CN113480611A - Rig-i的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

Rig-i的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113480611A
CN113480611A CN202110721461.8A CN202110721461A CN113480611A CN 113480611 A CN113480611 A CN 113480611A CN 202110721461 A CN202110721461 A CN 202110721461A CN 113480611 A CN113480611 A CN 113480611A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
glu
antiviral
lys
rig
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110721461.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113480611B (zh
Inventor
章晓联
饶健炜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN202110721461.8A priority Critical patent/CN113480611B/zh
Publication of CN113480611A publication Critical patent/CN113480611A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113480611B publication Critical patent/CN113480611B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用，所述多肽为RIG‑I的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)蛋白或多肽，所述抗病毒多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过圆二色谱仪及核磁共振仪确定丙型肝炎病毒core RNA上存在G4结构，再利用G4pull down实验及Western Blot鉴定得到G4结构的结合蛋白RIG‑I，随后通过FRET及qRT‑PCR实验发现RIG‑I‑2CARDs结构域能稳定G4结构并抑制HCV的复制，表明2CARDs多肽可作为潜在的药物发挥抗病毒作用。

Description

RIG-I的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在 制备抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染容易导致慢性肝炎，最终导致肝硬化和肝细胞癌。在全球范围内，据估计有超过1.1亿人具有当前或过去感染HCV的血清学证据，而8000万人具有慢性病毒感染，估计每年导致703800人死亡，占HCC总死亡率的三分之一。HCV属于黄病毒科单股正链RNA病毒，全长约9.6kb，其编码的多聚蛋白可被蛋白酶切割成为十个不同的蛋白，包括三个结构蛋白(核衣壳蛋白core，包膜蛋白E1和E2)和七个非结构蛋白(p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。其中，HCV core基因编码的结构蛋白Core全长191个氨基酸，能够形成HCV病毒的核衣壳，防止病毒在感染宿主的过程中基因组RNA受到损伤。
G-四链体(G4)是由富含鸟嘌呤的DNA或RNA形成的非典型的核酸二级结构[7,8]，其基本序列公式为GXN1-7GXN1-7GXN1-7GX，其中x≥3，N代表loop区，可由任一碱基组成。人类基因组中有超过375000个G4基序，广泛存在于启动子、端粒和癌基因(如c-Myc,c-Kit 等)中，具有维持基因组稳定，调控基因转录、复制等重要生命进程的作用。G-四链体也存在于病毒基因中，通过与G-四链体结合蛋白的相互作用可介导病毒的免疫逃逸。研究发现HCV的RNA能够形成G4结构，且core G4最为保守和稳定。
由于HCV的高度变异性，HCV的防治必须依赖多条途径。而对HCV基因组RNA上高度保守结构的探索以及可结合这些结构的配体的筛选也将会为抗HCV感染提供新的思路。因此有必要开发一种新抗病毒药物。
发明内容
本发明目的是提供一种抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗病毒多肽，所述抗病毒多肽为视黄酸诱导基因1 的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)，所述抗病毒多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.3 所示。
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子为编码所述的抗病毒多肽的编码基因。
进一步地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明的第三方面，提供了一种含有所述的编码基因的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种含有所述载体的宿主菌。
进一步地，所述宿主菌为DH5α、Top10、BL21和Rosetta中的一种。
在本发明的第五方面，提供了一种含有所述载体的细胞系。
在本发明的第六方面，提供了一种所述的抗病毒多肽、所述的核酸分子或所述的载体或者所述的宿主菌或所述的细胞系在制备抗病毒药物中的应用。
进一步地，所述病毒包括含有G4结构的病毒。
在本发明的第七方面，提供了一种抗病毒的药物，所述药物的活性成分包括所述的抗病毒多肽。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供一种抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用中，发现视黄酸诱导基因1(RIG-I)的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)可通过稳定HCV core RNAG4结构而抑制病毒复制，说明2CARDs多肽可作为潜在的药物发挥抗病毒作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为HCV 1a型core基因RNAG4结构的形成；其中，图1A为圆二色谱仪分析G4 结构的形成结果，图1B为由800-MHz核磁共振仪验证结果；
