CN116272708A - 一种量子点-抗体复合物微球及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种量子点‑抗体复合物微球及其制备方法、应用，包括：取量子点溶液，加入EDC溶液，涡旋混匀，加入NHS溶液和纳米抗体Nb90溶液，轻轻搅拌，培养后离心，加入磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，加入水解乳清蛋白溶液，反应后，加入乙醇胺，终止反应，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得的修饰量子点‑抗体复合物溶液；取DTAB加入修饰量子点‑抗体复合物溶液，超声，加入表面活性剂，搅拌反应后，加入乳清蛋白溶液，搅拌，得量子点‑抗体复合物微球溶液。本发明选用CTLA‑4特异性抗体与量子点结合，得量子点‑抗体复合物微球，CTLA‑4特异性抗体可有效结合CTLA‑4+T细胞，量子点则提供强的荧光信号，能够用于检测CTLA‑4+T细胞。
Description
技术领域
本发明涉及抗原检测领域，特别涉及一种量子点-抗体复合物微球及其制备方法、应用。
背景技术
细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。
目前，多种方法用于检测CTLA-4+ T细胞，其中荧光偶联单克隆抗体(单克隆抗体)是最常用的方法。由于CTLA-4+ T细胞亚群在外周血和肿瘤组织中的比例较低，且易受到肿瘤微环境的干扰，导致采用单克隆抗体检测时难度增加，且费用昂贵。因此，迫切需要一种更简单、更敏感的检测方法来监测CTLA-4+T细胞亚群。纳米体(Nbs)是一种特殊类型的单结构域抗体，由不同区域的重链抗体组成，存在于骆驼的血液中。与传统抗体相比，Nbs具有高特异性、理化稳定性高、缺乏免疫原性、产量高、成本低等优点，适合于癌症的免疫靶向诊断和治疗。采用CTLA-4特异性抗体，并与CTLA 4+ T细胞有效结合，能够有效提高对CTLA4+ T细胞检测的特异性和敏感性。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种量子点-抗体复合物微球及其制备方法、应用，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，包括如下步骤：
S1配制量子点溶液：在磷酸盐缓冲液中加入量子点，振荡，静置，得量子点溶液；
S2制备量子点-抗体复合物：采用磷酸盐缓冲液溶液溶解纳米抗体Nb90，得纳米抗体Nb90溶液；
取步骤S1的量子点溶液，加入EDC溶液，涡旋混匀，加入NHS溶液和纳米抗体Nb90溶液，轻轻搅拌，培养；培养后离心，收集共轭量子点-抗体复合物，加入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得量子点-抗体复合物溶液；
在量子点-抗体复合物溶液中加入水解乳清蛋白溶液，于36-38℃反应后，加入乙醇胺，于36-38℃终止反应，离心，收集沉淀物，加入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得的修饰量子点-抗体复合物溶液；
S3制备量子点-抗体复合物微球溶液：取DTAB加入水，边搅拌边加入步骤S2的修饰量子点-抗体复合物溶液，超声，加入表面活性剂，搅拌反应后，加入乳清蛋白溶液，搅拌，得量子点-抗体复合物微球溶液。
进一步说明，步骤S2中，所述纳米抗体Nb90溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL。
进一步说明，步骤S2中，所述量子点溶液、DEC溶液、NHS溶液和纳米抗体Nb90溶液的体积比为4-4.5：10-12：10-12：25-27，EDC溶液的浓度为1-1.4mM，NHS溶液的浓度为1-1.4mM；所述培养1-1.5h，所述离心的条件为：10000-12000r/min离心20-30min。
进一步说明，步骤S2中，所述量子点-抗体复合物溶液的质量浓度为8-12mg/mL，所述修饰量子点-抗体复合物溶液的质量浓度为4-6mg/mL。
进一步说明，步骤S2中，所述量子点-抗体复合物溶液、水解乳清蛋白溶液和乙醇胺的体积比为25-27：1-1.2：3-3.5，所述36-38℃反应30-40min，所述36-38℃终止反应30-40min。
进一步说明，步骤S3中，所述DTAB、水和修饰量子点-抗体复合物溶液的料液质量体积比为15-17mg：20-22mL：1.5-2mL。
进一步说明，步骤S3中，所述超声的条件为：超声温度为4-5℃，超声功率为300-400W，超声时间为30-40min；所述搅拌反应的时间为9-11h。
进一步说明，步骤S3中，所述表面活性剂为烷基葡糖苷，烷基葡糖苷的加入量为体系的2.5-4wt％。
