CN113502329A

CN113502329A - 检测腺苷受体a2b表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN113502329A
Application number: CN202110782157.4A
Authority: CN
Inventors: 隋雨桐; 孟子愉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2021-10-15

Abstract

本发明涉及检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用，属于肺腺癌诊断试剂技术领域。检测腺苷受体A2B表达量的试剂能够用于制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒，本发明所述应用给出了通过抑制ADORA2B的方式治疗或预防肺腺癌的方法，为开发新的药物靶点提供了依据。

Description

检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及肺腺癌诊断试剂技术领域，具体涉及检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用。

背景技术

肺腺癌是肺癌的一种常见病理形式，肺腺癌死亡率高。肺腺癌的特征是存在起源于小气道并扩散到周围肺组织的异质性肿瘤。多器官转移是肺腺癌患者死亡的主要原因，转移可以在诊断后的几个月内迅速在不同的器官发生。放疗和化疗等传统方式对肺腺癌效果差，靶向基因治疗在肺腺癌的临床治疗中具有潜力。肺腺癌的发病机制复杂，主要涉及细胞周期调控和信号转导，表现为疾病不同发育阶段基因功能的改变，基因根据种族、性别和吸烟状况有不同表达。肺腺癌的新药靶点应该通过筛选与肿瘤形成和进展相关的基因网络来确定，但目前仍缺乏肺腺癌的有效新药靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用。本发明所述应用给出了通过抑制 ADORA2B的方式治疗或预防肺腺癌的方法，为开发新的药物靶点提供了依据。

本发明提供了检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/ 或预后试剂盒中的应用。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖的药物中的应用。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖标志蛋白表达的试剂盒中的应用；所述肺腺癌细胞增殖标志蛋白包括 cyclinD1和PCNA。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞转移的药物中的应用。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞转移标志蛋白表达的试剂盒中的应用；所述肺腺癌细胞转移标志蛋白包括： N-cadherin和vimentin。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备预防和/或治疗肺腺癌的药物中的应用。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制膜联蛋白 A1、整合素亚单位α3和S100钙结合蛋白A6的表达，促进赖氨酸脱甲基酶 2B、星云蛋白和CBFA2/RUNX1伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒中的应用。

本发明还提供了过表达腺苷受体A2B的试剂在制备促进膜联蛋白A1、整合素亚单位α3和S100钙结合蛋白A6的表达，抑制赖氨酸脱甲基酶2B、星云蛋白和CBFA2/RUNX1伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒中的应用。

优选的是，抑制腺苷受体A2B表达的试剂包括小干扰RNA，所述小干扰RNA包括ADORA2B si-RNA-1、ADORA2B si-RNA-2或ADORA2B si-RNA-1；所述ADORA2B si-RNA-1的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述ADORA2B si-RNA-2的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ADORA2B si-RNA-3的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供了检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/ 或预后试剂盒中的应用。本发明通过生物信息学分析和体外实验发现 ADORA2B在肺腺癌中过度表达和扩增，且ADORA2B高表达预示肺腺癌患者预后不良。同时，ADORA2B的表达水平与免疫细胞浸润有关。体外实验发现，在人类肺腺癌细胞系A549细胞和NCl-H1299细胞中ADORA2B的mRNA和蛋白水平显著高于正常支气管上皮HBE细胞，且与ADORA2B正相关或负相关的基因转录水平一致，并具有统计学意义，siRNA转染实验和功能实验进一步证实了这些结果，体外实验结果也与生物信息学分析结果一致。最终得出，检测腺苷受体A2B表达量的试剂能够用于制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒；抑制腺苷受体A2B表达的试剂能够用于制备抑制肺腺癌细胞增殖的药物，具体能够抑制肺腺癌细胞增殖标志蛋白cyclin D1和 PCNA；抑制腺苷受体A2B表达的试剂能够用于制备抑制肺腺癌细胞转移的药物，具体抑制肺腺癌细胞转移标志蛋白N-cadherin和vimentin；抑制腺苷受体A2B表达的试剂能够用于制备预防和/或治疗肺腺癌的药物；抑制腺苷受体A2B表达的试剂能够用于制备抑制膜联蛋白A1、整合素亚单位α3和 S100钙结合蛋白A6的表达，促进赖氨酸脱甲基酶2B、星云蛋白和 CBFA2/RUNX1伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒；相反，过表达腺苷受体A2B的试剂能够用于制备促进膜联蛋白A1、整合素亚单位α3和S100钙结合蛋白A6的表达，抑制赖氨酸脱甲基酶2B、星云蛋白和CBFA2/RUNX1 伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒。

