CN102399905A - 用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物和1对蚊子内对照引物，在检测的步骤中需要先对被测对象进行RT扩增反应再进行PCR扩增反应，放大被检测信号。利用电泳系统对扩增产物进行检测，通过分析扩增产物的片段长度，实现对12种病毒的快速检测和同步鉴定。本发明可以快速地实现对未知样品中是否携带上述12种虫媒性脑炎病毒进行检测和鉴定。检测灵敏度高，特异性强。本发明可以应用于出入境口岸、野外战场、圈舍、雨林、沼泽等不同环境下的蚊子等吸血昆虫进行高效的检测和病毒鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学方法进行病毒检测领域，具体检测12种脑炎病毒的方法。
背景技术
东方型马脑脊髓炎病毒、西方型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯雅热病毒和Ⅲ型登革热病毒均是通过蚊子（或其他野生动物）转播的脑炎病毒。传统的检测技术和方法主要是针对少量种类的此类病毒进行血清学或者分子生物学的检测，一般不超过5种。检测通量小，检测时间花费时间长。本发明主要基于在病毒特异性引物的两端加上一对外引物，在特异性扩增的基础上，利用外引物进行信号的统一放大，从而实现对12种虫媒病毒的高通量并行检测。
东方型马脑脊髓炎病毒、西方型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯雅热病毒和Ⅲ型登革热病毒均是通过蚊子传播的病原体，在现代战争中，均可能被恐怖分子利用，加以危害公众的安全。同时，人类食用被这些病毒污染的食品也会形成致命的危害。然而，在现有的报道中尚无一种技术可以同时对如上12种虫媒病毒进行同步的检测和筛查。由此可见，本发明将适用于针对蚊子所携带的病原体的动态研究、生物反恐、食品安全检测等有关的领域。
发明内容
本发明目的是提供一种高通量的、高敏感度和高特异性的针对12种虫媒性脑炎病毒的快速分子生物学检测方法，具体包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物、1对内对照引物以及特殊设计的检测方法。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：基于12种病毒的特征性基因序列，设计针对各种病毒的特异性检测引物、加上一对通用的放大引物，对检测信号进行放大和扩增，通过分析扩增产物的片段长度，实现对12种病毒的快速检测和同步鉴定。用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物和1对蚊子内对照引物，核苷酸序列为：
拉科鲁尼亚病毒上游引物，SEQ NO.1；拉科鲁尼亚病毒下游引物，SEQ NO.2；高地J病毒上游引物，SEQ NO.3；高地J病毒下游引物，SEQ NO.4；Ockelbo 病毒上游引物，SEQ NO.5；Ockelbo 病毒下游引物，SEQ NO.6；Ⅲ型登革热病毒上游引物，SEQ NO.7；Ⅲ型登革热病毒下游引物，SEQ NO.8；基孔肯雅热病毒上游引物，SEQ NO.9；基孔肯雅热病毒下游引物，SEQ NO.10;辛德毕斯病毒上游引物，SEQ NO.11；辛德毕斯病毒下游引物，SEQ NO.12；东部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ NO.13；东部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ NO.14；西部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ NO.15；西部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ NO.16；委内瑞拉马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ NO.17；委内瑞拉马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ NO.18；日本脑炎病毒上游引物，SEQ NO.19；日本脑炎病毒下游引物，SEQ NO.20；西尼罗河病毒上游引物，SEQ NO.21；西尼罗河病毒下游引物，SEQ NO.22；圣路易斯脑炎病毒上游引物，SEQ NO.23；圣路易斯脑炎病毒下游引物，SEQ NO.24；通用放大引物上游，SEQ NO.25；通用放大引物下游，SEQ NO.26；蚊子内对照引物上游，SEQ NO.27；蚊子内对照引物下游，SEQ NO.28。
用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法包括反转录扩增、聚合酶链式反应扩增反应和产物的检测三部分;
其中，所述反转录反应液含：1x 反转录缓冲液(50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1.5～5.0mmol/L MgCl2, 10mmol/L DTT, pH8.3(25℃))，0.5 mmol/L dNTP（含A、G、C、T）, 20U RNA酶抑制剂，1～2U 逆转录酶, 0.1～0.5 μmol/L下游嵌套引物，100～500 ng 样品RNA，按参数40～55℃，15～60 min, 85℃, 5 min进行反应。反应完毕后，进行后续反应。
所述聚合酶链式反应扩增反应的检测反应液含有1x 反应缓冲液（500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl, 1% Triton X-100）, 2.0～5.0 mmol/L MgCl2, 200～400μmol/L dNTP(含A、G、C、T), 2～3U 耐热DNA聚合酶, 12对病毒特异性引物的浓度均为0.1～0.3 μmol/L，蚊子内对照引物0.1～0.3μmol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4～1.2μmol/L，2.5～5% DMSO，0.2～0.5 mol/L 甜菜碱 2～5μL cDNA。
反应条件为：预变性95℃ 5 min；5～10个循环的预扩增：94℃，30s；45℃～55℃, 35s; 72℃ 60s～120s; 35～40个循环：94℃，40s，55℃～62℃，40s，65℃～72℃，2min～5 min；补充延伸：72℃，10 min。
产物的检测：用电泳系统对聚合酶链式反应扩增得到的产物进行分离和检测；根据所述产物的片段长度确定病毒类型。
各种引物的序列为：
