JP2008532006A - アッセイ方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
i)前記溶解剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後に起こること、
ii)前記阻害剤が存在する場合には前記阻害剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後であって前記溶解剤との接触前に起こること、及び
iii)前記結合剤及び前記微粒子との接触が、前記結合剤及び前記微粒子を共に含む液体との接触を伴わないこと。
i)稀釈液との接触、
ii)酵素及び還元剤との接触、
iii)インキュベーション、
iv)微粒子、阻害剤、及び溶解剤との接触、
v)結合剤との接触、
vi)インキュベーション、及び
vii)膜を通しての引き出し。
i)稀釈剤との接触、
ii)還元剤、酵素、及び微粒子との接触、
iii)インキュベーション、
iv)溶解剤、阻害剤、及び結合剤との接触、
v)インキュベーション、及び
vi)膜を通しての引き出し。
i)稀釈剤との接触、
ii)還元剤、酵素、及び微粒子との接触、
iii)インキュベーション、
iv)溶解剤及び阻害剤との接触、
v)結合剤との接触、
vi)インキュベーション、及び
vii)膜を通しての引き出し。
1)キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
2)カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程(すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される)、
3)カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
4)稀釈剤を第1のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
5)血液及び稀釈剤を先端にキャピラリーが付いたピペットから第2のウェルに導入する工程、
6)第2のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
7)インキュベーションの間、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤を第1のウェルから第3のウェルに導入する工程、
8)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、インキュベートされた液体を第2のウェルから第3のウェルに導入する工程、
9)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、結合剤及び稀釈剤を第4のウェルから第3のウェルに導入する工程、
10)第3のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
11)インキュベートされた液体を第3のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
12)膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
13)血漿HCy含有量を測定し、その結果を表示及び/又はエクスポートする工程。
1)キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
2)カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程(すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される)、
3)カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
4)稀釈剤を第1のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
5)血液及び稀釈剤を先端にキャピラリーが付いたピペットから第3のウェルに導入する工程、
6)第3のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
7)インキュベーションの間、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤を第1のウェル及び/又は第2のウェルから第4のウェルに導入する工程、
8)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、溶解剤、及び阻害剤を第2のウェルから第3のウェルに導入する工程、
9)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、結合剤及び稀釈剤を第4のウェルから第3のウェルに導入する工程、
10)第3のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
11)インキュベートされた液体を第3のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
12)膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
13)血漿HCy含有量を測定し、その結果を表示及び/又はエクスポートする工程。
1)キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
2)カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程(すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される)、
3)カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
4)稀釈剤を第1のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
5)血液及び稀釈剤を先端にキャピラリーが付いたピペットから第2のウェルに導入する工程、
6)第2のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
7)インキュベーションの間、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤を第3のウェルから第4のウェルに導入する工程、