附图说明

图1为本发明提供的肺腺癌中ADORA2B表达情况；其中，(A)Okayama Lung数据集，(B)Landi Lung数据集，(C)Selamat Lung数据集，(D) Stearman Lung数据集,(E)BeerLung数据集，(F)Su Lung数据集，(G) Bhattacharjee Lung数据集，(H)Garber Lung数据集；

图2为本发明提供的肺腺癌患者亚组ADORA2B表达水平；其中，(A) 与癌旁组织相比，(B)个体癌症分期，(C)不同种族，(D)不同性别， (E)不同年龄，(F)不同吸烟习惯，(G)不同淋巴结转移状态，(H) TP53突变状态；

图3为本发明提供的肺腺癌中ADORA2B改变的频率和类型结果图；其中，(A)肺腺癌(cBioPortal)ADORA2B的改变，(B)肺腺癌中ADORA2B 改变与临床属性和突变的关系；

图4为本发明提供的ADORA2B的表达与肺腺癌患者的生存率相关结果图；其中，(A)ADORA2B高、低表达肺腺癌患者的平均全OS分析，(B) ADORA2B高表达和低表达肺腺癌患者12个月(1年)的OS分析，(C) ADORA2B高表达和低表达肺腺癌患者36个月(3年)的OS分析，(D) ADORA2B高表达和低表达肺腺癌患者60个月(5年)的OS分析；

图5-1为本发明提供的与ADORA2B(LinkedOmics)相关的差异表达基因，其中，(a)为与ADORA2B相关的基因，(b)为与ADORA2B正相关的差异表达基因，(c)与为ADORA2B负相关的差异表达基因；

图5-2为本发明提供的ADORA2B及其相关基因(LinkedOmics)的基因表达相关分析，ADORA2B表达与(a)ANXA1，(b)ITGA3，(c)S100A6， (d)KDM2B，(e)NEB和(f)CBFA2T2的皮尔逊相关性(n＝515)；

图6为本发明提供的在肺腺癌中ADORA2B表达与免疫浸润的相关性结果图；其中，(A)ADORA2B与肿瘤纯度及不同亚群免疫细胞浸润的关系， (B)ADORA2B的拷贝数变异对各种免疫细胞分布的影响；

图7为本发明提供的人肺腺癌细胞系中ADORA2B及相关基因的表达水平；其中，(A)Westernblotting法检测ADORA2B的蛋白表达水平，(B) 蛋白质表达水平定量统计分析，(C)qRT-PCR检测ADORA2B的mRNA 表达水平，(D)与ADORA2B表达水平呈正相关的基因mRNA表达水平，(E)与ADORA2B表达水平呈负相关的基因mRNA表达水平，(F)siRNA 转染后ADORA2B的mRNA表达水平，(G)siRNA转染后，与ADORA2B 表达水平呈正相关基因mRNA表达水平，(H)siRNA转染后，与ADORA2B 表达水平呈正相关基因mRNA表达水平；

图8为本发明提供的抑制ADORA2B表达可显著抑制肺腺癌细胞的增殖和转移的结果图；其中，(A)CCK8法检测转染ADORA2B siRNA后的细胞活力，(B)转染ADORA2B siRNA后的细胞迁移效率，(C)westernblotting 检测癌细胞增殖(cyclin D1，PCNA)和转移(N-cadherin，vimentin)标志蛋白的表达水平，(D)蛋白定量统计分析。