图2为验证RIG-I与HCV 1a core G4结构的结合的结果；其中，图2A和图2B为G4pull down实验拉取RIG-I，并用Western Blot实验验证结果；图2C为构建RIG-I及其结构域真核表达质粒及原核表达质粒的结果；
图3为RIG-I及2CARDs结构域对G4结构稳定性的影响；图3A和图3B为FRET实验验证RIG-I及2CARDs结构域对G4结构的作用结果；
图4为RIG-I及2CARDs结构域对HCV RNA复制水平调控的检测；图4A和图4B为qRT-PCR验证结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
本发明通过圆二色谱仪及核磁共振仪确定丙型肝炎病毒(HCV)core RNA上存在G4结构，再利用G4 pull down实验及Western Blot鉴定得到G4结构的结合蛋白RIG-I；
随后通过FRET及qRT-PCR实验发现RIG-I-2CARDs结构域能稳定G4结构并抑制HCV的复制。
表明RIG-I的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)能通过稳定病毒RNAG4结构而抑制病毒复制。所述RIG-I的mRNA核酸序列如SEQ ID NO.1所示。RIG-I的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。所述抗病毒多肽(RIG-I的半胱天冬酶激活募集结构域)的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
因此，RIG-I的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)多肽，可以作为抑制HCV等含有G4结构的病毒复制的药物。
因而，可以构建所述抗病毒多肽的重组载体、导入宿主菌或靶细胞进行表达，所述的抗病毒多肽、所述的核酸分子或所述的载体或者所述的宿主菌或所述的细胞系均可以在制备抗病毒药物中的应用。
所述病毒包括含有G4结构的病毒本发明的抗病毒作用包括但不限于抗HCV等，具体地，所述抗病毒多肽可以抑制HCV的复制，本发明通过qRT-PCR实验验证RIG-I及2CARDs对HCV在人肝癌细胞Huh7.5.1细胞复制的影响。
此外，所述抗病毒药物的活性成分包括所述的抗病毒多肽。所述的抗病毒多肽以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组成的药物组合物也在本发明的保护范围之内。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用进行详细说明。
实施例1、HCV 1a型core基因RNA G4结构的形成
本发明实施例验证HCV 1a core RNA G4结构的形成。
1.RNA序列的合成：擎科生物技术有限公司合成HCV 1a core RNA G4序列 (5’biotin-GGGCUGCGGGUGGGCGGGA-3’，如SEQ ID NO.5所示)及其对应的点突变序列(5’biotin-GGACUGCGUGUGAGCGGGA-3’，如SEQ ID NO.6所示)。
2.利用含有10mM Tris-HCl(pH 7.0)、100mM KCl的buffer溶解RNA序列冻干粉，并用95℃加热5min，然后缓慢降至室温，以形成G4结构。设定圆二色谱仪的运行温度为 25℃，扫描波长为220nm～320nm，光程路径为1.0mm，扫描速度为50nm/min，然后将混合液吸入1.00mm比色皿中，测出不同RNA序列的CD光谱。
3.将HCV 1a core RNA G4样品溶于含100mM KCl和10％D2O的10mM PBS(pH 7.0)中，终浓度为0.5mM，ASO终浓度为0.1mM。于95℃加热5min后缓慢冷却至室温以形成G4结构。在298K条件下，在带有三共振5mm HCN低温探头的800-MHz Bruker Avance III HDspectrometer仪器上采集信号。原始数据利用MestReNova软件分析。
结果如图1所示，可知所述RNA G4序列能够形成G4结构。
实施例2、验证RIG-I与HCV 1a core G4结构的结合
首先利用G4 pull down实验拉取RIG-I，并用Western Blot实验进行验证，然后利用荧光共聚焦显微镜观察RIG-I与G4结构的共定位情况，并构建RIG-I及其结构域真核表达质粒及原核表达质粒，进一步用EMSA实验验证RIG-I与G4的结合。
1、G4 pull down实验：
采用实施例1中合成的biotin-G4序列及其对应点突变序列，取20μLstretavidin-agarose 加入1mL PBS重悬，2500rpm离心2min后重复洗涤1次，随后加入600μL PBS重悬，加入10μg biotin-G4放入4℃层析柜提前孵育2h。将孵育好的G4-agarose与RIPA裂解Huh7 细胞得到的总蛋白充分混合，放入4℃层析柜中翻转过夜。将蛋白结合液2500rpm离心3 min，小心弃去上清。加入1mL PBS洗涤1次，2500rpm离心3min，洗去未结合的蛋白。向底部加入50μL 2×SDS loading buffer，100℃煮沸变性5min。
2、Western Blot验证：
将biotin-G4拉取的蛋白进行10％SDS-PAGE凝胶分离实验，转移至PVDF膜后5％脱脂奶粉封闭2h，与一抗RIG-I(1：1000稀释)4℃孵育过夜。TBST洗膜4次，每次10min。加入二抗HRP-羊抗兔IgG(1：10000)，37℃孵育1h。TBST洗膜6次，每次5min。将A液与B液按照1：1体积比避光配制显色液，加入到PVDF膜上，进行ECL显色。
结果图2A-2B所示，表明RIG-I与G4结构存在相互作用。
3、构建RIG-I及其结构域真核表达质粒及原核表达质粒：
(1)载体构建
依据人RIG-I基因编码序列(AF038963.1)及蛋白结构，扩增RIG-I及其结构域序列并克隆到pFlag-CMV-2真核表达载体和pGEX-KG原核表达载体上。
pFlag-CMV-2-RIG-I载体、pGEX-KG-RIG-I载体、pFlag-CMV-2-2CARDs载体和pGEX-KG-2CARDs载体的构建时所需引物对和退火温度具体如下表1所示；具有同源臂的序列采用同源重组的方式构建，具有酶切位点的序列采用酶连方式构建。
表1
Figure BDA0003136981600000051
