CN113045662A

CN113045662A - 一种特异性识别pd-l1的纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN113045662A
Application number: CN202110596814.6A
Authority: CN
Inventors: 张广华; 刘云; 陆阳; 区文彩; 阮月敏
Original assignee: Seebio Biotech (shanghai) Co ltd
Current assignee: Seebio Biotech (shanghai) Co ltd
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-05-31
Also published as: CN113045662B

Abstract

本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体来说是一种特异性识别PD‑L1的纳米抗体及其应用，所述纳米抗体的互补决定区包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列CDR1、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列CDR2和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列CDR3。本发明所提供的一种特异性识别PD‑L1的纳米抗体，所述的纳米抗体对于PD‑L1具有良好的特异性，与其它蛋白的交叉反应性很低。本发明的纳米抗体可灵敏检测PD‑L1，重复性好，结果稳定；利用所述的纳米抗体，还可以可制备方便、快速且准确地检测PD‑L1的试剂盒。

Description

一种特异性识别PD-L1的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体来说是一种特异性识别PD-L1的纳米抗体及其应用。

背景技术

PD-1的临床转化研究主要是通过研发可以封闭PD-1或其配体的抗体进行。这些抗体有的已经应用于临床I期和Ⅱ期实验，有的还在动物模型中进行实验。据文献报道，这些抗体主要应用于：晚期癌症治疗，例如转移性黑色素瘤、肾癌等；慢性和长期病毒感染，比如脉络丛脑膜炎病毒，HIV感染等。另外，对于自身免疫病中PD-1及其配体的异常表达也有报道，激活PD-1途径以治疗自身免疫病也在讨论的范围内。目前已有的进入临床实验的封闭PD-1信号通路的抗体均是针对癌症治疗的，且大多数都是由药物公司研发。

另外，上个世纪90年代，在驼类体内发现天然缺失轻链，仅由重链组成的抗体。重链单域抗体可直接识别抗原，其蛋白质大小约为15-17kD，由于分子量小，因此又称为纳米抗体。重链抗体大约含130个氨基酸，具有较小的分子质量和较简单的结构，是可获得的较小的与抗原结合的单位。已有研究表明，纳米抗体相对于传统抗体具有更高的热稳定性，更好的折叠能力以及组织侵入性。文献表明，有些纳米抗体可以通过血脑屏障，这一特性对于药物输送意义重大。且其CDR3区比传统抗体长，更容易与凹陷结构结合，因此对于在封闭酶的活性方面很有优势。此外重链抗体还可以其他蛋白共同表达组成具有双特异性或者多种功能的融合蛋白。重链抗体与荧光蛋白结合极大地推动了分子成像技术的发展，进而推动了肿瘤的个性化治疗及药物研发领域的进步。近年来，国内外已构建了很多驼源天然单域重链抗体噬菌体库，也有半合成驼源单域重链抗体噬菌体库的建立，其展示的纳米抗体在癌症治疗、疫苗研发等领域都有重要应用。

发明内容

本发明的目的在于，通过使用合成法成功构建了噬菌体展示的纳米抗体文库，随后，以PD-L1胞外域蛋白为抗原筛选抗体，最终得到特异性结合PD-L1的抗体。纳米抗体本身的分子量较小，具有免疫原性小，高温稳定性等优点，使得针对PD-L1胞外域蛋白的纳米抗体相对已有的传统抗体具有较大的优势和更广泛的应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供一种特异性识别PD-L1的纳米抗体，所述纳米抗体的互补决定区包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列CDR1、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列CDR2和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列CDR3。

进一步的，所述纳米抗体的骨架区包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列FR1、SEQID NO.6所示的氨基酸序列FR2、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列FR3和SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列FR4。

进一步的，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还包括一种多核苷酸，其编码具有上述纳米抗体。

进一步的，还包括一种表达载体，所述表达载体中包括上述多核苷酸。

优选的，所述表达载体优选为pET28a，上述多核苷酸可通过分子克隆技术克隆至pET28a中进行表达。

本发明还提供一种宿主细胞(为非繁殖细胞)，该宿主细胞中含有上述的表达载体或其基因组中整合有上述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种产生纳米抗体的方法，包括：培养上述的宿主细胞，使之表达上述的纳米抗体。

进一步的，提供一种用如上所述表达载体转化的宿主细胞。宿主细胞优选为大肠杆菌。

在本发明的另一方面，提供一种纳米抗体噬菌体(噬菌粒)，其包括：噬菌体(噬菌粒)，以及展示于噬菌体表面的所述的纳米抗体。

在另一优选例中，所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的噬菌体。例如，所述的噬菌体是M13丝状噬菌体。

在本发明的另一方面，提供所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体的用途，用于检测PD-L1；或用于制备检测PD-L1的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的用途为非诊断性的用途。较佳地，用于检测来自人体或动物体以外的样品(如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等)中的PD-L1。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测PD-L1的试剂盒，所述的试剂盒中包括所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体或纳米抗体噬菌体被固定于固相载体(如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：

能与所述的纳米抗体连接的可检测标记物(如HRP)，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米抗体或分离地存在于试剂盒；和/或PD-L1标准品或PD-L1偶联物(为PD-L1与载体蛋白的偶联物，如PD-L1-BSA、PD-L1-OVA)标准品；和/或与可检测标记物相对应的底物；和/或酶联免疫反应试剂(包括但不限于：包被(缓冲)液，洗涤(缓冲)液，封闭液，固定液，终止液，显色液)；和/或说明检测PD-L1的方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种检测待测样品中PD-L1存在情况的方法，所述方法包括：

以所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体作为PD-L1的检测抗体，通过酶联免疫反应法来检测待测样品中PD-L1的存在情况。

在另一优选例中，将待测样品包被于固相载体上，以携带或不携带可检测标记物(以携带可检测标记物的抗抗体进一步结合)的所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体作为检测抗体，检测PD-L1的存在情况。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。所述的待测样品是来自人体或动物体以外的样品(如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等)。

本发明另一方面，提供一种包含与治疗剂缀合的本发明所述抗体的免疫缀合物。所述治疗剂优选为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。

