JP5726167B2 - マイクロ流体臨床分析器 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００９年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／１６８，８４０号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

分野
本発明は、マイクロ流体デバイスの分野であり、臨床検査室アッセイの実行のためのマイクロ流体デバイスおよび装置に関する。

臨床医は、看護下の患者の状態をより良く評価するために日常的に臨床試験に依存する。“ｒｏｂｏｔ ｃｈｅｍｉｓｔ”（特許文献１）、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ ＡｕｔｏＡｎａｌｙｚｅｒ、およびＡｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）等の大型の臨床分析機器が周知である。Ｃｏｌｅｍａｎに対する特許文献２において、臨床アッセイの小型化に向けたステップがとられている。

しかし、マイクロ流体チップはさらに大きな縮尺効果があり、マイクロリットルまたはナノリットルサイズのサンプルを受け取るのに適している。しかし、Ｌｉｌｊａにより特許文献３に記されるように、試薬および被検物質を均質に混合するのは、より小さな反応器においてはより困難で時間がかかり、例えば何らかの機械的振動手段が必要となる。Ｌｉｌｊａは、最適な振動数および振幅は実験的に決定されるのが最善であると報告する。超音波混合も、Ｌｉｓｔｏｎ（特許文献４）、Ｙａｎｇ（Ｙａｎｇ Ｚ等、２００１，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｅｎｓｏｒｓ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ ３：２６６−２７２）、およびＹａｒａｌｉｏｇｌｕ（Ｙａｒａｌｉｏｇｌｕ ＧＧ等、２００４，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７６：３６９４−９８）により提案されている。遠心分離は、Ｐｉｃｃｏｌｏ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣａｒｄｉｎａｌＨｅａｌｔｈ，Ｄｕｂｌｉｎ ＯＨ）のように試薬ディスクからの試薬の機械的混合および溶解のために使用しているが、これは約１２分で結果をもたらし、Ｓｃｈｅｍｂｒｉ（Ｓｃｈｅｍｂｒｉ ＣＴ等、１９９２，Ｐｏｒｔａｂｌｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎａｌｙｔｅ ｗｈｏｌｅ−ｂｌｏｏｄ ａｎａｌｙｚｅｒ ｆｏｒ ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３８：１６６５−１６７０）により記載されている。他の混合手段は、米国特許第６３８２８２７号および第６８０８３０４号に、また最近ではＱｉａｎ（Ｑｉａｎ Ｍ等、２００８，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｉｘｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｏｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８０：６０４５−５０）により提案され、困難で未解決の問題が指摘されている。

Ｈａｍｍｏｎｄは米国特許第４９６５０４７号において、希釈液または試薬液を保つための壊れやすいブリスターを伴う分析試験ストリップを記載する。サンプルが吸収体層において液体試薬と反応し、観察窓における反射率によりエンドポイントカラーが読み取られる。Ｋｉｔａｇｕｃｈｉは米国特許第７６２５７６０号において、Ｗｉｌｄｉｎｇ（米国特許第５３０４４８７号）により早期に提案されるような、分析が実行されるチップの外から供給される試薬を利用するｕＴＡＳ法が周知であると述べる。しかし、Ｋｉｔａｇｕｃｈｉは、このレベルの複雑さがポイントオブケア分析用途に適さないことを指摘し、定量分析に適するカートリッジ上の液体試薬貯蔵および放出の方法を提案する。しかし、例えばＫｉｔａｇｕｃｈｉ特許の図８および１３において観察されるように、この方法はデバイス組成を相当複雑にし、試薬および被検物質を即座に混合することが困難なため明らかにエンドポイントアッセイに限られる。

Ｓｕｂｒａｍｉｎｉａｎは米国特許第５２２３２１９号において、デバイスに直接適用される血液中の様々な臨床被検物質のアッセイを実行するために、毛細管流動および多孔性反射マトリックスに依存する。モニタが、典型的に三つの波長でのアッセイ反応の間にデバイス反応マトリックスの反射率を記録する。エンドポイントでの反射率の変化を既知の較正材料のものと比較することにより、モニタは被検物質濃度を計算しうる。しかし、毛細管流動は標準化が困難であることが分かっており、不規則性により全体的なアッセイ再現性および精度が高められうる。

Ｏｏｓｔａは米国特許第５４７８７５１号において、血中グルコースのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼアッセイ等の反応がサンプル中で完成に反応することを許容され、指示色素の強度が分光光度的に読み取られる、自動通気材料でできたデバイスを記載する。微小孔構造ポリプロピレンフィルム、モノフィラメント織りスクリーンまたは他の疎水性、空気透過性材料でできたデバイスボディが、内部チャネルから空気を除去するために用いられる。

Ｎａｋａは米国特許第６００１３０７号において、液体サンプルにおける小スケール分析測定用デバイスを請求する。分析反応が選択された期間進行した後、任意の生じた色素が光学観察エリアにおいて濾紙またはスポンジに取り込まれ、色素の生成を測定するために反射光を使用して濃度測定により測定される。固定された固体免疫化学も光学観察エリアに配備されればよく、所定の反応時間後に被検物質および結合試薬のサンドイッチがアッセイされる。換言すれば、アッセイ方法はここでもエンドポイント反応に限られる。発明者らは、請求項中のバイパスチャネル（６）の重要性も強調する。これは過剰なサンプルまたは混入空気を吸い取り、任意の過剰な吸引圧を中和するために使用され（１４段、２５〜５３行、４段、４０〜５５行）、上流の引き込みチャネルセグメントで最も大きく、バイパスチャネルにおいてより少なく、下流の分析チャネルにおいて最少の流動抵抗の減少を計画的に実施するが、実際には不要であるように思われる。

Ｎａｋａは米国特許第６３２５９７５号において、小さな親指サイズの吸引チャンバに固定された細長いサンプリングチャネルをさらに記載し、この吸引チャンバは、変形されて開放されたときに吸引を生成するための弾力を有し、細長いチャネルは、被検物質と反応するための固定された試薬を含む「サンプル分析デバイス」を有する第二チャンバを含む。デバイスは、吸引チャンバが押圧された後にサンプルがデバイスに収容されなければならないという不利益を有し、陽圧の適用時にサンプルの圧出を防ぐためのチェックバルブまたはベントはない。また、積層膜への試薬の取り込みは、反応速度を被検物質濃度から独立した拡散カイネティクスに有効に制限し、したがってデバイスをエンドポイント反応に制限する。

患者の臨床状態をより良く特徴づけるために、複数のアッセイからの結果を有することが所望されうる。試験パネルは、ポイントオブケアでリアルタイムにおいて入手可能であれば非常に有用である。毛細サンプル管等により得られる１０または２０マイクロリットルのサンプルサイズの全血に、複数の分析を実行することが難しい。特に難しいのは、高ヘマトクリットがサンプル血漿体積の減少を伴う小児科血液サンプルである。

最小限のサンプル体積から複数のアッセイが所望される場合には、アッセイを並行してではなく順に実行し、サンプルを必要なだけ測定することが望ましく、それを達成するために、臨床的重要性の順位で可能な限り多くのアッセイを実行できるように、反応を一度に一つずつ実行するために充分な血漿を引き出す、全血から血漿を「オンデマンド」で分離するための手段が必要である。