结果如图2C所示，表明pFlag-CMV-2-RIG-I载体、pGEX-KG-RIG-I载体、 pFlag-CMV-2-2CARDs载体和pGEX-KG-2CARDs载体均构建成功。
(2)蛋白表达
利用大肠杆菌原核表达系统诱导RIG-I及其结构域蛋白表达，然后利用亲和层析的方法纯化蛋白。
实施例3、RIG-I及其结构域对G4结构稳定性的影响
1、利用FRET动力学分析检测RIG-I及其结构域对G4结构稳定性的影响：合成dual-HCV core RNA G4序列(5’-FAM-GGGCUGCGGGUGGGCGGGA-TAMRA-3’，如SEQ ID NO.15所示)。用含有10mM Tris-HCl(pH 7.0)、100mM KCl的buffer溶解dual-HCV core RNA G4冻干粉，95℃加热5min后缓慢冷却至室温以形成结构。
ASO(5’-ACCCGCAGCCCUCCCGCCCACC-3’，如SEQ ID NO.16所示)也用同样的方法溶解。双标记的G4序列、ASO终浓度分别为200nM和2.0μM。GST-RIG-I等蛋白浓度为1.0molarequiv，同时加入GST空载蛋白作为对照。加入蛋白后室温孵育30min。从加入ASO开始(t＝0)采集信号。反应在25℃条件下，1cm光程的比色杯中进行，利用荧光分光光度计(F-4600)采集荧光信号。设置激发波长和发射波长分别为494nm和590nm。
结果如图3A所示，表明FRET实验验证了RIG-I及2CARSs结构域对G4结构的存在稳定作用。
2、利用FRET原理检测RIG-I及其结构域对G4结构的解旋作用：合成双标记的dual-HCV core RNA G4-FB序列(5’-FAM-GGGCUGCGGGUGGGCGGGA-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.17所示)。用含有10mM Tris-HCl(pH 7.0)、100mM KCl的buffer溶解dual-HCV core RNA G4-FB冻干粉，95℃加热5min后缓慢冷却至室温以形成结构。将200nM双标 HCV G4与1.0molarequiv蛋白混合，冰上孵育20min。将混合液体吸入1cm光程的比色杯中，利用荧光分光光度计(F-4600)扫描荧光光谱。激发波长和发射波长分别为490nm 和522nm。
结果如图3A所示，表明FRET实验验证了RIG-I及2CARSs结构域对G4结构存在解旋作用。
实施例4、RIG-I及其2CARDs结构域对HCV RNA复制水平调控的检测
qRT-PCR实验：
收集细胞，每孔加入1mL Trizol，冰上孵育3-5min，转移至去RNase酶的1.5mL EP管中。继续向EP管中加200μL氯仿，来回剧烈震荡管体15s，室温静置2-3min。12000rpm，4℃离心15min，此时管中液体分为上层无机水相、中间层以及下层有机酚氯仿相，将上层水相转移到新的无RNase酶EP管中。加入等体积的异丙醇，上下颠倒使充分混匀，室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min。加入1mL预冷的75％的乙醇洗涤白色沉淀，12000 rpm离心5min，重复1次。吸弃上清，将白色沉淀在通风橱进行吹干直至底部沉淀变半透明。加入20μL提前65℃预热的DEPC-ddH2O溶解沉淀，紫外分光光度计测定RNA浓度。按照RNA逆转录试剂盒(日本Toyobo公司)进行RNA逆转录，qRT-PCR检测HCV RNA的表达水平。
表2-RT-qPCR所用引物
Figure BDA0003136981600000071
结果如图4所示，图4A表明qRT-PCR验证了RIG-I及其结构域对HCV RNA复制存在影响。图4B表明qRT-PCR验证了HCV G4结构突变之后，RIG-I及其结构域对HCV RNA 复制存在影响。RIG-I的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)能通过稳定HCV core RNA G4结构而抑制HCV的复制。提示RIG-I的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)多肽可作为药物发挥抗病毒作用。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> RIG-I的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2778
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccaccg agcagcgacg cagcctgcaa gccttccagg attatatccg gaagaccctg 60
gaccctacct acatcctgag ctacatggcc ccctggttta gggaggaaga ggtgcagtat 120
attcaggctg agaaaaacaa caagggccca atggaggctg ccacactttt tctcaagttc 180
ctgttggagc tccaggagga aggctggttc cgtggctttt tggatgccct agaccatgca 240
ggttattctg gactttatga agccattgaa agttgggatt tcaaaaaaat tgaaaagttg 300
gaggagtata gattactttt aaaacgttta caaccagaat ttaaaaccag aattatccca 360
accgatatca tttctgatct gtctgaatgt ttaattaatc aggaatgtga agaaattcta 420
cagatttgct ctactaaggg gatgatggca ggtgcagaga aattggtgga atgccttctc 480
agatcagaca aggaaaactg gcccaaaact ttgaaacttg ctttggagaa agaaaggaac 540
aagttcagtg aactgtggat tgtagagaaa ggtataaaag atgttgaaac agaagatctt 600
gaggataaga tggaaacttc tgacatacag attttctacc aagaagatcc agaatgccag 660
aatcttagtg agaattcatg tccaccttca gaagtgtctg atacaaactt gtacagccca 720
tttaaaccaa gaaattacca attagagctt gctttgcctg ctatgaaagg aaaaaacaca 780