具体实施方式

本发明提供了检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/ 或预后试剂盒中的应用。ADORA2B在肺腺癌中过度表达和扩增，且 ADORA2B高表达预示肺腺癌患者预后不良。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖的药物中的应用。本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖标志蛋白表达的试剂盒中的应用；所述肺腺癌细胞增殖标志蛋白包括cyclinD1和PCNA。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞转移的药物中的应用。本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞转移标志蛋白表达的试剂盒中的应用；所述肺腺癌细胞转移标志蛋白包括：N-cadherin和vimentin。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备预防和/或治疗肺腺癌的药物中的应用。本发明通过抑制ADORA2B的方式治疗或预防肺腺癌，为开发新的药物靶点提供了依据。

本发明还提供了抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制膜联蛋白 A1、整合素亚单位α3和S100钙结合蛋白A6的表达，促进赖氨酸脱甲基酶 2B、星云蛋白和CBFA2/RUNX1伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒中的应用。以及过表达腺苷受体A2B的试剂在制备促进膜联蛋白A1、整合素亚单位α3和S100钙结合蛋白A6的表达，抑制赖氨酸脱甲基酶2B、星云蛋白和CBFA2/RUNX1伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒中的应用。

在本发明中，抑制腺苷受体A2B表达的试剂包括小干扰RNA，所述小干扰RNA包括ADORA2B si-RNA-1、ADORA2B si-RNA-2或ADORA2B si-RNA-1；所述ADORA2B si-RNA-1的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示(ACUUCUACGGCUGCCUCUUTT)，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(AAGAGGCAGCCGUAGAAGUTT)；所述ADORA2B si-RNA-2 的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示 (GGAUGGAACCACGAAUGAATT)，另一条链的核苷酸序列如SEQID NO.4所示(UUCAUUCGUGGUUCCAUCCTT)；所述ADORA2B si-RNA-3 的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示 (CCAAGUGGGCAAUGAAUAUTT)，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(auauucauugcccacuuggtt)。在本发明中，实施例使用的阴性对照 siRNA(Control si-RNA)的核苷酸序列如下所示： UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO.7)，ACGUGACACGUUCGGAGAATT(SEQ ID NO.8).本发明对所述所有小干扰RNA的来源没有特殊限定，采用常规基因合成公司进行人工合成即可，如上海吉玛公司。在本发明中，所述小干扰RNA更优选为ADORA2B si-RNA-2，ADORA2B si-RNA-2的抑制效果最强。

下面结合具体实施例对本发明所述的检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.细胞培养

人肺癌细胞系A549细胞、NCl-H1299细胞和正常人支气管上皮细胞系 HBE细胞均来源于美国ATCC细胞库。A549细胞在含有10％胎牛血清(FBS) 的DMEM培养基，HBE细胞培养基中含有20％FBS的DMEM培养基， NCl-H1299细胞在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养。所有细胞在温度为37℃，CO₂浓度为5％的加湿培养箱中培养。选取细胞传代次数少于5次，密度大于70％的细胞用于实验。

2.RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

使用TRIzol法提取A549，NCl-H1299和HBE细胞RNA。加入1mL TRIzol裂解细胞，室温静置10分钟后转移至RNase Free EP管。加入200μL 三氯甲烷，用力摇晃30秒，室温静置3分钟。4℃12000g，离心15分钟。离心后，用移液器轻轻吸取上层水相至新的RNase Free EP管中，加入相同体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10分钟。静置后，4℃，12000g，离心 10分钟。离心后弃上清，吸干残留液体，管底沉淀即RNA。加入1ml 75％乙醇溶液，轻轻摇匀，4℃，7500g，离心5分钟。离心后弃上清，超净台内风干至RNA呈透明状即可。

加DEPC水溶解RNA。测定RNA浓度，使用反转试剂盒将RNA反转为cDNA。将cDNA稀释至适当浓度，利用实时定量荧光PCR仪检测，以β-Aactin为内参，以2^-ΔΔCt法进行基因相对表达量分析。