本发明另一方面，还提供了包含本发明所述抗体的任何一种双特异性分子。例如，可以将上述PD-l抗体与具有另一种抗原结合特性的抗体或抗体片段功能性连接组成双特异性抗体。诸如，所述双特异性抗体包括但不限于针对以下分子的抗体:VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受体或其它生长因予受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS。

本发明另一方面，还提供了一种药物组合物，其包含本发明所述抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明又一方面，还提供了制备本发明所述抗体的方法，其包括: (a)在允许产生所述抗体的条件下培养本发明的上述宿主细胞; (b)回收、分离产生的所述抗体。

本发明再一方面，还涉及根据本发明所述结合PD-L1的抗体、或包含其的药物组合物、或包含其的免疫缀合物、或包含其的双特异性分子在制备用于治疗PD-L1介导的疾病或病症的药物中的用途。

其中，所述的疾病优选为癌症:更优选为高表达PD-L1的癌症:所述的癌症包括但不限于肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀肮癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、头颈癌:优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤:最优选为非小细胞肺癌、黑素瘤和肾癌。

其中，所述疾病优选为感染性疾病:例如，慢性病毒感染、细菌感染或寄生虫感染疾病。所述感染性疾病更优选为HIV,HBV和HCV。

发明的有益效果

本发明提供了一种针对PD-L1的纳米抗体，所述的纳米抗体对于PD-L1具有良好的特异性，与其它蛋白的交叉反应性很低。本发明的纳米抗体可灵敏检测PD-L1，重复性好，结果稳定；利用所述的纳米抗体，可制备方便、快速且准确地检测PD-L1的试剂盒。

附图说明

图1示例性示出了本发明的纳米抗体通用基因全长连接操作示意图；

图2示例性示出了本发明的纳米抗体阳性克隆特异性检测结果示意图；

图3示例性示出了本发明的PD-L1纳米抗体亲和常数Kaff测定结果示意图。

具体实施方式

本发明经过深入的研究，揭示了一种针对PD-L1的纳米抗体，所述的纳米抗体对于PD-L1具有良好的特异性，与其它蛋白的交叉反应性很低。本发明的纳米抗体可灵敏检测PD-L1，重复性好，结果稳定；利用所述的纳米抗体，可制备方便、快速且准确地检测PD-L1的试剂盒。

如本文所用，所述的“纳米抗体”是指缺失轻链的重链抗体(如：来源于骆驼体内)，克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量(Mr)仅约为15000。纳米抗体具有分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。

如本文所用，所述的“检测抗体”是指特异性地抗PD-L1的抗体。

如本文所用，所述的“可检测标记物”是指位于检测抗体上的，用于确定待检测样品中PD-L1的存在与否以及存在的量的标志物。如：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。优选的，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

如本文所用，所述的“与可检测标记物相对应的底物”是指可被检测抗体的标记物所催化显色，用于显示检测抗体与PD-L1发生结合的识别信号。所述的底物比如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。

1、抗PD-L1蛋白的纳米抗体

本发明提供了一种纳米抗体，所述的纳米抗体筛选自驼源性天然单域重链抗体库。

本发明所述的纳米抗体，能高亲和力特异性与PD-L1结合。

本发明也包括所述的纳米抗体的变异体、衍生物和类似物。如本文所用，术语“变异体”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的纳米抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽变异体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽)。根据本文的定义这些变异体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

此外，在所述的纳米抗体的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所述的纳米抗体的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列)，或其它可促进所述的纳米抗体的活性、表达量或稳定性的序列。

本发明还包括编码本发明的纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。

为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的纳米抗体的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。

在获得了编码本发明新纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA序列之后，将其克隆入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的纳米抗体。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新纳米抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达纳米抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明纳米抗体的条件下培养该细胞，从而表达出纳米抗体；然后再分离出表达的纳米抗体。

2、试剂盒

基于本发明获得的新的纳米抗体，本发明提供一种检测PD-L1的试剂盒，所述的试剂盒可用于PD-L1的检测。

所述的试剂盒含有：本发明所述的纳米抗体或纳米抗体噬菌体(噬菌粒)。

作为一种实施方式，可以将待测样品包被于固相载体上，以本发明的纳米抗体作为检测抗体进行检测，所述的纳米抗体可连接一可检测标记物，或可以与连接可检测标记物的另一抗体(抗抗体)结合，从而获知待测样品中PD-L1的存在情况。应理解，在获得了本发明的纳米抗体后，可以采取多种本领域已知的方式来实施PD-L1的检测，这些方式均包含在本发明中。

在确定了本发明的试剂盒所采用的检测抗体后，可以采用本领域常规可用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物作为可检测标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中PD-L1的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。例如，所述的检测抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记。抗体标记的方法在本领域是公知的，例如用简易过碘酸钠法或者戊二醛二步法进行HRP标记抗体。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺( OPD )、四甲基联苯胺( TMB )、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)。

为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控(对照)。所述的质控品例如采用PD-L1标准品。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个PD-L1的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。利用所述的标准品，标准曲线如下设置：用标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成PD-L1试剂盒的定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中PD-L1的浓度。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是酶联免疫试验中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂包括：显色剂、洗涤液、终止液，增敏稀释液。

所述的包被抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板(又称为多孔板，如96孔板)或微球。

在本发明的一个实例中，采用的固相载体是微量滴定板(酶标板)，所述的微量滴定板是一种聚苯乙烯板，规格是12×8可拆卸条板。

由于本发明的试剂盒采用的纳米抗体配合单克隆抗体对于PD-L1具有极其优异的结合特性(高特异性)。按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的PD-L1含量。

本发明首次获得一种对于PD-L1特异性良好的纳米抗体，能够快速检验PD-L1，检测过程方便快捷成本低，且抗体扩增稳定性强。本发明为有效检测PD-L1提供了一种优异的试剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 纳米抗体通用基因全长连接

1、目的基因模板和引物设计

1）纳米抗体通用基因全长模板设计

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的单链DNA，其中N代表随机的碱基。

片段A(FR 1)-正义链

5’ATGGCTGATGTCCAGCTGCAGGCGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC3’

片段B(FR1-CDR1-FR2)-反义链

5’CTTCCCTGGAGCCTGGCGGTACCAGCCCATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTC 3’

片段C-(FR2-CDR2-FR3)正义链

5’CAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGACTTGGTCGCACTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC3’