8)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、インキュベートされた液体を第2のウェルから第3のウェルに導入する工程、
9)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、結合剤及び稀釈剤を第4のウェルから第3のウェルに導入する工程、
10)第3のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
11)インキュベートされた液体を第3のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
12)膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
13)血漿HCy含有量を測定し、その結果を表示及び/又はエクスポートする工程。
1)キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
2)カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程(すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される)、
3)カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
4)稀釈剤を第2のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
5)血液、稀釈剤、及び酵素を先端にキャピラリーが付いたピペットから第2のウェルに流す工程、
6)第2のウェルの内容物をインキュベートする工程、
7)稀釈剤及び細胞溶解剤を第1のウェルから先端に膜が付いたピペットに導入し、第1のウェルに流し戻す工程、
8)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、細胞溶解剤、及び阻害剤を第1のウェルから第2のウェルに導入する工程、
9)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、溶解した試料を第2のウェルから第3のウェルに導入する工程、
10)第3のウェルの内容物をインキュベートする工程、
11)インキュベートされた液体を第3のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
12)膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
13)血漿HCy含有量を測定し、その結果を表示及び/又はエクスポートする工程。
1)キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
2)カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程(すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される)、
3)カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
4)稀釈剤を第2のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
5)血液、稀釈剤、及び酵素を先端にキャピラリーが付いたピペットから第2のウェルに流す工程、
6)第2のウェルの内容物をインキュベートする工程、
7)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤及び細胞溶解剤を第1のウェルから第5のウェルに導入して阻害剤を溶解する工程、
8)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、細胞溶解剤、及び阻害剤を第5のウェルから第1のウェルに移す工程、
9)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、細胞溶解剤、及び阻害剤を第1のウェルから第2のウェルに移す工程、
10)先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、溶解した試料を第2のウェルから第3のウェルに導入する工程、
11)第3のウェルの内容物をインキュベートする工程、
12)インキュベートされた液体を第3のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
13)膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
14)血漿HCy含有量を測定し、その結果を表示及び/又はエクスポートする工程。
ウェルA
このウェルは、WO 00/40973の実施例1に記載されるようにして調製され、US−A−5691207及びUS−A−5650333に記載されるように結合され、逆円錐形のプラスチックカップ上に真空乾燥された金コロイド(粒子径:約100nm)と抗SAH抗体との複合体を約22μg含む。
ウェルB
このウェルは、約4mm×8mmのSupor800膜(Pall−孔径0.8μm)が先端に付いたピペットを含む。
ウェルC
このウェルは、酵素阻害剤(0.2%メルチオレート(チメロサール))及び溶解剤(1%トリトンX−100)を含有する185μlの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)を含む。
ウェルD
このウェルは、0.27μgアデノシン、50μg微粒子(S−アデノシル−システインを結合した1μmのラテックス粒子)又は300μg微粒子(S−アデノシル−システインを結合した2μmのラテックス粒子)、約5ユニットの組換えSAH−ヒドロラーゼ、及び、還元剤(23μgTCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスファイン:HCl))を含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルE
このウェルは、300〜350μLの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)を含む。
