asp Asp Phe Asn Thr

260 265 270

Lys Thr Glu Asp Asp Phe Met Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser

275 280 285

Ala Asp Asp Thr Asp Leu Asp Asp Leu Leu Asn Asp Leu

290 295 300

<210> 32

<211> 299

<212> PRT

<213> Escherichia phage RB69

<400> 32

Met Phe Lys Arg Lys Ser Thr Ala Asp Leu Ala Ala Gln Met Ala Lys

1 5 10 15

Leu Asn Gly Asn Lys Gly Phe Ser Ser Glu Asp Lys Gly Glu Trp Lys

20 25 30

Leu Lys Leu Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gln Ala Val Ile Arg Phe Leu

35 40 45

Pro Ala Lys Thr Asp Asp Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu Val Asn His

50 55 60

Gly Phe Lys Lys Asn Gly Lys Trp Tyr Ile Glu Thr Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Gly Asp Tyr Asp Ser Cys Pro Val Cys Gln Tyr Ile Ser Lys Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Asn Thr Asn Lys Thr Glu Tyr Ser Gln Leu Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Ser Tyr Trp Ala Asn Ile Leu Val Val Lys Asp Pro Gln Ala Pro

115 120 125

Asp Asn Glu Gly Lys Val Phe Lys Tyr Arg Phe Gly Lys Lys Ile Trp

130 135 140

Asp Lys Ile Asn Ala Met Ile Ala Val Asp Thr Glu Met Gly Glu Thr

145 150 155 160

Pro Val Asp Val Thr Cys Pro Trp Glu Gly Ala Asn Phe Val Leu Lys

165 170 175

Val Lys Gln Val Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Asp Glu Ser Lys Phe Leu

180 185 190

Asn Gln Ser Ala Ile Pro Asn Ile Asp Asp Glu Ser Phe Gln Lys Glu

195 200 205

Leu Phe Glu Gln Met Val Asp Leu Ser Glu Met Thr Ser Lys Asp Lys

210 215 220

Phe Lys Ser Phe Glu Glu Leu Asn Thr Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly

225 230 235 240

Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Ala Asp

245 250 255

Lys Val Ala Ser Asp Leu Asp Asp Phe Asp Lys Asp Met Glu Ala Phe

260 265 270

Ser Ser Ala Lys Thr Glu Asp Asp Phe Met Ser Ser Ser Ser Ser Asp

275 280 285

Asp Gly Asp Leu Asp Asp Leu Leu Ala Gly Leu

290 295

Claims (15)

1.一种一个、优选至少两个靶序列的核酸等温扩增方法，所述靶序列优选在生物样品中，所述方法包括以下步骤：

(a)提供

(i)至少一种重组酶，至少一种单链结合蛋白，至少一种、优选至少两种靶序列特异性引物，至少一种DNA聚合酶，和可选地：提供至少一种逆转录酶和/或至少一种能量再生酶，以及合适的反应组分，其中，

(ii)未提供对至少一种所述酶的活性必不可少的至少一种辅因子；或者其中提供了至少一种阻断所述至少一种重组酶的活性的抑制剂；

(b)提供至少一种生物样品以分析至少一种靶序列的存在，并可选地提供优选无菌的提取试剂盒以获得生物样品；

(c)可选地：提供至少一种探针和可选地提供至少一种激活探针的酶以便产生可检测信号；

(d)加入起始试剂以启动扩增反应；和

(e)获得至少一种扩增的靶序列和/或获得至少一种可检测信号，每个信号指示所扩增的相应靶序列的成功扩增；

优选地，其中，步骤(i)中提供的至少一种所述酶，包括至少一种重组酶、至少一种单链结合蛋白、至少一种DNA聚合酶，和可选地：至少一种逆转录酶和/或至少一种能量再生酶，更优选至少两种所述酶，最优选所有使用的酶是在高于37℃至约85℃，优选约39℃至约2560℃，最优选约40℃至约55℃的温度下具有最佳活性的热稳定酶。