ataatatgtg ctcctacagg ttgtggaaaa acctttgttt cactgcttat atgtgaacat 840
catcttaaaa aattcccaca aggacaaaag gggaaagttg tcttttttgc gaatcagatc 900
ccagtgtatg aacagcagaa atctgtattc tcaaaatact ttgaaagaca tgggtataga 960
gttacaggca tttctggagc aacagctgag aatgtcccag tggaacagat tgttgagaac 1020
aatgacatca tcattttaac tccacagatt cttgtgaaca accttaaaaa gggaacgatt 1080
ccatcactat ccatctttac tttgatgata tttgatgaat gccacaacac tagtaaacaa 1140
cacccgtaca atatgatcat gtttaattat ctagatcaga aacttggagg atcttcaggc 1200
ccactgcccc aggtcattgg gctgactgcc tcggttggtg ttggggatgc caaaaacaca 1260
gatgaagcct tggattatat ctgcaagctg tgtgcttctc ttgatgcgtc agtgatagca 1320
acagtcaaac acaatctgga ggaactggag caagttgttt ataagcccca gaagtttttc 1380
aggaaagtgg aatcacggat tagcgacaaa tttaaataca tcatagctca gctgatgagg 1440
gacacagaga gtctggcaaa gagaatctgc aaagacctcg aaaacttatc tcaaattcaa 1500
aatagggaat ttggaacaca gaaatatgaa caatggattg ttacagttca gaaagcatgc 1560
atggtgttcc agatgccaga caaagatgaa gagagcagga tttgtaaagc cctgttttta 1620
tacacttcac atttgcggaa atataatgat gccctcatta tcagtgagca tgcacgaatg 1680
aaagatgctc tggattactt gaaagacttc ttcagcaatg tccgagcagc aggattcgaa 1740
gagattgagc aagatcttac tcagagattt gaagaaaagc tgcaggaact agaaagtgtt 1800
tccagggatc ccagcaatga gaatcctaaa cttgaagacc tctgcttcat cttacaagaa 1860
gagtaccact taaacccaga gacaataaca attctctttg tgaaaaccag agcacttgtg 1920
gacgctttaa aaaattggat tgaaggaaat cctaaactca gttttctaaa acctggcata 1980
ttgactggac gtggcaaaac aaatcagaac acaggaatga ccctcccggc acagaagtgt 2040
atattggatg cattcaaagc cagtggagat cacaatattc tgattgccac ctcagttgct 2100
gatgaaggca ttgacattgc acagtgcaat cttgtcatcc tttatgagta tgtgggcaat 2160
gtcatcaaaa tgatccaaac cagaggcaga ggaagagcaa gaggtagcaa gtgcttcctt 2220
ctgactagta atgctggtgt aattgaaaaa gaacaaataa acatgtacaa agaaaaaatg 2280
atgaatgact ctattttacg ccttcagaca tgggacgaag cagtatttag ggaaaagatt 2340
ctgcatatac agactcatga aaaattcatc agagatagtc aagaaaaacc aaaacctgtc 2400
cctgataagg aaaataaaaa actgctctgc agaaagtgca aagccttggc atgttacaca 2460
gctgacgtaa gagtgataga ggaatgccat tacactgtgc ttggagatgc ttttaaggaa 2520
tgctttgtga gtagaccaca tcccaagcca aagcagtttt caagttttga aaaaagagca 2580
aagatattct gtgcccgaca gaactgcagc catgactggg gaatccatgt gaagtacaag 2640
acatttgaga ttccagttat aaaaattgaa agttttgtgg tggaggatat tgcaactgga 2700
gttcagacac tgtactcgaa gtggaaggac tttcattttg agaagatacc atttgatcca 2760
gcagaaatgt ccaaatga 2778
<210> 2
<211> 925
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile
1 5 10 15
Arg Lys Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp
20 25 30
Phe Arg Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys
35 40 45
Gly Pro Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu
50 55 60
Gln Glu Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala
65 70 75 80
Gly Tyr Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro
100 105 110
Glu Phe Lys Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser
115 120 125
Glu Cys Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu
145 150 155 160
Arg Ser Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu
165 170 175
Lys Glu Arg Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile
180 185 190
Lys Asp Val Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp
195 200 205
Ile Gln Ile Phe Tyr Gln Glu Asp Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Glu
210 215 220
Asn Ser Cys Pro Pro Ser Glu Val Ser Asp Thr Asn Leu Tyr Ser Pro
225 230 235 240
Phe Lys Pro Arg Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Ala Leu Pro Ala Met Lys
245 250 255
Gly Lys Asn Thr Ile Ile Cys Ala Pro Thr Gly Cys Gly Lys Thr Phe
260 265 270
Val Ser Leu Leu Ile Cys Glu His His Leu Lys Lys Phe Pro Gln Gly
275 280 285
Gln Lys Gly Lys Val Val Phe Phe Ala Asn Gln Ile Pro Val Tyr Glu
290 295 300
Gln Gln Lys Ser Val Phe Ser Lys Tyr Phe Glu Arg His Gly Tyr Arg
305 310 315 320
Val Thr Gly Ile Ser Gly Ala Thr Ala Glu Asn Val Pro Val Glu Gln
325 330 335
Ile Val Glu Asn Asn Asp Ile Ile Ile Leu Thr Pro Gln Ile Leu Val
340 345 350
Asn Asn Leu Lys Lys Gly Thr Ile Pro Ser Leu Ser Ile Phe Thr Leu
355 360 365
Met Ile Phe Asp Glu Cys His Asn Thr Ser Lys Gln His Pro Tyr Asn
370 375 380
Met Ile Met Phe Asn Tyr Leu Asp Gln Lys Leu Gly Gly Ser Ser Gly
385 390 395 400
Pro Leu Pro Gln Val Ile Gly Leu Thr Ala Ser Val Gly Val Gly Asp
405 410 415
Ala Lys Asn Thr Asp Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Cys Lys Leu Cys Ala
420 425 430
Ser Leu Asp Ala Ser Val Ile Ala Thr Val Lys His Asn Leu Glu Glu
435 440 445
Leu Glu Gln Val Val Tyr Lys Pro Gln Lys Phe Phe Arg Lys Val Glu
450 455 460
Ser Arg Ile Ser Asp Lys Phe Lys Tyr Ile Ile Ala Gln Leu Met Arg
465 470 475 480
Asp Thr Glu Ser Leu Ala Lys Arg Ile Cys Lys Asp Leu Glu Asn Leu
485 490 495
Ser Gln Ile Gln Asn Arg Glu Phe Gly Thr Gln Lys Tyr Glu Gln Trp
500 505 510
Ile Val Thr Val Gln Lys Ala Cys Met Val Phe Gln Met Pro Asp Lys
515 520 525
Asp Glu Glu Ser Arg Ile Cys Lys Ala Leu Phe Leu Tyr Thr Ser His
530 535 540
Leu Arg Lys Tyr Asn Asp Ala Leu Ile Ile Ser Glu His Ala Arg Met
545 550 555 560
Lys Asp Ala Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Phe Phe Ser Asn Val Arg Ala
565 570 575
Ala Gly Phe Glu Glu Ile Glu Gln Asp Leu Thr Gln Arg Phe Glu Glu
580 585 590
Lys Leu Gln Glu Leu Glu Ser Val Ser Arg Asp Pro Ser Asn Glu Asn
595 600 605
Pro Lys Leu Glu Asp Leu Cys Phe Ile Leu Gln Glu Glu Tyr His Leu
610 615 620
Asn Pro Glu Thr Ile Thr Ile Leu Phe Val Lys Thr Arg Ala Leu Val
625 630 635 640
Asp Ala Leu Lys Asn Trp Ile Glu Gly Asn Pro Lys Leu Ser Phe Leu
645 650 655
Lys Pro Gly Ile Leu Thr Gly Arg Gly Lys Thr Asn Gln Asn Thr Gly
660 665 670
Met Thr Leu Pro Ala Gln Lys Cys Ile Leu Asp Ala Phe Lys Ala Ser
675 680 685
Gly Asp His Asn Ile Leu Ile Ala Thr Ser Val Ala Asp Glu Gly Ile
690 695 700
Asp Ile Ala Gln Cys Asn Leu Val Ile Leu Tyr Glu Tyr Val Gly Asn
705 710 715 720
Val Ile Lys Met Ile Gln Thr Arg Gly Arg Gly Arg Ala Arg Gly Ser
725 730 735