ウェルAに示されるキャピラリー中の血液試料(5〜10μL)を、ウェルEから200μLの緩衝剤を引き込むことによって稀釈し、空になるまでウェルDに移す。キャピラリーピペットを用いてウェルCの85μLの内容物をウェルAに移して、金複合体を溶解させる。キャピラリーピペットを用いてウェルDの100μLの内容物をウェルCに移す前に、カートリッジを37℃で3分間インキュベートする。次に、ヘマトクリットレベルを、ウェルCの内容物による緑色又は青色ダイオードからの光の吸光度を検出ことによって測定する。次に、キャピラリーピペットを用いて、ウェルAの60μLの内容物をウェルCに移す。次に、カートリッジを37℃で1分間インキュベートする。次に、ウェルCの全内容物(選択的に、続いてウェルEに残存する緩衝剤)を先端に膜が付いたピペットに引き込み、バックグラウンドを低減させる。次に、膜の外側に保持される(2回目のインキュベーションで形成される金/ラテックス複合体に対応する)金コロイドを、緑色又は青色ダイオード照射を用いて反射モードで検出する。
ウェルA
約22μgの複合体を用いること以外は実施例1と同様。
ウェルB
実施例1と同様。
ウェルC
このウェルは、0.27gアデノシン、20μg微粒子(S−アデノシル−システインを結合した1μmのラテックス粒子)又は160μgの微粒子(S−アデノシル−システインを結合した2μmのラテックス粒子)、約5ユニットの組換えSAH−ヒドロラーゼ、及び、還元剤(23μgトリス(2−カルボキシエチル)ホスファイン:HCl)を含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルD
このウェルは、酵素阻害剤(0.4%メルチオレート(チメロサール))及び溶解剤(2%のトリトンX−100)を含有する、225μLの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)を含む。
ウェルE
このウェルは、350μLの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)を含む。
キャピラリーピペットに引き込まれた血液試料(5〜10μL)を、160μLの緩衝剤をウェルEからキャピラリーピペットに引き込むことによって稀釈する。次に、キャピラリーピペットの内容物をウェルCに排出する。キャピラリーピペットを用いて85μLの緩衝剤をウェルE(又はウェルD)からウェルAに移す。次に、カートリッジを37℃で3分間インキュベートする。次に、キャピラリーピペットを用いて、ウェルDの40μLの内容物をウェルCに移す。次に、ウェルCの内容物を用いて、ヘマトクリット値を実施例2のように測定する。キャピラリーピペットを用いて、ウェルAの60μLの内容物をウェルCに移し、カートリッジを37℃で1分間インキュベートする。ウェルCの内容物(選択的に、続いてウェルD及び/又はEの残りの内容物)を先端に膜が付いたピペットで引き込み、膜の外側に保持された金コロイドを実施例2のように測定する。較正を実施例2のように行う。
ウェルA
実施例1と同様。
ウェルB
実施例1と同様。
ウェルC
このウェルは、20μg微粒子(S−アデノシル−システインを結合した1μmのラテックス粒子)又は160μg微粒子(S−アデノシル−システインを結合した2μmのラテックス粒子)、75μgメルチオレート(チメロサール)、及び750μgトリトンX−100を含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルD
このウェルは、0.27μgアデノシン、5ユニットの組換えSAH−ヒドロラーゼ、及び23μgTCEP:HClを含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルE
このウェルは、350μLの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)を含む。
キャピラリーピペット中の血液試料(5〜10μL)を、ウェルEから175μLの緩衝剤を引き込むことによって稀釈し、ウェルDに排出する。次に、キャピラリーピペットを用いて80μLの緩衝剤をウェルEからウェルAに移す。次に、カートリッジを37℃で3分間インキュベートする。次に、キャピラリーピペットを用いてウェルDの75μLの内容物をウェルCに移す。次に、ウェルCの内容物を用いて、ヘマトクリット値を実施例2のように測定する。次に、キャピラリーピペットを用いてウェルAの50μLの内容物をウェルCに移す。次に、カートリッジを37℃で1分間インキュベートする。次に、ウェルCの内容物(選択的に、続いてウェルEの内容物)を先端に膜が付いたピペット内に引き込み、次に、膜の外側に保持された金コロイドを実施例2のように測定する。較正を実施例2のように行う。
ウェルA
実施例3と同様。
ウェルB
実施例1と同様。
ウェルC
このウェルの内容物は、4.5μg/mlアデノシン、330μg/ml微粒子(S−アデノショル−システインを結合した1μmのラテックス粒子)又は2.7mg/mL(S−アデノシル−システインを結合した2μmのラテックス粒子)、80U/mL組換えSAH−ヒドロラーゼ、及び380μg/mL TCEP:HClを含有する60μLの水性組成物である。
ウェルD
このウェルは、0.4%メルチオレート(チメロサール)及び2%トリトンX−100を含有する225μLの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)を含む。
ウェルE
このウェルは、285μLの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)を含む。
キャピラリーピペット中の血液試料(5〜10μL)を、ウェルEから100μLの緩衝剤を引き込むことによって稀釈し、ウェルCに排出する。次に、キャピラリーピペットを用いて85μLの緩衝剤をウェルE(ウェルD)からウェルAに移す。次に、カートリッジを37℃で3分間インキュベートする。次に、40μLのウェルDの内容物をウェルCに移し、次いで、ヘマトクリットを実施例2のように測定する。次に、キャピラリーピペットを用いてウェルAの60μLの内容物をウェルCに移し、カートリッジを37℃で1分間インキュベートする。次に、ウェルCの内容物(選択的に、続いてウェルD及び/又はEの内容物)を先端に膜が付いたピペット内に引き込み、次に、膜の外側に保持された金コロイドを実施例2のように測定する。較正を実施例2のように行う。
ウェルA
このウェルは、カートリッジ1内に配置されるとき先端にキャピラリーが付いたピペット10の先端から過剰な試料を除去するように作用する吸着ワイパー15を含む。ピペット10の本体内にビーズ16及び17を含む試薬が配置される。ビーズ16は、65μgのTECPとともに約5ユニットのrSAHアーゼを含む。ビーズ17は、40μgのMgCl2とともに約0.1ユニットのヌクレアーゼ(例えば、Merckからのベンゾナーゼ)を含む。両ビーズもまた、バインダーとしてトレハロースを含む。
ウェルB