3.小干扰RNA(si-RNA)转染

ADORA2B siRNA或阴性对照siRNA序列由上海吉玛公司提供。

阴性对照si-RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，ACGUGACACGUUCGGAGAATT；

ADORA2B si-RNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：ACUUCUACGGCUGCCUCUUTT，AAGAGGCAGCCGUAGAAGUTT；

ADRA2B si-RNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示：GGAUGGAACCACGAAUGAATT，UUCAUUCGUGGUUCCAUCCTT；

ADORA2B si-RNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示：CCAAGUGGGCAAUGAAUAUTT，AUAUUCAUUGCCCACUUGGTT。

用DEPC水将小干扰RNA配制成50nM的工作浓度，分装备用。转染前一天，用0.25％胰酶消化液处理A549细胞，以合适的比例接种到细胞培养板中，待细胞密度达到50％～70％时，进行转染。按照以下体系配制转染混合液(以6孔板为例)，每孔需要如下体系：300μL opti-MEM培养基加 3μL lipofectamine 2000转染试剂，涡旋混匀静置5分钟；300μLopti-MEM 培养基加4.5μLADORA2B siRNA或阴性对照siRNA，涡旋混匀静置5分钟。将含有转染试剂的培养基与含有si RNA的培养基混合到同一管中，涡旋混匀静置20分钟。之后将转染混合液旋转滴加到细胞培养板中，轻轻摇晃细胞培养板，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，转染4～6小时后，根据细胞状态，更换新鲜完全培养基。

4.蛋白印记(WesternBlotting)检测

用蛋白裂解液RIPA裂解细胞，4℃，10000转/分钟，离心15分钟，吸取蛋白上清。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。10～12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，每组上样20μg蛋白提取物，110V恒压电泳使其分离。然后，将分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，并用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜2小时，阻断非特异性结合。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜2次，每次7～8分钟。将PVDF膜与下列一抗在4℃环境孵育过夜:β-actin(Bioss,bs-0061R,中国，北京，1:3000)、ADORA2B(Bioss, bs-5900R，1:1000)、cyclin D1(ABclonal,A2708，中国，武汉，1:1000)、 PCNA(Proteintech,10205-2-AP，中国，武汉，1:1000)、N-cadherin(ABclonal, A0433，1:1000)和vimentin(ABclonal,A2584，1:1000)。第二日，PBST 洗膜5次，每次7～8分钟。将膜与二抗(Abclonal,AS014,1:2000)。室温孵育1小时，PBST洗膜5次，每次7～8分钟。采用增强化学发光试剂盒检测蛋白印迹发光强度。

5.细胞增殖检测

Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞活力。在96孔板中配置100μL 的细胞悬液，每孔3000个A549细胞。将培养板在培养箱预培养24小时 (37℃，5％CO₂)。24小时后，用ADORA2B siRNA和阴性对照siRNA按上述方法进行转染。到24小时、48小时和72小时后，向每孔加入10μL CCK8 溶液。将培养板在培养箱内孵育1～4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCl溶液或者 1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

6.细胞迁移检测

按上述方法用Lipofectamine 2000转染ADORA2B siRNA和阴性对照 siRNA。转染后的细胞密度达到100％时，然后使用移液管尖端创建划痕，同时用无血清培养基代替完全培养基以消除细胞增殖的影响。在0小时和48 小时用显微镜拍摄图像。采用ImageJ软件计算细胞迁移率。

细胞培养方法、RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法、小干扰RNA(si-RNA)转染方法、蛋白印记(WesternBlotting)检测方法、细胞增殖检测方法、细胞迁移检测的方法均参考上述具体条件。基于上述方法，进行ADORA2B在肺腺癌中的mRNA表达、肺腺癌中ADORA2B改变的频率和类型、ADORA2B的表达与肺腺癌患者的生存相关、ADORA2B及其相关基因表达的相关性分析、肺腺癌中ADORA2B表达与浸润性免疫细胞的关系、ADORA2B及其相关基因在人肺腺癌细胞中的表达水平、抑制 ADORA2B基因表达水平在抑制肺腺癌细胞增殖和转移方面的试验。

