JP4515733B2

JP4515733B2 - 尿中総ヘモグロビン定量試薬

Info

Publication number: JP4515733B2
Application number: JP2003323607A
Authority: JP
Inventors: 英彦近藤; 尚彦石田
Original assignee: Godo Shusei KK
Current assignee: Godo Shusei KK
Priority date: 2003-09-16
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2023-09-16
Also published as: JP2005091111A

Description

本発明は、金コロイド粒子凝集法を用いる尿中総ヘモグロビンの定量試薬に関する。さらに詳しくは、尿中の赤血球を迅速にかつ完全に溶解させ、尿中の微量な総ヘモグロビンを精度良く定量する方法に関する。

腎尿路系の疾患による血尿では、尿中に赤血球とヘモグロビンが混在している場合が多い。従来より、肉眼的には判断できない微量な血尿の検査法としては、試験紙による潜血反応（試験紙法）と顕微鏡による沈渣有形成分検査が一般的である。しかしながら、試験紙法は、簡便に尿中のヘモグロビンを定性判定できるが、混在する赤血球は斑点状の呈色となり、機器判定では低めに判定されるという問題点があった。また、試験紙法はヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性による酸化還元反応を反応原理とするため、アスコルビン酸などの尿中に存在する還元物質や、ミオグロビンなどのペルオキシダーゼ様活性を有する他の物質の影響を受けやすく、特異性が低いという問題もあった。

そこで、特異性を高めるために、抗原抗体反応を利用した尿中ヘモグロビン測定方法が試みられている（非特許文献１）。すなわち、抗ヘモグロビン抗体を感作させたポリスチレンラテックスを用いた粒子凝集法で尿試料を分析した結果、アスコルビン酸やミオグロビンの影響を受けることなく尿中のヘモグロビンを特異的に定性判定できることが記載されている。しかしながら、尿中に赤血球が混在する尿検体の場合はこれを検出できず、陰性結果となるという問題点があった。

一方、赤血球が混在する尿を−８０℃で凍結し、再融解した尿試料について、抗ヘモグロビン抗体を感作させたポリスチレンラテックス法で分析すると、尿中の総ヘモグロビン量を正確に定量できることが開示されている（非特許文献２）。しかしながら、凍結に際して、尿試料にヘモグロビン安定化試薬を加える必要があること、さらに−８０℃という超低温での凍結処理と再融解操作に多大な時間と労力、設備を必要とするという問題があった。

特許文献１や特許文献２には、生体試料中に存在する赤血球を溶血させるために、フローサイトメトリー用試薬等に界面活性剤が使用されている。しかしながら、粒子凝集法を用いる定量的免疫分析において反応系に界面活性剤が存在すると、界面活性剤の種類によっては、分析対象となる抗原や試薬中の抗体が変性して全く反応が起こらないという現象を引き起こす。さらに、タンパク質変性作用が穏やかな界面活性剤であっても、粒子凝集を抑制するため、反応性が著しく低下し、試料中に微量に存在する抗原を精度良く測定できないという問題があった。

特開平０６−１０９７２５号公報特開平０９−３２９５９６号公報臨床検査ｖｏｌ．３９９６９−９７３頁１９９２年臨床病理ｖｏｌ．５１４０３−４０８頁２００３年

本発明は、赤血球が混在する尿試料中の総ヘモグロビン定量における、上記の問題点を解決し、前処理を必要とせずに尿中の微量な総ヘモグロビンを簡便かつ精度良く定量する試薬の提供を目的とするものである。

本発明は、金コロイド粒子凝集法による尿中総ヘモグロビンの定量的免疫分析において、尿中に混在する赤血球を溶血させる界面活性剤と、粒子凝集反応を促進させて反応性を高める高分子重合体を試薬中に予め含有させることを特徴とするものである。

すなわち、臨床検査に用いられている汎用自動分析装置で広く採用されている２種類の試薬を用いる反応系において、本発明の定量分析試薬は、第１試薬に界面活性剤を含有させ、第１試薬又は第２試薬のどちらか一方、あるいは第１試薬と第２試薬の両方に所定の濃度で高分子重合体を含有させることで、上記課題を解決する。

本発明の定量分析試薬によれば、赤血球が混在する尿試料の微量な総ヘモグロビン量でも、特別な前処理を必要とせずに、特異的に簡便かつ精度よく定量することができる。

本発明に用いる試薬は、赤血球を溶血させる作用を有する界面活性剤を含有する第１試薬、並びにヘモグロビンに対する抗体を結合させた金コロイド粒子担体を含有する第２試薬から構成される。他方の必須成分である粒子凝集反応を促進する高分子重合体は、第１試薬又は第２試薬のどちらか一方、あるいは第１試薬と第２試薬の両方に所定の濃度で含有させる。

本発明に用いる界面活性剤としては、赤血球を溶血させる作用を有するポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤を使用することができる。例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（付加モル数５〜２０）またはポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（付加モル数５〜２０）等が挙げられる。特にポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（付加モル数１０）またはポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（付加モル数１０）の使用が好適である。また、以上を組み合わせることも可能である。これらの界面活性剤の含有量は、０．０１〜０．５重量％である。