2.如权利要求1所述的方法，其中，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或多于六个不同的靶序列被扩增，优选在使用的相同样品中和/或其中不提供额外的拥挤剂。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述靶序列独立地选自由感染原的靶序列组成的组，所述感染原的靶序列包括选自以下病毒的靶序列：埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、本迪布焦病毒、猴痘病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、裂谷热病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、狂犬病病毒、包括H5N1、H7N9和H9N2的甲型或乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、包括腺病毒1、4.7的腺病毒、副流感病毒3、MERS CoV、SARS-CoV-2、细小病毒B19、西尼罗河病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、诺如病毒、牛冠状病毒、口蹄疫病毒、块状皮肤病病毒，或包含以下细菌的靶序列，包括金黄色葡萄球菌，包括抗菌素抗性基因，或包括溃疡分枝杆菌、梅毒螺旋体、杜氏利什曼原虫、麻风分枝杆菌、土拉弗朗西拉菌、炭疽杆菌的靶序列，包括pacA/capC、艰难梭菌，包括tcdB/tcdA、泛立克次体、伤寒沙门氏菌或副伤寒沙门氏菌、恶性疟原虫、巨细胞病毒或肠道病毒、东方弗朗西斯菌、白斑综合症病毒或细角对虾浓核病毒。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，提供了至少两个靶序列，并且其中，这至少两个靶序列是系统组的一部分，其中，所述组选自由以下组成的组：急性传染病组、脑膜脑炎组、严重呼吸道疾病组、虫媒病毒组、抗生素耐药基因组、特定国家/地区旅行返回者组、孕期筛查特异性组、计划或急性住院前个体检测特异性组、用于筛查包括与红斑相关的儿科疾病的传染性儿科疾病的筛查组，和/或用于测试家畜动物的组和/或用于测试水产养殖感染的组。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，不提供另外的拥挤剂和/或其中另外提供至少一种重组酶辅助酶或因子，优选在步骤(d)之前。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，提供至少一种能量再生酶系统和/或其中提供至少一种正向引物和至少一种反向引物作为靶序列特异性引物，其中，这些引物中的至少一种，优选反向引物，相对于其他引物以更高的量或浓度提供。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，提供至少一种探针和/或标记，其中，所述至少一种探针和/或至少一种标记包含直接或间接可检测部分和/或其中，至少一种酶包含至少一个标签和/或标记。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，至少一种，优选至少两种所提供的酶独立地选自由SEQ ID NO:1至8，或其催化活性片段，或与相应参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至99％的序列，或编码相应酶的核酸序列组成的组。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述靶序列是单链或双链DNA和/或RNA核酸序列。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，扩增反应期间的温度为约37℃至约85℃，优选约39℃至约60℃，最优选约40℃至约55℃。

11.一种用于检测生物样品或从表面获得的样品中的至少两个靶序列的系统，优选便携式系统，所述系统包括：

至少一个裂解室(12)，至少两个扩增室(14.1和14.2)，它们是一个第二容器(14)的一部分，以及至少一个发光、优选至少一个荧光检测装置(16)，其中，所述裂解室(12)包含裂解液，所述至少两个扩增室(14.1和14.2)中的每一个包含混合物，所述混合物包含权利要求1至10所定义的酶组和合适的反应组分以用于扩增至少两个靶核酸序列，以及所述发光、优选所述荧光检测装置(16)，其包括配置成接收扩增室(14)或扩增室的内容物的检测室(42)、光源(44)、光学传感器(46)、能量供应装置(48)、无线数据接口(52)和控制器(50)，其中，所述系统被配置为执行根据权利要求1至10中任一项所述的方法。

12.如权利要求11所述的系统，其中，所述系统被配置成使得它可以被组合以形成一个单一的流体密封组件(34)，其中，至少一个第一裂解室(12)包括第一组化学品和/或试剂，所述第一室在使用前被关闭，优选地，其中第一组化学品和/或试剂允许至少一个被扩增的靶核酸序列的可接近性和/或样品中潜在传染性物质的失活，并且其中，所述至少两个扩增室(14)中的第二扩增室(14.1或14.2)各自包括第二组化学品和/或试剂，其至少部分不同于第一组的化学品和/或试剂并且至少不同于设置在对靶基因特异性具有决定性的部分中的至少一个另外的第二扩增室的化学品和/或试剂，并且其中至少一个第一裂解室包括盖子(26)，当至少一个第一裂解室(12)和至少两个第二室(14.1或14.2)之一组合形成单个流体密封组件(34)时打开，以允许至少一个第一裂解室(12)的内容物单独进入所述至少两个第二室(14)中的每一个。

13.如权利要求11或12所述的系统，其中，所述系统另外包括发光、优选荧光检测装置(16)，所述发光、优选荧光检测装置(16)包括：

-配置成接收扩增室或扩增室的内容物的检测室(42)，

-配置成激发发光并且特别是荧光的光源(44)，

-配置成捕获发光并且特别是荧光的光学传感器(46)，

-能量供应装置(48)，

-无线数据接口(52)和

-控制器(50)。

14.用于执行权利要求1至10中任一项所述方法的试剂盒，其中，所述试剂盒包含

(i)至少一种重组酶，至少一种单链结合蛋白，至少一种DNA聚合酶，和可选地：至少一种逆转录酶和/或至少一种能量再生酶，以及合适的反应组分，其中，

(ii)至少两个靶序列特异性引物；

(iii)合适的反应组分，其包括至少一种酶的至少一种辅助因子、dNTP或dNTP和ddNTP的混合物、至少一种缓冲系统、至少一种还原剂和三磷酸腺苷；

(iv)至少一套无菌套件，其用于提取待分析的生物探针，并包括至少一种配置成应用于权利要求11所定义的系统的组件，优选应用于系统的裂解室(12)；

(v)可选地：至少一种探针和可选地至少一种激活所述探针的酶；和

(vi)可选地：至少一种阻断至少一种重组酶的活性的抑制剂和/或可选地：至少一种重组酶辅助因子；和

(vii)可选地：其中所述试剂盒进一步包含第二部分，所述第二部分包含(i)至(v)，其中，所述第二部分包含用作阳性对照的预定第二靶序列和至少一个，优选至少两个对所述第二靶序列具有特异性的引物，并且优选第二探针。

15.权利要求7或8所定义的至少一种酶的用途，或编码该酶的至少一种核酸序列的用途，可选地与权利要求14所定义的试剂盒组合使用，以用于执行权利要求1至10中任一项所定义的至少一个靶序列的核酸等温扩增方法。

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