JP2002107365A - 全血免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】全血免疫測定法において、抗原抗体反応に影響
を及ぼさずに、血球の影響を除去する方法を提供するこ
とを目的とする。 【解決手段】全血試料と、免疫感作した不溶性担体粒子
とを混合して免疫凝集反応を行わせ、得られた凝集反応
混合物を、赤血球溶解剤を含む水溶液で希釈することに
より赤血球を溶解して測定用試料を調製し、測定用試料
の凝集度を測定する全血免疫測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、全血免疫測定方法
に関し、より詳細には、粒子凝集反応を利用した全血免
疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
感染症関連項目の免疫検査では、測定試料に血清を使用
していたが、全血から血清を得るまでには、血液凝固時
間と、その後の遠心分離時間を合わせ、血清分離に少な
くとも約３０分の処理時間が必要となっていた。

【０００３】免疫測定法としては、ラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、
粒子凝集法、カウンティングイムノアッセイ等がある
が、ＲＩＡやＥＩＡでは、抗原抗体反応を行った後、Ｂ
／Ｆ分離を行う必要があり、測定結果が出るまでに手間
も時間がかかる。

【０００４】一方、粒子凝集法は、抗体または抗原を感
作した不溶性担体粒子（例えばラテックス）懸濁液と測
定試料とを混合するだけでよく、Ｂ／Ｆ分離は必要な
く、簡便な操作で実施できるという点で有利である。

【０００５】しかし、近年、免疫検査の高精度で簡易に
測定できる手法が求められるようになり、特に、肝炎や
ＨＩＶなどの感染症患者かそうでないかを早急に判断し
たい緊急手術では、採血後からの検査時間の短縮化を行
ったより迅速な測定法が求められていた。

【０００６】検査時間の短縮化を考えた場合、測定試料
に血清を用いるよりも全血を用いる方が望ましい。しか
し、全血を用いた場合、血球成分の存在が粒子の凝集の
度合を検出する際に妨げとなる。

【０００７】そこで、従来のラテックス凝集法での全血
測定法として、例えば、特開平１０−１８２１４号で
は、溶血させた後、ラテックス免疫比濁法にて検出する
方法が開示されている。

【０００８】しかし、この方法では、溶血させるのに十
分な濃度の界面活性剤は抗原抗体反応に影響を及ぼし、
感度が得られないという問題があった。

【０００９】本発明は、上記課題に鑑みなされたもので
あり、全血免疫測定法において、抗原抗体反応に影響を
及ぼさずに、血球の影響を除去する方法を提供すること
を目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、全血試
料と、免疫感作した不溶性担体粒子とを混合して免疫凝
集反応を行わせ、得られた凝集反応混合物を、赤血球溶
解剤を含む水溶液で希釈することにより赤血球を溶解し
て測定用試料を調製し、測定用試料の凝集度を測定する
全血免疫測定方法が提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の全血免疫測定法における
全血試料とは、通常ヒト又は他の動物から採取した血液
であって、血清や血漿を分離する処理を行っていないも
のを意味する。ただし、本発明の方法の実施に際して、
抗凝固処理されたもの、さらに反応緩衝液によって希釈
されたものであってもよい。

【００１２】抗凝固処理に使用する抗凝固剤は、例え
ば、ＥＤＴＡ塩やクエン酸塩等の血液検査で通常使用さ
れるものを用いることができる。また、反応緩衝液とし
ては、特に限定されるものではなく、例えば、リン酸塩
緩衝液、Ｔｒｉｓ-塩酸緩衝液等が挙げられる。反応緩
衝液のｐＨは、６〜８．５程度が適当である。また、反
応緩衝液には、非特異反応を抑制するための物質や増感
剤なども必要に応じて添加することができる。反応緩衝
液を全血と混合することによって、後に続く免疫凝集反
応の環境を整えることができる。全血を反応緩衝液で希
釈する場合の希釈倍率は、５〜１００倍程度（容量）が
適当であり、好ましくは１０〜５０倍程度である。全血
を反応緩衝液と混合する場合の温度は、２０〜５０℃程
度が適当であり、混合時間は１〜５分間程度とすること
ができる。

【００１３】不溶性担体粒子は、免疫感作、すなわち抗
原又は抗体によって感作された粒子であり、その材料と
しては、合成高分子、代表的にはポリスチレンラテック
ス等が挙げられる。

【００１４】この粒子のサイズは特に限定されず、公知
のもののすべてを用いることができる。例えば、直径約
０．１〜２０μｍ程度、さらに０．１〜１．０μｍ程度
が好適である。なお、この粒子は、粒径が均一であるこ
とが好ましい。

