CN113916852A - 血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法 - Google Patents

血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法，包括步骤：提供磁性纳米杨梅颗粒；加CD63适配体形成AptCD63‑磁性纳米杨梅颗粒；加外泌体使其与AptCD63‑磁性纳米杨梅颗粒结合形成外泌体复合物；加三种荧光探针分别结合所述外泌体表面的EGFR、EpCAM、或嵌入外泌体脂质双分子层中；用荧光光谱仪检测三种荧光探针的荧光强度，利用荧光强度与外泌体浓度、外泌体膜蛋白EGFR浓度、外泌体膜蛋白EpCAM浓度之间的相关关系，实现对外泌体浓度及外泌体膜蛋白EGFR和EpCAM浓度的同步检测。所以，本发明提供的上述同步检测方法具有潜在的临床应用价值。

Description

血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法
技术领域
本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法。
背景技术
外泌体（exosomes）是液体活检的生物标志物之一，为细胞主动分泌来进行细胞间通讯的直径在30～150 nm的细胞外囊泡。几乎所有细胞都能分泌外泌体，且几乎所有的体液中都含有外泌体。它具有许多不可替代的优点，包括含量高（每毫升血液中可达1010个）、稳定、能反映其来源细胞的实时状态，含有丰富的可检测靶标。研究表明，单个肿瘤细胞每天可释放大量的外泌体（超过104个），明显高于正常细胞。越来越多的证据表明，肿瘤患者的外泌体含量较健康人显著增加。除此之外，外泌体蛋白在肿瘤形成、肿瘤进展和转移中也起到关键作用，如促进上皮间质转化，诱导肿瘤血管生成，促进转移前生态位的形成等，是潜在的肿瘤标志物。
然而，目前极少有方法可以实现外泌体浓度和外泌体中蛋白质的同时定量检测。检测外泌体浓度的难点主要是如何在不需要繁琐的外泌体提取过程的前提下特异精确检测纳米级的外泌体。现常用的纳米颗粒跟踪分析仪不仅需要采用超速离心等耗时的程序来分离外泌体，而且还存在特异性低的问题。为了提高外泌体检测的特异性，研究人员提出了采用信号标记抗体或适配体来识别外泌体表面的特异性蛋白质进而实现外泌体的定量。然而，由于不同生理状态或细胞来源下外泌体蛋白质的含量差异较大，因此这种方法在推广使用时不可避免地存在偏差。此外，生物样品中的可溶性蛋白质也可能引起假阳性信号。
对于外体蛋白质的检测，目前主要有三个难点。第一个难点是如何实现多种蛋白质的同时检测。第二个难点在于如何实现低浓度外泌体蛋白质的检测。第三个难点是如何避免生物样品中可溶性蛋白质的干扰。现有的方法很难同时解决这三个难点。例如，传统的多种目标物检测策略通常采用单信号检测模式，存在着操作繁琐、需要的样品量大、准确率低等明显缺陷。酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前检测外泌体蛋白质的最常用方法之一，但是该方法不仅耗时而且灵敏度较低。近年来有研究报道了一步法检测策略，这类方法操作简便，但无法避免可溶性蛋白质的干扰。综上所述，目前仍需开发灵敏准确的方法来同时检测外泌体浓度和外泌体膜蛋白。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种基于适配体-磁性纳米杨梅颗粒的荧光（FL）分析法用于外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测。
其中，本文中的“磁性纳米杨梅”其主要是通过ZnO纳米线（NWs）原位生长在二氧化硅磁珠（MBs）上，形成形似杨梅的磁性纳米材料制得。本文中的“外泌体膜蛋白EGFR”是指外泌体中的表皮生长因子受体，“外泌体膜蛋白EpCAM”是指外泌体中的上皮细胞粘附分子。
为此，本发明提供一种血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法，包括：
提供磁性纳米杨梅颗粒 提供一种磁性纳米杨梅颗粒，该磁性纳米杨梅颗粒包括二氧化硅磁珠和形成在该二氧化硅磁珠表面的氧化锌纳米线，且所述磁性纳米杨梅颗粒外形呈杨梅状；
加CD63适配体（AptCD63） 先对所述磁性纳米杨梅颗粒中的氧化锌纳米线进行氨基化处理，形成氨基化磁性纳米杨梅颗粒；再对AptCD63和所述氨基化磁性纳米杨梅颗粒进行偶联处理，形成AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒，其中，该AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒的CD63适配体与氨基化磁性纳米杨梅偶联；
加外泌体 将所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒与外泌体溶液混合进行室温孵育处理，经磁分离处理，获得外泌体复合物，该外泌体复合物为所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒与外泌体的结合体；
加荧光探针 先将三种荧光探针溶液同时与所述外泌体复合物混合，进行室温孵育处理；再经磁分离处理，收集待测上清液；其中，所述三种荧光探针溶液分别是外泌体EGFR适配体探针溶液、外泌体膜蛋白EpCAM适配体探针溶液和外泌体脂质探针溶液，所述待测上清液中含有三种荧光探针；
荧光检测及建立回归方程 采用荧光光谱仪同步测定所述待测上清液中的三种荧光探针的荧光强度，利用荧光探针的荧光强度与外泌体膜蛋白EGFR浓度、外泌体膜蛋白EpCAM浓度、外泌体浓度之间的关系建立对应的回归方程。
基于上述，所述提供磁性纳米杨梅颗粒的步骤包括：
形成氧化锌种子层 在超声条件下，醋酸锌、氢氧化钠和二氧化硅磁珠均匀混合，在所述二氧化硅磁珠表面生成氧化锌种子，形成种子层包覆磁珠颗粒；
生长氧化锌纳米线 在聚乙烯醇水溶液中，先将硝酸锌和所述种子层包覆磁珠颗粒均匀混合，再加入六亚甲基四胺于70℃～100℃发生反应，在所述二氧化硅磁珠表面生长氧化锌纳米线，制得所述磁性纳米杨梅颗粒。
基于上述，所述加CD63适配体的步骤包括：
氨基化处理 将所述磁性纳米杨梅颗粒加入无水乙醇中，并均匀搅拌形成纳米杨梅悬浮液；在搅拌作用下，依次向所述纳米杨梅悬浮液中滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷水混合溶液和乙酸；持续搅拌18～36 h，离心分离处理，得到氨基化磁性纳米杨梅颗粒；
偶联处理 将所述氨基化磁性纳米杨梅颗粒、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、吗啉乙磺酸缓冲液、CD63适配体溶液均匀混合，并进行震荡孵育和磁分离处理，制得所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒。