拉科鲁尼亚病毒上游引物，SEQ NO.1的序列为：
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATCACCTGTATCTTGAATTATG-3′。
拉科鲁尼亚病毒下游引物，SEQ NO.2的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGTACAACTATAGCAGAATCTT-3′。
高地J病毒上游引物，SEQ NO.3的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATAGACGCAGGTTGAAGAT-3′。
高地J病毒下游引物，SEQ NO.4的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGAGTGAGGATAGCATACGA-3′。
OCKELBO 病毒上游引物，SEQ NO.5的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACCACCTGCAGCCGATAACACCTC-3′。
OCKELBO 病毒下游引物，SEQ NO.6的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGGTGGAATTGGCTCTTCCTGCGTTT-3′。
Ⅲ型登革热病毒上游引物，SEQ NO.7的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACAGTGGAGTGGAAGGAGAA-3′。
Ⅲ型登革热病毒下游引物，SEQ NO.8的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTATTACCGTGCCTGTTGGA-3′。
基孔肯雅热病毒上游引物，SEQ NO.9的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACGTACGTGCCGGCGACCATT-3′。
基孔肯雅热病毒下游引物，SEQ NO.10的序列为;
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGCTTGGGCGACCACGGGAAT-3′。
辛德毕斯病毒上游引物，SEQ NO.11的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTAACATCAGCCTCCAATTAGATAC-3′。
辛德毕斯病毒下游引物，SEQ NO.12的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTCTCCTGGTGCTGACTCTT-3′。
东部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ NO.13的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACAGTGGGTAGAGAGAAAT-3′。
东部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ NO.14的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTTTGTTGTCAATCAGGTAAG-3′。
西部型马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ NO.15的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACATTACCGATGACTTCAC-3′。
西部型马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ NO.16的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTTTCTCCATACTGTCTTCC-3′。
委内瑞拉马脑脊髓炎病毒上游引物，SEQ NO.17的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTAAAGTGTCACTCCATACATCTC-3′。
委内瑞拉马脑脊髓炎病毒下游引物，SEQ NO.18的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGCTCTACTCCGTGTTCTG-3′。
日本脑炎病毒上游引物，SEQ NO.19的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATAGTGGGAGTGAAGAGGGTAG-3′。
日本脑炎病毒下游引物，SEQ NO.20的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTGGGCTAATGCTGTAAACTTGAAG-3′。
西尼罗河病毒上游引物，SEQ NO.21的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTACATAACATTCACAACGACATCAA-3′。
西尼罗河病毒下游引物，SEQ NO.22的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTCCTATTCCGACCATCAACAG-3′。
圣路易斯脑炎病毒上游引物，SEQ NO.23的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTAAATCGTGGAAGTAGACAGA-3′。
圣路易斯脑炎病毒下游引物，SEQ NO.24的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTAGCCTAAGTCAACAACCT-3′。
通用放大引物上游，SEQ NO.25的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTA-3′。
通用放大引物下游，SEQ NO.26的序列为；
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTT-3′。
蚊子内对照引物上游，SEQ NO.27的序列为；
5′-GCGTGTAGAGACTCACCCCGTATTCAAATATCTGCCCTATCAA-3′。
蚊子内对照引物下游，SEQ NO.28的序列为：
5′-ACTGCATCCAAAGGCTCGCAGTTCCGTGTTGGACAAGAATA-3′。