【００１５】不溶性担体粒子の免疫感作の方法は、当該
分野で公知の方法により行うことができ、例えば、物理
吸着法、化学結合法等が挙げられる。免疫感作を行う場
合に用いる抗原又は抗体としては、抗原抗体反応を利用
して検出可能なものであれば特に限定されない。

【００１６】不溶性担体粒子は、通常、懸濁液として使
用される。この場合の溶媒は、水、上記緩衝液等が適当
であり、不溶性担体粒子と溶媒との混合割合は、０．１
〜１w/v％程度が適当である。

【００１７】免疫凝集反応は、例えば、反応緩衝液で任
意に希釈した全血試料にラテックス懸濁液を添加し、抗
原抗体反応を行わせる。ここで、試料と不溶性担体粒子
（あるいは、希釈全血試料とラテックス懸濁液）との混
合割合は、例えば、１：５〜１：２０程度が挙げられ
る。反応温度は２０〜５０℃、反応時間は１５秒〜２０
分間が適当である。

【００１８】得られた凝集反応混合物を希釈するために
用いる赤血球溶解剤としては、単に赤血球膜を破壊する
だけでなく、膜を溶解又は収縮できるものを用いること
が好適である。例えば、血球計数の分野において、通
常、赤血球を溶血するために用いられる界面活性剤を用
いることができる。具体的には、水溶性界面活性剤が挙
げられる。水溶性界面活性剤は、カチオン性、アニオン
性、非イオン性、両性のいずれでもよい。なかでも、疎
水性部分の疎水性の強いもの（炭素数の多いもの）ほど
赤血球を溶解する力が強くなるので好ましい。

【００１９】カチオン性界面活性剤の例としては、アル
キルトリメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム
塩が挙げられる。

【００２０】アニオン性界面活性剤の例としては、アル
キル硫酸塩が挙げられる。

【００２１】非イオン性界面活性剤の例としては、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン
アルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテルが挙げられる。

【００２２】両性界面活性剤の例としてはアルキル酢酸
ベタインが挙げられる。

【００２３】赤血球溶解剤は、凝集反応混合物を希釈す
るための水溶液中に、２〜１００００ｐｐｍ程度で使用
することが適当である。

【００２４】なお、上記赤血球溶解剤を含有する水溶液
は、赤血球溶解剤の他に塩化ナトリウムのような塩類や
緩衝剤を含有していてもよい。この場合のこれら物質の
量は、上記ｐＨ等を考慮して適宜調整することができ
る。

【００２５】本発明では、免疫凝集反応を行った後、測
定の障害にならないように赤血球を溶解した後に測定を
行う。特開平１０−４８２１４号のように赤血球を溶血
した後に抗原抗体反応を行う方法では、赤血球を溶血す
るためには多量の界面活性剤が必要になる。多量の界面
活性剤の共存下では、抗原抗体反応が阻害されてしま
う。使用する界面活性剤濃度を下げるには、全血試料の
量を低くするか希釈する必要があるが、そうすると、抗
原抗体反応に関与する抗原または抗体濃度も低下し、結
果として感度が低くなってしまう。しかし、まず、上記
の条件下で抗原抗体反応を行うと、抗原抗体反応自体は
界面活性剤の影響を受けることがなく、必要十分な抗原
抗体反応を行わせることができる。さらに、反応した抗
原抗体反応複合体（凝集反応物）を崩すことなく検出が
可能になる。

【００２６】赤血球を溶解した測定用試料の凝集度を測
定する方法としては、公知の方法であれば特に限定され
ず、公知の凝集度の測定装置を使用して測定することが
できる。例えば、免疫比濁法を利用する場合には、分光
光度計を使用することができる。カウンティングイムノ
アッセイを利用する場合は、フローサイトメトリの原理
を利用した測定装置を使用でき、市販のフローサイトメ
ータを使用することができる。

【００２７】なお、シスメックス株式会社のＰＡＭＩＡ
シリーズは、カウンティングイムノアッセイ用の測定装
置であり、試料と緩衝液との混合から凝集度の算出まで
の一連の操作を全自動で行うことができるため最も好適
である。

【００２８】フローサイトメータを用いた凝集度の測定
は、以下のようにして行うことができる。

【００２９】調製された測定試料中に含有する凝集粒子
又は未凝集粒子を、フローセルの中に形成されたシース
液の層流中に、少しずつ押し出す。すると粒子は一列に
なって、ひとつずつフローセルの中央を通過する。

【００３０】フローセルを通過する粒子に対し、フロー
セルに垂直な方向からレーザダイオードでレーザ光を照
射する。レーザ光はフローセルを通過した後、透過光は
ビームストッパで止められ、前方散乱光のみがフォトダ
イオードで受光される。レーザ光としては、３１０〜１
２８５ｎｍ程度の波長範囲の光、具体的には、４８８、
６８０、７８０、８６０、９８０ｎｍ等の光を利用する
ことができる。また、散乱光の検出は、前方散乱光のほ
か、側方散乱光を検出してもよいし、その両方を検出し
てもよい。

【００３１】粒子がレーザ光を横切るとき、粒子の体積
に応じた強さの散乱光パルスが発生し、そのパルスが受
光素子によって受光される。通常、受光された散乱光パ
ルスは、電気パルスに変換される。これにより、粒子の
粒度分布の情報を得ることができる。つまり、この電気
パルスは、レーザ光の中に入った粒子が凝集せず、１個
のとき、凝集して２個のとき又は凝集して３個のとき、
あるいは血球であるとき等、その体積（容積）に応じた
強さとなる。

【００３２】この電気パルスをその強さで弁別し、未凝
集粒子、凝集粒子をカウントする。これらの粒子をカウ
ントする場合、散乱光強度に基づいて、未凝集粒子、凝
集粒子を弁別するための閾値を設定する。つまり、未凝
集粒子、凝集粒子は、その粒子サイズの違いから散乱光
強度が異なり、区別することができる。よって、未凝集
粒子と凝集粒子との間で、散乱光強度によって、未凝集
粒子と凝集粒子とを区別するための閾値を設定する。

【００３３】ここでの閾値の設定は、測定用試料の散乱
光強度を測定しながら、同時にそのデータに基づいて、
その場で閾値を設定してもよいし；データが得られた
後、そのデータに基づいて、閾値を設定してもよいし；
既知の情報あるいは過去のデータの蓄積等から、あらか
じめ予想される閾値を設定してもよい。なかでも、測定
誤差や再現性等を考慮すると、散乱光強度を測定しなが
ら、同時にそのデータに基づいて、その場で閾値を設定
することが好ましい。

【００３４】そして、各閾値に基づいて、未凝集粒子、
凝集粒子をそれぞれ弁別、計数し、凝集度を求めること
ができる。

【００３５】凝集度は、カウントされた全ての粒子のう
ち、上記で得られた凝集粒子数Ｐと未凝集粒子数Ｍ（Ｐ
＋Ｍ＝Ｔ）とから、抗原抗体反応に関与した凝集した粒
子の割合、すなわちＰ／（Ｍ＋Ｐ）として求めることが
できる。

【００３６】なお、試料中に乳び粒子等の測定対象外粒
子が存在すると、測定対象として測定される不溶性担体
粒子の粒度分布図に対象外粒子の分布が現れる。この場
合には、対象外粒子の粒度分布をスプライン関数で補間
して推定し、対象粒子と対象外粒子を含む粒度分布から
対象外粒子の粒度分布を差し引くことにより、対象粒子
のみを近似した補正データを得、補正データから凝集粒
子数と未凝集粒子数を求めることによってより正確な値
を得ることができる（日本特許第２９１２４１３号参
照）。

【００３７】また、本発明においては、凝集度を算出
し、この凝集度から、さらに抗原又は抗体濃度を求めて
もよい。

【００３８】抗原又は抗体濃度は、測定しようとする抗
原又は抗体について、既知の抗原又は抗体濃度における
凝集度を測定して（濃度を変化させて複数の凝集度を測
定することが好ましい）、その関係をあらかじめ求めた
検量線を利用することによって、求めることができる。

【００３９】分光光度計で測定を行う場合には、全血、
緩衝液、ラテックス試薬を混合後、直ちに赤血球溶解剤
を含む水溶液で希釈して溶血させ、溶血させた試料を測
定セルに入れ、光を照射して吸光度を測定する。波長は
６００〜２０００ｎｍの範囲が好適である。このときの
吸光度を時間０（すなわち抗原抗体反応が未反応）の吸
光度とする。

【００４０】次いで、全血、緩衝液、ラテックス試薬を
混合して所定時間反応させた後、赤血球溶解剤を含む水
溶液で希釈して溶血させ、溶血させた試料を同様に測定
し、得られた吸光度と時間０の吸光度との差から凝集度
合を求めることができる。

【００４１】

【実施例】実施例として、ランリームHBsAg（シスメッ
クス（株））を用い、全血を溶血後、ラテックス凝集反
応を行わせた試料を調製し、ＰＡＭＩＡ-３０（シスメ
ックス（株））を用いて測定した。

【００４２】ランリームHBsAgはHBs抗原測定用の試薬キ
ットであり、ラテックス試薬、緩衝液、検体希釈液、キ
ャリブレータから構成される。このうち、本実施例で
は、ラテックス試薬と緩衝液を使用した。

【００４３】ラテックス試薬は、抗HBs抗体を感作した
０．８μｍのポリスチレンラテックスの０．５％(w/v)
懸濁液である。

【００４４】全血１０μｌを緩衝液（ｐＨ６）８０μｌ
と混合し、１分間、４５℃でインキュベーションした。
これに抗HBs抗体感作ラテックス試薬１０μl加えて４５
℃で反応を開始した。

【００４５】反応を開始してから約２０秒後に、１９μ
lの反応混合物を９５０μlのシース液（２００ｐｐｍド
デシル硫酸ナトリウム、０．３ｇ／ｌ塩化ナトリウム水
溶液）を加えて５１倍に希釈し、赤血球を溶血して、測
定用試料を調製した。測定用試料を、ＰＡＭＩＡ-３０
の光学検出部に導き凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）を測定
した。

【００４６】反応を開始してから約１５分後に、凝集度
Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）の測定と同様にして赤血球を溶血
した後、凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ２）を測定した。な
お、Ｔ１は反応初期の凝集度であり、試料が測定範囲内
にあるかどうか確認する際に利用されるもので、通常は
Ｔ２を試料の凝集度（凝集率）として採用する。

【００４７】一方、比較のために従来法として、溶血さ
せた後にラテックス凝集反応を行わせ、凝集率を測定し
た。この場合、全血試料を、まず１００００ｐｐｍのド
デシル硫酸ナトリウムを含有する緩衝液を用いて溶血
し、ラテックス凝集反応に付した。また、シース液には
ドデシル硫酸ナトリウムを含まないものを用いた。

【００４８】さらに参考のために血清サンプルを用い、
緩衝液及びシース液にはドデシル硫酸ナトリウムを含有
させずに凝集率（Ｐ／Ｔ）を測定した。

【００４９】これらの結果を表１に示す。

【００５０】

【表１】

【００５１】上記に示したように、従来法では、界面活
性剤の影響を受けて抗原抗体反応が阻害されているのに
対し、本発明では、阻害されずに測定できていることが
確認された。

【００５２】本発明によれば、測定直前に界面活性剤を
含む水溶液で希釈して赤血球を溶解することにより、界
面活性剤により反応を阻害されることなく抗原抗体反応
を行わせることができ、感度の高い測定を行うことがで
きる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｚ 21/35 21/35 Ｚ 33/483 33/483 Ｃ (72)発明者 鳥居 経芳 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 (72)発明者 中嶋 一博 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA01 BB02 BB29 BB42 BB50 CA25 CB17 FA12 FA14 FA34 FA37 FB03 FB15 JA01 2G059 AA05 BB13 CC16 DD04 EE02 GG01 HH01 HH02 HH06 KK01 4B029 AA07 AA21 BB11 BB17 BB20 CC03 CC13 FA12

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 全血試料と、免疫感作した不溶性担体粒
   子とを混合して免疫凝集反応を行わせ、得られた凝集反
   応混合物を、赤血球溶解剤を含む水溶液で希釈すること
   により赤血球を溶解して測定用試料を調製し、測定用試
   料の凝集度を測定することを特徴とする全血免疫測定方
   法。
2. 【請求項２】 赤血球溶解剤が、界面活性剤である請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】 界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム
   である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 フローサイトメトリの原理を利用したカ
   ウンティングイムノアッセイ用の測定装置を用いる請求
   項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
5. 【請求項５】 測定用試料をフローセルに導き、フロー
   セルを通過する粒子にレーザー光を照射し、それによっ
   て生じる散乱光を検出し、 その散乱光強度について、未凝集粒子と凝集粒子とを弁
   別するための閾値を設定し、 各閾値に基づいて、未凝集粒子、凝集粒子を弁別、計数
   し、 前記未凝集粒子数と凝集粒子数とから凝集度を算出する
   請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
6. 【請求項６】 凝集度を、凝集粒子Ｐ／（凝集粒子Ｐ＋
   未凝集粒子Ｍ）として算出する請求項１〜５のいずれか
   １つに記載の方法。
7. 【請求項７】 散乱光が前方散乱光である請求項５に記
   載の方法。
8. 【請求項８】 不溶性担体粒子の大きさが、０．１μｍ
   〜２０μｍである請求項１〜７のいずれか１つに記載の
   方法。
9. 【請求項９】 試料と不溶性担体粒子との混合割合が、
   １：５〜１：２０である請求項１〜８のいずれか１つに
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 試料と不溶性担体粒子との反応温度が
    ２０〜５０℃、反応時間が１５秒〜２０分間である請求
    項１〜９のいずれか１つに記載の方法。