基于上述，所述加外泌体的步骤包括：先将所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒溶于pH7.4的缓冲溶液中，形成AptCD63-磁性纳米杨梅溶液；再将所述AptCD63-磁性纳米杨梅溶液与所述外泌体溶液混合，室温孵育1 h后磁分离，弃对应的上清液，获得所述外泌体复合物。其中，pH 7.4的缓冲溶液为TBST缓冲溶液或PBST缓冲溶液。优选地，pH 7.4的缓冲溶液为TBST缓冲溶液。优选地，所述AptCD63-磁性纳米杨梅溶液的浓度为10 mg/mL、体积为10～60 µL；所述外泌体溶液的体积为1 mL、浓度范围为5×104～2.5×106个/µL。
其中，所述外泌体溶液优选地通过将外泌体溶于TBST缓冲溶液或PBST缓冲溶液中制得；更优选地，所述外泌体溶液通过将所述外泌体溶于TBST缓冲溶液中制得。本文所采用的外泌体可以采用现有的常用方法从血液中提取。优选地，所述外泌体采用超滤联合共沉淀法从细胞上清液中提取。
基于上述，在所述加荧光探针的步骤中，所述外泌体EGFR适配体探针为6-羧基荧光素-EGFR适配体探针，所述外泌体EpCAM适配体探针为6-羧基四甲基罗丹明-EpCAM适配体探针，所述外泌体脂质探针为5H-吲哚菁-双胆固醇探针，每种探针溶液的浓度为50～400nmol/L。其中，所述5H-吲哚菁-双胆固醇探针主要是由单胆固醇脂质探针及胆固醇互补链探针按照摩尔比1:1混合，室温涡旋杂交一小时得到的。
基于上述，所述荧光检测及建立回归方程的步骤包括：
采用荧光光谱仪同步测定所述待测上清液中的外泌体EGFR适配体探针的荧光强度值FLEGFR或FL0(EGFR)、外泌体EpCAM适配体探针的荧光强度值FLEpCAM或FL0(EpCAM)、外泌体脂质探针的荧光强度值FLexosome或FL0(exosome)；
在所述外泌体EGFR浓度为2.5～125.6 pg/mL的范围内，建立检测外泌体EGFR浓度的回归方程：YEGFR=31148.16 lgCEGFR+12205.72，其中，YEGFR为相对应的荧光强度差值：FL0(EGFR)-FLEGFR，复相关系数R 2 =0.9998，CEGFR代表外泌体膜蛋白EGFR的浓度；
在所述外泌体EpCAM浓度为0.9～30.7 pg/mL的范围内，建立检测外泌体EpCAM浓度的回归方程：YEpCAM=22374.27 lgCEpCAM+28711.33，其中，YEpCAM为相对应的荧光强度差值：FL0(EpCAM)-FLEpCAM，复相关系数R 2 =0.9964，CEpCAM代表外泌体膜蛋白EpCAM的浓度；
在所述外泌体溶液浓度为5 × 104～2.5 × 106个/µL的范围内，建立检测外泌体浓度的回归方程：Yexosome=91385.74 lgCexosome-389924.92，其中，Yexosome为相对应的荧光强度差值：FL0(exosome)-FLexosome，复相关系数R 2 =0.9978，Cexosome代表外泌体的浓度。
基于上述，所述外泌体膜蛋白EGFR浓度的检出限分别为0.96 pg/mL，所述外泌体膜蛋白EpCAM浓度的检出限0.19 pg/mL，所述外泌体浓度的检出限为2.4×104 个/µL。
因此，本发明提供的血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法，包括提供磁性纳米杨梅颗粒，加CD63适配体形成AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒，加外泌体使其与AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒结合形成外泌体复合物，加三种荧光探针分别结合所述外泌体表面的EGFR、EpCAM、或嵌入外泌体脂质双分子层中；用荧光光谱仪检测三种荧光探针的荧光强度，利用荧光强度与外泌体浓度、外泌体膜蛋白EGFR浓度、外泌体膜蛋白EpCAM浓度之间的相关关系，实现对外泌体浓度及外泌体表面EGFR和EpCAM浓度的同步检测。
本发明使用的磁性纳米杨梅颗粒不仅具有表面积大和高亲和结合外泌体的优点，而且可以实现外泌体的快速磁性分离，所以，AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒具有以下优点：1）比表面积大；2）杨梅状纳米结构和多价核酸适体可以有效提高捕获外泌体的亲和力；3）磁性纳米杨梅上的ZnO纳米结构致密，具有尺寸排阻效应，有利于提高外泌体捕获的特异性；4）通过磁性分离可以有效分离和回收外泌体。AptCD63-磁性纳米杨梅在捕获外泌体后，加入三种荧光探针分别识别外泌体表面的膜蛋白EGFR、EpCAM或自发锚定到外泌体脂质双分子层的疏水区域。因此，本发明可以通过测量待测上清液中残余探针的荧光强度来同时检测外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度。
所以，本发明提供的同步检测方法有以下优点：
1）使用AptCD63捕获外泌体，然后根据外泌体脂质含量对外泌体进行定量；由于脂质双分子层是外泌体的基本结构，这种策略可以避免不同生理状态或细胞来源下外泌体中蛋白质含量变化引起的检测结果偏差；
2）采用的“一对多”模型可以有效地放大检测信号；
3）由于AptCD63和三种荧光探针的双重识别，可以避免可溶性蛋白的干扰；
4）所建立的方法不需要繁琐的外泌体分离过程。
此外，本发明提供的同步检测方法具有潜在的临床应用价值，可以应用于癌症患者和健康人的血浆外泌体检测。
附图说明
图1是本发明提供的血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测原理流程图；其中，该图中的图（A）是AptCD63-磁性纳米颗粒的合成路线图，图（B）是利用AptCD63-磁性纳米颗粒同步检测血浆中外泌体浓度和外泌体膜蛋白的原理图。
图2是本发明实施例提供的磁性纳米杨梅颗粒相关的电镜图；其中，该图中的图（A）是MBs透射电镜图，图（B）是氧化锌种子包裹的MBs透射电镜图，图（C）是磁性纳米杨梅透射电镜图及氧化锌纳米线高分辨透镜图，图（D）是磁性纳米杨梅颗粒扫描电镜图。
图3是本发明实施例提供的磁性纳米杨梅颗粒的EDS图谱及EDS mapping分析图。
图4是本发明实施例提供的MBs和磁性纳米杨梅颗粒的XRD光谱图。
图5是本发明实施例提供的磁性纳米杨梅颗粒的XPS能谱图及高分辨谱图；其中，该图中的图（A）是磁性纳米杨梅颗粒XPS谱图，图（B）是O 1s和Zn 2p高分辨谱图。
图6是本发明实施例提供的由MBs形成AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒整个过程的Zeta电位表征图，其中，该图中的组1代表MBs，组2代表氧化锌种子包裹的MBs，组3代表磁性纳米杨梅，组4代表NH2-磁性纳米杨梅，组5代表AptCD63-磁性纳米杨梅，组6代表AptCD63。
图7是本发明实施例提供的细胞外泌体浓度粒径NTA测定图。
图8是本发明实施例提供的细胞外泌体Western blotting表征图。
图9是本发明实施例提供的细胞外泌体透射电镜图。
图10是采用ELISA试剂盒测定的本发明实施例提供的细胞外泌体中的膜蛋白EGFR的标准曲线图。
图11是采用ELISA试剂盒测定的本发明实施例提供的细胞外泌体中的膜蛋白EpCAM的标准曲线图。
图12是本发明实施例提供的外泌体复合物的透射电镜图，其中，图中标尺为50nm。
图13是本发明实施例采用的Cy5-AptCD63和三种荧光探针分别与外泌体孵育后的激光共聚焦图，其中，Cy5-AptCD63是指Cy5荧光染料标记的AptCD63，FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol的激发波长分别为488 nm、554 nm和638 nm，且各图中标尺均为5 μm。