进一步说明，本发明提供一种量子点-抗体复合物微球的制备方法制备得到的量子点-抗体复合物微球。
进一步说明，本发明提供一种量子点-抗体复合物微球在提高与CTLA-4+T细胞的结合率中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明选用CTLA-4特异性抗体与量子点结合，提供一种新的量子点-抗体复合物微球，CTLA-4特异性抗体可有效结合CTLA-4+ T细胞，量子点则提供强的荧光信号，采用量子点-抗体复合物微球能够用于检测CTLA-4+ T细胞。
其中，本发明通过水解乳清蛋白溶液和乙醇胺制成的修饰量子点-抗体复合物，结合DTAB、烷基葡糖苷和乳清蛋白制成的量子点-抗体复合物微球，在PHA刺激的细胞中，量子点-抗体复合物微球与CTLA-4+ T细胞具有较强的特异性结合，在肿瘤浸润的T细胞中，量子点-抗体复合物微球检测到的阳性细胞数量高于抗CTLA-4单抗，这些结果表明，量子点-抗体复合物微球的检测效率明显高于抗CTLA-4单抗，提高检测CTLA-4+ T细胞的特异性和荧光强度。
本发明获得的量子点-抗体复合物微球对细胞无毒性，本发明提供的特异性抗体与量子点结合的方法，也可用于其他靶点的特异性抗来检测其他生物靶点，方法简单，效果明显，优于单克隆抗体的检测。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
S1配制量子点溶液：在磷酸盐缓冲液中加入量子点，振荡4min，静置4h，得量子点溶液；
S2制备量子点-抗体复合物：采用磷酸盐缓冲液溶液溶解纳米抗体Nb90，得到质量浓度为1mg/mL的纳米抗体Nb90溶液；
取80μL量子点溶液，加入200μL EDC(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐Thermo Scientific Pierce，简称EDC)溶液(1.2mM)，涡旋混匀10min，加入200μL NHS溶液(N-羟基琥珀酰亚胺N-Hydroxysuccinimide，简称NHS)(1.2mM)和500μL纳米抗体Nb90溶液(1mg/mL)，轻轻搅拌，培养1h；10000r/min离心20min，收集共轭量子点-抗体复合物，加入含有1％(m/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得质量浓度10mg/mL的量子点-抗体复合物溶液；
在50μL量子点-抗体复合物溶液中20μL加入质量浓度8％的水解乳清蛋白溶液，于37℃反应30min后，加入6μL的乙醇胺，于37℃终止反应30min，10000r/min离心20min，收集沉淀物，加入含有1％(m/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得质量浓度5mg/mL的修饰量子点-抗体复合物溶液；
S3制备量子点-抗体复合物微球溶液：取15mg DTAB(十二烷基三甲基溴化铵Dodecyltrimethylammonium bromide，简称DTAB)加入22mL水，边搅拌边加入2mL质量浓度5mg/mL的修饰量子点-抗体复合物溶液，4℃、400W超声30min，加入3wt％烷基葡糖苷，搅拌反应10h后，加入质量浓度8％的乳清蛋白溶液，搅拌40min，得量子点-抗体复合物微球溶液。
实施例2
S1配制量子点溶液：在磷酸盐缓冲液中加入量子点，振荡4min，静置4h，得量子点溶液；
S2制备量子点-抗体复合物：采用磷酸盐缓冲液溶液溶解纳米抗体Nb90，得到质量浓度为1.5mg/mL的纳米抗体Nb90溶液；
取90μL量子点溶液，加入240μL EDC(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐Thermo Scientific Pierce，简称EDC)溶液(1.2mM)，涡旋混匀10min，加入240μL NHS溶液(N-羟基琥珀酰亚胺N-Hydroxysuccinimide，简称NHS)(1.2mM)和540μL纳米抗体Nb90溶液(1.5mg/mL)，轻轻搅拌，培养1.5h；10000r/min离心30min，收集共轭量子点-抗体复合物，加入含有1％(m/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得质量浓度12mg/mL的量子点-抗体复合物溶液；
在50μL量子点-抗体复合物溶液中20μL加入质量浓度8％的水解乳清蛋白溶液，于37℃反应40min后，加入6μL的乙醇胺，于37℃终止反应40min，10000r/min离心20min，收集沉淀物，加入含有1％(m/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得质量浓度6mg/mL的修饰量子点-抗体复合物溶液；S3制备量子点-抗体复合物微球溶液：取15mg DTAB(十二烷基三甲基溴化铵Dodecyltrimethylammonium bromide，简称DTAB)加入22mL水，边搅拌边加入2mL质量浓度5mg/mL的修饰量子点-抗体复合物溶液，4℃、300W超声40min，加入4wt％烷基葡糖苷，搅拌反应10h后，加入质量浓度8％的乳清蛋白溶液，搅拌40min，得量子点-抗体复合物微球溶液。