片段D(FR3)-反义链

5’AGGTTTCAAGTTGTTCATTTGCAGATACACCGTGCTCTTGGCGTTGTCTCTGGAGATGGTGAATCGGCCCTT3’

片段D(FR3)-正义链

5’TGTATCTGCAAATGAACAACTTGAAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTA3’

片段E(FR3-CDR3-FR4)-反义链

5’GTAGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCAGGGTCCCCTGGCCCCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACAGTAATAGACGGCTGTGTCCTC3’

片段DE扩增

上游引物：5’TGTATCTGCAAATGAACAACTTGAAACCT3’

下游引物：5’GTAGCGGCCGCTGGAGACG3’

2）利用目的基因引物设计

利用引物设计软件Prime Primer 5.0人工设计出一对包含酶切位点、保护碱基的引物

上游引物：

5’AACATGCCATGACTCGCGGCTCAAGGCCCAGCCGGCCATGGCTGATGTCCAGCTGCAGGCG3’

下游引物：

5’GTTATTATTATTCAGATTATTGTAGCGGCCGCTGGAGACGGTG3’

2、纳米抗体通用基因全长连接和扩增

如图1所示，利用重叠延伸PCR将6段单链模板连接出VHH全长。采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成一小段的重叠链，然后在随后的反应中通过重叠链的延伸，将不同模板片段重叠拼接起来。

以上步骤多次重复得到纳米抗体通用基因全长，序列如下:

5’ATGGCTGATGTCCAGCTGCAGGCGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGACTTGGTCGCACTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAGCACGGTGTATCTGCAAATGAACAACTTGAAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTAC3’

实施例2、重组质粒的获得

用于构建抗体库的质粒载体为通用载体pCANTAB5E，纳米抗体通用基因基因插入至酶切位点Sfi 1和Not 1之间。具体如下：

A. pCANTAB5E空载体抽提

含pCANTAB5E质粒的TG1在100μg/ml氨苄霉素LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒：

1)取1-4 ml过夜培养的细菌10，000×g离心1分钟，尽量吸尽上清。

2)加入250μl无色溶液RB (含RNase A)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

3)加入250μl蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。

4)加入350μl黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

5) 15，000×g离心5分钟，小心吸取上清加入吸附柱中。

6) 15，000×g离心1分钟，弃流出液。

7) 加入650μl溶液WB(加乙醇)，15，000×g离心1分钟，弃流出液。

8) 15，000×g离心1-2分钟，彻底去除残留的WB。

9)将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去离子水(pH>7.0)室温静置1分钟。(EB或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好)。

10) 10，000×g离心1分钟，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃保存。

B. PCR回收产物与空载体酶切和回收

1)将PCR回收产物与载体pCANTAB5E同时分别进行Sfi 1单酶切，酶切条件：50℃水浴2小时。

2)目的基因酶切片段和载体酶切产物回收

利用PCR纯化试剂盒的方法：

1.取50μl-100μlPCR产物，加入5倍体积的溶液BB，混匀后加入吸附柱中(为提高纯化产量可以选择静置1 min)，10，000×g离心1分钟，弃去流出液。

2.加入650μl溶液WB，10，000×g离心1分钟，弃去流出液。

3.10，000×g离心1-2分钟，去除残留的WB。

4.将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30μl-50μlEB。为提高纯化产量，可选择65℃-70℃预热EB或去离子水(pH>7.0)室温静置1分钟，10，000×g离心1分钟，洗脱DNA。洗脱出的DNA于-20℃保存。

3）将PCR回收产物与载体pCANTAB5E同时分别进行Not 1单酶切，酶切条件：37℃水浴1小时。

4)目的基因酶切片段和载体酶切产物胶回收

1.切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，如凝胶重为100mg，可视为100μl(100mg约等于100μl)，以此类推。

2.加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴融胶6-10min，间断(2-3min)混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠(pH 5.2)，调整颜色和GSB颜色相同(黄色)。

3.待融化的凝胶溶液降至室温(高温时吸附柱结合DNA能力弱)，加入吸附柱中静置1分钟，10,000×g离心1分钟，弃流出液。

4.加入650μl溶液WB，10,000×g离心1分钟，弃流出液。

5.10,000×g离心1-2分钟，去除残留的WB。

6.将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μlEB(EB在60-70℃水浴预热，使用效果更好)，室温静置1分钟。

7.10,000×g离心1分钟，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。

5）以上步骤多次重复。

C.酶切产物连接回收

1）酶切产物连接，连接条件：16℃水浴过夜反应。

2）使用酚氯仿方法回收连接产物

1.等体积的酚氯仿和DNA混合，混匀后放置五分钟，然后13000rpm离心十分钟。

2.吸上层液到另一干净的EP管或者PCR中。

3.加等量的异丙醇到管中，吹吸混匀，放置十分钟，13000rpm离心十分钟，弃上清。

4.用等体积的75％的乙醇洗沉淀一次，然后离心十分钟.将液体洗出。

5.自然凉干沉淀。

6.用适量体积的ddH2O溶解沉淀。

3）以上步骤重复多次

D.重组质粒的验证

1）通用引物设计

表达载体pCANTAB5E,用于特异性检测的通用引物。

pCANTAB5E-S1: 5’CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC3’

由上海生工生物技术公司合成。

2）PCR验证重组质粒

以连接产物为模板，以表达载体通用上游引物为上游引物，以目的基因VHH下游引物为下游引物，进行高保真PCR扩增。阴性对照以空载质粒为模板，同样上下游引物进行PCR扩增。

50μlPCR扩增产物中取5μL上样于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,观测连接产物与阴性对照的区别。

实施例3、初级文库获得

A.电转感受态菌的制备和验证

选用TG1作为宿主菌，为了提高转化效率将重组质粒以电转化的方式进行转化。电转感受态菌制备的成功是构建初级库至关重要的一个步骤。为了得到理想的转化结果电转感受态菌，制备过程中细菌温度不超过4℃。

1）电转感受态菌制备方法如下：

1.从新鲜的琼脂板上挑取一个TG1单菌落，接种于含50ml LB培养液的锥形瓶中，于37℃摇动(250r/min)培养、过夜。

2.接种两份25ml的过夜培养物分别到盛有500ml预热LB培养基的2L锥形瓶中，于37℃摇动(250r/min)培养，每隔20min测量一次OD600值。

3.当OD600值达到0.35时，收集细胞，迅速将培养物置于冰浴中15-30min，不试缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。