图14～16分别是本发明实施例提供的三种荧光探针FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol的荧光激发光谱图和荧光发射光谱图。
图17是本发明实施例提供的FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol在不同激发波长下的荧光发射光谱图。
图18是本发明实施例提供的三种荧光探针在各自最大激发波长在不同组别情况下的荧光光谱图，其中，该图中的图a为FAM-AptEGFR在494 nm激发下的荧光光谱图，图b为TAMRA-AptEpCAM在560 nm激发下的荧光光谱图，图c为Cy5-B-Chol在649 nm激发下的荧光光谱图。
图19是本发明实施例中的“加荧光探针”步骤提供的待测上清液与沉淀中的三种探针的荧光信号强度对比图。
图20是采用本发明实施例提供的AptCD63-磁性纳米杨梅的用量优化曲线图。
图21是采用本发明实施例提供的三种荧光探针的用量优化曲线图，其中，该图中的FL0和FL指无外泌体和有外泌体时的荧光信号强度。
图22是采用本发明实施例提供的脂质探针的种类选择对比图，其中，该图中的FL0和FL指无外泌体和有外泌体时的荧光信号强度。
图23是采用本发明实施例提供的缓冲溶液的种类选择对比图；其中，该图中的FL0和FL指无外泌体和有外泌体时的荧光信号强度。
图24是本发明实施例提供的同步检测外泌体中的膜蛋白EGFR浓度、EpCAM浓度以及外泌体浓度的拟合标准曲线图。
图25是针对本发明实施例所建方法的特异性评价图；其中，该图中的图（A）是MVs的透射电镜图，图（B）是MVs浓度粒径NTA测定图，图（C）是特异性考察图。
图26是本发明实施例所建方法与常用方法比较图，其中，该图中的（A）采用现有的外泌体试剂盒提取的血浆外泌体透射电镜图，（B）采用现有的外泌体试剂盒提取的血浆外泌体NTA结果图，（C）所建立方法的检测结果与NTA检测结果比较图，（D）所建立方法与ELISA检测的膜蛋白浓度比较图。
图27是肺癌患者（LC组）及健康人（HC组）血浆外泌体检测结果相关图；其中，该图中的（A）LC组和HC组血浆外泌体浓度、膜蛋白EGFR浓度和膜蛋白EpCAM浓度的荧光信号强度对比图；（B）LC组和HC组血浆外泌体中膜蛋白EGFR浓度的检测结果对比图（P<0.001）；（C）LC组和HC组血浆外泌体中膜蛋白EpCAM浓度的检测结果对比图（P=0.005）；（D）LC组和HC组血浆外泌体含量的检测结果图（P=0.014）；（E）主成分分析PCA图，图中每个点代表一个样品。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。若未特别指明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明以下实施例采用的试剂与材料如下：
二氧化硅磁珠（MBs，百运纳米科技有限公司）；二水合醋酸锌（Zn(CH3COO)2 ·2H2O），硝酸锌（Zn(NO3)2·6H2O），六亚甲基四胺（HMTA），聚乙烯醇1750（PVA-1750），国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（NaOH），氯化镁（MgCl2·6H2O），1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），上海晶纯生化科技股份有限公司；吐温-20（Tween 20）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH=7.4），DMEM 高糖培养基，0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA），5×蛋白上样缓冲液（含DTT），BCA试剂盒，5%牛血清包蛋白（BSA），人血清白蛋白，兔抗人IgG，索莱宝科技有限公司；胎牛血清（Lonsera）；Omni-ECL化学发光检测试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司）；脱脂奶粉（北京博奥拓达科技有限公司）；兔抗人CD63抗体（abcam）；鼠抗人HSP70抗体，鼠抗人TSG101抗体，兔抗鼠HRP-IgG抗体，成都正能生物技术有限责任公司；羊抗兔HRP-IgG抗体（北京爱必信生物技术有限公司）；鼠抗人AliX抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；转印聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45 μm，美国密理博公司）；Amicon® Ultra 100 kDa超滤管（德国默克公司）；共沉淀试剂Total Exosome Isolation（美国赛默飞世尔科技有限公司）；人非小细胞肺癌细胞（A549，中国科学院细胞库）；癌胚抗原（CEA，北京科跃中楷生物技术有限公司）；CD146，北京义翘神州科技股份有限公司；酶联免疫吸附实验试剂盒（EGFR和EpCAM，武汉华美）；所用核酸购自上海生工生物工程股份有限公司，详细信息见表1；实验用水均为Milli-Q水（电阻率大于18.2 MΩ·cm）。
表1 实验所用核酸序列
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以下实施例采用的主要仪器有：纳米粒度及Zeta电位分析仪（Zetasizer Nano-zs90，英国马尔文仪器有限公司）；透射电子显微镜（Talos F200X ，美国；JEM-1400，日本；Aquilios，美国）；可调系列微量加样器（Eppendorf，德国）；微波消解仪Mars6（CEM，美国）；荧光光谱仪（FS5，英国爱丁堡仪器公司）；纳米颗粒跟踪分析仪（Nanosight NS300，英国马尔文帕纳科有限公司）； X射线衍射仪（Ultima Ⅵ）；X 射线光电子能谱仪（ESCALAB，美国）；激光共聚焦荧光显微镜（TCS SP8，德国Leica公司）；超纯水装置（美国 Millipore公司）；凝胶成像仪/化学发光成像仪（美国Bio-rad有限公司）。
以下各实施例主要使用的配制溶液
1）10×Tris缓冲盐溶液（TBS）：取12.1 g Tris和40.0 g NaCl溶于300 mL Milli-Q水中，转移到500 mL的容量瓶中，Milli-Q水定容，混匀，4 ℃储存。
2）Tris缓冲盐吐温溶液-1（TBST-1）：取10×TBS缓冲液50 mL，用Milli-Q水定容到500 mL，得到 1×TBS缓冲液，加入500 μL Tween 20，混匀。
3）Tris缓冲盐吐温溶液（TBST）：20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，5 mmol/LMgCl2，0.5 mmol/L EDTA，0.05% Tween 20，pH 7.4。
4）磷酸盐吐温缓冲液（PBST）：0.01 mol/L PBS，5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/LEDTA，0.05% Tween 20，pH 7.4。