Lys Cys Phe Leu Leu Thr Ser Asn Ala Gly Val Ile Glu Lys Glu Gln
740 745 750
Ile Asn Met Tyr Lys Glu Lys Met Met Asn Asp Ser Ile Leu Arg Leu
755 760 765
Gln Thr Trp Asp Glu Ala Val Phe Arg Glu Lys Ile Leu His Ile Gln
770 775 780
Thr His Glu Lys Phe Ile Arg Asp Ser Gln Glu Lys Pro Lys Pro Val
785 790 795 800
Pro Asp Lys Glu Asn Lys Lys Leu Leu Cys Arg Lys Cys Lys Ala Leu
805 810 815
Ala Cys Tyr Thr Ala Asp Val Arg Val Ile Glu Glu Cys His Tyr Thr
820 825 830
Val Leu Gly Asp Ala Phe Lys Glu Cys Phe Val Ser Arg Pro His Pro
835 840 845
Lys Pro Lys Gln Phe Ser Ser Phe Glu Lys Arg Ala Lys Ile Phe Cys
850 855 860
Ala Arg Gln Asn Cys Ser His Asp Trp Gly Ile His Val Lys Tyr Lys
865 870 875 880
Thr Phe Glu Ile Pro Val Ile Lys Ile Glu Ser Phe Val Val Glu Asp
885 890 895
Ile Ala Thr Gly Val Gln Thr Leu Tyr Ser Lys Trp Lys Asp Phe His
900 905 910
Phe Glu Lys Ile Pro Phe Asp Pro Ala Glu Met Ser Lys
915 920 925
<210> 3
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Thr Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile
1 5 10 15
Arg Lys Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp
20 25 30
Phe Arg Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys
35 40 45
Gly Pro Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu
50 55 60
Gln Glu Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala
65 70 75 80
Gly Tyr Ser Gly Leu Tyr Glu
85
<210> 4
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaccaccg agcagcgacg cagcctgcaa gccttccagg attatatccg gaagaccctg 60
gaccctacct acatcctgag ctacatggcc ccctggttta gggaggaaga ggtgcagtat 120
attcaggctg agaaaaacaa caagggccca atggaggctg ccacactttt tctcaagttc 180
ctgttggagc tccaggagga aggctggttc cgtggctttt tggatgccct agaccatgca 240
ggttattctg gactttatga a 261
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcugcggg ugggcggga 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggacugcgug ugagcggga 19
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaaagacga tgacgacaag atgaccaccg agcagcgacg 40
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcacaggga tgccacccgg tttggacatt tctgctggat c 41
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atactcgaga tgaccaccga gcagcgacg 29
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ataaagcttt ttggacattt ctgctggatc 30
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acaaagacga tgacgacaag atgaccaccg agcagcgacg 40
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcacaggga tgccacccgg tttcaaagtt ttgggccag 39
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atactcgaga tgaccaccga gcagcgacg 29
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ataaagcttt ttcaaagttt tgggccag 28
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggcugcggg ugggcggga 19
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acccgcagcc cucccgccca cc 22
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gggcugcggg ugggcggga 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