このウェルは、ピペットの本体内に120μgN−エチル−マレイミドを含む試薬含有ビーズ18を含むこと以外は実施例1に記載されたとおりである。
ウェルC
このウェルは、2つの試薬含有ビーズ19及び20を含む。ビーズ19は、実施例1においてウェルAについて記載された約100μgの金複合体を含む。ビーズ20は、0.12μgの微粒子(実施例1においてウェルDについて記載されたS−アデノシル−システインを結合した1〜2μm、好ましくは1.6μmのラテックス粒子)を含む。
ウェルD
このウェルは、200μLの緩衝剤(10mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4、又は、25mMトリス、150mM NaCl、pH8.1)中に0.27μgアデノシンを含む。
ウェルE
このウェルは、ウェルDの緩衝剤中に300μLの0.4重量%SDSを含む。
ウェルAにおいて示されるキャピラリー中4.5μLの血液試料(3〜10μL)とともに200μLの緩衝剤(125〜300μL)をウェルDから先端にキャピラリーが付いたピペット内に引き込み、ビーズ16及び17を溶解させる。内容物をウェルDに流し戻し、37℃で1分間(3分まで)インキュベートする。
ウェルA
ビーズ17を省略すること以外は実施例9に記載されたとおりである。
ウェルB
実施例9に記載されたとおりである。
ウェルC
実施例9に記載されたとおりである。
ウェルD
0.1ユニットのヌクレアーゼ(実施例9のウェルAの記載と同様)及び40μgMgCl2を含むこと以外は実施例9に記載されたとおりである。
ウェルE
実施例9に記載されたとおりである。
アッセイの工程は、実施例10に記載されたとおりに実施される。
ウェルA
先端にキャピラリーが付いたピペット及びその内部のビーズ(16)は、実施例11に記載されたとおりである。ウェルのベースは、80〜200μg(例えば、120μg)のN−エチル−マレイミドを含有する乾燥阻害剤組成物を含む(実施例1に記載された)挿入物を含む。
ウェルB
実施例1に記載されたとおりである。
ウェルC
実施例9に記載されたとおりである。
ウェルD
実施例11に記載されたとおりである。
ウェルE
実施例9に記載されたとおりである。
試料、酵素、及び還元剤をウェルDに移し、そこで実施例10のようにインキュベートする。
実施例9から14で用いられるビーズを以下のように調製する。
Claims (11)
- ヒト又はヒト以外の血管を有する動物の被検体から採取された血液試料中の血漿ホモシステインを分析する方法であって、
前記被検体からの全血試料を以下の試薬−液体稀釈液、還元剤、ホモシステイン変換酵素、選択的に前記酵素のホモシステイン変換反応の阻害剤、細胞溶解剤、前記ホモシステイン変換酵素の変換産物に結合可能な色標識結合剤、及び前記変換産物と競合して前記結合剤に結合可能な微粒子に接触させること;
前記試薬との接触後、結合していない状態及び前記変換産物に結合した状態の前記結合剤を通過させるのには十分であるが、前記微粒子に結合した状態の前記結合剤を通過させるのには不十分な多孔性を示す膜を通して前記試料を引き込むこと;
前記膜上に保持された前記結合剤の色標識を検出すること;
前記全血試料中の赤血球細胞の濃度に依存する補正因子を適用することにより血漿ホモシステイン濃度の示度を前記検出から判断すること;
選択的ではあるが好ましくは、前記血漿ホモシステイン濃度を可視又は電子信号として提示することを含み、
前記試薬との接触が、下記規定に従うことを条件として連続して又は同時に行われる方法。
i)前記溶解剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後に起こること、
ii)前記阻害剤が存在する場合には前記阻害剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後であって前記溶解剤との接触前に起こること、及び
iii)前記結合剤及び前記微粒子との接触が、前記結合剤及び前記微粒子を共に含む液体との接触を伴わないこと。 - 前記膜を通して前記試料を引き込む前に、前記試料中のDNAをフラグメント化する請求項1に記載の方法。
- 前記試薬の少なくとも1つがビーズ形態で提供される請求項1及び2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記色標識結合剤が、金属ビーズ標識結合剤である請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 全血を用いる血漿ホモシステインアッセイ用の使い捨てカートリッジであって、
前記カートリッジは、複数ウェルを備えたベース、先端にキャピラリーが付いた取り外し可能なピペット、及びカバーを有し、
前記カバーは、先端に膜が付いたピペットを担持し、
前記ベースのウェルは、以下のアッセイ試薬:液体稀釈剤、還元剤、ホモシステイン変換酵素、選択的に前記酵素のホモシステイン変換反応の阻害剤、細胞溶解剤、前記酵素の変換産物に結合可能な色標識結合剤、及び前記変換産物と競合して前記結合剤に結合可能な微粒子を含み、
前記結合剤及び前記微粒子は異なる前記ウェル内に存在し、
前記阻害剤が存在する場合には、前記阻害剤及び前記酵素は異なる前記ウェルに存在し、
前記溶解剤は、前記酵素並びに前記還元剤及び前記稀釈剤の少なくとも一部を含む1つ又は複数のウェルとは異なるウェルに存在するカートリッジ。 - 前記ベースに少なくとも5つのウェルを線形配列で有する請求項5に記載のカートリッジ。
- 前記ベースにおける少なくとも1つのウェル内に少なくとも1つの試薬含有ビーズを有する請求項5及び6のいずれか1項に記載のカートリッジ。
- 前記ピペットの少なくとも1つに前記ビーズの少なくとも1つを有する請求項7に記載のカートリッジ。
- 前記ベース内の前記ウェルのうちの少なくとも1つにヌクレアーゼを含む請求項5から8のいずれか1項に記載のカートリッジ。
- 血漿及び血液細胞中に存在する分析物を分析する方法であって、
(a)全血試料の血漿中の前記分析物の含有量を測定すること、
(b)前記試料のヘマトクリット又はヘモグロビンの含有量を(好ましくは分光測光法で)測定すること、及び
(c)前記測定から前記分析物の血漿濃度を測定することを含む方法。 - 診断用アッセイのための使い捨てカートリッジであって、
少なくとも1つが前記アッセイを実施するための試薬を含む複数のウェルを含むカートリッジ本体を有し、
少なくとも1つのウェルが、溶媒中で、少なくとも1つの前記試薬を放出するビーズを含んでいることを特徴とするカートリッジ。
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