4.将细菌转移至冰冷的离心管中，4℃以1000g离心15min，以回收细胞。倒去培养液，用500ml冰冷的纯水重悬沉淀。

5.4℃以1000g离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用250ml冰冷的纯水重悬沉淀。

6.4℃以1000g离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用250ml冰冷的10%甘油重悬沉淀。

7.4℃以1000g离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用10ml冰冷的10%甘油重悬沉淀。

8.4℃以1000g离心20min，小心倒掉上清液，再吸去管壁上的残留液体。加1ml冰冷的10%甘油重悬沉淀。

9.将悬液按40μl/份分装到冷却的无菌0.5ml微量离心管中，封紧管口，没入液氮中速冰冻感受态细胞。贮存于-80℃备用。

10.需要用冻存的电转化感受态细胞时，从-80℃冰箱中取出适当的份数，在冰上溶解后使用。

2）电转感受态菌验证

将适量新鲜制备的电转感受态菌均匀涂布在具有氨苄抗性的琼脂糖平板上，37℃过夜培养。第二天观察平板上是否有菌落长出。如果在有抗性的平板上出现菌落，证明制备感受态菌的过程中产生污染，则这批感受态菌全部丢弃。

B.转化及验证

1）电击转化过程如下：

1.吸去40μl冻融的感受态细胞入0.5ml冰冷的微量无菌离心管中。与电转化仪样品池仪器放在冰上冷却。

2.以1μl的体积向每一微型离心管中加入10pg-25ng的待转化DNA，置于冰上30-60s。包括所有的阳性与阴性对照。

3.调节电击仪，使电脉冲为25μF,电压2.5kV。

4.将细菌与DNA混合物加至冷的电击杯内，轻击液体以确保细菌与DNA悬液于电击杯底部。擦干电击槽外的冷凝水和雾气。将电击杯放进电击仪。

5.按上述设定参数，启动对细胞的电脉冲。

6.脉冲结束后，尽可能快地取出样品池，室温下加入1mlSOC培养液。

7.将细胞转移至离心管，于37℃在轻柔振荡下培养1h。

8.取不同体积的电击转化细胞，铺于含有适当抗菌素的琼脂板。其余菌液保存为甘油菌冻存。

9.室温下待培养板中的液体被完全吸收。

10.倒置培养板于37℃培养，转化克隆应在12-16h内出现。

2）电转化效率计算

不同体积的电击转化细胞涂布后，计数平板上的菌落数，计算出每次转化每管感受态菌获得的单克隆数目。转化效率为当连接产物为1μg时，所能获得的单克隆数目。并在此基础上计算初级库的库容量。

3）PCR阳性克隆验证

转化后，随机挑取单克隆菌于相应的氨苄霉素培养基中过夜振荡培养，取菌液用目的基因引物PCR验证，体系同前，验证为阳性的菌液保存。

实施例4、抗体库的验证

随机挑选180个来源自初级库中的单克隆在相应的氨苄霉素培养基中过夜培养，取菌液送至美吉生物医药科技有限公司进行测序处理。将测序结果经过序列比对分析，计算挑取克隆中的外源片段属于有意义的编码重链抗体可变区基因的比例。从而计算出抗体的多样性。

实施例5、纳米抗体通用基因抗体库的包装

A. M13K07单克隆噬菌体的扩增、纯化

1) TG1平板挑单菌落，接种于10ml新鲜的2×TY培养基中，37℃摇床培养过夜；

2)次日，以1:100的比例将过夜菌重新接种于10ml新鲜的2×TY培养基，37℃摇菌至OD600=0.4-0.6(约2.5h)；

3)将噬菌体原液进行一系列10倍梯度稀释，溶于100μL新鲜的2×TY培养基中，使得最后噬菌体的浓度约为103-105/ml；

4)微波炉高温融化已灭菌的2×TY上层琼脂，适当稀释液后冷却至45℃；

5)取每个M13K07噬菌体稀释液10l于500l新鲜的TG1细胞中，10min后加入适量的上层琼脂，充分混匀后立即将混合物倒于LB平板上，轻轻摇晃平板，将上层琼脂均匀铺开，然后于37℃静置培养过夜；

6)计算噬菌体滴度：原液噬菌体的滴度=噬菌斑数目×100×稀释的倍数；

7)选择一个数目在100~200的计数平板，随机挑取一个单噬菌斑，在1ml新鲜的TG1中吹洗，37℃振荡培养1h；

8)吸取100µl培养物于50ml新鲜的2×TY培养基中，30℃振荡培养24h；

9)将培养过夜菌转移至无菌离心管中，12000rpm，4℃离心10min，上清液转移至新的离心管中，加入1/5(v/v)的40%PEG 4000&2.5M NaCl溶液，强烈振荡混匀，然后将混合液冰浴20min；

10)冰浴混合物于12000rpm，4℃离心20min，尽量去除上清，用1/20体积的1×PBS缓冲液将沉淀重悬，重悬液于12000rpm，4℃离心5min，上清转移到新的无菌EP管中，即为M13K07；

11)对纯化好的M13K07用0.22µM滤膜过滤除菌保存，取适当的M13K07稀释后测其滴度(OD268=1.0对应约每微升5×1012个噬菌粒)。

B.原始纳米抗体通用基因库的制备

1）将获得的初级库重新接种于新鲜的2×TY培养基，37℃摇菌至OD600=0.4-0.6；

2)用20倍的M13K07(1013)100l对上溶液进行侵染，37℃静置侵染1h；

3)侵染液于4800rpm，室温离心15min，弃上清，沉淀在管底的细胞重悬于1L 2×TY+Amp(100g/ml)+Kan(50g/ml)+0.1%Glu中，然后30℃，150rpm振荡培养16-20h；

4)过夜培养菌分装于50ml无菌管中，12000rpm，4℃离心20min，上清转移到新的50ml无菌管中，加入1/5体积的40% PEG 4000&2.5 M NaCl溶液，强烈振荡混匀，然后冰浴20min；