试验结果如下：

1.ADORA2B在肺腺癌中的mRNA表达

使用TCGA和GEO获得的数据分析肺腺癌患者ADORA2B转录水平。利用OncoMine数据库分析ADORA2B在肺腺癌中的mRNA表达 (www.oncomine.org)。从Okayama Lung，LandiLung，Selamat Lung，Stearman Lung，BeerLung，Su Lung，Bhattacharjee Lung，GarberLung数据集分析肺腺癌的表达情况。OncoMine数据显示，与癌旁组织相比，在肺腺癌组织中 ADORA2B mRNA的表达显著上调(p<0.01)。ADORA2B在高mRNA表达基因中排名前33％，其倍数差值小于2(详见图1，图1为肺腺癌中ADORA2B 表达情况。与癌旁组织相比，肺腺癌组织中ADORA2B mRNA拷贝数显著较高。(A)Okayama Lung数据集，(B)Landi Lung数据集，(C)Selamat Lung数据集，(D)Stearman Lung数据集,(E)BeerLung数据集，(F) Su Lung数据集，(G)Bhattacharjee Lung数据集，(H)Garber Lung数据集)。

进一步，运用UALCAN分析与肺腺癌中ADORA2B mRNA表达相关的多种临床和病理特征(http://ualcan.path.uab.edu)。采用TCGA水平的RNA 测序分析UALCAN中肺腺癌的ADORA2B的表达，并对临床资料进行分析，以确定ADORA2B在不同肿瘤亚群中的表达水平。TCGA数据库肺腺癌患者的多种临床和病理特征的分析显示ADORA2B mRNA表达升高。此外，在基于样本类型、个体癌症分期、种族、性别、年龄、吸烟习惯、淋巴结转移状态和TP53突变状态的亚组分析中，在肺腺癌组织中ADORA2B mRNA表达显著高于癌旁组织(详见图2，图2为肺腺癌患者亚组ADORA2B表达水平。ADORA2B在正常及不同类型肺腺癌组织中的相对表达，其中，(A) 与癌旁组织相比，(B)个体癌症分期，(C)不同种族，(D)不同性别， (E)不同年龄，(F)不同吸烟习惯，(G)不同淋巴结转移状态，(H) TP53突变状态)。

从GEO和TCGA数据库获得的临床样本数据中分析转录测序数据。为了确定ADORA2B在肺腺癌中的作用，评估了几种在该疾病中表达的基因的表达模式。对肿瘤数据库的分析显示，根据mRNA表达水平，ADORA2B 在肺腺癌中显著过表达。

2.肺腺癌中ADORA2B改变的频率和类型

通过C-BioPortal(http://cbioportal.org)分析癌症基因组图谱(TCGA) 中肺腺癌样本的ADORA2B表达。通过分析各种类型的突变、拷贝数变异和 mRNA表达水平，OncoPrint显示了每个样本中基因变化的概况，进一步绘图显示临床属性和突变数据类型的概述。通过cBioPortal数据库，根据从 TCGA和PanCancerAtlas数据库获得的肺腺癌患者的测序数据，评估肺腺癌组织中ADORA2B改变的类型和频率。图3为肺腺癌中ADORA2B改变的频率和类型结果图，其中，(A)肺腺癌(cBioPortal)ADORA2B的改变， (B)肺腺癌中ADORA2B改变与临床属性和突变的关系。根据图3中的A 可知，503例肺腺癌患者中有30例(6％)ADORA2B发生改变。这些基因改变包括错义突变(1，0.2％)、扩增(3，0.6％)、深度缺失(4，0.8％)、mRNA高(2，0.4％)和mRNA低(20，4％)。根据图3中的B可知，分析包括临床属性和突变类型、部分基因组改变和突变类型，包括错义(VUS)、未突变、未分析突变、扩增、增益、二倍体、浅缺失、深缺失和未分析CNA。因此，mRNA低、浅缺失和二倍体是在肺腺癌中发现的最常见的ADORA2B 基因改变类型。