5）0.01 mol/L 吗啉乙磺酸缓冲液（MES）：称取1.0 g 吗啉乙磺酸一水合物溶于Milli-Q水中，定容至500 mL，用氢氧化钾调剂pH为6。
本发明实施例提供一种血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法，包括提供磁性纳米杨梅颗粒、加AptCD63、加外泌体、加荧光探针、荧光检测及建立回归方程等五个步骤。本发明实施例提供的血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测原理如图1所示。请参阅图1（A），在60℃超声条件下，醋酸锌和氢氧化钠反应生成氧化锌种子，最终形成氧化锌种子包裹的MBs；进一步地，硝酸锌和HMTA发生反应，以氧化锌种子为生长点原位生长出氧化锌纳米线，得到磁性纳米颗粒；利用APTES对氧化锌表面进行氨基化，再利用EDC将氨基化地磁性纳米颗粒与AptCD63偶联，最终得到AptCD63-磁性纳米颗粒。请参阅图1（B），当外泌体存在时，AptCD63可以特异性识别外泌体表面的CD63从而将其捕获下来；磁分离洗涤后，加入三种荧光探针：FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol，分别结合外泌体表面的膜蛋白EGFR或EpCAM、或嵌入外泌体脂质双分子层中；磁分离收集上清液，用荧光光谱仪检测上清液中残留的三种荧光探针的荧光强度，利用该三种荧光探针的荧光信号强度与外泌体浓度、外泌体膜蛋白EGFR浓度、外泌体膜蛋白EpCAM浓度之间的相关关系实现对外泌体浓度及外泌体膜蛋白EGFR和EpCAM的同步检测。此外，将上述所建立的同步检测方法可以应用于肺癌患者和健康人的血浆外泌体检测，为血浆外泌体的检测提供参考和技术支持。
下面将具体地进一步详细解释说明本发明实施例提供的同步检测方法。
一、提供磁性纳米杨梅颗粒
（1）形成氧化锌种子层
1）称取270 mg二水合醋酸锌加入60 mL无水乙醇中，将150 mg氢氧化钠加入130mL无水乙醇中，超声溶解；2）将2.5 mg MBs加入二水合醋酸锌乙醇中，超声混匀；3）将65 mLNaOH逐滴滴加入二水合醋酸锌和MBs的混合溶液中，该过程中一直保持60℃，超声功率100%，滴加过程中多次超声氢氧化钠，防止析出；4）于60℃下，超声反应30 min，超声功率为100%，室温静置冷却30 min，在该过程中，醋酸锌和NaOH反应生成氧化锌种子，最终形成氧化锌种子包裹的MBs；5）将反应后溶液7000 rpm离心5 min，弃上清，将沉淀重悬于500 μLMilli-Q水中，洗涤颗粒3次，最后重悬于500 μL Milli-Q水中得到氧化锌种子液备用。
（2）生长氧化锌纳米线
1）称取3346.75 mg PVA-1750 置于1000 mL圆底烧瓶中，加入200 mL水，在机械搅拌下，于水浴锅中加热至45℃，恒温搅拌5 min；升温至60℃，恒温搅拌15 min；再加热至95℃，恒温搅拌2 h；2）从水浴锅中取出所述圆底烧瓶，并将水浴锅温度调至60℃，再向所述圆底烧瓶中加入20 mL 12.5 mmol/L硝酸锌溶液，持续搅拌5 min；3）将2 mL所述氧化锌种子液分散于30 ml水中，并滴加入步骤2）的圆底烧瓶中，持续搅拌5 min以充分混匀；4）向步骤3）的圆底烧瓶中逐滴加入12.5 mmol/L HMTA 250 mL，滴加结束后，持续搅拌混匀30 min，整个过程保持搅拌速度不变；5）将步骤4）的圆底烧瓶中混合后的溶液转移至消解仪管，放入微波消解仪中，设置升温程序为：5 min 内加热到80℃，保持3 min，再于3 min内升至90℃，再保持15 min，得到表面生长有ZnO纳米线（NWs）的MBs颗粒，即所述磁性纳米杨梅颗粒；6）反应结束后磁分离，用水洗涤磁性纳米杨梅颗粒5次，最后分散于10 mL水中储备。
磁性纳米杨梅颗粒的表征
1）采用透射电镜对MBs、氧化锌种子包裹的MBs、以及磁性纳米杨梅的形貌及尺寸进行表征，结果如图2所示。与图2（A）相比，从图2（B）可见在MBs表面有直径约6 nm的球形颗粒，提示在MBs表面成功生长了氧化锌种子。从图2（C）和图2（D）可以看出在氧化锌种子表面原位生长了氧化锌纳米线之后，颗粒由球形变为杨梅状，颗粒直径从最开始的约1 µm增加至约3 µm。氧化锌纳米线长500 nm～1 µm，直径约10 nm～100 nm。图2（D）所示的高分辨电镜图可清洗观察到氧化锌纳米线的晶格条纹，条纹间距约0.263 nm，对应ZnO六方纤锌矿结构的(002)晶面。
2）用EDS能谱对纳米杨梅颗粒中的元素分布进行表征，结果如图3所示。从图3中可以看出：合成的磁性纳米杨梅中存在O、Si、Fe、Zn元素，其中Fe元素主要存在材料的中心，即Fe3O4区域。O元素和Zn元素主要分布在氧化锌纳米线区域，进一步说明了本实施例提供的方法成功实现了氧化锌纳米线的生长。
3）用XRD图谱对MBs及纳米杨梅的晶体结构进行表征，结果如图4所示。从图4中的曲线a可以清晰地观察到氧化锌的主要衍射峰，对应六角相氧化锌（JCPDS No. 36-1451）。从图4中的曲线b可以观察到Fe3O4的衍射峰。两条曲线中的衍射峰强度的不同或与不同的结晶程度有关。此外，曲线b中20°～40°之间的宽峰，峰值约23°的峰来源于MBs中的无定形硅。
4）如图5所示，用XPS分析法研究了磁性纳米杨梅颗粒的化学成分及其相关元素的化学状态。从图5中可以看出：磁性纳米杨梅颗粒样品中存在O和Zn元素。其中，O 1s谱在530.1 eV和532.4 eV处有峰，分别对应O2−和空氧位；Zn 2p的峰分别在1021 eV和1044.15eV，分别对应Zn 2p3/2和Zn 2p1/2。由此可见，本发明实施例提供的方法能够合成磁性纳米杨梅颗粒。
二、加AptCD63
（1）氨基化处理
1）将所述磁性纳米杨梅颗粒干燥后，放置于等离子体清洗机中进行清洗，其中，设置氧压为0.1 Pa，10 cc/min；每次清洗时间为1 min，共清洗5次，每次处理结束后轻轻晃动颗粒以重新混匀一次；2）向250 mL圆底烧瓶中加入234.75 mL无水乙醇，加入120 mg磁性纳米杨梅颗粒，快速机械搅拌；向离心管中加入10 mL水和5mL APTES，混合均匀后逐滴加入所述圆底烧瓶中；再将250 μL乙酸逐滴滴入所述圆底烧瓶中，继续搅拌24 h后，将溶液7000rpm离心10 min，收集氨基化的磁性纳米杨梅（NH2-磁性纳米杨梅）沉淀，用Milli-Q水洗涤沉淀5次，重悬于6 mL水中，得到20 mg/mL NH2-磁性纳米杨梅溶液。
（2）偶联处理
1）用PBST洗涤离心管1次，向离心管中加入1.5 mL 20 mg/mL的NH2-磁性纳米杨梅溶液，磁分离，去上清，用1.5 mL MES (pH 6.0) 洗涤2次，磁分离，弃上清；2）向上述经步骤1）处理的离心管中依次加入870 μL MES溶液、30 μL 100 μmol/L 的AptCD63溶液，且该AptCD63溶液的溶剂为PBS；3）称取47.925 mg EDC，溶解于1 mL MES溶液中，制得浓度0.25mol/L的EDC溶液，现配现用；4）向上述经步骤2）处理的离心管中再加入0.25 mol/L EDC溶液600 μL，摇晃混匀，使得该离心管中的EDC的浓度为0.1 mol/L；5）将上述经步骤4）处理的离心管置于涡旋振荡仪上室温振荡15 min，置于37℃震荡孵育2 h，其中，注意调节涡旋振荡仪的振荡速度让其中的颗粒尽量悬浮；6）磁分离，弃上清，每次用1.5 mL PBS洗涤沉淀3次，得到AptCD63-磁性纳米杨梅，最后磁分离，弃上清；7）向上述经步骤6）处理的离心管中依次加入PBS溶液5.4 mL、5% BSA 600 μL，于摇床上室温振荡封闭1 h；8）用PBS洗涤颗粒3次，每次6mL，最后分散于3mL PBS缓冲溶液中，制得浓度为10 mg/mL的AptCD63-磁性纳米杨梅溶液，于4℃储存。