5)冰浴后的溶液于12000rpm，4℃离心20min，弃上清，沉淀重悬于适量的无菌的1×PBS缓冲液中；

6)对纯化好的噬菌体用0.22µM滤膜过滤除菌保存，并测其滴度。

实施例5、表达质粒构建

A.引物设计

利用引物设计软件Prime Primer 5.0人工地设计出一对含有双酶切位点的引物，由上海生工生物技术公司合成。

上游：5’CCATGGATGTTTACTGTCACGGTTCCCAAG 3’包含Nco 1 site

下游：5’CTCGAGTCCACTCAGGACTTGATGGTC 3’包含Xhol 1 site

B. p-EGFP-N1-PD-L1质粒保存扩增

1）p-EGFP-N1-PD-L1质粒保存

1.将包含质粒的滤纸减下，将其溶于TE中。

2.取出三只50μL感受态菌冰浴放置至半融状态。

3.取1μl包含质粒的TE溶液在冰上与50μLDH5α感受态混匀，另外设立阳性(1μL已知质粒)、阴性对照(加入DDH2O)，冰浴30分钟。轻搅至混匀，冰浴30分钟。42℃水浴。

4.42℃热休克50-60秒，注意热休克时不能搅拌或振动，随后冰浴两分钟。

5.感受态菌加入200μl无抗生素LB液体培养基，37℃摇床培养1小时。

6.将孵育的菌液分别全部均匀涂板，37℃过夜培养

7.隔天挑取单克隆后，在包含卡纳抗性的LB培养基中培养。

8.菌落PCR验证

转化后，挑单一个转化克隆使用目的基因上下游引物进行PCR验证。

50μl PCR扩增产物中取5μL上样于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,观测条带大小是否在500bp左右。将阳性克隆摇菌后进行测序处理。

2）p-EGFP-N1-PD-L1质粒抽提

含p-EGFP-N1-PD-L1质粒的DH5α在30μg/ml卡那霉素LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒：

1.取1-4 ml过夜培养的细菌10，000×g离心1分钟，尽量吸尽上清。

2.加入250μl无色溶液RB (RNase A)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

3.加入250μl蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。

4.加入350μl黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

5.15，000×g离心5分钟，小心吸取上清加入吸附柱中。

6.15，000×g离心1分钟，弃流出液。

7.加入650μl溶液WB(加乙醇)，15，000×g离心1分钟，弃流出液。

8.15，000×g离心1-2分钟，彻底去除残留的WB。

9.将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去离子水(pH>7.0)室温静置1分钟。(EB或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好)。

10.10，000×g离心1分钟，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃保存。

C.重组质粒构建

1）pET-28a空载体抽提

含pET-28a质粒的DH5α在30μg/ml卡那霉素LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒。过程如前所述。

2）p-EGFP-N1-PD-L1和pET-28a双酶切

将质粒p-EGFP-N1-PD-L1与原核表达载体pET-28a(空载体)同时进行双酶切，酶切条件：37℃水浴1小时。

双酶切产物回收，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit方法如前所述。

3）酶切产物连接，连接条件：16℃水浴过夜反应。

4）转化Rosetta (DE3)感受态细胞

将连接产物转化如Rosetta (DE3)感受态细胞，隔天挑取转化克隆进行菌落PCR验证和测序处理。转化方法如前所述。

5）菌落PCR验证

转化后，挑单五个克隆菌置于相应的卡那霉素培养基中过夜摇菌，取菌液用目的基因引物PCR验证，验证为阳性的菌液保存1ml甘油菌(500μl 60％甘油，500μl菌液)。反应体系和参数如前所述。50μl PCR扩增产物中取5μL上样于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,观测条带大小。将阳性克隆摇菌后进行测序处理。

实施例6、蛋白快速诱导表达以及检测

A.蛋白快速诱导表达

目的是为检测该重组质粒在Rosetta(DE3)中是否能够诱导表达出重组蛋白。操作步骤如下：

1)将10μl甘油菌加入含有50μg/ml卡那抗性的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2)取100μl过夜菌加入含有50μg/ml卡那霉素抗性10ml LB液体培养液中，用50ml离心管37℃振荡约2.5小时，至OD600达到0.4-0.6时加入终浓度为0.4mM的IPTG，30℃诱导。(诱导前取1ml菌液做未诱导的对照，6000rpm离心3min，去上清，按OD600×100μl的量加入1×上样缓冲液，混匀。

3)诱导4h后收集菌液，取1ml样品，测其OD600值，样品处理方法同上。

4)根据我们蛋白分子量的大小配置12%的SDS-PAGE胶。

5)将处理后样品在水中煮5-10min，上样20μl，120V电压跑浓缩胶，加电压至150V跑分离胶，直至染料刚好走到胶底。

6)取下胶，考马斯亮蓝染色1小时，脱色液脱色过夜。

B.小量蛋白诱导表达

该步骤的目的是检测蛋白是否存在可溶性上清表达以及是否是目的融合蛋白。低温和低IPTG浓度可以降低目的蛋白的合成速度，使细菌有相对充分的时间对目的蛋白进行折叠，有利于蛋白表达于上清，实验方法如下：

1)取保存的甘油菌20μl于10ml含有50μg/ml卡那抗性的LB培养液中，37℃振荡培养过夜。

2)在50ml培养瓶中，取过夜培养液500μl加入含有50ml 50μg/ml卡那抗性的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600达到0.4-0.6。