3.ADORA2B的表达与肺腺癌患者的生存相关

进一步研究ADORA2B在肺腺癌患者中的预后价值。根据Kaplan-Meier 绘图仪数据库，ADORA2B高表达的肺腺癌患者总体生存率(OS)较差。图 4为ADORA2B的表达与肺腺癌患者的生存率相关结果图，其中，(A) ADORA2B高、低表达肺腺癌患者的平均全OS分析，(B)ADORA2B高表达和低表达肺腺癌患者12个月(1年)的OS分析，(C)ADORA2B高表达和低表达肺腺癌患者36个月(3年)的OS分析，(D)ADORA2B高表达和低表达肺腺癌患者60个月(5年)的OS分析。生存分析显示，低 ADORA2B表达组的平均全OS时间长于高ADORA2B表达组(p＝0.034)(图 4中的A)。ADORA2B低表达组12个月(1年)、36个月(3年)和60 个月(5年)的平均OS时间明显长于高表达组(图4中的B～图4中的D)。这些结果表明ADORA2B与肺腺癌患者的预后显著相关。ADORA2B高表达预示肺腺癌患者预后不良。

4.ADORA2B及其相关基因表达的相关性分析

通过LinkedInkOmics的Linkfinder模块 (http://www.linkedomics.org/login.php)鉴定TCGA数据库中肺腺癌组织切片中与ADORA2B(n＝515)相关的差异表达基因。为了确定相互作用蛋白的层次结构，使用LinkedOmics数据库并绘制了与ADORA2B表达相关的差异表达基因的热图，鉴定与ADORA2B共表达的RNA-seq基因。图5-1为与ADORA2B(LinkedOmics)相关的差异表达基因，其中，(a)为与ADORA2B 相关的基因，(b)为与ADORA2B正相关的差异表达基因，(c)与为ADORA2B 负相关的差异表达基因；图5-2为ADORA2B及其相关基因(LinkedOmics) 的基因表达相关分析，ADORA2B表达与(a)ANXA1，(b)ITGA3，(c)S100A6，(d)KDM2B，(e)NEB和(f)CBFA2T2的皮尔逊相关性(n＝515)。火山图显示5246个基因的表达与ADORA2B的表达呈负相关，3447个基因的表达与ADORA2B的表达呈正相关。本发明确认了前50个与ADORA2B 负或正相互作用的基因(图5-1)。结果表明，多个差异表达基因与ADORA2B 表达相关。通过RNA-seq获得搜索和目标数据集，并用Pearson相关系数对结果进行分析。分析显示ADORA2B表达水平与膜联蛋白A1(ANXA1)、整合素亚单位α3(ITGA3)和S100钙结合蛋白A6(S100A6)呈正相关，与赖氨酸脱甲基酶2B(KDM2B)、星云蛋白(NEB)呈负相关，和CBFA2/RUNX1 伴侣转录辅抑制子2(CBFA2T2)(图5-2)。

在肺腺癌中，ADORA2B被预测与几个ADORA2B相关基因相关。其中， ANXA1在多种恶性肿瘤中高表达，血清ANXA1水平的上调与特定类型肺腺癌的病理分级及临床分期有关。ANXA1基因敲除可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而ITGA3的表达水平可作为多种恶性肿瘤的诊断和预后指标。 S100A6调节细胞骨架蛋白动力学、细胞增殖、分化、钙代谢、泛素化和乙酰化，通过抑制p53的乙酰化而促进肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和血管生成。KDM2B通过抑制癌基因的表达而抑制癌细胞的增殖，癌基因在干细胞的自我更新、分化和凋亡中起重要作用。因此，本发明的结果证实了 ADORA2B在肺腺癌中的诊断和预后的重要价值。ADORA2B与这些调节与癌症和疾病相关的重要细胞过程的蛋白质相互作用。