本发明的优点是本发明可以快速地实现对未知样品中是否携带上述12种虫媒性脑炎病毒进行检测和鉴定。
检测灵敏度高，特异性强。由于设计的扩增产物均在500 bp以内，所有特异性的病毒可以获得良好的扩增。特别的PCR循环条件所设计的5个循环的特异性预扩增，可以保证所有的目标病毒得到高效的扩增和特异性的扩增。
本发明可以应用于出入境口岸、野外战场、乡村圈舍、雨林沼泽等不同环境下的蚊子等吸血昆虫进行高效的检测和病毒鉴定。
附图说明
图1不同病毒的特异性扩增示例；
1-12种病毒单管同步扩增；2-西部型马脑脊髓炎病毒；3-东部型马脑脊髓炎病毒；4-拉科鲁尼亚病毒；5-圣路易斯脑炎病毒6-Ockelbo病毒；7-基孔肯雅热病毒；8-委内瑞拉马脑脊髓炎病毒；9-日本脑炎病毒；10-高地J病毒；11-辛德毕斯病毒；12-Ⅲ型登革热病毒；13-圣路易斯脑炎病毒；14-蚊子内对照；M-DL2000 DNA 分子量标记。
具体实施方式
实施例1，样品RNA抽提
采集蚊子等吸血昆虫，加入800μL TriPure Isolation Reagent（Roche, USA），研磨至透明乳液，加入 200μL 氯仿，震荡60 s，然后于4℃，12000 r/min高速离心15 min，取500μL上清，并加入等体积异丙醇室温静置30 min,同前离心15 min，弃去上清，用70%乙醇洗涤1次。RNA沉淀溶解于20μL 无RNAse水。
实施例2，反转录扩增（RT）反应
在冰上融化RT反应试剂及样品RNA，按下表体系配制反应液。
表 1.RT反应液配制
RT反应条件：50℃，30 min, 85℃,5 min。
实施例3，聚合酶链式反应（PCR）扩增反应
室温溶化PCR反应试剂及cDNA，按下表体系配制反应液。
表 2.PCR反应液配制
PCR反应条件：预变性 95℃ 5 min；5个循环的预扩增：94℃，30 s；49℃, 35 s; 72℃ 60 s; 第二阶段35个循环：94℃，40 s，60℃,40 s，70℃，3 min；72℃，10 min。
实施例4，结果判读
取PCR产物5～10μL PCR产物用5%的琼脂糖进行电泳，或者使用Agilent 2100 Lab on Chip系统、Qiacexl毛细电泳系统进行电泳检测。根据产物的片段长度确定病毒类型。
表3 各种病毒及蚊子内对照的产物片段长度
实施例5，废弃物处理
依照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。
实施例6,引物的制备
（1）从GenBank下载东方型马脑脊髓炎病毒、西方型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯雅热病毒、Ⅲ型登革热病毒基因组序列，通过生物软件多重比对分析，在保守区设计针对如上12种病毒的基因特异性引物。引物的热力学特征符合常规要求。蚊子内对照引物同样设计。
（2）将如上13种物种的上下游引物首尾连接成一条长DNA链。使用随机DNA片段生成软件获得一段随机DNA，并从随机DNA上手工抽取一对GC%含量在50～60%之间，退火温度在55～62℃之间的引物。分析这对引物和13种物种引物形成的DNA长链之间的交叉互补情况，调整随机DNA引物至符合二聚体最少的状态，获得通用扩增引物。
(3)将通用扩增引物的上下游分别加到13种物种基因特异性引物上下游，形成嵌套扩增引物。
（4）引物委托生物合成公司按PAGE级别（及以上）合成，存储浓度在100umol/l,工作浓度10umol/l。
实施例7，试剂盒的组装
试剂盒按照说明书要求的组分和条件进行包装，至少包括：
(1)反转录反应液：1x 反转录缓冲液(50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1.5～5.0mmol/L MgCl2, 10mmol/L DTT, pH8.3(25℃))，0.5 mmol/L dNTP（含A、G、C、T）, 20U RNA酶抑制剂，1～2 U 逆转录酶, 0.1～0.5 umol/L下游嵌套引物（12种病毒嵌套引物，1对蚊子内对照引物）。
(2)聚合酶链式检测反应液：1x 反应缓冲液（500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl, 1% Triton X-100）, 2.0～5.0 mmol/L MgCl2, 200～400μmol/L dNTP(含A、G、C、T), 2～3U 耐热DNA聚合酶, 12对病毒特异性引物的浓度均为0.1～0.3 μmol/L，蚊子内对照引物0.1～0.3 μmol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4～1.2 μmol/L，2.5～5% DMSO，0.2～0.5 mol/L 甜菜碱, 50～200 ng cDNA。
（3）对检测条件进行说明的文件（说明书）：
逆转录反应：取100～500 ng 样品RNA加入反转录反应液，按参数40～55℃，15～60 min, 85℃, 5 min进行反应。反应完毕后，进行后续反应。
聚合酶链式检测反应：取2～5μL cDNA加入聚合酶链式检测反应液中，按照条件：预变性95℃ 5 min；5～10个循环的预扩增：94℃，30 s；45℃～55℃, 35s; 72℃ 60 s ～120s; 35～40个循环：94℃，40s，55℃～62℃,40s，65℃～72℃，2 min ～5 min；补充延伸：72℃，10 min进行反应。
取产物5～10μL PCR产物用5%的琼脂糖进行电泳，或者使用Agilent 2100 Lab on Chip系统、Qiacexl毛细电泳系统进行电泳检测。根据下表中产物的片段长度确定病毒类型。
表4各种病毒及蚊子内对照的产物长度
（4）至少包括东方型马脑脊髓炎病毒、西方型马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒、西尼罗河病毒、高地J病毒、拉科鲁尼亚病毒、辛德毕斯病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯雅热病毒、Ⅲ型登革热病毒以及蚊子共计13种不同的质控（或对照）RNA，用于试剂盒检测反应的佐证。
（5）至少包括盛放反转录反应液、聚合酶链式检测反应液、质控RNA、说明书的容器、架子以及试剂盒的外包装。
<110> 重庆大学、重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物及其检测方法
<160> 28
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.1