3)各取1ml培养液测其OD600值，6000rpm离心3min，去上清。按OD600×100μl的量加入1×上样缓冲液，作为未诱导对照。

4)诱导时加入相应的0.4mMIPTG浓度，30℃摇床培养。

5)诱导约4小时后收集菌液，取40ml菌液于50ml离心管中，6000rpm，4℃离心15min，去上清。

6)以每100ml菌液加入4ml 1×PBS的比例重悬湿菌，先用枪头打碎菌块，再混匀。

7)加入终浓度为1mM的PMSF蛋白酶抑制剂，防止目的蛋白降解。

8)取1ml PBS重悬菌液于1.5ml EP管中超声，超声时EP管置于冰上。10s超声，15s间隔，200W，30次循环。

9) 4℃，12000rpm离心15min。上清置于新EP管中，沉淀用1ml PBS充分重悬。

10)按比例加入6×上样缓冲液，样品处理方法同前。

11) SDS-PAGE方法检验蛋白表达情况。

C.大量蛋白诱导表达

选取小量蛋白诱导表达中条件，在保证培养环境相同的情况下，扩大表达时LB的体积，以使蛋白能在近似相同的条件下表达，表达出的蛋白用于包涵体复性和纯化。

D.包涵体复性

1）包涵体加入2M尿素透析液重悬后，4℃，4800rpm离心30min，弃上清取沉淀。

2）沉淀用4M尿素透析液溶解后，4℃，4800rpm离心30min，取上清弃沉淀。

3）将上清导入透析袋中，透析袋置于透析液中，4℃下分别用2M,1M,0.5M尿素透析液进行梯度透析12h,期间换透析袋1-2次。

4）将透析袋置于PBS透析液中，4℃透析24h,期间换透析袋2-3次。

5)将透析袋中蛋白取出，4℃，4800rpm离心30min，取上清分装保存。

6）SDS-PAGE方法检验蛋白复性情况。

E. Ni2+-NTA亲和层析纯化

Ni-NTA树脂是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由4%交联的Sepharose(琼脂糖凝胶)耦连了一种四齿螯合剂NTA(金属螯合剂：次氮基三乙酸)。NTA含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。

纯化采用AKTA Purifier纯化仪，以及Ni-NTA预装柱。操作方法如下：

1)首先用1×PBS缓冲液平衡Ni-NTA预装柱，直至仪器显示的UV280、电导和pH均不再变化。

2)重组蛋白细胞裂解上清上样于Ni-NTA柱,上样速度0.5ml/min。

3)上样完毕，流出液即穿透液保留作为对照，然后用1×PBS缓冲液洗柱，直至仪器显示的UV280、电导和pH均不再变化。后分别用含50mM、100mM、250mM、1M咪唑的平衡缓冲液进行温和的梯度洗脱。

4）使用透析方法去除咪唑获得蛋白

5）将以上洗脱液SDS-PAGE检测。

实施例7、纳米抗体库的筛选、富集

PD-L1-Ig-V纳米抗体库的富集、筛选

先准备宿主菌：取冻存的TG1甘油菌，在无菌操作台将TG1菌液以划线法划于LB平板上，以便于次日挑单菌落。

1)抗原包被

取一定量的抗原加入到一定碳酸盐包被缓冲液(pH=9.6)，使其终浓度为30µg/ml，加入Nunc孔中，250l/孔，共3孔，37℃包被2h；

2)准备宿主菌

昨天过夜培养的TG1平板，挑取一个单菌落于新鲜的2×TY培养基(10ml)中，37℃摇床扩增培养，保证在第7步侵染时其OD600达到0.4~0.6；

3)乙醇胺封闭

10mM的乙醇胺溶液封闭活性位点：包被结束，将孔内液体扣干，用无菌的1×PBS加满孔洗涤10次，然后加入10mM的乙醇胺溶液，300l/孔，37℃封闭1h；

4) BSA封闭

3%的BSA封闭潜在蛋白结合位点：将孔内液体扣干，用无菌的1×PBS加满孔洗涤10次，然后加入3%的BSA，300µl/孔，37℃封闭1.5h；

5)加原始VHH抗体库

取原始噬菌体VHH库液300l(共约1013个噬菌体)与300l 3%的BSA混合(降低非特异性)，然后以200l/孔的体积加入Nunc孔中，于微量振荡器室温振荡40min，然后室温静置1h；

6)噬菌体洗脱、中和

无菌的1×PBST洗涤10次，后PBS洗涤10次，尽量甩干孔内的残留液体，然后加入10mM的HCl洗脱液200l/孔，于微量振荡器室温振荡洗脱30min；将洗脱液小心吸出(吸出的时候可以用移液枪小心吹打，以增加洗脱量)，加入到新的无菌的50ml离心管中，然后加入200l的0.1M Tris-HCl混匀中和；

7)噬菌体抗体库侵染宿主菌

将洗脱中和后的噬菌体加入到5ml OD600=4.0-6.0的新鲜的TG1菌液中，37℃静置40min；

8)洗脱计数

取适量侵染液用2×TY培养基稀释，以10倍梯度稀释(10-1-10-12)，取10µl的各稀释度的细胞液于LB-氨苄平板上涂布，37℃孵箱内孵育过夜，寻找平板上菌落数量在100~200之间的平板计算洗脱下来的噬菌体的数目；剩余的洗脱中和液加入5ml新鲜的2×TY培养基，37℃再摇荡培养30min；

9)辅助噬菌体M13K07侵染加5l的M13K07噬菌体(约1012个)于上侵染液中，37℃静置侵染1h，然后于4800rpm室温离心10min，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的2×TY培养基中，加Amp至100g/ml，Kan至50g/ml，葡萄糖加至0.1%，然后于30℃，200rpm振荡培养16-20h；

10)噬菌体的纯化

过夜菌转移至50ml无菌离心管中，4800rpm，4℃离心20min，弃沉淀，上清液转移到新的50ml离心管中，加入1/5体积比的40% PEG 4000&2.5M NaCl溶液，强烈振荡后冰浴20min；然后再于4800rpm，4℃离心20min，弃上清，用无菌的1×PBS缓冲液将沉淀重悬后用0.22M滤膜过滤除菌，并测其滴度，即为筛选第一轮的抗体库[86,87]。

第二、三、四、五、六轮的富集步骤同第一轮。

2.5.2.2 PD-L1-Ig-V VHH库特异性检测

VHH库的特异性通过ELISA方法检测，步骤如下：

1）抗原包被：浓度为2.5g/ml，阴性对照组为单纯的包被液组，100l/孔，4℃包被12h；

2）1×PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200µl/孔，37℃封闭1.5h；

3）1×PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，每孔中分别加入不同轮次的VHH噬菌体1011个，用5%的脱脂奶粉稀释，100l/孔，37℃静置1h；

4）1×PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复一次上面的洗涤过程，扣干孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100l/孔，37℃，1h；

5）1×PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复一次上面的洗涤过程，扣干孔内液体，加入显色底物液A+B液(两者体积比1:1)显色，100l/孔，显色时间根据阴性对照组定；

6）终止，2M的H2SO4，50l/孔；

7）酶标仪读取OD450值，并分析结果。

实施例8、单克隆抗体阳性克隆筛选

1、单克隆VHH菌落的挑选

1）根据纳米抗体库的富集度检测结果，选择到达平台期的第五轮和第六轮筛选得到的抗体库中随机挑选55个VHH单克隆菌落，分别接种于1ml新鲜的2×TY+Amp(100µg/ml)，37℃振荡培养过夜；

2）次日重新1:100接种于5 ml新鲜的2×TY+Amp(100g/ml)，37℃振荡培养至OD600=0.4-0.6后分别用M13K07侵染辅助扩增，37℃静置侵染1h；

3）4800rpm，室温离心10min，弃上清，沉淀重悬于5 ml新鲜的2×TY+Amp(100g/ml)+Kan(50g/ml)+IPTG (1mM)培养

4）次日于4800rpm，4℃离心20min，上清转移至新的离心管中，直接作为抗体进行ELISA检测。

2、单克隆VHH ELISA检测

A.单克隆阳性克隆初筛选

1）抗原包被：抗原PD-L1-Ig-V包被，浓度为2.5g/ml，100l/孔，4℃包被12h；

2) 1×PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200µl/孔，37℃封闭1.5h；

3) 1×PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将每个单克隆上清分别加入对应的孔内，100l/孔，37℃静置1h；

4) 1×PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干孔内液体，加入HRP-Anti-M13KO7兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100l/孔，37℃，1h；

5) 1×PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干孔内液体，加入显色底物液A+B液(两者体积比1:1)显色，100l/孔，显色时间根据阴性对照组定；

6)终止，2M的H2SO4，50l/孔；

7)酶标仪读取OD450值，并进行数据分析。

B.阳性克隆特异性初步检测

因为得到的抗体有可能是靶向结合His-Tag，所以为了排除干扰而导致的假阳性，我们进行His-Tag抗体的排除实验，选择同样具有His-Tag的Cys-C蛋白以及完全无关蛋白BSA作为对照组进行抗原包被，进而进行假阳性的排除。

1）对之前所得的八株阳性克隆，进行扩增纯化。

1.阳性克隆原菌液重新1:100接种于10ml新鲜的于2×TY培养基+Amp(100µg/ml)，37℃摇至OD600=0.4-0.6；

2.辅助噬菌体M13K07侵染：上菌液中加入5l的M13K07噬菌体(约1012个)，37℃静置侵染1h；

3.侵染液于4800rpm，室温离心10min，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的2×TY+ Amp(100g/ml)+Kan(50g/ml)+IPTG(1mM)，30℃，200rpm振荡培养16-20h；

4.噬菌体抗体的的纯化：将过夜菌转移到50ml无菌离心管中，4800rpm，4℃离心20min，将上清转移到新的50ml离心管中，加入体积比为1/5的40% PEG 4000&2.5M NaCl溶液，强烈振荡后冰浴20min；然后再于4800rpm，4℃离心20min，弃上清，沉淀重悬于适量无菌的1×PBS缓冲液中，然后用0.22M的滤膜过滤除菌，并进行滴度测定。

2）阳性克隆特异性检测

1.抗原包被：抗原PD-L1-Ig-V、Cys-C和BSA包被，浓度均为2.5g/ml，100l/孔，4℃包被12h；

2.1×PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200µl/孔，37℃封闭1.5h；

3.1×PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将每个单克隆上清分别加入对应的孔内，100l/孔，37℃静置1h；

4.1×PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干孔内液体，加入HRP-Anti-M13KO7兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100l/孔，37℃，1h；

5.1×PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干孔内液体，加入显色底物液A+B液(两者体积比1:1)显色，100l/孔，显色时间根据阴性对照组定；

6.终止，2M的H2SO4，50l/孔；

7.酶标仪读取OD450值，并进行数据分析。

由图2所示，八株单克隆中6-21号克隆PD-L1-Ig-V的吸光度与Cys-C吸光度差距较大，比值大于2.5。同时单克隆6-13,6-16,6-20和6-21PD-L1-Ig-V的吸光度与BSA吸光度差距较大。综合来说，6-21号克隆可视为特异性的单克隆。

实施例9、单克隆纳米抗体氨基酸编码序列测定

根据上述实施例结果，取保存的单克隆甘油菌，重新划线后挑去单克隆过夜摇菌后，取1ml送于公司测序，并对其序列进行分析，序列如SEQ ID NO.1所示。

氨基酸序列共分为7部分：4个骨架区分别为FR1(SEQ ID NO.5)、FR2(SEQ IDNO.6)、FR3(SEQ ID NO.7)及FR4(SEQ ID NO.8)，3个超变区分别为CDR1(SEQ ID NO.2)、CDR2(SEQ ID NO.3)及CDR3(SEQ ID NO.4)。

重组表达纳米抗体的方法：首先，将VHH编码序列插入到pET28a载体的多克隆位点中，在宿主菌Rosta(购自北京全式金生物技术有限公司)中进行蛋白表达，重组菌株表达方法如下：

(1)取保存的甘油菌20μl于10ml含有50μg/ml卡那抗性的LB培养液中，37℃振荡培养过夜。

(2)在50ml培养瓶中，取过夜培养液500μl加入含有50ml50μg/ml卡那抗性的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600达到0.4-0.6。

(3)各取1ml培养液测其OD600值，6000rpm离心3min，去上清。按OD600×100μl的量加入1×上样缓冲液，作为未诱导对照。

(4)诱导时加入相应的0.5mMIPTG浓度，30℃摇床培养。

(5)诱导约6小时后收集菌液，取40ml菌液于50ml离心管中，6000rpm，4℃离心15min，去上清。

(6)以每100ml菌液加入4ml 1×PBS的比例重悬湿菌，先用枪头打碎菌块，再混匀。

(7)加入终浓度为1mM的PMSF蛋白酶抑制剂，防止目的蛋白降解。PMSF有剧毒，拿装PMSF的试管时必须带上手套。

(8)取1ml PBS重悬菌液于1.5ml EP管中超声，超声时EP管置于冰上。10s超声，15s间隔，200W，30次循环。

(9)超声后加入终浓度2% Triton-100帮助目的蛋白融解于上清，不会影响目的蛋白活性。

(10) 4℃，12000rpm离心15min。上清置于新EP管中，沉淀用1ml PBS充分重悬。

(11)按比例加入6×上样缓冲液，样品处理方法同前。

(12) SDS-PAGE和蛋白免疫印记分析方法检验抗体表达情况。

(13)选取小量抗体诱导表达中条件，在保证培养环境相同的情况下，扩大表达时LB的体积，以使抗体能在近似相同的条件下表达，表达出的抗体直接用于纯化。经验证，表达纯化后获得序列正确的纳米抗体。