5.肺腺癌中ADORA2B表达与浸润性免疫细胞的关系

通过Tumor Immune Estimation Resource(TIMER，https://cistrome. io/timer/)分析不同类型癌症中不同免疫细胞亚群的浸润水平。分析了 ADORA2B在肺腺癌中的表达与肿瘤和免疫浸润细胞(包括B细胞、CD8+T 细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)的关系。通过 TIMER数据库分析ADORA2B表达水平与免疫细胞浸润亚群的关系。结果如图6所述，图6为在肺腺癌中ADORA2B表达与免疫浸润的相关性结果图，其中，(A)ADORA2B与肿瘤纯度及不同亚群免疫细胞浸润的关系，(B) ADORA2B的拷贝数变异对各种免疫细胞分布的影响。ADORA2B的表达与 B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润显著相关(图6中的A)。此外，还分析了基因拷贝数变异与免疫浸润细胞丰度的关系。ADORA2B的臂水平缺失拷贝数变异(CNV)与巨噬细胞的浸润水平显著相关(图6中的 B)。

免疫细胞浸润分析结果表明，ADORA2B的表达水平与LUAD中浸润的免疫细胞(包括B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)有关。这些结果揭示了ADORA2B在肺腺癌发展中不可或缺的作用。

6.ADORA2B及其相关基因在人肺腺癌细胞中的表达水平

上述研究发现，与正常肺组织相比，发病率较高的肺腺癌患者肿瘤组织中ADORA2B的表达水平显著升高。为了证实ADORA2B的表达与肺腺癌有关，本发明进一步检测ADORA2B基因在人肺腺癌细胞系(A549， NCl-H1299)和正常人支气管上皮(HBE)细胞系中的表达水平。图7为人肺腺癌细胞系中ADORA2B及相关基因的表达水平。其中，(A)Western blotting法检测ADORA2B的蛋白表达水平，(B)蛋白质表达水平定量统计分析，(C)qRT-PCR检测ADORA2B的mRNA表达水平，(D)与ADORA2B 表达水平呈正相关的基因mRNA表达水平，(E)与ADORA2B表达水平呈负相关的基因mRNA表达水平，(F)siRNA转染后ADORA2B的mRNA 表达水平，(G)siRNA转染后，与ADORA2B表达水平呈正相关基因mRNA 表达水平，(H)siRNA转染后，与ADORA2B表达水平呈正相关基因mRNA 表达水平。Western blotting结果表明，A549细胞和NCl-H1299细胞中 ADORA2B蛋白的相对表达水平显著高于HBE细胞(图7中的A和B)。 qRT-PCR检测ADORA2B的mRNA表达水平，发现在三种细胞系中， ADORA2B的相对mRNA表达水平与其蛋白质表达水平一致(图7中的C)。

LinkedLink组学鉴定的与ADORA2B相关的差异表达基因，ANXA1、 ITGA3和S100A6在肺腺癌中的表达水平与ADORA2B的表达水平呈正相关；KDM2B、NEB和CBFA2T2在肺腺癌中的表达水平与ADORA2B的表达水平呈负相关。为验证上述结果，qRT-PCR检测上述基因的mRNA表达水平。与HBE细胞相比，A549细胞中ANXA1、ITGA3和S100A6的表达水平显著升高，并且与ADORA2B表达水平正相关(图7中的D)。相反， A549细胞中KDM2B、NEB和CBFA2T2的表达水平显著低于HBE细胞，并且与ADORA2B表达呈负相关(图7中的E)。这些结果与生物信息学分析结果一致。