对比例1
S1配制量子点溶液：在磷酸盐缓冲液中加入量子点，振荡4min，静置4h，得量子点溶液；
S2制备量子点-抗体复合物：采用磷酸盐缓冲液溶液溶解纳米抗体Nb90，得到质量浓度为1mg/mL的纳米抗体Nb90溶液；
取80μL量子点溶液，加入200μL EDC(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐Thermo Scientific Pierce，简称EDC)溶液(1.2mM)，涡旋混匀10min，加入200μL NHS溶液(N-羟基琥珀酰亚胺N-Hydroxysuccinimide，简称NHS)(1.2mM)和500μL纳米抗体Nb90溶液(1mg/mL)，轻轻搅拌，培养1h；10000r/min离心20min，收集共轭量子点-抗体复合物，加入含有1％(m/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得质量浓度10mg/mL的量子点-抗体复合物溶液。
对比例2
S1配制量子点溶液：在磷酸盐缓冲液中加入量子点，振荡4min，静置4h，得量子点溶液；
S2制备量子点-抗体复合物：采用磷酸盐缓冲液溶液溶解纳米抗体Nb90，得到质量浓度为1mg/mL的纳米抗体Nb90溶液；
取80μL量子点溶液，加入200μL EDC(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐Thermo Scientific Pierce，简称EDC)溶液(1.2mM)，涡旋混匀10min，加入200μL NHS溶液(N-羟基琥珀酰亚胺N-Hydroxysuccinimide，简称NHS)(1.2mM)和500μL纳米抗体Nb90溶液(1mg/mL)，轻轻搅拌，培养1h；10000r/min离心20min，收集共轭量子点-抗体复合物，加入含有1％(m/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得质量浓度10mg/mL的量子点-抗体复合物溶液；
在50μL量子点-抗体复合物溶液中20μL加入质量浓度8％的水解乳清蛋白溶液，于37℃反应30min后，加入6μL的乙醇胺，于37℃终止反应30min，10000r/min离心20min，收集沉淀物，加入含有1％(m/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得质量浓度5mg/mL的修饰量子点-抗体复合物溶液。
实施例3
分离外周血单个核细胞，在含有10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃培养2h后，去除贴壁细胞，用尼龙毛分离T细胞，得T细胞；取质量浓度10μg/mL PHA，(聚羟基脂肪酸Polyhydroxyalkanoates，简称PHA)，加入T细胞(细胞密度为1×106个)，加入2％ BSA(牛血清白蛋白)，于24℃搅拌孵化30min，以避免非特异性结合，采用300μL磷酸盐缓冲液重悬T细胞，至细胞密度为4×105个，加入上述实施例的量子点-抗体复合物微球溶液，在RPMI1640培养基中，于4℃培养30min后，冲洗，300μL磷酸盐缓冲液重悬刺激T细胞，对照组给予等效剂量的抗CTLA-4单抗和量子点，采用PBS缓冲液洗涤3次，然后用质量浓度4％聚甲醛室温固定15min，PBS缓冲液洗涤后，在4℃结合缓冲液中孵育50min，PBS缓冲液洗涤3次，重悬细胞，采用流式细胞术检测结合率，结果如下表1。
表1
| 项目 | 实施例1 | 量子点 | 抗CTLA-4单抗 | 对比例1 | 对比例2 |
| 结合率/％ | 45.8 | 0.25 | 30.7 | 34.9 | 38.3 |
由上表1可知，量子点-抗体复合物微球和抗CTLA-4单抗特异性结合到CTLA-4+ T细胞。在Pha刺激的细胞中，与抗CTLA-4单抗相比，量子点-抗体复合物微球与CTLA-4+ T细胞的结合率更高，而量子点的结合率则最小，表明量子点-抗体复合物微球可用于高效地检测CTLA-4+ T细胞。
与对比例1和2相比，本发明通过水解乳清蛋白溶液和乙醇胺制成的修饰量子点-抗体复合物，结合DTAB、烷基葡糖苷和乳清蛋白制成的量子点-抗体复合物微球，可更有效提高与CTLA-4+ T细胞的结合效率。
实施例4