raycactccc ctgtgaggaa c 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgrtgcacgg tctacgagac ctc 23
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaagatggtg atgggatttc 20

Claims (10)

1.一种抗病毒多肽，其特征在于，所述抗病毒多肽为视黄酸诱导基因1的半胱天冬酶激活募集结构域(2CARDs)，所述抗病毒多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求1所述的抗病毒多肽的编码基因。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
4.一种含有权利要求2-3任一所述的编码基因的载体。
5.一种含有权利要求4所述载体的宿主菌。
6.根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为DH5α、Top10、BL21和Rosetta中的一种。
7.一种含有权利要求4所述载体的细胞系。
8.一种权利要求1所述的抗病毒多肽、权利要求2-3任一所述的核酸分子或权利要求4所述的载体或者权利要求5-6任一所述的宿主菌或权利要求7所述的细胞系在制备抗病毒药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗病毒药物包括含有G4结构的病毒。
10.一种抗病毒的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括如权利要求1所述的抗病毒多肽。
CN202110721461.8A 2021-06-28 2021-06-28 Rig-i的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用 Active CN113480611B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110721461.8A CN113480611B (zh) 2021-06-28 2021-06-28 Rig-i的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110721461.8A CN113480611B (zh) 2021-06-28 2021-06-28 Rig-i的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113480611A true CN113480611A (zh) 2021-10-08
CN113480611B CN113480611B (zh) 2022-12-02

Family

ID=77936379

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110721461.8A Active CN113480611B (zh) 2021-06-28 2021-06-28 Rig-i的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113480611B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114617960A (zh) * 2022-03-17 2022-06-14 北京大学 调节ptir1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103173455A (zh) * 2012-08-09 2013-06-26 中国农业科学院上海兽医研究所 一种具有抗新城疫病毒活性的鹅源基因rig-i及其应用
CN110325545A (zh) * 2016-12-20 2019-10-11 巴塞尔大学 基于减毒细菌的蛋白递送

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103173455A (zh) * 2012-08-09 2013-06-26 中国农业科学院上海兽医研究所 一种具有抗新城疫病毒活性的鹅源基因rig-i及其应用
CN110325545A (zh) * 2016-12-20 2019-10-11 巴塞尔大学 基于减毒细菌的蛋白递送

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVAKOWALINSKI等: "Structural Basis for the Activation of Innate Immune Pattern-Recognition Receptor RIG-I by Viral RNA", 《CELL》 *
JI-SEUNG YOO等: "DHX36 Enhances RIG-I Signaling by Facilitating PKR Mediated Antiviral Stress Granule Formation", 《PLOS PATHOGENS》 *
SHAO-RU WANG等: "A highly conserved G-rich consensus sequence in hepatitis C virus core gene represents a new anti–hepatitis C target", 《SCIENCE ADVANCES》 *
WEN-XIU BIAN等: "Binding of cellular nucleolin with the viral core RNA G-quadruplex structure suppresses HCV replication", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
XIAOQIANG SUN等: "A Hierarchical Mechanism of RIG-I Ubiquitination Provides Sensitivity, Robustness and Synergy in Antiviral Immune Responses", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
YI-WU,S.: "RNA helicase [Homo sapiens]", 《NCBI GENEBANK》 *
张丽丽等: "RIG-I蛋白2CARD结构域真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达定位", 《齐齐哈尔医学院学报》 *