检验上述方法是否能够制备AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒
采用交联剂APTES在磁性纳米杨梅表面修饰氨基，进一步利用EDC将羧基化AptCD63偶联到磁性纳米杨梅表面，整个过程的Zeta电位表征结果如图6所示。从图6中可以看出：MBs呈现负电，在其表面生长氧化锌纳米线后，从氧化锌种子包裹的MBs到磁性纳米杨梅颗粒，电位逐渐向0靠近。修饰氨基形成NH2-磁性纳米杨梅后，Zeta电位明显向正电位偏离；偶联AptCD63后，电位由正转变为负。由此表明AptCD63成功的修饰于磁性纳米杨梅表面，即AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒合成成功。
三、加外泌体
（1）提取外泌体
采用超滤联合共沉淀法从细胞上清液中提取外泌体，具体地，1）培养肺癌A549细胞所用培养基为DMEM（添加10%胎牛血清），细胞培养温度为37℃，CO2含量为5%，待显微镜下观察到细胞融合度约为70%时，用PBS冲洗细胞两次，加入无胎牛血清的DMEM培养基继续培养48 h，随后收集A549细胞培养上清液用于提取外泌体；2）对A549细胞培养上清液进行离心处理，离心温度为4℃，离心过程为：去除A549细胞培养上清液中的悬浮细胞300 g × 10min、去除A549细胞培养上清液中的死细胞2000 g×10 min、去除A549细胞培养上清液中的细胞碎片和细胞器10000 g×30 min，随后收集离心后的上清液；用0.22 μm的滤膜过滤所述离心后的上清液以除去大粒径的杂质，收集滤液，将该滤液加入100 kDa超滤管中，在4000 g下离心10 min，收集滤膜夹层中的外泌体浓缩液；向外泌体浓缩液中加入共沉淀试剂，其中外泌体浓缩液与共沉淀试剂的体积比为2:1，轻轻吹打混匀，于4℃静置12 h后，将混合液在4℃下10000 g离心60 min，弃去上清液，加入PBS溶液重悬沉淀，得到外泌体溶液，将该外泌体溶液置于-80℃储存备用。
细胞外泌体的表征
采用透射电镜、NTA和western blotting对超滤联合共沉淀法得到的外泌体进行表征，具体表征方法如下：
1）粒径和颗粒浓度测定
将所述外泌体溶液按30～100倍稀释，将稀释液加入1 mL注射器，再将其加入到检测槽中，利用纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布和颗粒浓度，结果如图7所示。
2）蛋白免疫印迹实验
采用蛋白免疫印迹实验对外泌体的标志性蛋白标志物CD63、TSG101、HSP70和AliX进行鉴定，具体实验步骤如下：
①蛋白浓度测定：采用BCA试剂盒测定外泌体溶液的蛋白浓度。
②蛋白变性：向外泌体溶液中加入5×上样缓冲液（V外泌体溶液 : V5×上样缓冲液 = 4:1），混匀后于95℃加热5 min，得到外泌体裂解液。
③制胶：按照SDS-PAGE凝胶配置试剂盒的说明书，分别配制聚丙烯酰胺凝胶的分离胶和浓缩胶。吸取分离胶约5 mL，注入制胶板中，再用Milli-Q水加满制胶板进行压胶，室温静置30 min。待分离胶凝固后将水倒出，再将浓缩胶注入制胶板中，小心插入梳子。静置30 min。取下制胶架，放入电泳槽，倒入1×电泳缓冲液，并拔出梳子。
④电泳：将外泌体裂解液（每孔40 µg）和蛋白marker加入凝胶孔中，设置电泳电压为80 V，待条带迁移至浓缩胶与分离胶的分界处时，调整电压为120 V。90 min后，将凝胶从玻璃板中取出。
⑤转膜：采用湿转方式将凝胶条带转移到（PVDF）膜上，转膜时，转膜夹中从负极到正极依次为海绵、滤纸、聚丙烯酰胺分离胶、PVDF膜、滤纸、海绵。转膜参数设为200 mA，时间为90 min。所用缓冲液为1×电转缓冲液。
⑥封闭：转膜结束后，轻轻取出PVDF膜，用TBST-1缓冲液洗涤3次，浸入5%脱脂奶粉溶液中于37℃孵育2 h，封闭非特异性吸附位点。TBST缓冲液洗膜5次，每次5 min。
⑦孵育CD63、HSP70、TSG101和AliX一抗：将PVDF膜浸入一抗稀释液中，在室温下震荡30 min后，于4℃过夜孵育。用TBST-1洗膜5次，每次5 min。
⑧孵育CD63、HSP70、TSG101和AliX二抗：将PVDF膜浸入二抗稀释液，37℃孵育1 h。用TBST-1缓冲液洗膜5次，每次洗涤5 min。
⑨显影：按照超敏化学发光液使用说明书取等体积A、B液，混匀，现配现用。吸取配制好的化学发光液，滴加在PVDF膜上条带处，轻摇使液体分布均匀，多余液体用滤纸吸去，使用化学发光成像系统对条带显影，结果如图8所示。
3）透射电子显微镜
吸取10 μl外泌体溶液滴在铜网上，室温下干躁20 min。在封口膜上滴加PBS溶液，膜面朝下，洗涤铜网5次。再向铜网上滴加1滴2%醋酸双氧铀负染5 min，多余染液用滤纸吸干，室温晾干。用透射电子显微镜观察外泌体形态，工作电压为120 kV。结果如图9所示。
4）ELISA测定外泌体中膜蛋白EGFR和EpCAM的含量
将外泌体与0.3% Triton X-100按1:1混合，4℃裂解30 min，得到外泌体裂解液。根据ELISA试剂盒说明书，依次加入膜蛋白EGFR和EpCAM的标准品、检测抗体和酶标二抗，TMB显色液，最后测定吸光度值，分别建立如图10和图11所示的膜蛋白EGFR和EpCAM的标准曲线。同时测定出外泌体裂解液的吸光度，根据标注曲线计算得到外泌体裂解液中的EGFR和EpCAM含量。
从图7所示的NTA结果可以看出：本发明实施例提取的外泌体的平均水合粒径为144.9 ± 83.7 nm。图8所示的Western blotting的结果显示本发明实施例提取的外泌体中含有Alix、HSP70、TSG101、CD63等外泌体膜上及膜内的特异性蛋白质。从图9中可以看出：透射电子显微镜视野下可见外泌体呈杯盘状小囊泡，尺寸在30～150 nm之间。因此，本发明实施例采用超滤联合共沉淀法成功提取出了A549细胞上清液中的外泌体。
图10中显示本发明实施例提供的外泌体溶液中的膜蛋白EGFR的标准曲线为：Y=0.494 lgCEGFR–0.364（R 2 =0.9940）。从图11中看出：本发明实施例提供的外泌体溶液中的膜蛋白EpCAM的标准曲线为Y=0.927 lgCEpCAM–0.867（R 2 =0.9971）。经计算得到外泌体溶液中EGFR和EpCAM的浓度分别为9.949 ng/mL和2.428 ng/mL。
（2）获得外泌体复合物
1）用TBST缓冲液洗涤低吸附离心管1次，向该低吸附离心管中加入10 mg/mL的AptCD63-磁性纳米杨梅溶液，磁分离，除去上清；2）继续向上述步骤1）中的低吸附离心管中加入1 mL所述外泌体溶液，于室温孵育1 h后磁分离，弃上清；用TBST缓冲液洗涤沉淀2次，每次1 mL，获得外泌体复合物。