将肿瘤组织以及邻近粘膜浸泡在最佳切割温度的化合物中，加工成冷冻切片(-20℃)。采用量子点-抗体复合物微球溶液、抗CTLA-4单抗和量子点分别孵育后进行免疫荧光染色。将样品组织切割后，加入EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0)浸泡5min，缓慢加热至99℃并持续10min进行抗原修复，将切片放入PBS冲洗缓冲液中浸泡清洗两次，每次5min，加入胶原酶II进行消化，使用抗人CD3单克隆抗体免疫磁珠试剂盒，通过流式细胞术进行分析，检测CD3和CTLA-4表达的特异性抗体(抗人CD3单抗、量子点-抗体复合物微球、抗CTLA-4单抗和量子点的浓度为100nM，4℃孵育30min)，结果如下表2。
表2
| 项目 | 实施例1 | 量子点 | 抗CTLA-4单抗 | 对比例1 | 对比例2 |
| 肿瘤 | 16.2 | 0.30 | 12.1 | 12.5 | 14.2 |
| 邻近粘膜 | 5.7 | 0.22 | 3.9 | 4.2 | 4.5 |
由上表2可知，对肿瘤组织和邻近粘膜进行免疫荧光染色，研究量子点-抗体复合物微球或抗CTLA-4单抗在肿瘤组织中浸润的CTLA-4+ T细胞的荧光信号明显高于邻近粘膜。量子点-抗体复合物微球检测到的阳性细胞数量高于抗CTLA-4单抗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1配制量子点溶液：在磷酸盐缓冲液中加入量子点，振荡，静置，得量子点溶液；
S2制备量子点-抗体复合物：采用磷酸盐缓冲液溶液溶解纳米抗体Nb90，得纳米抗体Nb90溶液；
取步骤S1的量子点溶液，加入EDC溶液，涡旋混匀，加入NHS溶液和纳米抗体Nb90溶液，轻轻搅拌，培养；培养后离心，收集共轭量子点-抗体复合物，加入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得量子点-抗体复合物溶液；
在量子点-抗体复合物溶液中加入水解乳清蛋白溶液，于36-38℃反应后，加入乙醇胺，于36-38℃终止反应，离心，收集沉淀物，加入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液进行重悬，得的修饰量子点-抗体复合物溶液；
S3制备量子点-抗体复合物微球溶液：取DTAB加入水，边搅拌边加入步骤S2的修饰量子点-抗体复合物溶液，超声，加入表面活性剂，搅拌反应后，加入乳清蛋白溶液，搅拌，得量子点-抗体复合物微球溶液。
2.根据权利要求1的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述纳米抗体Nb90溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL。
3.根据权利要求1的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述量子点溶液、DEC溶液、NHS溶液和纳米抗体Nb90溶液的体积比为4-4.5：10-12：10-12：25-27，EDC溶液的浓度为1-1.4mM，NHS溶液的浓度为1-1.4mM；所述培养1-1.5h，所述离心的条件为：10000-12000r/min离心20-30min。
4.根据权利要求1的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述量子点-抗体复合物溶液的质量浓度为8-12mg/mL，所述修饰量子点-抗体复合物溶液的质量浓度为4-6mg/mL。
5.根据权利要求1的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述量子点-抗体复合物溶液、水解乳清蛋白溶液和乙醇胺的体积比为25-27：1-1.2：3-3.5，所述36-38℃反应30-40min，所述36-38℃终止反应30-40min。
6.根据权利要求1的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述DTAB、水和修饰量子点-抗体复合物溶液的料液质量体积比为15-17mg：20-22mL：1.5-2mL。
7.根据权利要求1的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述超声的条件为：超声温度为4-5℃，超声功率为300-400W，超声时间为30-40min；所述搅拌反应的时间为9-11h。
8.根据权利要求1的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述表面活性剂为烷基葡糖苷，烷基葡糖苷的加入量为体系的2.5-4wt％。
9.根据权利要求1～8任意一项的一种量子点-抗体复合物微球的制备方法制备得到的量子点-抗体复合物微球。
10.根据权利要求9的一种量子点-抗体复合物微球的应用，其特征在于，所述量子点-抗体复合物微球在提高与CTLA-4+T细胞的结合率中的应用。
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