また、本発明に用いる高分子重合体としては、反応を促進する作用を有する平均分子量４，０００〜２５，０００のポリエチレングリコールが使用できる。高分子重合体の含有量は、１〜１０重量％である。
さらに、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム緩衝液やグッド緩衝液等を使用すると、一定のｐHを維持するために、好都合である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（試薬の作製）０．２重量％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（付加モル数１０）、６重量％ポリエチレングリコール６０００（平均分子量６，０００）、０．１重量％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を第１試薬とした。

フレンスらによる（Nature Phys.Sci.,Vol.241,p20-22 (1973)）に記載された方法により、塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元し、金コロイド液を調製した。特開平２−１４１６６５号公報に記載の抗ヒトヘモグロビン・マウスモノクローナル抗体を金コロイド液１ｍｌあたり６μｇ添加した後、０．５ｍＬの１％ウシ血清アルブミン溶液を加えた。次いで、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することにより暗赤色沈殿である抗体結合金コロイドを回収し、１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、波長５４０ｎｍにおける吸光度が２．４になるように縣濁し、第２試薬とした。

（測定）ヘパリン採血したヒト血液を生理食塩水で１００倍に希釈してヒト赤血球浮遊液を調製した。生理食塩水でさらに１，０００、２，０００、４，０００倍希釈したものを非溶血試料として測定した。測定には、汎用自動分析装置（（株）日立製作所製７０７０形自動分析装置）を用いた。反応系は、試料：５μｌ、第１試薬：１３０μｌ、第２試薬：１４０μｌとし、反応開始直後と５分後の吸光度差を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。また、実験に先立ち、標準ヘモグロビンとして合同酒精（株）製キャリブレーター２０１０を用いて、同一の条件で吸光度差を測定し、ヘモグロビン濃度と吸光度差の関係を示す検量線を作成した。この検量線から、試料中のヘモグロビン濃度を算出した。
比較例１として、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（付加モル数１０）を添加していない第１試薬を使用した。また、本発明の定量性を確認するために、ヒト赤血球浮遊液を蒸留水で同様の倍率に希釈し、完全に溶血させた試料の測定も行った。その結果を図１に示した。
本発明の試薬を用いると、赤血球が混在する試料の総ヘモグロビン濃度を正確に分析することができた。一方、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（付加モル数１０）を添加しない試薬を用いた場合は、著しく低いヘモグロビン測定値となり、定量できなかった。

ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（付加モル数１０）のかわりに、試験紙に溶血剤として広く用いられている界面活性剤の０．２重量％ラウリル硫酸ナトリウムを添加した第１試薬を使用した場合は、全く反応が見られなくなり、測定することができなかった。

（試薬の作製）０．０５重量％ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（付加モル数１０）、３重量％ポリエチレングリコール２００００（平均分子量２０，０００）、０．１重量％アジ化ナトリウムを含む０．０２Ｍピペラジン-N,N'-ビス2-エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を第１試薬とした。第２試薬は実施例１と同じものを使用した。

（測定）赤血球が混在した尿を試料として、１０回測定を繰り返した。実施例２と同様に、測定には、汎用自動分析装置（（株）日立製作所製７０７０形自動分析装置）を用いた。反応系は、試料：５μｌ、第１試薬：１３０μｌ、第２試薬：１４０μｌとし、反応開始直後と５分後の吸光度差を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。標準ヘモグロビンにより作製した検量線から、試料中のヘモグロビン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を算出した。
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（付加モル数１０）を添加していない第１試薬を使用した測定結果を比較例２、ポリエチレングリコール２００００を添加していない第１試薬を使用した測定結果を比較例３として、表１に結果を示した。

本発明の試薬を用いると、実際に赤血球が混在する尿検体を分析した場合にも、総ヘモグロビン濃度を再現性良く分析することができた。一方、界面活性剤を添加しない試薬を用いた比較例２では、著しく低いヘモグロビン測定値となり定量性がなかった。また、高分子重合体を添加しない比較例３では、反応に伴う吸光度差が著しく低下し、ヘモグロビン測定値のばらつきを示す変動率が大きくなった。

本試薬は、汎用自動分析装置に適用できるので、集団検診など、大量の検体を処理する場合に、処理能力が向上し、省力化や効率化が期待できる。

本発明の効果（実施例２，比較例１）

Claims

尿試料に第１試薬を反応させ、次いでヘモグロビンに対する抗体を結合させた金コロイド粒子担体を含有する第２試薬を反応させる金コロイド粒子凝集法による尿中総ヘモグロビンの定量的免疫分析法であって、
第１試薬にポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（付加モル数５〜２０）またはポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（付加モル数５〜２０）０．０１〜０．５重量％を含有させ、第１試薬又は第２試薬のどちらか一方、あるいは第１試薬と第２試薬の両方に平均分子量４，０００〜２５，０００のポリオキシエチレングリコール１〜１０重量％を含有させることを特徴とする尿中総ヘモグロビンの定量的免疫分析法。