透射电镜表征所述外泌体复合物
将所述AptCD63-磁性纳米杨梅溶液与所述外泌体溶液混合，室温孵育1 h。磁分离，洗涤沉淀3次；加入2.5%的戊二醛溶液对其中的外泌体进行固定，随后依次加入30%、50%、70%、95%和100%乙醇溶液进行脱水，每次10 min，每个浓度重复脱水一次。最后进行磁分离，收集AptCD63-磁性纳米杨梅捕获外泌体后形成的所述外泌体复合物，喷金后进行扫描电镜拍摄，如图12所示。
从图12中可以看出：在材料表面附着球形颗粒，其直径在30～150 nm之间，如此说明AptCD63-磁性纳米杨梅能有效的捕获外泌体，形成所述外泌体复合物。
四、加荧光探针
加荧光探针的步骤包括：（1）将Cy5-M-Chol和M-Chol-2探针按照摩尔比1:1混合，室温涡旋杂交一小时，得到Cy5-B-Chol，即Cy5-B-Chol由Cy5-M-Chol和M-Chol-2互补杂交形成，并含有两个胆固醇分子；（2）向盛有外泌体复合物的低吸附离心管中加入FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol探针的混合溶液70 μl，于室温孵育1 h；磁分离，并收集上清液作为待测上清液。
验证试验
1）验证AptCD63及三种荧光探针是否分别与外泌体结合的试验
将Cy5-AptCD63、FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol分别与所述外泌体溶液混合，室温反应1 h。用激光共聚焦荧光显微镜对荧光标记外泌体进行拍摄。同时对相同浓度的荧光探针进行荧光拍摄，作为对照组，结果如图13所示。
从图13中可以看出：当外泌体存在时，可以在视野下观察到相应的荧光标记外泌体，由此可见，AptCD63和三种荧光探针均能有效的结合外泌体。
2）验证三种荧光探针是否相互干扰的试验
FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol三种荧光探针之间若相互干扰明显，则会直接影响实验结果的准确性。其中，该三种荧光探针分别测定506 nm～560 nm、567 nm～620 nm和658 nm～700 nm范围内的荧光光谱。结果分别如图14～16所示。
由图14～16可见，FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol的最大激发波长分别是494 nm、560 nm和649 nm；最大发射波长分别为520 nm、584 nm和670 nm。在此基础上，对三种荧光探针之间的相互干扰进行考察，如图17所示，当激发波长为494 nm时，在发射波长520 nm处，FAM-AptEGFR荧光强度最强，TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol荧光微弱。对具体强度进行分析，TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol的荧光总强度不足FAM-AptEGFR的1%。因此，TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol对FAM-AptEGFR的测定干扰很小。同理，584 nm 和670 nm处的荧光强度有>99%来源于TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol。因此，三种荧光探针之间的干扰很小。
五、荧光检测及建立回归方程
具体方法包括：取60 μL所述待测上清液用荧光光谱仪测定其中残留的FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol探针的荧光强度，其中，测定FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol的激发波长设置分别为494 nm、560 nm和649 nm；利用三种荧光探针的荧光强度与外泌体膜蛋白EGFR浓度、外泌体膜蛋白EpCAM浓度、外泌体浓度之间的关系建立对应的回归方程。
同时检测外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的可行性试验
1）采用该步骤提供的方法，以下面各组的上清液为待测样品进行荧光强度检测，检测结果如18所示。
组1：AptCD63-磁性纳米杨梅溶液+外泌体溶液；
组2：磁性纳米杨梅溶液+外泌体溶液+荧光探针；
组3：AptCD63-磁性纳米杨梅溶液+TBST缓冲溶液+荧光探针；
组4：AptCD63-磁性纳米杨梅溶液+外泌体溶液+荧光探针。
图18是进一步对有无外泌体存在时采用本发明实施例提供的方法分别进行荧光强度测定。从图18中可以看出：组1中只有AptCD63-磁性纳米杨梅和外泌体，不含有探针，则未检测到荧光信号，提示实验体系中无其它干扰荧光检测的物质；从组3与组4的检测结果来看，当AptCD63-磁性纳米杨梅分别与外泌体和荧光探针孵育后，磁分离后组4的上清液中的荧光强度明显降低；用磁性纳米杨梅取代AptCD63-磁性纳米杨梅进行实验的组2的检测结果显示：其荧光信号强度与组3的区别不大。因此，综合组1至组4的检测结果说明修饰于磁性纳米杨梅表面的AptCD63可以有效的捕获外泌体，且荧光探针可以有效的结合外泌体。
2）最优的检测方式选择试验
为选择最优的检测方式，对上述加荧光探针的步骤中获得的作为检测样品的待测上清液以及该步骤获得的沉淀中的三种探针的荧光强度进行分别测定。具体地，将AptCD63-磁性纳米杨梅与一定量的外泌体溶液混合，室温孵育1 h。磁分离，洗涤沉淀一次。再加入三种荧光探针的混合溶液，室温孵育1 h。磁分离，收集第一次上清液。用TBST缓冲溶液洗涤沉淀3次，磁分离，弃上清液，将沉淀分散于相同体积的缓冲溶液中。对所述第一次上清液和沉淀中的三种探针的荧光强度分别进行测定，与相应的溶剂对照进行对比，结果如图19所示。
从图19中可以看出：作为待测样品的待测上清液中的三种探针的荧光强度明显高于沉淀中的荧光强度，因此本发明实施例选择待测上清液作为待测样品检测其荧光强度。
试验条件优化
依据本发明实施例提供的上述同步检测外泌体浓度和外泌体蛋白浓度的方法，尤其是“三、加外泌体”、“四、加荧光探针”、“五、荧光检测及建立回归方程”等方法步骤，AptCD63-磁性纳米杨梅的用量、三种荧光探针的浓度、胆固醇探针的种类及缓冲溶液的种类等因素均对荧光强度有重要影响。下面根据荧光强度选择上述影响因素的最优条件。
1、AptCD63-磁性纳米杨梅的用量优化试验
AptCD63-磁性纳米杨梅的用量过少，会导致大量外泌体无法被捕获，从而影响检测灵敏度；用量过大，则会造成浪费。因此，采用单因素法对AptCD63-磁性纳米杨梅的用量进行优化。基于前述分析，为节约试剂， AptCD63-磁性纳米杨梅用量优化试验中仅加入了FAM-AptEGFR探针。
采用的参数为：10 mg/mL AptCD63-纳米杨梅溶液的用量分别为10 µL、20 µL、30 µL、40 µL、60 µL，荧光探针的浓度均为300 nmol/L，采用的外泌体溶液中外泌体浓度为2 ×105个/µL。按照本发明实施例提供的方法步骤进行实验，结果如图20所示。