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TATCACCTGT ATCTTGAATT ATG 43
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.2
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTGTACAAC TATAGCAGAA TCTT 44
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.3
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TATAGACGCA GGTTGAAGAT 40
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.4
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTGAGTGAG GATAGCATAC GA 42
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.5
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TACCACCTGC AGCCGATAAC ACCTC 45
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.6
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTGGTGGAA TTGGCTCTTC CTGCGTTT 48
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.7
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TACAGTGGAG TGGAAGGAGA A 41
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.8
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTATTACCG TGCCTGTTGG A 41
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.9
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TACGTACGTG CCGGCGACCA TT 42
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.10
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTGCTTGGG CGACCACGGG AAT 43
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.11
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TAACATCAGC CTCCAATTAG ATAC 44
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.12
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTCTCCTGG TGCTGACTCT T 41
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.13
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TACAGTGGGT AGAGAGAAAT 40
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.14
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTTTGTTGT CAATCAGGTA AG 42
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.15
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TACATTACCG ATGACTTCAC 40
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.16
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTTTCTCCA TACTGTCTTC C 41
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.17
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TAAAGTGTCA CTCCATACAT CTC 43
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.18
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTGCTCTAC TCCGTGTTCT G 41
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.19
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TATAGTGGGA GTGAAGAGGG TAG 43
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.20
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTGGGCTAA TGCTGTAAAC TTGAAG 46
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.21
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TACATAACAT TCACAACGAC ATCAA 45
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.22
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTCCTATTC CGACCATCAA CAG 43