田沺等: "G-四链体RNA作为新型抗丙肝病毒靶标的研究", 《 中国化学会第30届学术年会摘要集-第二十八分会：化学生物学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114617960A (zh) * 2022-03-17 2022-06-14 北京大学 调节ptir1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113480611B (zh) 2022-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lin et al. Heterogeneous nuclear ribonuclear protein K interacts with the enterovirus 71 5′ untranslated region and participates in virus replication
Zeng et al. Leveraging mRNA sequences and nanoparticles to deliver SARS‐CoV‐2 antigens in vivo
Krieger et al. Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations
CN110628955B (zh) 一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统
Chen et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of membrane protein genes of porcine epidemic diarrhea virus isolates in China
Geyer et al. Structure of the anchor-domain of myristoylated and non-myristoylated HIV-1 Nef protein
Suzuki et al. Nuclear localization of the truncated hepatitis C virus core protein with its hydrophobic C terminus deleted
Mackintosh et al. Structural and biological identification of residues on the surface of NS3 helicase required for optimal replication of the hepatitis C virus
Dolan et al. Identification and comparative analysis of hepatitis C virus–host cell protein interactions
US20100316989A1 (en) Method for screening an inhibitory agent of hbv proliferation by using the interaction between hbv capsid and surface proteins based on cellular imaging
Yang et al. Nanomolar inhibition of SARS-CoV-2 infection by an unmodified peptide targeting the prehairpin intermediate of the spike protein
CN113480611B (zh) Rig-i的半胱天冬酶激活募集结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用
Yamada et al. Full-length sequence of the genome of hepatitis C virus type 3a: comparative study with different genotypes
Zhuang et al. A bacteriophage-related chimeric marine virus infecting abalone
CN112794895A (zh) 外源性atg10s蛋白在制备抗病毒药物中的应用
CN113527522A (zh) 一种新冠病毒三聚体重组蛋白、DNA、mRNA及应用和mRNA疫苗
Liu et al. Screening and rational design of hepatitis C virus entry inhibitory peptides derived from GB virus A NS5A
Gozdek et al. NS3 Peptide, a novel potent hepatitis C virus NS3 helicase inhibitor: its mechanism of action and antiviral activity in the replicon system
CN113480612B (zh) Rig-i的c末端结构域抗病毒多肽、载体及其在制备抗病毒药物中的应用
Kato et al. Hepatitis C virus population dynamics in human lymphocytes and hepatocytes infected in vitro.
Li et al. Rational design of peptides with anti‐HCV/HIV activities and enhanced specificity
CN109810959B (zh) 一种与keap1结合并调节nrf2蛋白稳定性的蛋白多肽
Ciccaglione et al. Mutagenesis of hepatitis C virus E1 protein affects its membrane-permeabilizing activity
Xiao et al. Characterization of the N-terminal domain of classical swine fever virus RNA-dependent RNA polymerase
CN107209188A (zh) 用于检测人Pegivirus 2 (HPgV‑2)的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant