CN114617960A

CN114617960A - 调节ptir1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用

Info

Publication number: CN114617960A
Application number: CN202210263482.4A
Authority: CN
Inventors: 尹玉新; 吕丹; 宋佳
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2022-03-17
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2022-06-14

Abstract

本发明涉及抑制PTIR1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用，属于药物制备技术领域。本发明提供了抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达能够促进细胞的抗原呈递能力，最终增强肿瘤免疫治疗的有效性。

Description

调节PTIR1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及抑制(负向调节)PTIR1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。

背景技术

RIG-I(retinoic acid-inducible gene-I)是定位在细胞浆中的双链RNA感受器。RIG-I蛋白由925个氨基酸组成，分子量为106kDa，包括N端两个CARD结构，中间的两个RNAHelicase结构域以及位于C端的CTD结构域。在静息状态下，RIG-I N端的CARD结构域被折叠在内部，不能发挥功能，在病毒感染过程中，RIG-I与病毒双链RNA结合，并暴露出CARD结构域。暴露出N端的RIG-I能够发生K63类型泛素化，并与定位于线粒体的MAVS等发生相互作用，进而激活转录因子IRF3，促进一型干扰素和其他促炎因子的转录，从而起到抗病毒的作用。除了在抗病毒免疫中发挥重要作用外，在肝癌中，RIG-I也表现出抑制肿瘤生长的功能。

肿瘤细胞对免疫治疗敏感性不高是目前肿瘤免疫治疗亟待解决的难题。在临床上，对PD-1/PD-L1单克隆抗体敏感的患者仅占15％～20％。作为T细胞活化的第一信号，T细胞受体-主要组织相容复合物(TCR-MHC)对于T细胞增殖并发挥功能起着不可或缺的作用。肿瘤细胞免疫原性的降低会导致其逃逸宿主免疫系统的攻击，从而促进了肿瘤的生长。目前，缺少一种可以增强肿瘤细胞对免疫治疗敏感性的生物学靶点及相关靶向药物。

免疫增强剂，是一类通过非特异性途径提高机体对抗原或微生物特异性反应的物质。自1925年法国免疫学家兼兽医Gasotn Rmaon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗反应以来，在医学和兽医学领域中，许多国家都不同程度地开展了这方面的研究。

现在WTO与世界各国认为免疫增强剂一般有以下特点：(1)诱导合适的免疫应答；(2)增强疫苗的粘膜传递；(3)增强细胞免疫；(4)增强弱免疫原的免疫原性，如高度纯化的抗原或重组抗原；(5)减少抗原接种剂量和接种次数；(6)促进疫苗对在弱免疫力人群的免疫效果；(7)增加免疫应答的速度和持续时间，调节抗体的亲和力及特异性，促进抗病毒感染药物的筛选研究。到目前为止，已有数百种天然和合成的物质被证实具有免疫增强剂的活性，但因为安全性等问题，用于临床的免疫增强剂鲜有报道。目前仍缺乏用于肿瘤免疫治疗的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供抑制PTIR1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达能够促进细胞的抗原呈递能力，最终增强肿瘤免疫治疗的有效性。

本发明提供了抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用，所述PTIR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PTIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述抑制PTIR1蛋白表达的试剂包括抑制ADAR1-p110蛋白表达的试剂，所述抑制PTIR1基因表达的试剂包括抑制ADAR1-p110基因表达的试剂。

优选的是，所述抑制ADAR1-p110蛋白或ADAR1-p110基因表达的试剂包括全反式维甲酸。

优选的是，所述抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂包括全反式维甲酸。

优选的是，所述肿瘤包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌和/或前列腺癌。

本发明还提供了检测PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂在制备肿瘤诊断和/或预后判断的产品中的应用，所述PTIR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PTIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述肿瘤诊断和/或预后判断包括肿瘤对免疫治疗敏感性的诊断和/或预后判断。

优选的是，所述检测PTIR1基因表达的试剂包括引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选的是，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。

本发明提供了抑制PTIR1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。本发明鉴定到PTIR1在肿瘤中特异性表达，并发现PTIR1可以作为肿瘤免疫逃逸的标志物，及其作为肿瘤患者不良预后的标志物。本发明还发现，PTIR1通过激活去泛素化酶UCHL5，从而限制肿瘤细胞中蛋白酶体的活性，降低癌抗原的加工和呈递，最终降低T淋巴细胞对肿瘤抗原的识别能力。本发明能够通过抑制PTIR1信号通路，能够增强肿瘤免疫治疗效果。

试验结果表明，肿瘤细胞中PTIR1基因能够在干扰素诱导下上调表达。PTIR1通过激活UCHL5，限制蛋白酶体活性，降低癌抗原的抗原呈递。过表达PTIR1的肿瘤细胞能够逃逸宿主免疫系统的攻击，从而促进肿瘤生长。并且过表达PTIR1的肿瘤细胞对免疫治疗敏感度下降。本发明鉴定到全反式维甲酸可以通过抑制ADAR1-p110基因转录，从而限制PTIR1-UCHL5-蛋白酶体活性，增强宿主的免疫监视，提高肿瘤免疫治疗效果。因此，PTIR1可以作为免疫治疗新靶点，全反式维甲酸可以作为潜在的治疗手段，提高肿瘤细胞对免疫治疗的敏感性。

附图说明

图1为本发明提供的分子量低于RIG-I的未知蛋白PTIR1的检测结果图；

图2为本发明提供的质谱鉴定PTIR1结果图；

图3为本发明提供的PTIR1基因组、mRNA及蛋白质分析结果图；

图4为本发明提供的半定量PCR鉴定PTIR1结果图；

图5为本发明提供的结肠癌中PTIR1的表达结果图；

图6为本发明提供的肺癌、乳腺癌以及前列腺癌中PTIR1的表达结果图；

图7为本发明提供的与RIG-I pre-mRNA结合蛋白的质谱鉴定结果图；

图8为本发明提供的ADAR-p110促进PTIR1的产生结果图；

图9为本发明提供的ADAR1与RIG-I RNA的第三个内含子相互作用结果图；

图10为本发明提供的ADAR1敲低抑制RIG-I-Short的产生结果图；

图11为本发明提供的RIG-I第三个内含子发生RNA编辑位点结果图；

图12为本发明提供的PTIR1表达质粒示意图；

图13为本发明提供的A285G突变对于PTIR1产生的影响结果图；

图14为本发明提供的A285G突变对于RIG-I RNA二级结构影响结果图；

图15为本发明提供的A285G突变对于RIG-I RNA与剪切因子结合的影响结果图；

图16为本发明提供的PTIR1对小鼠皮下肿瘤生长的影响结果图；

图17为本发明提供的GSEA分析PTIR1调控的基因表达谱；

图18为本发明提供的流式细胞分析肿瘤浸润T细胞的比例结果图；

图19为本发明提供的敲除肿瘤细胞PD-L1表达对PTIR1成瘤作用的影响结果图；

图20为本发明提供的T细胞过继转移对PTIR1成瘤作用的影响结果图；

图21为本发明提供的肿瘤疫苗治疗对PTIR1成瘤作用的影响结果图；

图22为本发明提供的体外T细胞杀伤实验结果图；

图23为本发明提供的蛋白质免疫印迹检测OVA的蛋白水平，半定量PCR检测OVA的mRNA水平和基因组拷贝数结果图；

图24为本发明提供的蛋白质稳定性分析实验结果图；

图25为本发明提供的蛋白质谱定量分析蛋白表达水平结果图；

图26为本发明提供的蔗糖密度梯度离心结合蛋白质谱分析实验结果图；

图27为本发明提供的蛋白酶体的荧光底物检测实验结果图；

图28为本发明提供的流式细胞术检测细胞表面MHC表达水平结果图；

图29为本发明提供的免疫沉淀结合蛋白质谱分析实验鉴定PTIR1相互作用蛋白结果图；

图30为本发明提供的蛋白酶体的荧光底物检测实验结果图；

图31为本发明提供的流式细胞术检测细胞表面MHC表达水平结果图；

图32为本发明提供的AlphaFold软件对PTIR1与UCHL5蛋白相互作用的晶体结构分析结果图；

图33为本发明提供的去泛素化酶底物检测实验结果图；

图34为本发明提供的GSEA分析PTIR1调控蛋白表达的富集性分析结果图；

图35为本发明提供的流式细胞术检测细胞表面MHC表达水平结果图；

图36为本发明提供的半定量PCR检测不同浓度ATRA对PTIR1产生的影响结果图；

图37为本发明提供的实时定量PCR检测不同浓度ATRA处理细胞后ADAR1mRNA的水平结果图；

图38为本发明提供的Western Blot检测维甲酸处理对不同ADAR1家族成员表的影响结果图；

图39为本发明提供的荧光素酶报告基因技术分析ATRA对ADAR1转录的影响结果图；

图40为本发明提供的整体研究思路的汇总图。

具体实施方式

本发明提供了抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用，所述PTIR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MTTEQRRSLQAFQDYIRKTLDPTYILSYMAPWFREEEVQYIQAEKNNKGPMEAATLFLKFLLELQEEGWFRGFLDALDHAGYSGLYEAIESWDFKKIEKLEEYRLLLKRLQPEFKTRIIPTDIISDLSECLINQECEEILQV，所述PTIR1基因的核苷酸序列(编码所述PTIR1蛋白的mRNA)如SEQ ID NO.2所示：augaccaccgagcagcgacgcagccugcaagccuuccaggauuauauccggaagacccuggacccuaccuacauccugagcuacauggcccccugguuuagggaggaagaggugcaguauauucaggcugagaaaaacaacaagggcccaauggaggcugccacacuuuuucucaaguuccuguuggagcuccaggaggaaggcugguuccguggcuuuuuggaugcccuagaccaugcagguuauucuggacuuuaugaagccauugaaaguugggauuucaaaaaaauugaaaaguuggaggaguauagauuacuuuuaaaacguuuacaaccagaauuuaaaaccagaauuaucccaaccgauaucauuucugaucugucugaauguuuaauuaaucaggaaugugaagaaauucuacagguauaa。本发明首次鉴定到维甲酸诱导蛋白I(RIG-I)新的剪切亚型——PTIR1，并发现PTIR1在包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌以及前列腺癌中特异性上调表达，结合临床信息进行分析，发现表达PTIR1的肠癌患者预后较差。通过小鼠肿瘤模型研究发现，PTIR1能够抑制宿主免疫监视，促进肿瘤的免疫逃逸，最终加重肿瘤恶行转化，因此，本发明将RIG-I新亚型定义为肿瘤免疫逃逸促进因子1(Promoter of Tumor Immune Resistance 1，PTIR1)。本发明发现，在人源肿瘤细胞中，I型干扰素以及II型干扰素可以特异性诱导PTIR1的表达。在人源肿瘤细胞中RIG-I蛋白N端特异性抗体能够识别大小为17kDa的一个蛋白，结合其具有促进肿瘤细胞免疫逃逸的能力，此蛋白即为PTIR1，为RIG-I的一个新亚型。与RIG-I转录本不同，PTIR1的mRNA序列缺少了RIG-I的第四个外显子，开放阅读框的移位导致RIG-I翻译的提前终止。因此，PTIR1仅包含N端第一个完整的CARD结构域。在本发明中，ADAR1-p110能够促进PTIR1的产生。ADAR1与RIG-I pre-mRNA的第三个内含子存在相互作用。本发明生物学功能实验发现，PTIR1可以通过激活去泛素化酶UCHL5，从而抑制肿瘤细胞蛋白酶体的活性，降低肿瘤抗原的加工和随后的呈递，最终实现肿瘤细胞免疫逃逸。抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达能够促进细胞的抗原呈递能力，最终增强肿瘤免疫治疗的有效性。

在本发明中，所述抑制PTIR1蛋白表达的试剂优选包括抑制ADAR1-p110蛋白表达的试剂，所述抑制PTIR1基因表达的试剂优选包括抑制ADAR1-p110基因表达的试剂；所述ADAR1-p110蛋白的和ADAR1-p110基因ID号是NM_001025107.3。本发明发现，RNA特异性腺苷脱氨酶1-P110亚型(ADAR1-p110)基因对肿瘤细胞中PTIR1的生成是必不可少的，通过编辑前体RNA的A-to-I，从而诱导RIG-I新亚型(PTIR1)的生成。抑制ADAR1-p110的表达能够实现PTIR1的抑制。

在本发明中，所述抑制ADAR1-p110蛋白或ADAR1-p110基因表达的试剂优选包括全反式维甲酸。全反式维甲酸可以通过抑制ADAR1-p110基因的转录，抑制具有免疫调节功能的PTIR1基因的表达，从而促进细胞的抗原呈递能力，最终增强肿瘤免疫治疗的有效性。本发明首次发现，收集被不同浓度全反式维甲酸处理的HEK293T细胞，提取RNA，通过实时定量PCR实验检测细胞中ADAR1-p110基因的表达水平。结果显示，全反式维甲酸可以明显抑制ADAR1-p110基因的转录。

在本发明中，所述抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂优选包括全反式维甲酸。全反式维甲酸通过抑制PTIR1信号通路的激活，增强肿瘤免疫治疗效果。全反式维甲酸作为维生素A的中间代谢产物，可以上调RIG-I基因的转录。本发明首先在HEK293T细胞中，分别加入干扰素β、全反式维甲酸以及两者同时加入到细胞中。结果显示，全反式维甲酸不仅没有像干扰素那样促进PTIR1基因的表达，还可以减弱干扰素对PTIR1基因的促进作用。为了进一步验证上述结果，本发明分别在HEK293T细胞中，加入干扰素β的同时，逐步增加全反式维甲酸的浓度，处理24小时；结果显示，随着全反式维甲酸浓度的增加，由干扰素β诱导的PTIR1转录上调水平被逐步的减弱。

在本发明中，所述肿瘤优选包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌和/或前列腺癌。

本发明还提供了检测PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂在制备肿瘤诊断和/或预后判断的产品中的应用，所述PTIR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PTIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，肿瘤诊断和/或预后情况的判断通过测定样本中PTIR1蛋白或PTIR1基因的表达水平，并与相对应的癌旁、正常组织中的表达水平相比上调而确定。在本发明中，所述肿瘤诊断和/或预后判断包括肿瘤对免疫治疗敏感性的诊断和/或预后判断。在本发明中，所述免疫治疗优选包括抗PD-1治疗、T细胞过继转移及肿瘤疫苗。PTIR1能够用于构建预测肿瘤的计算模型。在本发明中，所述产品优选包括制剂、芯片或试剂盒。在本发明中，所述PTIR1蛋白或PTIR1基因的表达水平的检测方法优选包括测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术。在本发明中，所述核酸扩增技术优选包括半定量PCR。在本发明中，所述检测PTIR1基因表达的试剂包括引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3(5′-ttggagctccaggaggaa-3′)和SEQ ID NO.4(5′-cacaacctgtaggagcaca-3′)所示。

在本发明中，所述半定量PCR的扩增体系和扩增程序优选如表1和表2所示。

表1半定量PCR扩增体系

表2半定量PCR扩增程序

在本发明中，术语“表达水平”指生物字样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“编码基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体5RNA、miRNA、lncRNA、circRNA)。

下面结合具体实施例对本发明所述的抑制PTIR1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

PTIR1是干扰素诱导表达的RIG-I可变剪切

(1)PTIR1蛋白序列和mRNA序列的鉴定

RIG-I是一个典型的干扰素刺激基因，在病毒感染以及干扰素刺激情况下会上调表达，通过Western blotting以及定量实时PCR实验，本发明验证了这一结果。凝胶电泳实验结果显示：在人源细胞系(HCT116人肠癌细胞系、SW480人肠癌细胞系以及H460人肺癌细胞系)中，采用干扰素γ刺激，不同时间点分别采用RIG-I蛋白N端特异性抗体进行检测，结果显示抗RIG-I抗体不仅可以识别全长RIG-I(又称DDX58)蛋白(分子量为105kDa)，而且还能够识别出17kDa大小的蛋白(图1，未知蛋白PTIR1的检测结果图，凝胶电泳内参选用管家基因GAPDH，为了判断干扰素γ有效性，本发明选用干扰素γ下游蛋白STAT1以及其磷酸化修饰STAT1的抗体进行检测)。

为了进一步确定RIG-I蛋白N端抗体识别条带对应蛋白质是RIG-I亚型，本发明用仙台病毒感染H460细胞，并在24小时以及48小时利用RIG-I蛋白N端抗体富集蛋白，并通过蛋白质凝胶电泳分离不同大小蛋白，将纯化的17kDa条带进行质谱分析，LC-MS/MS捕捉到了RIG-I蛋白N端的序列，这一结果证实RIG-I蛋白N端抗体识别的17kDa位置的蛋白确实为RIG-I的一个新亚型，本发明将其命名为PTIR1(图2，质谱鉴定PTIR1结果图，24小时处理的蛋白泳道中加框标注的是全长RIG-I蛋白，右侧展示的是蛋白质谱检测到的RIG-I蛋白的五个肽段(从上到下氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5～9所示)；48小时处理的蛋白泳道中加框标注的是PTIR1蛋白，右侧展示的是蛋白质谱检测到的PTIR1蛋白的一个肽段，SEQ IDNO.10)。

为了确定PTIR1的核苷酸序列，在病毒感染条件下，提取细胞总RNA，并对逆转录后的cDNA进行测序分析，本发明发现与RIG-I转录本不同，PTIR1的mRNA序列缺少了RIG-I的第四个外显子，开放阅读框的移位导致RIG-I翻译的提前终止。因此，PTIR1仅包含N端第一个完整的CARD结构域和部分第二个CARD结构域(图3，PTIR1基因组、mRNA及蛋白质分析结果图)。

由于PTIR1与RIG-I转录本不同，本发明利用特异性引物进行半定量PCR实验来鉴定PTIR1，并验证了PTIR1在干扰素刺激下的上调表达(图4，半定量PCR鉴定PTIR1结果图，图4上图显示，干扰素γ处理不同的时间点，RIG-I(DDX58)的表达呈现出先升高后降低的情况；而PTIR1的表达则呈现出随着干扰素γ处理快速上调的情况，NC指的是阴性对照，本发明选用的内参是管家基因GAPDH；图4下图显示干扰素β也和干扰素γ一样，特异性诱导PTIR1的表达)。同时，本发明通过半定量PCR实验检测了多种肿瘤及癌旁组织中PTIR1的表达情况，包括了结直肠癌、肺癌、乳腺癌以及前列腺癌。结果显示PTIR1在多种肿瘤组织中特异性高水平表达(图5，结直肠癌中PTIR1的表达结果图，本发明收集了122份结直肠癌组织(T)以及癌旁正常组织(N)，采用同时识别PTIR1以及RIG-I的引物，由于PTIR1基因缺失4号外显子，因此PCR扩增片段较小的为PTIR1基因，而大分子量的PCR片段为RIG-I基因，结果显示癌旁正常组织(N)中仅表达RIG-I，而结直肠癌组织(T)中存在以下几种情况，即仅表达RIG-I型，既表达RIG-I又表达PTIR1型以及仅表达PTIR1型癌组织)；和图6肺癌、乳腺癌以及前列腺癌中PTIR1的表达结果图，其中，a为PTIR1在肺癌表达情况的检测(共28例癌组织(T)和癌旁正常组织(N))，b为PTIR1在乳腺癌表达情况的检测(共8例癌组织和癌旁正常组织)，c为PTIR1在前列腺癌中表达情况的检测(共17例癌组织和癌旁正常组织)，PC代表阳性对照，即采用干扰素γ处理的SW480细胞的cDNA；NC代表阴性对照，即采用双蒸水)。

(2)ADAR1介导的RNA编辑导致PTIR1的产生

PTIR1与RIG-I的基因组序列相同，但是mRNA序列不同，因此PTIR1是RIG-I一种新的剪切体。考虑到这种RNA剪接特异性发生在pre-mRNA阶段，为了探究影响RIG-I剪切的机制，本发明通过外源RNA pulldown实验，用生物素标记的外源转录的RNA与细胞裂解液共孵育，富集RNA结合蛋白后利用质谱鉴定的方式寻找与RIG-I基因pre-mRNA相互作用的蛋白。质谱鉴定到一系列RNA结合蛋白，例如：ADAR1，IGF2BP1，SRSF1，SRSF3等(图7，RIG-Ipre-mRNA结合蛋白的质谱鉴定结果图，sense指的是生物素标记的RIG-I基因pre-mRNA，而antisense指的是和RIG-I基因pre-mRNA序列相反(A变为U；C变成G)的RNA序列，通过生物素富集以及质谱分析，结果显示包括ADAR1，IGF2BP1，SRSF6，SRSF1，SRSF9以及SRSF3在内的多种蛋白可以和RIG-I基因pre-mRNA发生相互作用。尤其是ADAR1，质谱结果显示，有5个ADAR1多肽(从上到下氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11～15所示)被检测到，说明其与RIG-I基因pre-mRNA相互作用亲和力最高)。值得注意的是，研究发现ADAR1包括两个家族成员，分别是ADAR1-p150以及ADAR1-p110。为了进一步确定上述蛋白对RIG-I基因剪接的影响，本发明在细胞中过表达上述蛋白，发现只有ADAR1-p110能够促进PTIR1的产生，而其他蛋白则不能促进干扰素诱导的PTIR1产生(图8，ADAR-p110促进PTIR1的产生结果图)。本发明通过CLIP实验(图9左图)以及外源RNA pulldown实验(图9右图)进一步确定了ADAR1与RIG-I pre-mRNA的第三个内含子存在相互作用(图9左图进一步证实ADAR1和RIG-I pre-mRNA存在相互作用；图9右图显示，ADAR1和RIG-I pre-mRNA的第三个内含子相互作用)。

为了探究ADAR1对PTIR1产生的必要性，本发明接下来利用ADAR1基因敲低细胞系，通过半定量PCR以及Western blotting实验验证了在ADAR1缺失的情况下，PTIR1不能产生(图10，ADAR1敲低抑制PTIR1的产生结果图，图10左图PCR结果显示，随着仙台病毒(SeV)的刺激，对照组(Scramble)中，RIG-I(DDX58)的mRNA水平先升高后降低，而PTIR1的表达是逐步升高的表现；图10右图Western blotting显示，干扰素γ处理，RIG-I(DDX58)的蛋白水平先升高后降低，而PTIR1的表达是逐步升高的表现，无论是半定量PCR以及Westernblotting实验都采用管家基因GAPDH为内参)。因此，PTIR1的产生是依赖于ADAR1的。

作为双链RNA腺苷脱氨基酶，本发明随后验证了ADAR1促进PTIR1的产生是与ADAR1介导的RNA编辑有关的。将ADAR1与表达RIG-I第三个内含子的载体共同转染，用病毒感染48小时后对RIG-I第三个内含子进行测序，发现一系列腺嘌呤变为次黄嘌呤(在转录过程中次黄嘌呤被识别为鸟嘌呤)(图11，RIG-I第三个内含子发生RNA编辑位点结果图，结果显示，发生转变的腺嘌呤分别是125位的腺嘌呤、215位腺嘌呤、285位腺嘌呤、380位腺嘌呤、320位腺嘌呤以及303位腺嘌呤；不仅如此，上述转变还存在连续发生转变。通过多轮测序发现，共存在五种类型的转变，结果显示，这五种类型的转变的概率分别为37.5％(即125位和285位腺嘌呤同时发生转变的类型)，25％(即380位和285位腺嘌呤同时发生转变)，12.5％(215位、285以及320位腺嘌呤同时发生转变)，12.5％(303位腺嘌呤发生转变)以及12.5％(即没有发生转变的类型)。

为了进一步解析这些位点被编辑后对RIG-Ipre-mRNA剪切的影响，本发明构建了PTIR1表达质粒系统，考虑到这种RNA剪接特异性发生在第四个外显子，本发现特异性将第三个内含子和第四个内含子序列分别插入第四个外显子两侧，并在载体的N端加入FLAG标签，在载体的C端加入GFP标签，通过FLAG抗体和GFP抗体来检测RIG-I的表达状态，即FLAG抗体对RIG-I以及PTIR1均能识别，但是GFP抗体只能识别未剪切的RIG-I全长形式(图12，PTIR1表达质粒示意图)。在此载体的基础上，本发明将图11中所示腺嘌呤转变位点利用点突变的方式构建到图12所示载体中，并通过Western blotting实验检测，实验结果显示，首先在细胞中转染携带野生型(WT)的RIG-I的质粒，随后采用SeV处理，结果显示，SeV感染可以诱发RNA剪接，表现为蛋白质分子量从105kDa变成17kDa，这两组分别作为阴性对照以及阳性对照。随后，分别对比携带不同突变类型的RIG-I质粒，结果显示，单独点突变组(分别是A303G组、A285G组以及A380G组)只有A285G组可以诱发RNA剪接；而联合点突变组(分别是A125G及A285G组、A285G及A380G组、A215GA285GA320G组)都可以诱发RNA剪接，值得注意的是，这三种联合突变的共同点就是A285G的突变。本发明提示，位于RIG-I第三个内含子的A285位点的突变(A285G)是诱发RIG-I剪切亚型PTIR1产生的关键位点(图13)。

通过RNAfold数据库预测，本发明发现A285G突变对于RIG-I RNA二级结构影响很大，A285突变后破坏了原有的颈环结构(图14，A285G突变对于RIG-I RNA二级结构影响结果图)。一般而言，颈环结构为很多RNA结合蛋白提供潜在的结合位点，本发明随后利用外源RNA pulldown实验检测与A285位点突变的RIG-I pre-mRNA相结合的蛋白，结果表明A285突变后，RIG-Ipre-mRNA与剪切因子SRSF1以及SRSF3的结合减弱(图15，A285G突变对于RIG-IRNA与剪切因子结合的影响结果图，采用生物素标记的野生型RIG-Ipre-mRNA(Sense(WT))、A285G突变的RIG-I pre-mRNA(Sense(A285G))以及对照RNA(antisense)与SRSF1或者SRSF3共孵育，图15左图显示，SRSF1特异性与Sense(WT)，而无论是antisense还是A285G突变的RIG-I pre-mRNA都无法与SRSF1发生相互作用，同样的结果也在SRSF3上发生，即图15右图所示。综上所述，由ADAR1诱导的A285G可以破坏SRSF1与SRSF3这两个剪切因子与RIG-Ipre-mRNA相互作用，从而促进外显子跳跃诱导RNA剪接以及PTIR1的产生。因此ADAR1通过催化RIG-I pre-mRNA第三个内含子中A285位点腺嘌呤转变为此黄嘌呤，改变了RNA二级结构并抑制了RNA与剪切因子的相互作用，最终导致PTIR1的产生。

实施例2

PTIR1的生物学功能的检测

(1)PTIR1促进体内肿瘤生长并抵抗肿瘤免疫治疗

为了检测PTIR1的生物学功能，本发明在小鼠肠癌细胞系(CT26)中转染PTIR1，并构建稳定表达PTIR1细胞系。通过皮下接种肿瘤模型，发现过表达PTIR1可以促进肿瘤在小鼠体内的增殖(图16，PTIR1对小鼠皮下肿瘤生长的影响结果图)。本发明分别提取肿瘤组织的RNA，通过RNA测序技术结合GSEA分析，发现PTIR1的表达可以抑制肿瘤组织中免疫相关基因的表达(图17，GSEA分析PTIR1调控的基因表达谱，将RNA测序结果中差异性表达基因，根据GO数据集进行分析，结果显示，和免疫相关基因在对照组肿瘤中表达明显增高，此结果提示和对照肿瘤相比，PTIR1的表达明显限制宿主的免疫应答)。通过提取肿瘤中浸润免疫细胞进行分析，发现肿瘤中浸润T细胞比例明显减少(图18，流式细胞分析肿瘤浸润T细胞的比例结果图，提取肿瘤中浸润的免疫细胞，采用CD45、CD4以及CD8的抗体染色，流式细胞染色技术显示，CD45以及CD4双阳性的细胞(CD4⁺T细胞)比例，在对照组(Mock)中明显高于PTIR1表达的肿瘤；此外，CD45以及CD8双阳性的细胞(CD8⁺T细胞)比例也同样在对照组(Mock)中高)。为了证明PTIR1对肿瘤免疫治疗的影响，本发明采用shRNA，特异性敲低肿瘤细胞中的PD-L1(CD274)基因的表达。结果显示，无论在对照细胞(Scramble)还是在两种敲低CD274(shCD274-1^#和shCD274-2^#)细胞中，过表达PTIR1都可以促进肿瘤的生长。此结果提示，PD-L1信号通路的阻断无法影响表达PTIR1肿瘤的生长(图19)。为了进一步证明PTIR1对T细胞介导细胞杀伤作用的影响，本发明利用肿瘤特异性T细胞，采用小鼠T细胞过继转移技术，接种到荷瘤小鼠体内。结果显示，过表达PTIR1可以阻断T细胞介导的肿瘤杀伤作用(图20，T细胞过继转移对PTIR1成瘤作用的影响结果图，图20左图是实验流程图，即采用LCMVArmstrong病毒感染小鼠，从而诱导小鼠产生特异性识别LCMV抗原肽的T淋巴细胞，14天后，利用流式细胞分选技术，将病原特异性T细胞回输到荷瘤小鼠体内，荷瘤小鼠分为两类，分别是表达PTIR1的荷瘤小鼠以及不表达PTIR1的荷瘤小鼠，随后观察肿瘤的生长速度；图20右上显示，T细胞回输23天后的肿瘤大小；图20右下显示，回输T细胞后不同时间点肿瘤的体积)。此外，本发明还利用小鼠肿瘤模型实验，和其他的免疫治疗模型相同，过表达PTIR1可以抵消肿瘤疫苗介导的肿瘤杀伤作用(图21，肿瘤疫苗治疗对PTIR1成瘤作用的影响结果图，图21左图是实验流程图，即将使用100Gyγ射线照射的小鼠肺癌细胞(LLC)尾部皮下注射，从而诱导小鼠对LLC肿瘤产生免疫应答的能力，12天后，分别将表达PTIR1的LLC细胞以及不表达PTIR1的LLC细胞皮下接种到同一只小鼠的两侧，随后观察肿瘤的生长速度，为了确定免疫的效果，本发明还采用没有免疫的小鼠皮下接种两种LLC细胞；图20右图显示，接受肿瘤疫苗免疫的小鼠以及未接种疫苗小鼠对两种LLC细胞耐受程度)。综上所述，本发明首次发现了PTIR1具有较强的免疫抑制功能。

(2)PTIR1限制癌抗原的加工和呈递

为了分析PTIR1在肿瘤细胞和免疫细胞之间相互作用的影响，本发明采用共培养技术，将肿瘤特异性CD8⁺T细胞与表达鸡卵白蛋白(OVA)的肿瘤细胞共培养。结果显示，过表达PTIR1可以明显减低T细胞对肿瘤细胞的杀伤(图22，体外T细胞杀伤实验结果图，本发明将OT-I小鼠的CD8⁺T细胞(E)分别与共表达OVA以及PTIR1或者空载体(Mock)的LLC细胞(T)共培养，通过改变E细胞与T细胞的比例，本发明发现PTIR1可以明显限制T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力)。值得注意的是，尽管OVA的mRNA水平在表达PTIR1的肿瘤细胞中表达水平较低，但是OVA蛋白水平明显高于对照组(图23左图显示，本发明采用蛋白质免疫印迹实验发现，在表达PTIR1的细胞(LLC-PTIR1)中OVA的蛋白表达量明显高于对照组细胞(LLC-Mock)中OVA蛋白表达量，然而，图23右图显示，半定量PCR检测LLC-Mock细胞中OVA的mRNA水平和基因组拷贝数却显著高于表达PTIR1的LLC细胞)，从而提示PTIR1影响OVA蛋白的降解。为了进一步证明上述假设，本发明采用放线菌酮(CHX)处理细胞，限制蛋白质的重新合成。结果显示，过表达PTIR1明显减缓OVA蛋白的降解(图24，蛋白质稳定性分析实验结果图，图24左图是蛋白免疫印迹实验，显示和Mock组细胞相比，PTIR1的表达可以明显延长OVA蛋白的半衰期；图24右图是采用蛋白灰度扫描的统计分析结果，进一步验证上述结果)。不仅如此，本发明还利用蛋白质谱分析技术，发现PTIR1的表达可以降低组成蛋白酶体的多种关键组分(图25，蛋白质谱定量分析蛋白表达水平结果图，通过对表达存在差异的蛋白质含量进行富集性分析，本发明可以看到和蛋白酶体相关的蛋白组分在对照组(Mock)细胞中表达较高，相反，在表达PTIR1细胞组中表达相对较低)。通过蔗糖密度梯度离心结合蛋白质谱分析的方法，证明了PTIR1限制蛋白酶体的活性(图26，蔗糖密度梯度离心结合蛋白质谱分析实验结果图，左图是采用蛋白质凝胶电泳的结果，显示和Mock组细胞相比，表达PTIR1的细胞其经过蔗糖密度梯度离心后，富集到的蛋白酶体的组分较少；右图是采用质谱半定量分析的结果，进一步证明包括PSMA等构成蛋白酶体的关键组分在表达PTIR1的细胞中表达较低)。此外，本发明也采用多种蛋白酶体的荧光底物进行分析，进一步证明了PTIR1对蛋白酶体的抑制性作用(图27，蛋白酶体的荧光底物检测实验结果图，左图是采用20S蛋白酶体荧光底物Suc-LLVY-AMC进行检测图，分别在不同时间点，对比性分析，不处理或者IFNγ处理的两种条件下，Mock细胞和表达PTIR1细胞中蛋白酶体的活性，而MG132是蛋白酶体抑制剂处理的细胞，这组细胞作为一种阴性对照，结果显示IFNγ处理可以激活细胞中的蛋白酶体的活性，而PTIR1的表达可以明显抑制蛋白酶体的活性；右图是采用蛋白酶体荧光底物Z-LLE-AMC进行检测，分别在不同时间点，对比性分析，不处理或者IFNγ处理的两种条件下，Mock细胞和表达PTIR1细胞中蛋白酶体的活性，而MG132是蛋白酶体抑制剂处理的细胞，这组细胞作为一种阴性对照，结果显示IFNγ处理可以激活细胞中的蛋白酶体的活性，而PTIR1的表达可以明显抑制蛋白酶体的活性)。蛋白酶体介导的蛋白质降解，是细胞表面MHC-抗原肽复合体主要来源。蛋白酶体的功能受损可以限制细胞表面MHC-抗原肽复合体的表达。本发明采用流式细胞检测细胞表达MHC复合体的表达水平，结果显示，过表达PTIR1可以明显抵消II型干扰素诱导的MHC上调表达(图28，流式细胞术检测细胞表面MHC表达水平结果图，左图是通过抗H-2Kb抗体进行染色，之后采用流式细胞检测的结果；右图是通过定量细胞表面荧光强度的结果，这些结果显示，IFNγ处理可以明显促进细胞表面H-2Kb的表达，而PTIR1的表达可以抵消IFNγ对MHC上调表达的作用)。因此，本发现首次发现PTIR1可以通过影响肿瘤细胞蛋白酶体的活性，从而限制细胞表面MHC-抗原肽复合体的表达，最终实现肿瘤免疫逃逸。

(3)PTIR1通过激活去泛素化酶UCHL5限制蛋白酶体的活性

为了研究PTIR1抑制蛋白酶体功能的分子机制，本发明采用pulldown结合蛋白质谱分析技术。结果显示，PTIR1可以与多种蛋白酶体关键组分相互结合(图29，免疫沉淀结合蛋白质谱分析实验鉴定PTIR1相互作用蛋白结果图，本发明首先在细胞中过表达PTIR1-Flag载体，通过免疫沉淀结合蛋白质谱分析技术，鉴定到去泛素化酶UCHL5以及多种蛋白酶体关键组分(PSMD4，PSMD7等)都可以和PTIR1存在相互作用)。为了证明UCHL5参与PTIR1限制蛋白酶体活性的生物学过程，本发明采用shRNA敲低内源性UCHL5。结果显示，细胞中UCHL5的缺失明显破环了PTIR1对蛋白酶体的抑制性作用(图30，免疫蛋白酶体底物荧光素检测，即采用Ac-ANW-AMC荧光底物进行检测，本发明首先在Mock细胞或者过表达PTIR1的细胞中，分别敲除内源性UCHL5或者非特异性对照(scramble)，随后采用IFNγ处理上述细胞，通过在不同时间点提取细胞的裂解物，与底物相孵育，随后通过酶标仪进行检测，结果显示，在转染Scramble的Mock细胞和表达PTIR1细胞进行对比，发现PTIR1可以抑制细胞中免疫蛋白酶体的活性，而敲除细胞内源性UCHL5后，PTIR1这种抑制免疫蛋白酶体的能力受到明显破坏)。为了进一步判断UCHL5在PTIR1抑制宿主免疫应答过程中发挥关键作用，本发明采用流式细胞检测细胞表面HLA分子的表达实验，结果显示，UCHL5对PTIR1调控细胞表面HLA-A，B，C分子的表达至关重要(图31，流式细胞术检测细胞表面MHC表达水平结果图，本发明首先在Mock细胞或者过表达PTIR1的细胞中，分别敲除内源性UCHL5或者非特异性对照(scramble)，通过抗HLA-A，B，C抗体进行染色，再通过流式细胞进行分析，发现在不处理的条件下，敲除细胞中的UCHL5并不会改变细胞表面HLA-A，B，C的表达，然而，采用IFNγ处理后，在转染Scramble的Mock细胞和表达PTIR1细胞进行对比，发现PTIR1可以抑制细胞表面HLA-A，B，C分子的表达，而敲除细胞内源性UCHL5后，PTIR1这种抑制HLA-A，B，C分子表达的能力受到明显的破坏)，并增强细胞表面MHC-抗原肽复合体的表达)。由此可见，PTIR1通过激活UCHL5生物学功能，从而限制蛋白酶体的活性。

为了进一步分析PTIR1激活UCHL5生物学功能，本发明采用AlphaFold软件进行分析PTIR1与UCHL5互作的蛋白质结构。结果显示，PTIR1可以特异性与UCHL5的C端功能域结合，而且这种结合位点和ADRM1蛋白与UCHL5的结合位点相同(图32，AlphaFold软件对PTIR1与UCHL5蛋白相互作用的晶体结构分析结果图)。之前的研究发现，ADRM1可以通过与UCHL5的C端功能域结合，从而激活UCHL5的去泛素化酶活性。为了进一步证明上述结果，本发明采用UCHL5酶底物进行检测，结果显示，和ADRM1相同，PTIR1可以同样激活UCHL5的去泛素化酶活性(图33，去泛素化酶底物检测实验结果图，在去泛素化酶工作液中，加入去泛素化酶UCHL5以及底物Ub-AMC，随后分别PTIR1蛋白或对照蛋白(Control)，通过酶标仪检测UCHL5酶活化水平；此外，本发明还采用ADRM1作为阳性对照，结果显示，在加入Control蛋白组，UCHL5并没有被活化，而对底物Ub-AMC无明显激活，而加入ADRM1则激活UCHL5的去泛素化酶作用，表现为较高的荧光值，而PTIR1类似ADRM1，也发挥促进UCHL5的功能，激发了较高的荧光值)。

实施例3

半定量PCR检测ATRA对ADAR-PTIR1信号通路的影响

通过蛋白质谱分析表达PTIR1细胞系和对照细胞，结果显示，维甲酸信号通路在PTIR1表达细胞中明显受到抑制(图34，GSEA分析PTIR1调控蛋白表达的富集性分析结果图，通过对比对照细胞(Mock)以及表达PTIR1细胞中表达差异的蛋白进行富集性分析，结果显示与维甲酸信号通路有关的蛋白在Mock组细胞中表达较高，其中包括了NARS，ATP5D以及NUP62等)。本发明发现，在细胞中加入全反式维甲酸可以明显提高细胞表面MHC-抗原肽复合体的表达(图35，流式细胞术检测细胞表面MHC表达水平结果图，上面图显示，本发明采用IFNγ多次处理细胞，最后再采用维甲酸处理细胞，通过流式细胞检测细胞表面HLA-A，B，C的表达情况，对比维甲酸对细胞抗原呈递的影响；左下图显示，采用流式细胞检测的结果，而右下图是计算平均荧光强度的结果，结果显示，IFNγ首次加入可以促进细胞表面HLA-A，B，C分子的表达，然而反复刺激将逐渐降低细胞对IFNγ的敏感性，值得注意的是，维甲酸处理可以重新恢复细胞对IFNγ的敏感性)。值得注意的是，全反式维甲酸可以明显抑制PTIR1的表达(图36，半定量PCR检测不同浓度ATRA对PTIR1产生的影响结果图，左图是DNA琼脂糖电泳结果；右图是灰度扫描结果，以上结果显示，IFNβ的处理可以诱导PTIR1的产生，然而，随着添加维甲酸浓度逐渐升高，IFNβ诱导PTIR1产生的效果则被抵消)。考虑到ADAR-p110对PTIR1表达的关键作用，研究人员推测维甲酸具有抑制ADAR-p110活性。为了进一步验证研究人员的推测，通过实时定量PCR检测手段，发现全反式维甲酸可以抑制ADAR1-p110的mRNA水平(图37，实时定量PCR检测不同浓度ATRA处理细胞后ADAR1 mRNA(指的是ADAR1-p110的mRNA)的水平结果图)。通过Western blotting实验发现，全反式维甲酸特异性抑制ADAR-p110的表达(图38，Western Blot检测维甲酸处理对不同ADAR1家族成员表的影响结果图，本发明分别采用三种细胞系进行实验，分别是肺癌细胞系H460，肠癌细胞系HCT116以及人胚胎肾细胞系HEK293T进行实验，分别采用不同浓度的维甲酸(ATRA)处理上述细胞系24小时(hrs)以及48hrs，随后采用蛋白质免疫印迹实验进行分析，采用抗ADAR抗体进行检测，结果显示，在无维甲酸处理的条件下，三种细胞系中ADAR1家族成员的表达，主要是以ADAR1-p110为主，ADAR1-p150的表达量较低；然而随着维甲酸的处理，细胞中ADAR1-p110表达水平明显受到抑制；相反ADAR1-p150的表达量则不同程度的提高，三种细胞系都呈现出相似的趋势，本实验所使用的内参蛋白是GAPDH蛋白)。通过生物信息学分析，本发明发现，ADAR-p110启动子区含有一个保守的RARA：RXRG结合位点，相反，突变该位点则破坏了维甲酸对ADAR-p110转录抑制作用(图39，荧光素酶报告基因技术分析ATRA对ADAR1-p110以及ADAR1-p150转录的影响结果图，本发明分别将ADAR1-p110以及ADAR1-p150基因的启动子区克隆到pGL3-promoter载体中，采用不同浓度维甲酸进行处理，左图显示的是携带ADAR1-p110基因的启动子的报告基因产生的荧光素酶的活性，右图是携带ADAR1-p150基因的启动子的报告基因产生的荧光素酶的活性，结果显示，维甲酸对ADAR1-p110基因发挥着抑制性作用，而对ADAR1-p150基因则展现出不同程度的促进作用)。综上所述，本发明鉴定到全反式维甲酸可以作为ADAR-p110特异性抑制剂，通过限制PTIR1-UCHL5信号通路，增强肿瘤细胞蛋白酶体活性，最终增强肿瘤细胞的免疫源性，提高抗肿瘤免疫治疗的效果(图40，即维甲酸通过影响ADAR1-p110-PTIR1-UCHL5信号通路，从而影响癌抗原加工和处理，最终提高肿瘤细胞免疫原性的模式图)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 调节PTIR1表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile

1 5 10 15

Arg Lys Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp

20 25 30

Phe Arg Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys

35 40 45

Gly Pro Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu

50 55 60

Gln Glu Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala

65 70 75 80

Gly Tyr Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro

100 105 110

Glu Phe Lys Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser

115 120 125

Glu Cys Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Val

130 135 140

<210> 2

<211> 429

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

augaccaccg agcagcgacg cagccugcaa gccuuccagg auuauauccg gaagacccug 60

gacccuaccu acauccugag cuacauggcc cccugguuua gggaggaaga ggugcaguau 120

auucaggcug agaaaaacaa caagggccca auggaggcug ccacacuuuu ucucaaguuc 180

cuguuggagc uccaggagga aggcugguuc cguggcuuuu uggaugcccu agaccaugca 240

gguuauucug gacuuuauga agccauugaa aguugggauu ucaaaaaaau ugaaaaguug 300

gaggaguaua gauuacuuuu aaaacguuua caaccagaau uuaaaaccag aauuauccca 360

accgauauca uuucugaucu gucugaaugu uuaauuaauc aggaauguga agaaauucua 420

cagguauaa 429

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggagctcc aggaggaa 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacaacctgt aggagcaca 19

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Glu Ser Phe Val Val Glu Asp Ile Ala Thr Gly Val Gln Thr Leu

1 5 10 15

Tyr Ser Lys

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Gly Gly Ser Ser Gly Pro Leu Pro Gln Val Ile Gly Leu Thr Ala

1 5 10 15

Ser Val Gly Val Gly Asp Ala Lys

20

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

His Asn Leu Glu Glu Leu Glu Gln Val Val Tyr Lys Pro Gln Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln His Pro Tyr Asn Met Ile Met Phe Asn Tyr Leu Asp Gln Lys

1 5 10 15

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Ala Gly Phe Asp Glu Ile Glu Gln Asp Leu Thr Gln Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Ile Met Glu Met Pro Ser Phe Tyr Ser His Gly Leu Pro Arg

1 5 10 15

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ala Arg Asp Ile Asn Ala Val Leu Ile Asp Met Glu Arg

1 5 10

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Cys Phe Asn Thr Leu Thr Asn Ser Phe Gln Pro Ser Leu Leu Gly Arg

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Met Gly Tyr Gly Asn Trp Ile Ser Lys Pro Gln Glu Glu Lys

1 5 10 15

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Ser Glu Asp Met Gly Val Val Val Ser Leu Gly Thr Gly Asn Arg

1 5 10 15

Claims

1.抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用，所述PTIR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PTIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制PTIR1蛋白表达的试剂包括抑制ADAR1-p110蛋白表达的试剂，所述抑制PTIR1基因表达的试剂包括抑制ADAR1-p110基因表达的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制ADAR1-p110蛋白或ADAR1-p110基因表达的试剂包括全反式维甲酸。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂包括全反式维甲酸。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌和/或前列腺癌。

6.检测PTIR1蛋白或PTIR1基因表达的试剂在制备肿瘤诊断和/或预后判断的产品中的应用，所述PTIR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PTIR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤诊断和/或预后判断包括肿瘤对免疫治疗敏感性的诊断和/或预后判断。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测PTIR1基因表达的试剂包括引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。