为进一步证实上述结果，通过ADORA2B siRNA转染以抑制A549细胞中ADORA2B的表达。首先，通过qRT-PCR验证ADORA2B的敲除效率，选择具有最高敲除效率的siRNA-2用于后续实验(图7中的F)。然后，检测与ADORA2B表达水平呈正或负相关的基因的mRNA表达水平。与阴性对照siRNA组相比，ADORA2B siRNA组中ANXA1、ITGA3和S100A6的表达水平显著降低，并且与ADORA2B表达水平呈正相关(图7中的G)。 ADORA2B siRNA组中KDM2B、NEB和CBFA2T2的表达水平显著高于对照siRNA组，并且与ADORA2B表达水平呈负相关(图7中的H)。综上所述，ADORA2B在人肺腺癌A549细胞中高表达，ANXA1、ITGA3和S100A6 的表达水平与ADORA2B的表达水平呈正相关，KDM2B、NEB和CBFA2T2 的表达水平与ADORA2B的表达水平呈负相关。体外实验结果与生物信息学分析结果一致。

7.抑制ADORA2B基因表达水平可显著抑制肺腺癌细胞增殖和转移

为进一步探究ADORA2B在肺腺癌进展中的作用，本发明进一步进行相关功能实验来阐明ADORA2B的功能。图8为抑制ADORA2B表达可显著抑制肺腺癌细胞的增殖和转移的结果图；其中，(A)CCK8法检测转染 ADORA2B siRNA后的细胞活力，(B)转染ADORA2B siRNA后的细胞迁移效率，(C)westernblotting检测癌细胞增殖(cyclin D1，PCNA)和转移 (N-cadherin，vimentin)标志蛋白的表达水平，(D)蛋白定量统计分析。首先，通过CCK-8法检测细胞增殖水平。与对照siRNA组相比，ADORA2B siRNA组在转染后24小时、48小时和72小时的细胞活力显著降低(图8 中的A)。然后通过细胞划痕实验检测细胞迁移水平。划痕试验结果显示，在诱导48小时后，抑制ADORA2B基因表达可显著抑制A549细胞的细胞迁移能力，提示ADORA2B可促进肺腺癌转移(图8中的B)。接下来，本发明检测抑制ADORA2B基因表达后，肺腺癌细胞增殖和转移的标志蛋白表达水平。Westernblotting结果表明，ADORA2B siRNA组的癌细胞增殖(cyclin D1，PCNA)和转移(N-cadherin，vimentin)标志蛋白表达水平显著低于对照siRNA组(图8中的C和图8中的D)。综上表明，抑制ADORA2B基因表达可以显著抑制肺腺癌细胞的增殖和转移。ADORA2B可能参与肺腺癌的增殖和转移过程。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 隋雨桐

孟子愉

<120> 检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acuucuacgg cugccucuut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaggcagc cguagaagut t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggauggaacc acgaaugaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uucauucgug guuccaucct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaagugggc aaugaauaut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

auauucauug cccacuuggt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.检测腺苷受体A2B表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用。

2.抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖的药物中的应用。

3.抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖标志蛋白表达的试剂盒中的应用；所述肺腺癌细胞增殖标志蛋白包括cyclin D1和PCNA。

4.抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞转移的药物中的应用。

5.抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制肺腺癌细胞转移标志蛋白表达的试剂盒中的应用；所述肺腺癌细胞转移标志蛋白包括：N-cadherin和vimentin。

6.抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备预防和/或治疗肺腺癌的药物中的应用。

7.抑制腺苷受体A2B表达的试剂在制备抑制膜联蛋白A1、整合素亚单位α3和S100钙结合蛋白A6的表达，促进赖氨酸脱甲基酶2B、星云蛋白和CBFA2/RUNX1伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒中的应用。

8.过表达腺苷受体A2B的试剂在制备促进膜联蛋白A1、整合素亚单位α3和S100钙结合蛋白A6的表达，抑制赖氨酸脱甲基酶2B、星云蛋白和CBFA2/RUNX1伴侣转录辅抑制子2的表达的试剂盒中的应用。

9.根据权利要求2～7任一项所述的应用，其特征在于，抑制腺苷受体A2B表达的试剂包括小干扰RNA，所述小干扰RNA包括ADORA2B si-RNA-1、ADORA2B si-RNA-2或ADORA2B si-RNA-1；所述ADORA2B si-RNA-1的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述ADORA2B si-RNA-2的一条链的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ADORA2B si-RNA-3的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，另一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。