如图20所示，随着AptCD63-磁性纳米杨梅溶液的用量从10 µL增加至40 µL，荧光信号强度逐渐增强，由此说明在此过程中外泌体捕获效率逐渐增强。随着AptCD63-磁性纳米杨梅溶液的用量的进一步增加，荧光信号值出现降低。因此，在同等条件下，10 mg/mLAptCD63-磁性纳米杨梅溶液的最优用量为40 µL。
2、三种荧光探针的用量优化试验
三种荧光探针的用量，直接影响检测信号的强度，因此对这一关键影响因素进行优化。实验过程中，保持10 mg/mL AptCD63-磁性纳米杨梅溶液的用量为40 µL，外泌体溶液浓度不变，每种荧光探针的浓度分别为50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L，且同次试验中采用浓度相同的三种荧光探针。按照本发明实施例提供的方法步骤进行实验，结果如图21所示。
从图21中可以看出：当三种荧光探针的浓度均为300 nmol/L时，荧光信号强度最强。因此，三种探针的最佳浓度均为300 nmol/L。
3、脂质探针的种类优化选择试验
有研究显示，双胆固醇脂质探针Cy5-B-Chol较单胆固醇脂质探针Cy5-M-Chol能更有效的嵌入脂质双分子层中，所以，该优化选择试验按照本发明实施例提供的方法步骤进行实验，在其它条件相同的条件下，对这两类探针的进行对比试验以选择最优的脂质探针用于后续实验，结果如图22所示。
从图22中可以看出：Cy5-B-Chol组荧光信号强度明显强于Cy5-M-Chol组，由此说明双胆固醇分子可以更好的锚定到外泌体脂质双分子层中。所以，本发明实施例采用Cy5-B-Chol作为最优脂质探针。
4、缓冲溶液的种类优化选择试验
本研究采用单因素法对稀释外泌体溶液、溶解AptCD63-磁性纳米杨梅以及溶解三种荧光探针采用的缓冲溶液的种类进行优化。具体地，稀释外泌体溶液、溶解AptCD63-磁性纳米杨梅以及溶解三种荧光探针采用相同的缓冲溶液作为溶剂，按照本发明实施例提供的方法步骤进行试验，在其它条件相同的条件下，选择常用的TBST缓冲溶液和PBST缓冲溶液作为研究对象，检测荧光强度。结果如23所示。
从图23中可以看出：TBST组的荧光信号强度明显高于PBST组，故选择TBST缓冲溶液为最佳缓冲溶液。
标准曲线的构建及方法学评价
1、标准曲线的建立
用TBST缓冲液将外泌体标准品配制成不同浓度的试样，按最优的条件进行检测，每个浓度平行测定6次。分别用CEGFR、CEpCAM和Cexosome作为自变量，对应FAM-AptEGFR、TAMRA-AptEpCAM和Cy5-B-Chol的荧光信号强度作为应变量，拟合出图24所示的线性方程。
从图24中可以看出：检测外泌体中的EGFR浓度的标准曲线为YEGFR=31148.16lgCEGFR+12205.72，其中，线性范围为2.5～125.6 pg/mL，YEGFR为相对应的荧光强度差值：FL0(EGFR)-FLEGFR，复相关系数R 2 =0.9998，CEGFR代表外泌体EGFR的浓度。检测外泌体中的EpCAM浓度的标准曲线为YEpCAM=22374.27 lgCEpCAM+28711.33，其中，对应的线性范围为0.9～30.7pg/mL，YEpCAM为相对应的荧光强度差值：FL0(EpCAM)-FLEpCAM，复相关系数R 2 =0.9964，CEpCAM代表外泌体EpCAM的浓度。检测外泌体浓度的标准曲线为Yexosome=91385.74 lgCexosome-389924.92，其中，外泌体浓度为5 × 104～2.5 × 106个/µL，Yexosome为相对应的荧光强度差值：FL0(exosome)-FLexosome，复相关系数R 2 =0.9978，Cexosome代表外泌体的浓度。
2、检出限
为考察所建立方法的检出限，按照本发明实施例提供的方法步骤，同时对6个空白样品进行检测，测定其在520 nm、584 nm和670 nm处的荧光强度，求出-3SD的值，并将此值代入对应的标准曲线，分别计算得到外泌体中的EGFR浓度和EpCAM浓度以及外泌体浓度的检出限。计算结果为：EGFR浓度和EpCAM浓度以及外泌体浓度的检出限分别为0.96 pg/mL、0.19 pg/mL和2.4 × 104 个/µL。
3、精密度和加标回收率
用PBS将无外泌体胎牛血清稀释10倍，得到10%的无外泌体血清。向无外泌体血清中加入外泌体，使得其中外泌体的浓度为7.5×107 个/mL和1×108 个/mL。每个浓度6个平行，按照本发明实施例提供的同步检测方法步骤进行实验，记录其对应的荧光强度，根据标准曲线计算得到相对应的浓度，通过公式求出精密度（RSD）和加标回收率。结果如表2所示。
表2 精密度及加标回收率考察（n=6）
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4、特异性
实际样品的成分复杂，要求检测方法具有较好的特异性。为考察所建立方法的特异性，选择与外泌体结构相似的微泡（MVs）作为检测目标，其中，MVs采用离心法从A549细胞上清液中提取，如图25（A）和图25（B）所示；同时选择在实际血浆样品中常与外泌体共存的IgG、CEA、白蛋白、GAPDH和CD146作为阴性对照。采用本发明实施例所建立的方法进行检测，同时测定采用本发明实施例所提供的超滤联合共沉淀法从实际血浆中的A549细胞上清液中提取的外泌体溶液的荧光信号强度，通过比较检测结果，评价方法特异性。具体检测结果如图25（C）所示。
从图25（A）和图25（B）中可以看出：MVs能够从A549细胞上清液中提取出来，且其检测浓度与外泌体浓度一致。其余蛋白质的浓度选择血液中该物质的实际浓度。从图25（C）中可知：外泌体组的荧光信号强度明显强于上述各对照组，表明本发明实施例建立的方法具备高的特异性。
5、方法学比较
为进一步考察所建立方法的准确性，将所建立方法与现有常用的NTA/ELISA的测定结果相比较。具体步骤如下：
1）采用尺寸排阻色谱柱qEV，按照说明书的步骤提取血浆样品中的外泌体，采用透射电镜和NTA对外泌体进行鉴定，结果如图26（A）、图26（B）所示。
2）用本发明所建立的方法检测血浆外泌体浓度、外泌体中的膜蛋白EGFR和EpCAM的含量，操作步骤同本发明实施例提供的同步检测方法。同时用NTA测定外泌体浓度，并用ELISA试剂盒测定外泌体中膜蛋白EGFR和EpCAM的含量，结果如图26（C）和图26（D）所示。
从图26（A）可以看出：采用尺寸排阻色谱柱qEV从血浆样品中提取的外泌体呈杯盘状，粒径在30～150 nm之间。图26（B）显示的NTA结果表明其平均粒径为157.3 ± 83.6 nm。如此表明外泌体提取成功。图26（C）显示所建立方法测定的外泌体浓度与NTA检测结果一致（P > 0.05）。图26（D）相关性分析结果显示所建立方法检测外泌体膜蛋白EGFR和EpCAM时的信号强度与ELISA试剂盒检测相同样品的信号强度之间有相关（P < 0.05）。因此，本发明实施例所建立的方法与常用方法的检测结果一致。
6、血浆样品中外泌体测分析
经伦理学委员会审批及签署知情同意书下，采集某医院呼吸内科肺癌患者（LC）和健康体检中心健康对照者（HC）全血样本共100例。其中LC组50例，HC组对照50例。全血样本经4000 r/min 4℃离心分离后收集血浆，置于冻存管中于-80℃冰箱中保存备用。