文献においても示されているように、希釈液および試薬体積の除去または減少は、感度の増大をもたらすが、最小限のサンプル液体における乾燥試薬の直接再水和および混合の間に生じる任意の不均質性を受動的に分散させる問題につき満足な解決法は示されていない。ここで「受動的に」とは、機械的に補助された混合が存在しないことを意味する。

選択された被検物質の濃度を測定するためにゼロ次カイネティック条件下の反応速度が所望されるカイネティックアッセイの場合に必要なのは、律速な被検物質を含むサンプルを反応に加わる全ての反応物および補因子と即座に混合でき、それから反応速度が線形である非常に短い期間で、他の反応物が律速になる前に、定常状態反応速度を測定できるデバイスである。この条件は、例えば上記のＬｉｌｊａにより記載されるように、外部ドライバにより駆動される専用の混合回路に取り込まれ操作されるかなりの量のサンプルまたは試薬体積の使用なしには満たされていない。なぜなら、適切な混合なしでは反応速度が拡散により律速され被検物質により律速されないため、速度または「カイネティック」分析が達成できないためである。

上記に鑑みて、最小限のサンプル体積において受動的混合条件下で乾燥試薬を急速に再水和および均質化することにより小体積臨床アッセイを行うためのマイクロ流体デバイスであり、サンプル中の試薬溶解速度が被検物質反応カイネティクスを測定できないほど遅くない、マイクロ流体デバイスの必要性が存在する。本発明は、本明細書の開示から明らかとなるこれらおよび他の特徴を提供する。

米国特許第３，１９３，３５８号明細書 米国特許第３，７９９，７４２号明細書 米国特許第４，０８８，４４８号明細書 米国特許第４，５２８，１５９号明細書

マイクロリットル未満の反応チャンバにおいて一つ以上の臨床アッセイを実行するための、マイクロ流体カートリッジが記載される。各反応チャンバは、チャンバを封入する二つの光学的に透明なフィルムの間に積層されるＡＣＡ層から切って作られ、透明フィルムがサンプルの透照のための光学窓を形成する。サンプルが、ストップフロー条件下で下流の吸引圧の適用により反応チャンバ内に進められる。カートリッジに大気へのベントは提供されない。反応チャンバにおいては、乾燥試薬マトリックス中の脱水された色素原がサンプルに急速に溶解され、基質および補因子過剰の条件下で分析反応の開始を引き起こす。乾燥試薬マトリックスは、製造の間に反応チャンバ内に予めプリントされる。アッセイにおいては、ＮＡＤＨまたはホルマザン等の反応生成物の蓄積または消失が光学窓を通して分光光度的にモニタされる。対流渦拡散および分子拡散が、試薬の急速溶解を光学的に均質にする。驚くべきことに、反応チャンバにおける色素原溶解の最初の非一貫性にもかかわらず、受動的混合により酵素（または被検物質）濃度に対しゼロ次のカイネティクスが容易に得られ、反応生成物の蓄積の線形勾配から酵素濃度を計算するのに充分な分光学的データが、５〜６０秒で収集されうる。機械的混合は使用されない。

反応チャンバは、６ｍｉｌ未満（約１５０マイクロメートル）の光路および約３００ｎＬの総容積の、受動的混合デバイスおよびキュベットとして機能する。反応物の体積は下流のストップフローバリアにより固定されるが、これはガス透過可能であるが液体透過可能ではない。

再水和の間には試薬希釈に時間的変動が予想されるにもかかわらず、アッセイ結果は驚くほど一貫しており、臨床的に有意な範囲の値にわたり臨床被検物質の速度反応につき標準曲線が容易に得られる。最初は溶解カイネティクスが支配し、反応チャンバの単数の光学窓または複数の光学窓に堆積された再水和可能乾燥試薬マトリックスの関数である。再水和可能乾燥試薬マトリックスは、下流で適用される吸引パルスに応答した流体マイクロサンプルによる分析アームの固定体積の充填に作動可能につながれた、受動的に駆動された対流物質移動による静止条件下での均質溶解のために構成される。反応チャンバに堆積された色素原により吸光度が決定され、選択された色素原は、分析における目的の臨床被検物質との反応に特異的な規定の単数の波長または複数の波長での吸光度を有する。

アッセイ反応は、二相を有するものとして分析でき、混合カイネティクスが早期溶解相を支配し、ゼロ次反応カイネティクスが分析相を支配し、小さな固定体積および急速な平衡化のために二相は基本的に分離している。吸光度をモニタすることにより二相が観察されうる。吸光度の一次導関数の変曲点が、分析の第一相と第二相とを分離する。第二相の間には反応物が過剰であり、吸光度の任意の変化は被検物質につきゼロ次カイネティクスに従う。

このようにして、色素原の均質溶解がアッセイの第一相を規定し、この色素原の臨床被検物質との反応がアッセイの第二相を規定する。第一相と第二相とは、目的の色素原に関連する吸光度の一次導関数の符号の変化により分離される。この分析の第二相は、被検物質に対しゼロ次である吸光度の変化によりさらに規定される。これらの条件下で、目的の被検物質の濃度がサンプルにおいて測定されうる。

カートリッジに予めロードされる乾燥試薬の性質が、アッセイされる被検物質を決定する。例えば血液酵素のアッセイでは、サンプルが反応チャンバに引き込まれると、マイクロ流体取り込みチャネルに堆積された脱水酵素基質がサンプルに溶解される。反応チャンバにおいて、光学活性補因子が反応を開始し、これが吸光度を測定することによりモニタされうる。グルコース等の臨床基質のアッセイでは、脱水酵素および補因子がサンプルレセプタクルと反応チャンバとの間の取り込みチャネル内に堆積されればよく、反応を指示する色素原が反応チャンバに堆積される。

各カートリッジが複数のアッセイサブ回路を含めばよく、各サブ回路が、上流のマイクロ流体取り込みチャネルにより共通のサンプルレセプタクルに接続され、共通の下流の吸引マニホールドおよびカートリッジ外吸引圧源に接続された反応チャンバからなる。疎水性、ガス透過可能バリアまたはキャピラリストップが、反応チャンバの下流に配置される。流動がストップフローバリアに達すると流動が抑制され、反応チャンバにおけるバルク乱流混合が止む。好都合にそして予想外に、拡散および浸透対流渦混合が数秒以内に光学均質性を達成するために十分であるとわかった。

都合のよいことに、流れの停止は、直観的には混合を制限するように見えるが、逆にゼロ次カイネティックアッセイに理想的な静的、定常状態反応条件を促進し、サンプルも節約するため、共通のサンプルレセプタクルまたはウェルに配置された単一のサンプルから複数のアッセイが行われうる。

再水和の間に、チャンバが湿潤され、充填され、空気が流された際に反応チャンバ内の試薬の一部がチャンバを出る可能性がある。静的流動の条件下では、反応チャンバの充填容積を過ぎた連続的流動により試薬がチャンバから次第に洗い出される際に起こることが分かった吸光度ドリフトが回避される。反応チャンバおよびストップフローバリアは、カートリッジ間で正確に再現される固定体積を確立する。