实施例10、棋盘法亲和常数测定

运用棋盘法对抗体PD-L1-Ig V-VHH 6-21及抗原浓度进行摸索，即抗原、抗体均进行不同浓度梯度稀释。抗原包被浓度分别为：5g/ml、2.5g/ml、1.25g/ml和0.625g/ml，100l/孔；抗体孵育浓度分别为：8.3nM，1.66nM，0.332nM依次梯度稀释至5.312×10-4nM，100l/孔，观察不同浓度条件下，抗体与抗原的结合能力，计算其亲和常数Kaff。

通过对该噬菌体的抗原与抗体浓度关系的摸索，如图3所示：随着抗体浓度的增加，吸光值逐渐增加，而在其最大浓度下开始进入平台期。随着抗原浓度的增加，抗原与抗体的结合力也明显增加，但是在5g/ml和2.5g/ml浓度条件下，增幅较小，判断接近平台期。综合多方面因素，最佳抗原包被浓度为2.5g/ml，抗体的孵育浓度为1.66nM,即1011/孔。

根据非竞争性亲和力计算法，Kaff=(n-1)/2(n[Ab’]-[Ab])，式中[Ab]和[Ab’]分别代表当抗原浓度为[Ag]和[Ag’]时OD50(即最大光吸收密度一半)对应的抗体浓度(mol/L)，n= [Ag]/[Ag’]。然后两两比较，n= 8时可得1个K值；当n=4时，可得2个K值；n= 2时可得3个K值；最后对6个K值求平均值作为即为最后结果。通过计算，该抗体PD-L1-Ig-V-VHH 6-21的Kaff约为1.933×108L/mol。

以上所述，仅为此发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案和新型的构思加于等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西宝生物科技（上海）股份有限公司

<120> 一种特异性识别PD-L1的纳米抗体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 137

<212> PRT

<213> 纳米抗体(人工序列)

<400> 1

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Met Ile Phe Ser

20 25 30

Thr Phe Ser Ile Gln Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gln Arg Asp Leu Val Ala Leu Ile Thr Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Asp Asn Val Ser Gly Gly Arg Leu Leu

100 105 110

Leu Asn Ile Trp Trp Met Arg Asp Met Trp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> CDR1

<400> 2

Arg Met Ile Phe Ser Thr Phe Ser Ile Gln Asp

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> CDR2

<400> 3

Ile Thr Ser Asp Gly Ser Thr Asn

1 5

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> CDR3

<400> 4

Ala Ala Thr Asp Asn Val Ser Gly Gly Arg Leu Leu Leu Asn Ile Trp

1 5 10 15

Trp Met Arg Asp Met Trp Tyr Asn Tyr

20 25

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> FR1

<400> 5

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> FR2

<400> 6

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala

1 5 10 15

Leu

<210> 7

<211> 37

<212> PRT

<213> FR3

<400> 7

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> FR4

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

1 5 10

Claims

1.一种特异性识别PD-L1的纳米抗体，所述纳米抗体的互补决定区包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列CDR1、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列CDR2和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列CDR3。

2.如权利要求1所述的一种特异性识别PD-L1的纳米抗体,其特征在于，所述纳米抗体的骨架区包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列FR1、SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列FR2、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列FR3和SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列FR4。

3.如权利要求2所述的一种特异性识别PD-L1的纳米抗体,其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种多核苷酸，其特征在于，其编码具有权利要求1~3任一所述的纳米抗体。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中包括权利要求4所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的一种表达载体，其特征在于，所述表达载体优选为pET28a。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞内包括权利要求5~6任一所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞优选为大肠杆菌。

9.一种纳米抗体噬菌体，其特征在于，所述噬菌体表面包括权利要求1~3任一所述的纳米抗体。

10.一种用于检测PD-L1的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一所述的纳米抗体或权利要求9所述的纳米抗体噬菌体。

11.如权利要求10所述的一种用于检测PD-L1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体或纳米抗体噬菌体被固定于固相载体中。

12.如权利要求11所述的一种用于检测PD-L1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括能与所述的纳米抗体连接的可检测标记物，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米抗体或分离地存在于试剂盒中；和/或PD-L1标准品或PD-L1偶联物标准品；和/或与可检测标记物相对应的底物；和/或酶联免疫反应试剂。

13.一种用于非治疗目的的检测待测样品中PD-L1存在情况的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、以权利要求1~3任一所述的纳米抗体或权利要求9所述的纳米抗体噬菌体作为PD-L1的检测抗体，通过酶联免疫反应法来检测待测样品中PD-L1的存在情况。

14.如权利要求13所述的一种用于非治疗目的的检测待测样品中PD-L1存在情况的方法，其特征在于，所述步骤S1中，具体包括以下步骤：将待测样品包被于固相载体上，以携带或不携带可检测标记物的所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体作为检测抗体，检测PD-L1的存在情况。

15.一种免疫缀合物，其特征在于，包括治疗剂和与所述治疗剂缀合的如权利要求1~3任一所述的纳米抗体，所述治疗剂包括毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。

16.一种双特异性抗体，其特征在于，包括权利要求1~3任一所述的纳米抗体，以及与所述纳米抗体功能性连接的具有另一种抗原结合特性的抗体或抗体片段。

17.一种药用组合物，其特征在于，包括权利要求1~3任一所述的纳米抗体，以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

18.如权利要求1~3任一所述的纳米抗体和如权利要求15所述的免疫缀合物、如权利要求16所述的双特异性抗体，以及如权利要求17所述的药用组合物在制备用于治疗PD-L1介导的疾病的药物中的用途。