用PBS将血浆样品稀释10倍，经2000 g离心10 min后收集上清液进行10000 g 离心20 min。离心后的血浆经0.22 µm滤膜除去大尺寸干扰物。按照本发明实施例提供的同步检测方法对血浆样品中的外泌体含量、外泌体膜蛋白EGFR和EpCAM的含量进行检测，并将LC组和HC组的检测结果进行对比。各检测结果如图27所示。
从图27中可以看出：LC组的外泌体膜蛋白EGFR和EpCAM及外泌体浓度的荧光信号强度比HC组高1.64、1.37和1.39倍，差异均具有统计学意义。该结果表明与文献报道一致，如此说明本发明实施例所建立的方法能有效的检测血浆样品中的外泌体及外泌体膜蛋白。此外，图27（E）的结果显示根据外泌体、膜蛋白EGFR和EpCAM的含量，可有效的区分肺癌患者与健康人。因此，对血浆外泌体含量、外泌体膜蛋白EGFR含量和外泌体膜蛋白EpCAM的含量进行同步检测分析将是肺癌筛查的一个新的方向。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种血浆外泌体浓度和外泌体膜蛋白浓度的同步检测方法，包括：
提供磁性纳米杨梅颗粒 提供一种磁性纳米杨梅颗粒，该磁性纳米杨梅颗粒包括二氧化硅磁珠和形成在该二氧化硅磁珠表面的氧化锌纳米线，且所述磁性纳米杨梅颗粒的外形呈杨梅状；
加CD63适配体 先对所述磁性纳米杨梅颗粒中的氧化锌纳米线进行氨基化处理，形成氨基化磁性纳米杨梅颗粒；再对CD63适配体和所述氨基化磁性纳米杨梅颗粒进行偶联处理，形成AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒，其中，该AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒的CD63适配体与氨基化磁性纳米杨梅偶联；
加外泌体 将所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒与外泌体溶液混合进行室温孵育处理，经磁分离处理，获得外泌体复合物，该外泌体复合物为所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒与外泌体的结合体；
加荧光探针 先将三种荧光探针溶液同时与所述外泌体复合物混合，进行室温孵育处理；再经磁分离处理，收集待测上清液；其中，所述三种荧光探针溶液分别是外泌体EGFR适配体探针溶液、外泌体EpCAM适配体探针溶液和外泌体脂质探针溶液，所述待测上清液中含有三种荧光探针；
荧光检测及建立回归方程 采用荧光光谱仪同步测定所述待测上清液中的三种荧光探针的荧光强度，利用荧光探针的荧光强度与外泌体膜蛋白EGFR浓度、外泌体膜蛋白EpCAM浓度、外泌体浓度之间的关系建立对应的回归方程。
2.根据权利要求1所述的同步检测方法，其特征在于，所述提供磁性纳米杨梅颗粒的步骤包括：
形成氧化锌种子层 在超声条件下，醋酸锌、氢氧化钠和二氧化硅磁珠均匀混合，在所述二氧化硅磁珠表面生成氧化锌种子，形成种子层包覆磁珠颗粒；
生长氧化锌纳米线 在聚乙烯醇水溶液中，先将硝酸锌和所述种子层包覆磁珠颗粒均匀混合，再加入六亚甲基四胺于70℃～100℃发生反应，在所述二氧化硅磁珠表面生长氧化锌纳米线，制得所述磁性纳米杨梅颗粒。
3.根据权利要求1所述的同步检测方法，其特征在于，所述加CD63适配体的步骤包括：
氨基化处理 将所述磁性纳米杨梅颗粒加入无水乙醇中，并均匀搅拌形成纳米杨梅悬浮液；在搅拌作用下，依次向所述纳米杨梅悬浮液中滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷水混合溶液和乙酸；持续搅拌18～36 h，离心分离处理，得到氨基化磁性纳米杨梅颗粒；
偶联处理 将所述氨基化磁性纳米杨梅颗粒、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、吗啉乙磺酸缓冲液、CD63适配体溶液均匀混合，并进行震荡孵育和磁分离处理，制得所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒。
4. 根据权利要求1～3任一项所述的同步检测方法，其特征在于，所述加外泌体的步骤包括：先将所述AptCD63-磁性纳米杨梅颗粒溶于pH 7.4的缓冲溶液中，形成AptCD63-磁性纳米杨梅溶液；再将所述AptCD63-磁性纳米杨梅溶液与所述外泌体溶液混合，室温孵育后磁分离，弃对应的上清液，获得所述外泌体复合物，其中，pH 7.4的缓冲溶液为TBST缓冲溶液或PBST缓冲溶液。
5.根据权利要求4所述的同步检测方法，其特征在于，所述外泌体采用超滤联合共沉淀法从细胞上清液中提取。
6.根据权利要求5所述的同步检测方法，其特征在于，所述外泌体溶液通过将所述外泌体溶于TBST缓冲溶液或PBST缓冲溶液中制得。
7. 根据权利要求6所述的同步检测方法，其特征在于，所述AptCD63-磁性纳米杨梅溶液的浓度为10 mg/mL、体积为10～60 µL；所述外泌体溶液的体积为1 mL、浓度范围为5×104～2.5×106个/µL。
8. 根据权利要求7所述的同步检测方法，其特征在于，在所述加荧光探针的步骤中，所述外泌体EGFR适配体探针为6-羧基荧光素-EGFR适配体探针，所述外泌体EpCAM适配体探针为6-羧基四甲基罗丹明-EpCAM适配体探针，所述外泌体脂质探针为5H-吲哚菁-双胆固醇探针，每种探针溶液的浓度为50～400 nmol/L，其中，所述5H-吲哚菁-双胆固醇探针主要是由单胆固醇脂质探针及胆固醇互补链探针按照摩尔比1:1混合，室温涡旋杂交得到的。
9.根据权利要求8所述的同步检测方法，其特征在于，所述荧光检测及建立回归方程的步骤包括：
采用荧光光谱仪同步测定所述待测上清液中的外泌体EGFR适配体探针的荧光强度值FLEGFR或FL0(EGFR)、外泌体EpCAM适配体探针的荧光强度值FLEpCAM或FL0(EpCAM)、外泌体脂质探针的荧光强度值FLexosome或FL0(exosome)；
在所述外泌体EGFR浓度为2.5～125.6 pg/mL的范围内，建立检测外泌体EGFR浓度的回归方程：YEGFR=31148.16 lgCEGFR+12205.72，其中，YEGFR为相对应的荧光强度差值：FL0(EGFR)-FLEGFR，复相关系数R 2 =0.9998，CEGFR代表外泌体膜蛋白EGFR的浓度；
在所述外泌体EpCAM浓度为0.9～30.7 pg/mL的范围内，建立检测外泌体EpCAM浓度的回归方程：YEpCAM=22374.27 lgCEpCAM+28711.33，其中，YEpCAM为相对应的荧光强度差值：FL0(EpCAM)-FLEpCAM，复相关系数R 2 =0.9964，CEpCAM代表外泌体膜蛋白EpCAM的浓度；
在所述外泌体溶液浓度为5 × 104～2.5 × 106个/µL的范围内，建立检测外泌体浓度的回归方程：Yexosome=91385.74 lgCexosome-389924.92，其中，Yexosome为相对应的荧光强度差值：FL0(exosome)-FLexosome，复相关系数R 2 =0.9978，Cexosome代表外泌体的浓度。
10.根据权利要求9所述的同步检测方法，其特征在于，所述外泌体膜蛋白EGFR浓度的检出限分别为0.96 pg/mL，所述外泌体膜蛋白EpCAM浓度的检出限0.19 pg/mL，所述外泌体浓度的检出限为2.4×104个/µL。
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