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.23
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TAAATCGTGG AAGTAGACAG A 41
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.24
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTAGCCTAA GTCAACAACC T 41
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.25
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TA 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.26
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTT 22
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.27
GCGTGTAGAG ACTCACCCCG TATTCAAATA TCTGCCCTAT CAA 43
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ NO.28
ACTGCATCCA AAGGCTCGCA GTTCCGTGTT GGACAAGAAT A 41
Claims (6)
1.用于虫媒性脑炎病毒检测的寡核苷酸引物，其特征在于：包括12对病毒特异性引物、1对通用放大引物和1对蚊子内对照引物，它们的核苷酸序列如下：
拉科鲁尼亚病毒上游引物：SEQ NO.1；
拉科鲁尼亚病毒下游引物：SEQ NO.2；
高地J病毒上游引物：SEQ NO.3；
高地J病毒下游引物：SEQ NO.4；
Ockelbo 病毒上游引物：SEQ NO.5；
Ockelbo 病毒下游引物：SEQ NO.6；
Ⅲ型登革热病毒上游引物：SEQ NO.7；
Ⅲ型登革热病毒下游引物：SEQ NO.8；
基孔肯雅热病毒上游引物：SEQ NO.9；
基孔肯雅热病毒下游引物：SEQ NO.10;
辛德毕斯病毒上游引物：SEQ NO.11；
辛德毕斯病毒下游引物：SEQ NO.12；
东部型马脑脊髓炎病毒上游引物：SEQ NO.13；
东部型马脑脊髓炎病毒下游引物：SEQ NO.14；
西部型马脑脊髓炎病毒上游引物：SEQ NO.15；
西部型马脑脊髓炎病毒下游引物：SEQ NO.16；
委内瑞拉马脑脊髓炎病毒上游引物：SEQ NO.17；
委内瑞拉马脑脊髓炎病毒下游引物：SEQ NO.18；
日本脑炎病毒上游引物：SEQ NO.19；
日本脑炎病毒下游引物：SEQ NO.20；
西尼罗河病毒上游引物：SEQ NO.21；
西尼罗河病毒下游引物：SEQ NO.22；
圣路易斯脑炎病毒上游引物：SEQ NO.23；
圣路易斯脑炎病毒下游引物：SEQ NO.24；
通用放大引物上游：SEQ NO.25；
通用放大引物下游：SEQ NO.26；
蚊子内对照引物上游：SEQ NO.27；
蚊子内对照引物下游：SEQ NO.28。
2.权利要求1所述引物用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法,其特征在于:包括反转录扩增、聚合酶链式反应扩增反应和产物的检测三个步骤;
其中，所述反转录反应液含：1x 反转录缓冲液，0.5 mmol/L dNTP, 20U RNA酶抑制剂，1～2U 逆转录酶, 12对病毒特异性下游引物的浓度均为0.1～0.5 μmol/L，100～500 ng 样品RNA，按参数40～55℃，15～60 min, 85℃, 5 min进行反应；
所述聚合酶链式反应扩增反应的检测反应液含有：1x 反应缓冲液, 2.0～5.0 mmol/L MgCl2, 200～400 μmol/L dNTP, 2～3U耐热DNA 聚合酶, 12对病毒特异性引物的浓度均为0.1～0.3 μmol/L，蚊子内对照引物上游和下游0.1～0.3 μmol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的浓度均为0.4～1.2 μmol/L，2.5～5% DMSO，0.2～0.5 mol/L 甜菜碱, 2～5μL cDNA；
反应条件为：预变性95℃ 5 min；5～10个循环的预扩增：94℃，30s；45℃～55℃, 35s; 72℃ 60s～120s; 35～40个循环：94℃，40s，55℃～62℃,40s，65℃～72℃，2 min～5 min；补充延伸：72℃，10 min；
产物的检测：用电泳系统对聚合酶链式反应扩增反应得到的产物进行分离和检测；根据所述产物的片段长度确定病毒类型。
3.根据权利要求2所述用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法,其特征在于:所述1x 反转录缓冲液包含：50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1.5～5.0mmol/L MgCl2, 10mmol/L DTT。
4.根据权利要求2所述用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法,其特征在于:所述1x 反应缓冲液包含：500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl, 1% Triton X-100。
5.根据权利要求2所述用于虫媒性脑炎病毒检测的检测方法,其特征在于: 所述产物的片段长度分别是：
拉科鲁尼亚病毒 375～385 bp;
东部型马脑脊髓炎病毒 352～362 bp;
高地J病毒 335～345 bp;
Ockelbo 病毒 315～325 bp;
Ⅲ型登革热病毒 295～305 bp;
西部型马脑脊髓炎病毒 282～292 bp;
委内瑞拉马脑脊髓炎病毒 255～265 bp;
辛德毕斯病毒 235～245 bp;
基孔肯雅热病毒 215～225 bp;
圣路易斯脑炎病毒 194～204 bp;
西尼罗河病毒 163～173 bp;
日本脑炎病毒 147～157 bp;
蚊子内对照 395～405 bp。
6.权利要求1所述的引物用于虫媒性脑炎病毒检测试剂盒制备的用途。
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