全血、血清、血漿、尿または脳脊髄液が、本発明のカートリッジにおいて都合よく使用されうる。典型的には再水和希釈液体積が生物学的サンプルそのものであるため、単位体積あたりの定量被検物質データが直ちに得られる。多波長分析の使用により、または選択的上流吸収により、反応物干渉が克服される。インラインデプスフィルタ膜の使用による赤血球のカートリッジ上濾過を用いて、必要に応じて溶血のない血漿が得られる。血漿に行われうるアッセイは、電解質、血清酵素、血中グルコースおよび尿素窒素、クレアチニン、ホルモン等の臨床化学を含む。ほとんどのイムノアッセイも、血漿に実行されうる。アッセイは、エンドポイントアッセイまたは速度アッセイでありうる。

一実施形態においては、一つ以上のマイクロ体積臨床アッセイのための積載された単数の試薬または複数の試薬を伴う、使い捨てマイクロ流体カートリッジが開示される。別の実施形態では、各々が異なる被検物質の分析のための積載された乾燥試薬を伴う複数のアッセイサブ回路を伴うマイクロ流体カートリッジと、反応の制御および試験結果のパネルを形成するデータの収集のためのホスト器具またはワークステーションとの組み合わせが開示される。数マイクロリットルの血漿または他のサンプルからいくつかのアッセイが行われうる。別の実施形態では、複数のサンプルをアッセイするために単一のカートリッジが用いられうる。

サンプルの節約が所望される別の実施形態では、共通のサンプルウェルからアッセイ反応が連続的に、一つずつ行われる。したがって２〜１０マイクロリットルの血漿が、多数のアッセイを行うのに充分である。アッセイを一つずつ行うことにより、一つのアッセイサブ回路間の流動抵抗の非常に小さな差により湿潤時間の不一致が生じないことが確保される。能動的分光学的データサンプリングは、サンプルローディングおよび分析のプロセスを通して継続的である。速度計算に使用されるデータは、時間に対する光学濃度としての吸光度の定常状態線形変化の期間にマッチするように選択される。

本発明の教示は、以下の詳細な記載を添付の図面とあわせて考慮することで容易に理解されうる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
流体マイクロサンプル中の単数の臨床被検物質または複数の臨床被検物質を検出する、流体マイクロサンプルのアッセイを実行するためのマイクロ流体カートリッジであって、前記マイクロ流体カートリッジは：
カートリッジ本体と、前記流体マイクロサンプルを受け取るためのサンプルレセプタクルと、少なくとも一つのアッセイ回路アームと
を含み、
前記アッセイ回路アームが、
ａ）前記サンプルレセプタクルを反応チャンバに結合する取り込み流体チャネルであって、前記反応チャンバが、対向する光学窓対および周囲壁により封入され、前記光学窓が、前記カートリッジ本体がホストワークステーションにドッキングされたときに前記ホストワークステーションの光インターフェイスにより規定された単数の波長または複数の波長で前記反応チャンバを透照するためのものである、取り込み流体チャネルと、
ｂ）前記反応チャンバを、前記ホストワークステーションから吸引パルスを受け取るように構成された作動ポートに結合する、下流の流体チャネルであって、前記下流の流体チャネルが、前記反応チャンバと前記作動ポートとの間に挿入されたストップフローバリアをさらに含み、前記反応チャンバおよびストップフローバリアが、前記アッセイ回路アーム内の固定湿潤可能体積を画定する、流体チャネルと、
ｃ）前記反応チャンバ内の前記単数の光学窓または前記複数の光学窓上に堆積される再水和可能乾燥試薬マトリックスであって、前記再水和可能乾燥試薬マトリックスが、前記吸引パルスに応答した前記流体マイクロサンプルによる前記固定体積の充填に作動可能につながれた均質溶解のために構成される、再水和可能乾燥試薬マトリックスと、
ｄ）前記再水和可能乾燥試薬マトリックスに堆積される色素原であり、前記色素原が、前記臨床被検物質との反応に特異的な規定された単数の波長または複数の波長での吸光度を有する、色素原と
を含む、マイクロ流体カートリッジ。
（項目２）
前記対向する光学窓対が、ＡＣＡ層により分離された環状オレフィンコポリマーフィルムの二つの積層された層から形成され、ここでは、前記反応チャンバの前記周囲壁が切断されている、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目３）
前記固定体積における前記均質溶解が、対流物質移動により受動的に駆動される、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目４）
前記色素原の前記均質溶解が前記アッセイの第一相を規定し、前記色素原の前記臨床被検物質との前記反応が前記アッセイの第二相を規定し、前記第一相および前記第二相が、前記吸光度の前記一次導関数の符号の変化により分離される、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目５）
前記分析の前記第二相が、前記被検物質につきゼロ次である吸光度の変化によりさらに規定される、項目４に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目６）
前記マイクロ流体カートリッジが、前記上流の流体チャネルに堆積された反応のための単数の乾燥基質、複数の基質または酵素をさらに含み、前記乾燥基質、複数の基質、または酵素が、前記流体マイクロサンプル中の急速な再水和のための再水和可能マトリックスをさらに構成する、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目７）
前記サンプルレセプタクルが全血レセプタクルであり、前記全血レセプタクルおよび前記反応チャンバの間の前記取り込みチャネルに、血漿を全血から分離するための血液濾過要素が挿入される、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目８）
前記再水和可能乾燥試薬マトリックスが、緩衝塩および凍結乾燥保護薬剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）を含み、前記再水和可能乾燥試薬マトリックスが、前記光学窓の内面上に液体前駆体としてプリントされその場で乾燥される、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目９）
装置が、ゼロ次反応速度による臨床被検物質のアッセイのための色素原を伴って構成され、前記被検物質が、乳酸デヒドロゲナーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、リパーゼ、コレステロール、トリグリセリド、尿酸、グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、リン、カルシウム、塩化物、鉄、二酸化炭素、総タンパク、抗原、または抗体である、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目１０）
臨床被検物質のエンドポイントアッセイのためのアッセイ回路アームをさらに含み、前記被検物質が、遊離ヘモグロビン、総ヘモグロビン、ビリルビン、抗原、または抗体である、項目１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目１１）
アッセイのパネルが１２０秒未満で完了される、先行する項目に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目１２）
前記マイクロ流体カートリッジが、前記全血レセプタクルから複数のアッセイ回路アームの各々へ順に血漿を引き出すために構成される複数のアッセイ回路アームを含み、各アッセイ回路アームが、前記ホストワークステーションの別個の空気回路の制御下にある、項目７に記載のマイクロ流体カートリッジ。
（項目１３）
先行する項目のいずれかに記載の使い捨てマイクロ流体カートリッジを含むキットであって、前記マイクロ流体カートリッジが、密封されたフォイルパウチで供給され、前記流体マイクロサンプルの添加だけを必要とする、キット。
（項目１４）
前記流体マイクロサンプルが、血清、血漿、全血、脳脊髄液、滑液、または尿のサンプルである、項目１３に記載のキット。
（項目１５）
個々にまたは集合的に本明細書に開示されまたは本出願の明細書に示されるステップ、特徴、整数、組成物および／または化合物、ならびに前記ステップまたは特徴のうち二つ以上のいずれかおよび全ての組み合わせ。

図１Ａは、シングルチャネルの分析サブ回路の虫瞰図である。 図１Ｂは、シングルチャネルの分析サブ回路の虫瞰図である。 図２Ａは、複数チャネル分析サブ回路の虫瞰図である。 図２Ｂは、複数チャネル分析サブ回路の虫瞰図である。 図３は、マルチチャネルカートリッジベースの液体プロセスを制御するためのカートリッジ外の空気インターフェイスを伴う、マイクロ流体カートリッジの平面図である。 図４Ａは、カートリッジ上濾過を必要としない液体サンプルを分析するための分析サブ回路の平面図である。 図４Ｂは、カートリッジ上濾過を必要としない液体サンプルを分析するための分析サブ回路の長軸断面図である。 図５Ａは、カートリッジ上濾過を必要とする液体サンプルを分析するための分析サブ回路の平面図である。 図５Ｂは、カートリッジ上濾過を必要とする液体サンプルを分析するための分析サブ回路の長軸断面図である。 図６は、乾燥試薬の再生可能な急速な分子および渦拡散混合を有する、本発明のマイクロ流体カートリッジにより得られた乳酸デヒドロゲナーゼアッセイの線形反応カイネティクスを示す曲線適合である。 図７は、本発明の第一実施形態のマイクロ流体カートリッジにより実行された乳酸デヒドロゲナーゼアッセイの標準曲線である。 図８は、本発明の第一実施形態のマイクロ流体カートリッジにより行われたヘモグロビン分光学的エンドポイントアッセイの標準曲線である。

定義
一定の意味は、本明細書において発明者らにより企図されるように定義される、すなわち固有の意味である。本明細書で使用する他の語句は、関連技術の当業者に明らかであろう使用法と一致する意味である。

以下の説明および請求項の全体にわたり、一定の用語は特定の特徴、ステップまたは構成要素を指すために用いられる。当業者には当然のことながら、異なる人は、同じ特徴、ステップまたは構成要素を異なる名前で指しうる。本文書は、名前が異なるが機能または動作が異ならない構成要素、ステップまたは特徴を区別することを企図しない。

本明細書中の一定の特徴または構成要素は、いくらか模式的な形で示されるかもしれず、従来の要素の詳細の一部は、明快および簡潔のために示されないかもしれない。図面は必ずしも縮尺どおりではない。

本明細書で使用されるところの「拡散」とは、分子がより高濃度の領域とより低濃度の領域との間を平衡に向かってランダムな運動の総和において移動するプロセスを指す。

本明細書で使用されるところの「対流」とは、流体中の異なる部分の密度または温度の差による流体の部分の集団移動を伴う渦混合のプロセスを指す。

「対流物質移動」とは、拡散および渦の形での流体の運動の両方により起こる物質移動を指し、物質が流体中の流れの大規模運動により輸送され、したがって分子拡散および渦混合の組み合わせによる輸送を表す。対流物質移動は、システムに適用される機械的エネルギーにより駆動されない場合に、「受動的に駆動」される。慣例が浸透勾配により駆動される場合には、対流物質移動のためのエネルギーは製造時のデバイスに受動的に貯蔵され、湿潤時に放出されるポテンシャルエネルギーの形である。

「色素原」は反応して着色最終生成物を生成する化学物質または化合物を指し、目的の被検物質の存在を検出するために分析化学および酵素学において使用される。

吸収分光法とは、サンプル分子との相互作用による波長の関数として光の吸収を測定する分光技術を指す。吸収（または透過）の強度は波長の関数として変動し、この変動が吸収スペクトルである。吸収分光法は、サンプル中の特定の被検物質の存在を決定し、多くの場合には存在する被検物質の量を定量するための、分析化学ツールとして利用される。

ＡＣＡ層とは、積み重ねられた三つの層を有する両面の接着材を指し、二つの接着剤層が中心コアまたはキャリア層により分離されている（８１４１アクリル接着剤フィルム（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）等）。

本明細書の全体にわたる「一実施形態」または「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の各所における「一実施形態において」または「実施形態において（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という句の登場は、必ずしも全て同じ実施形態を指すわけではない。さらに、本発明の特定の特徴、構造または特性は、一つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わせられうる。

「従来の」とは、本発明が関連する技術で公知であり一般的に理解されているものを示す用語または方法を指す。

文脈から別段の読み方が要求されない限り、本明細書およびこれに続く請求項の全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、「を含むがこれに限られない」という、制限のない包括的な意味において解釈されるものとする。

添付の請求項は、「〜手段」という句を使用して請求項において制限が明示されない限り、ミーンズプラスファンクション制限を含むものと解釈されてはならない。

以下の詳細な記載は説明のために具体的詳細を含むが、当業者には当然のことながら、以下の詳細への多くの改変および変更が本発明の範囲内である。したがって、教示により後述される具体的な実施形態は、請求される発明に対するいかなる一般性の欠如も伴わず、制限を課すこともなく示される。

ここで図を参照すると、図１Ａは、本発明の基本的なマイクロ流体「サブ回路」または「アッセイ回路アーム」１００の一実施形態の略図を表す。図は、回路を含むカートリッジ本体の下から見上げたものである。カートリッジのボディは図示されていない。使用時には、例えば全血サンプルが、回路内へサンプルレセプタクル１０２に導入される。それから、ホストワークステーションの命令でサンプルがデプスフィルタ１０４を通って反応チャンバ１０５内へ引き入れられる。サンプルレセプタクルを反応チャンバ１０５に接続する上流の取り込みチャネル１０３の長さは、カートリッジ本体上のレイアウトに合理的に必要とされる長さを有しうる。下流の排出チャネル１０７は、反応チャンバを作動ポート１０８またはシリンジポンプもしくは緩衝化真空リザーバ等のカートリッジ外吸引マニホールドへの弁付接続部に接続する。反応チャンバ１０５と下流作動ポート１０８との間には、反応チャンバがいっぱいになった後にサンプルの流れを抑制するための疎水性のガス透過可能膜またはキャピラリストップ１０６がある。疎水性の、ガス透過可能な、液体透過不能な膜は、「ストップフローバリア」として機能する。キャピラリストップもストップフローバリアとして機能し、互換可能に用いられうる。反応チャンバは、上下の光学窓を伴って提供され、ホストワークステーションのドッキングベイおよび分光光度計とインターフェイスするように構成される。ドッキングベイは任意に温度制御され、分光光度計は、ＬＥＤおよびフォトダイオード対を、例えば反応チャンバを透照して中の物質の吸光度を測定するために含みうる。

この基本的なマイクロ流体回路が、見下ろした図で再び図１Ｂに示される。流体サンプルが、サンプルレセプタクル１０１に堆積される。それからホストワークステーションの命令で、流体が上流の取り込みチャネル１０３を介して反応チャンバ１０５へ、一般にポート１０８での吸引圧の発生により受け入れられる。それから反応チャンバが透照され、チャンバの上面および底面を形成する対向する光学窓対を通して分光光度的に調べられる。反応チャンバの壁は、光学窓を形成するフィルム層を一緒に積層するために使用されるＡＣＡ層から切られる。流体チャネル中にプリントされた乾燥試薬は溶解し、サンプル中の被検物質と反応する。データ収集の間に、下流の流体チャネル１０７においてストップフローバリア１０６で流体流動が停止される。光学窓上の乾燥試薬マトリックスにおいてプリントされた色素原は、静的無流動条件が達成された後に急速に溶解する。したがって、有限体積のサンプルが各アッセイにおいて使用され、試薬濃度が再生可能である。典型的には、反応チャンバおよびストップフローバリアにより規定される固定体積は約４００ｎＬ以下である。

上流の流体チャネル１０３および反応チャンバ１０４中にカートリッジの組み立ての間に堆積される乾燥試薬は、バッファまたは中間溶液ではなく、サンプルに溶解される。アッセイをモニタするのに必要な光学活性色素原が反応チャンバ中に配置され、その吸光度が第一相および第二相の間に能動的にモニタされ得るが、この第一相は溶解相に対応し、第二相はアッセイの分析相または「速度カイネティクス」相に対応する。

図２Ａは、最大四つのアッセイのための複数の平行な経路を伴う、より複雑なカートリッジを表す。サンプルレセプタクル２０２は、取り込みチャネル２０３ａにより、赤血球を血漿から分離するためのデプスフィルタ２０４に流体接続するが、取り込み経路はその後四つのブランチ（２０３ｂ）に分かれ、その各々が別個の反応チャンバ２０４およびストップフローバリア２０６を伴う。円周を時計回りに第一反応チャンバ２０５ａ、第二反応チャンバ２０６ｂ、第三反応チャンバ２０５ｃ、および第四反応チャンバ２０５ｄが示される。これらの反応チャンバは共通の下流排出チャネル２０７により結合されるが、これはここでは中央デプスフィルタの周囲に一定半径を伴っており、末端セグメントが作動ポート２０８で終端し、これが、カートリッジがホストワークステーションにドッキングされアッセイが開始されたときにデプスフィルタを通して反応チャンバ内へとサンプル流を引き入れるためのカートリッジ外圧力差に流体接続されている。

ストップフローバリア２０６は、「Ｕ−チャネル」２１０上に据えられる。ある実施形態では、吸引圧をサンプルレセプタクルから分岐するブランチの各々に同時に適用することにより、全てのチャネルが並行して操作される。各ブランチ間には流動抵抗の小さな差が存在するが、各チャネルが満たされ流動がストップフローバリア２０６の各々で停止されると、残りのチャネルも満たされる。

図３は、図２の四アームのマイクロ流体回路２００およびカートリッジ本体２０１を平面図による略図で示す。カートリッジ本体は、ホスト器具の温度制御されたドッキングベイ中に据えられ、作動ポート２０８で吸引圧マニホールドを空気係合するように、典型的に構成される。ユーザはまずサンプルレセプタクル２０２に液体サンプルを満たし、その後、アッセイを開始する。カートリッジは、この図においてはプレイングカートリッジの形状を有し、厚さ数ミリメートルでありうる。

図３のマルチアッセイカートリッジ２０１は、単一のプラスチックボディ２０１中に四つのアッセイサブ回路を含む。この平面図において、サンプルリザーバ２０２は、各々が付随のストップフローバリア２０６ａ、２０６ｂ、２０６ｃおよび２０６ｄならびに結合チャネルを伴う四つの反応チャンバ２０５ａ、２０５ｂ、２０５ｃおよび２０５ｄの中心の濾過ユニット２０４と流体接続される。マイクロ流体チャネルは、各反応チャンバを中央ハブでサンプルレセプタクル２０２に結合し、中央ハブの周りに車輪のリムのように円周方向に設けられてアッセイアームがスポークとして間に突出している共通の下流チャネル２０７により、下流作動ポート２０８に連結する。下流チャネル２０７は、ポート２０８を介してホストワークステーション（図示せず）上の負圧源に流体接続され、それはカード上で弁調節され、またはワークステーション上で遠隔で弁調節されうる。

図のように、カートリッジの構成が簡単になるように、共通の吸引マニホールド２０７および作動ポート２０８以外の全ての弁および下流チャネルは除去される。全てのサブ回路アッセイアームは並行して作動され、各反応チャンバから同時データが収集される
任意に、吸引マニホールドの各アームが別々に弁調節および制御される。代替的実施形態では、ホスト器具の制御下の空気マニホールドを介して弁が空気作動され、一つずつ作動される。制御空気ポートは、ホストワークステーションのドッキングアダプタと密封的にインターフェイスするように、カートリッジの端に整列配置される。ポート２０８は円形の下流チャネル２０７に結合され、これが共通の吸引マニホールドを形成する。カードとホスト器具の間のインターフェイスに、独立した弁のための別個のコントロールポートが形成される。あるいは、各アッセイ回路アームが、カートリッジ外吸引パルスのために独立のポートに接続される。

図４Ａに示すように、本発明のカートリッジ本体４０１は、例えば複数の層を含むことができ、積層により組み立てられうる。部材４１１および４１５が、カートリッジの上部および下部部材をなす。層４１２および４１４は、反応チャンバの上下の光学窓（４２０ａ、４２０ｂ）を形成し、透明プラスチックで製造される。サンプルレセプタクル４０２、取り込みチャネル４０３および排出チャネル４０７の壁を形成する層４１３は、二層の接着剤層（ＡＣＡ層）である。ストップフローバリア４０６が象徴的に示され、疎水性ガス透過可能インサートでありうる。任意に、ストップフローバリア４０６は、その代わりにキャピラリストップでありうる。層４１２および４１４は、溶剤溶接により、超音波溶接により、拡散により、接着により、または追加の積層ＡＣＡ層により、ボディ層４１１および４１５に結合されうる。カートリッジは、積層、成形または公知技術の方法による積層および成形の組み合わせにより製造されうる。経験から、２７５〜８００ｎｍの改善された透光性を有する環状ポリオレフィンプラスチックである、Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）フィルム（Ｚｅｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ）またはＴｏｐａｚ（登録商標）８００７Ｆ−４００（Ｔｉｃｏｎａ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ ＫＹ）等の環状オレフィンコポリマーフィルムで光学窓が都合よく形成されることが示されている。

説明のために、デバイスは二つの乾燥試薬スポット４３０および４３１を含んで示される。試薬スポット４３０は、単数の基質、複数の基質、単数の酵素または複数の酵素を含み得、反応チャンバへのサンプルの進入前に再水和されサンプルと混合される。試薬スポット４３１は、反応チャンバの体積と液体流動が停止されるストップフローバリアとにより規定される固定体積において湿潤され溶解される色素原を含む。両方の乾燥試薬スポットは液体マイクロサンプルにおいて再水和可能であり、乾固および貯蔵の間に活性が保たれることを確保するために、凍結乾燥保護剤および可塑剤を含む。スポットは、より迅速な湿潤および溶解のために結合剤も含みうる。スクロースまたはトレハロースに加えて、様々な凍結乾燥保護剤が使用されうる。これらには、アラビノース、エリスリトール、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルチトール、マルトース、マルトトリオース、マンニトール、マンノビオース、マンノース、リボース、ソルビトール、サッカロース、キシリトール、キシロース、デキストラン、またはその混合物が含まれる。アモルファスガラス相の融解温度を制御するために、可塑剤も用いられうる。可塑剤には、グリセロール、ジメチルスルホキシド、低分子量ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコールジメチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテル、テトラエチレングリコールジメチルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラメチ尿素（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｕｒｅａ）、水、またはその混合物が含まれる。可塑剤は、固相の結晶化度を制御するのにも有用でありうる。再水和カイネティクスを制御するため、および粉体処理のために、結合剤も用いられる。結合剤には、ポリビニルピロリジノン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、ポリビニルピロリジノン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、高分子量ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのブロックコポリマー、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリ−（ｄ−ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、トリエチレングリコールジメチルエーテル、ブチルジグリム、キトサン、セルロース、メチルセルロース、アルギネート、アルブミン、デキストラン、澱粉、ゼラチン、界面活性剤、またはその混合物が含まれる。必要に応じて複数の試薬スポットを使用でき、特定のアッセイの要請のために構成しうる。再水和可能乾燥試薬マトリックスは任意に緩衝塩および凍結乾燥保護剤を含み、この再水和可能乾燥試薬マトリックスは上記光学窓の内面上に液体前駆体としてプリントされてその場で乾燥され、その結果、受動的に駆動された対流物質移動が緩衝塩および凍結乾燥保護剤の浸透ポテンシャルにより駆動されて、急速溶解相が確保される。

この例では、作動ポート４０８で吸引が適用されたときに、血漿、血清、尿、または脳脊髄液等の液体マイクロサンプルが４１０でマイクロ流体回路に入るのが示される。マイクロ流体サブ回路４００を伴う単純化されたカートリッジが図４Ｂの平面図に示される。アッセイを実行するために、第一ステップは、サンプルをサンプルレセプタクル４０２に導入することである。それから、作動ポート４０８を通じて吸引パルスが受け取られ、これによりサンプル流体が取り込みチャネル４０３に流入することで、アッセイが作動される。チャネル内の乾燥試薬マトリックスに堆積された任意の反応基質が再水和されてサンプルとともに運ばれ、光学観察窓４２０の下の反応チャンバ４０４に入る。反応チャンバ内の乾燥マトリックスに堆積された試薬または補因子の溶解により、反応が開始される。サンプルはストップフローバリア４０６に接触すると流れを止め、反応は急速に定常状態カイネティクスに達する。反応物は、浸透渦対流および拡散によりほんの数秒で均質になる。光学窓４２０を通じて吸光度データが収集される。透過分光法がデータを収集する好適な方法であるが、他の計測モダリティが使用されてもよい。ホスト器具はＬＥＤ、コリメーティングレンズ、任意のフィルタ、およびフォトダイオードと基本的に約１５０マイクロメートルの光路長のミニチュアキュベットである光学観察チャンバにおける吸光度の検出のための高利得増幅器を備えている。ホストワークステーションはデータ処理および任意のオンボード曲線適合も担うが、ホストワークステーションにデジタル的に繋がれたリモートコンピュータによりデータ処理機能が実行できるように、ＡＤ変換器およびデータポートが任意で使用されうる。

ホストワークステーションは、例えば、低パルスツイストシリンジポンプを用いた集積マイクロ流体ワークステーション、ｍｉｃｒｏＦｌｏｗ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ，Ｒｅｄｍｏｎｄ ＷＡ）である。Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓのツイストシリンジポンプは、毎秒１〜１０，０００ナノリットルの流量を許容する。ワークステーションは、カートリッジ上反応を導くためにプログラム可能なソフトウェアを使用する。ワークステーションは、図３に示されるようなマイクロ流体カートリッジを端に沿ってドッキングさせるための空気臍孔および封止可能アダプタがついている。

各カートリッジは、典型的にサンプルリザーバ４０２を一つだけ含む。しかし、複数のアッセイサブ回路または「アーム」が、一つのリザーバに任意に接続される。各サブ回路は、図２および３に示されるように、車輪上のスポークのようにサンプルリザーバ４０２周辺に放射状に配列された別個の光学観察チャンバ４０４と接続する。任意にエンドポイントアッセイも実行でき、マルチアームデバイスの隣接する単数のアームまたは複数のアームにおいてサンプルおよび試薬ブランクが測定されうる。他の実施態様においては、各光学窓を通して複数の波長が測定される。任意に、単一のカートリッジが複数のサンプルリザーバおよびマイクロ流体分析回路を含みうる。

一実施形態においては、各アッセイサブ回路が一つずつ作動される。一つの反応につきサブ回路をキャピラリストップ４０６まで満たすのに十分なだけのサンプルが分配され、基本的にサンプルが各反応チャネルに「オンデマンド」で分配される。反応アーム中の乾燥試薬の正体および性質が、そのサブ回路により行われるアッセイを決定する。約１２０秒以下かかりうる一つの反応が完了すると、第二アッセイが開始されうる。各アッセイに必要なサンプルは数百ナノリットル未満であるため、１０または２０マイクロリットルのサンプルレセプタクルから複数のアッセイが実行される。別の実施形態では、多重データが収集できるように、デバイスの全てのアームが並行に作動されサンプルが各アームに同時に引き込まれる。

図５Ａおよび５Ｂは、本発明のマイクロ流体サブ回路５００の別の実施形態の平面図および断面図を表す。ここではカートリッジは、全血の精密濾過および血漿の収集のための、ポリスルホンデプス膜（例えばＢＴＳ−Ｖｉｖｉｄ ＧＦ，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）等の膜５１０を含む。血液５５０が全血レセプタクル５０２において回路に導入され、フィルタ膜５１０を通過させられる。ホストワークステーションの命令で、血漿サンプルの一部が反応チャンバ５０４内に引き入れられる。デプスフィルタ５１０において湿潤された血液から「オンデマンド」で血漿が濾過されうる。上流の流体チャネル５０３が、反応チャンバをサンプルレセプタクルに接続する。下流の流体チャネル５０７は、反応チャンバ５０４を、シリンジポンプまたは緩衝化真空リザーバ等の下流の吸引マニホールドへの弁付接続のために、作動ポート５０８に接続する。反応チャンバ５０４と下流の作動ポート５０８との間には、観察チャンバが満たされたときにサンプルの流動を抑制するためのストップフローバリア３０８がある。デバイスボディ５０１はホスト器具に装備され、観察窓５２０を通じて透照により光学吸光度データが収集される。

図５Ｂのカートリッジは五つの層を含むが、これに限定されない。部材５１１および５１５は、カートリッジの上部および下部部材をなす。層５１２および５１４は、光学窓５２０を形成し、光学的に透明なプラスチックで製造される。流体チャネルおよびチャンバ５０３、５０４および５０７の壁を形成する層５１３は、二層の接着剤層（ＡＣＡ層）である。この種のカートリッジは、積層、成形、または公知技術の方法による積層および成形の組み合わせにより製造でき、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエチレンまたはポリプロピレン等の材料で作られるがこれに限られない。

内部カートリッジ面は必要に応じて任意に不活性化され、選択した処理が、おそらくは被検物質または試薬の受動的結合を減少させることにより、溶解および反応速度の増加をもたらすことが分かっている。

ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびトレハロース等の乾燥マトリックス材料が、カートリッジ上において乾燥形態で安定であるとともに急速に溶解する試薬を調製するために用いられる。基質、バッファおよび反応補因子が単数の液体マトリックス前駆体または複数の液体マトリックス前駆体において溶解され、これがカートリッジ上にスポットされその場で乾燥または凍結乾燥される。任意に、保存寿命を増加させるためにカートリッジが無水フォイルパウチ（ｆｏｉｌ ｐｏｕｃｈ）に貯蔵されうる。冷蔵条件が使用されうる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、アデノシン三リン酸等の貯蔵困難な補因子には、貯蔵ポーチ中の乾燥アルゴン雰囲気も想定される。

この図では、二つの乾燥試薬スポットが示される。任意に、二つより多いまたは少ない試薬スポットが使用されうる。しかし、反応においてモニタされる色素原を含むスポット５３１が、デバイスの反応チャンバ５０４の再水和可能乾燥試薬マトリックスにおいて供給され、窓５２０の一方にプリントされており、流体マイクロサンプルにより湿潤されたときに急速に溶解される。ここで示されるスポット５３０は、アッセイに必要な反応基質、酵素または他の補因子の送達のための進入チャネル５０３中の試薬スポットの提供を示す。

糖および界面活性剤を含む試薬乾燥マトリックス賦形剤は、スポットされた試薬のスムーズで均一な乾燥、ならびにアッセイ実行時の速く均一な再水和を可能にするように設計される。商用グレードの試薬スポッター（Ｂｉｏｄｏｔ）が、製造のために都合よく用いられる。スポット体積は一般に約１００ｎｌであり、数十〜数百ナノモルの材料に乾燥する。湿潤時には浸透圧駆動による拡散および渦混合により、乾燥塊がほんの数秒で光学的に均質な溶液になる。最終反応混合物濃度は、数ミリオスモル〜１，０００ミリオスモル未満の範囲であり、血液ベースのアッセイでは３００および５００ミリオスモルの間であるのが好ましい。

本発明のマイクロ流体カートリッジは、グルコース、アルカリホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、リパーゼ、コレステロール、トリグリセリド、尿酸、尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物、二酸化炭素、リン、マグネシウム、鉄、ヘモグロビン、ビリルビン、クレアチニン、総タンパク等を含む血液化学成分を分析するために用いられうる。本発明の光学ウェルを使用して、固体固定化免疫測定法も実行されうる。

マイクロ流体条件は、乱流混合条件を得るのが難しいことで有名であり、反応物の分子量により拡散の速度が制限されることが知られている。透過分光法によりアッセイされるカイネティックアッセイの場合には、反応物が溶液中で光路に均質に配置されるまで反応勾配の直線性が達成されない。必要なのは、静的流動条件下で律速被検物質を含むサンプルを反応ウェル中の反応に加わる全ての反応物および補因子と基本的に即座に混合でき、それから反応速度が線形である非常に短い期間で、他の反応物が律速になる前に、律速被検物質の定常状態反応速度を測定できるデバイスである。一般に、データ収集のためのウィンドウは１２０秒を超えず、より典型的には６０秒未満であるため、反応定常状態が急速に達成されることが望ましい。主要試薬が枯渇しまたは色素原がベールの法則の吸光度の範囲を上回るなど反応物生成物が過剰に蓄積すると、見かけの定常状態は失われる。

一般に、機械的混合助媒を用いてこの問題を解決する試みは、この反応スケールでは不成功だった。溶液体積が反応チャンバからすぐ下流のストップフローバリアにより制約されるため、また瞬時に近いデータ収集の必要のため、機械的混合はオプションとして放棄された。この問題は、反応チャンバにおいて静止した液体サンプルが乾燥試薬スポットの再水和の間に渦対流および拡散混合により混合されるように、反応チャンバの窓上に乾燥色素原スポット（４３１、５３１）を直接加えることにより対処されている。選択された試薬が上流の取り込みチャネル内に配置されて中のサンプルに都合よく溶解されうるが、少なくとも一つの試薬、一般には光学的にモニタされる色素原が、この目的で反応チャンバ内に配置される。その結果、アッセイ混合物の小体積を前提とすれば、渦混合と組み合わされた拡散混合は溶解相を急速に分解し、有用な反応速度データが収集されうる分析相条件へ移行するのに十分である。

反応チャンバキュベットの光学窓は、反応チャンバの天井および床を形成するために積層された環状オレフィンコポリマーフィルムで都合よく形成される。驚くべきことに、反応チャンバの上下面を封入する窓（１２０，２２０、４２０、５２０）の光学的品質は、バッファ、塩類、試薬補因子および酵素を含む様々なマトリックス材料の窓ポータルへの直接的堆積によって低下しないことが分かっている。溶解は基本的に２７５〜８００ｎｍの範囲の光透過性の低下または散乱の増加が見られないように充分かつ完全であり、ナノリットル体積のカイネティック速度アッセイにおける精度とほとんどの比色および紫外線ベースの分光学的アッセイに充分すぎる光学的品質が達成される。

実施例１ 乳酸デヒドロゲナーゼ
肝疾患および心筋梗塞において上昇する血漿ＬＤＨを、基本的に図５のマイクロ流体カートリッジによりアッセイした。カートリッジを調製するために、ＰＶＰ（Ｋ−１２）およびトレハロース乾燥マトリックス中の過剰のピルビン酸ナトリウムを上流の取り込みチャネル５０３にスポットし、ＴＲＩＳバッファを伴うＰＶＰ−４０およびトレハロース中の乾燥マトリックス製剤としての過剰のＮＡＤＨ（約１４０ｎｍｏｌｅ／スポット）を反応チャンバ５０４内の光学窓５２０上にスポットした。

ＬＤＨのアッセイでは、作動ポート５０８での吸引パルスの適用時にサンプルレセプタクル５０２からの血漿がデプスフィルタ５１０を通して引き込まれ、反応チャンバ５０４に急速に満たされた。使用した血漿体積は、キャピラリストップ５０６により制限された。吸光度データの収集のために、カートリッジをホスト装置またはワークステーションにドッキングした（図示せず）。分光測光データを３４０ｎｍで連続的に収集するようにワークステーションをプログラムし、データをＬＤＨ活性の計算のために曲線適合プログラムに電子的に転送した。データの直線部を見つけるアルゴリズムにより、分析のためのデータが選択される。２５００Ｕ／ＬのＬＤＨ活性の代表的データが、図６に報告される。ＯＤ_３４０の減少は、ＮＡＤＨの酸化を表す。

図６は、アッセイの二相態様を示す。本明細書において「溶解相」と称される第一相（６０１）では、ＮＡＤＨ吸光度のピークが観察される。ピークは鋭く、反応チャンバにスポットされた色素原、ここでは酵素補因子ＮＡＤＨの急速な溶解を表す。本明細書において「分析相」と称される第二相（６０２）では、酵素濃度に対してゼロ次のカイネティクスの特徴である吸光度の着実な減少が観察される。一次導関数の符号の変化としてモニタできる曲線の鋭い屈折が二相を分離し、したがって機械分析と両立し、アッセイの閉ループ制御が可能になる。一次導関数の反転後の吸光度は線形曲線適合（点線として外挿される６０４）により分析でき、測定された吸光度が初期定常状態速度の最適線形外挿から外れると分析が中止される。こうしてデータ取得サイクルの開始点および終点が決定されうる。実際には数秒で溶解が達成されたことが分かり、分析曲線適合は被検物質濃度に応じてその後１５〜９０秒で完了した。

５００〜５０００ＩＵのＬＤＨのダイナミックレンジが達成された。本発明のカートリッジにおけるＬＤＨ活性の標準曲線が、図７に示される。

任意に、着色染料ホルマザンを指示薬として用いてジアフォラーゼとの結合によりＬＤＨがアッセイされうる。ジアフォラーゼがアッセイ回路アームの上流のアームにスポットされ、ホルマザンが反応チャンバにスポットされる。

試薬のスポッティングは、カートリッジ製造プロセスの間に商用グレードの試薬スポッタ（Ｂｉｏｄｏｔ）を用いて実行されうる。オンライン式試薬スポッティングを伴うロールツーロール製造も考えられる。スポッティング体積は一般に１００ｎｌである。ゲル様の乾燥試薬マトリックスにおけるＮＡＤＨの状態は、主に完全なままである。ピルベート用およびＮＡＤＨ用のマトリックス製剤が、別々に最適化された。試薬は、長時間４Ｃでフォイル防湿バッグに貯蔵した場合に安定であると分かった。様々なアッセイのためのカートリッジを含むキットが、別々に販売されうる。

実施例２ ヘモグロビン
実施例１のカートリッジおよび装置を使用して、濾過した血漿の遊離ヘモグロビンを検査した。試薬は用いず、代わりに血漿を４１５ｎｍで光学的に調べ、データを用いて溶血
血漿標本からＬＤＨデータを退けた。任意に、マルチ波長ヘモグロビンアッセイを用いて遊離または全ライセートヘモグロビンを正確に定量しうる。血漿中の遊離ヘモグロビンの標準曲線が、図８に示される。

実施例３ マグネシウム
クエン酸カリウムを基質として、ＥＤＴＡ／グリコールエーテルジアミンＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸をキレータとして用いて、イソクエン酸脱水素酵素およびＮＡＤＰ＋により血漿マグネシウムを測定した。方法は、Ｓｕｎａｈａｒａにより米国特許第５１０８９０５号に記載されるものとＳｔｏｎｅによる注釈（１９９６．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｏｔａｌ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４２：１４７４−７７）に基づく。

実施例４ グルコース
血漿グルコースを、グルコースオキシダーゼにより測定する。過剰のグルコースオキシダーゼおよび３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを、反応チャンバの上流の取り込みチャネル５０３のスポットにおいて脱水する。セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素を、反応チャンバ５０４にスポットする。全てのスポットを乾燥させ、カートリッジを使用までアルゴン下で貯蔵する。作動ポート５０８での吸引パルスの適用後、サンプルレセプタクル５０２からの血漿がデプスフィルタ５１０を通して濾過され、光学観察チャンバに急速に進入し満たされる。ストップフローバリア５０６により、使用する血漿体積が制限された。６００ｎｍで速度データを収集するように外部ワークステーションをプログラムする。

エンドポイントアッセイも可能である。ペルオキシドのアッセイにおいて使用される様々な染料が、米国特許第５５１８８９１号に記載される。ビリルビン妨害に抵抗性の染料が、米国特許第５７９２６１９号に報告される。あるいは、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン、還元型）等の蛍光色素を用い、計装パッケージにおいて落射蛍光を代用することにより、蛍光定量的にエンドポイントがモニタされうる。あるいは、化学発光を用いてまたは電気化学的にエンドポイントが測定され、またはグルコースのゼロ次反応速度の条件下で濃度データが測定されうる。

本明細書において参照されおよび／または添付の提出物に引用される米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物の全ては、参照により全体として本明細書に組み込まれる。引用された研究が参照により組み込まれる場合には、その参考文献中の語の任意の意味または定義で本明細書において使用される意味と矛盾しまたはこれを狭めるものは、当該文献に特異なものとみなされるべきであり、本明細書の開示において用いられる語の意味に取って代わることはない。

以上は本発明のある実施形態の説明であるが、様々な変形例、変更態様および等価物を使用することが可能である。したがって本発明の範囲は、以上の説明に準拠してではなく、添付の請求項とその等価物の完全な範囲に準拠して決定されなければならない。

以下の請求項においては、使用される用語は、明細書および請求項において開示される特定の実施形態に請求項を制限するものと解釈されてはならず、全ての可能な実施形態をかかる請求項が享受する等価物の完全な範囲とともに含むものと解釈されなければならない。したがって請求項は、本開示の詳細により制限されない。

Claims (14)

1. 流体マイクロサンプル中に含まれる被検物質を検出する、前記流体マイクロサンプルのアッセイを実行するためのマイクロ流体カートリッジであって、前記マイクロ流体カートリッジは：
   カートリッジ本体と、前記流体マイクロサンプルを受け取るためのサンプルレセプタクルと、少なくとも一つのアッセイ回路アームと
   を含み、
   前記アッセイ回路アームが、
   ａ）前記サンプルレセプタクルを反応チャンバに結合する取り込み流体チャネルであって、前記反応チャンバが、対向する光学窓対およびガス透過可能かつ液体透過不能なストップフローバリアにより封入され、前記対向する光学窓対が、前記カートリッジ本体がホストワークステーションにドッキングされたときに前記ホストワークステーションの光インターフェイスにより規定された単数の波長または複数の波長で前記反応チャンバを透照するためのものである、取り込み流体チャネルと、
   ｂ）前記反応チャンバを、前記ホストワークステーションから吸引パルスを受け取るように構成された作動ポートに結合する、下流の流体チャネルであって、前記下流の流体チャネルが、前記反応チャンバと前記作動ポートとの間に挿入された前記ストップフローバリアをさらに含み、前記反応チャンバおよび前記ストップフローバリアが、前記アッセイ回路アーム内の固定湿潤可能体積を画定する、流体チャネルと、
   ｃ）前記反応チャンバ内の前記対向する光学窓対のうちの１つまたは複数に堆積される再水和可能乾燥試薬マトリックスであって、前記再水和可能乾燥試薬マトリックスが、前記吸引パルスに応答した前記流体マイクロサンプルによる前記固定体積の充填に作動可能につながれた均質溶解のために構成される、再水和可能乾燥試薬マトリックスと、
   ｄ）前記再水和可能乾燥試薬マトリックスに配置される色素原であり、前記色素原が、前記被検物質との反応に特異的な規定された単数の波長または複数の波長での吸光度を有する、色素原と
   を含む、マイクロ流体カートリッジ。
2. 前記対向する光学窓対が、接着剤−コア−接着剤層により分離された環状オレフィンコポリマーフィルムの二つの積層された層から形成される、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
3. 前記固定体積における前記均質溶解が、対流物質移動により受動的に駆動される、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
4. 前記色素原の前記均質溶解が前記アッセイの第一相を規定し、前記色素原の前記被検物質との前記反応が前記アッセイの第二相を規定し、前記第一相および前記第二相が、前記吸光度の前記一次導関数の符号の変化により分離される、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
5. 前記分析の前記第二相が、前記被検物質につきゼロ次である吸光度の変化によりさらに規定される、請求項４に記載のマイクロ流体カートリッジ。
6. 前記マイクロ流体カートリッジが、前記上流の流体チャネルに堆積された反応のための単数の乾燥基質、複数の基質または酵素をさらに含み、前記乾燥基質、複数の基質、または酵素が、前記流体マイクロサンプル中の急速な再水和のための再水和可能マトリックスをさらに構成する、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
7. 前記サンプルレセプタクルが全血レセプタクルであり、前記全血レセプタクルおよび前記反応チャンバの間の前記取り込みチャネルに、血漿を全血から分離するための血液濾過要素が挿入される、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
8. 前記再水和可能乾燥試薬マトリックスが、緩衝塩および凍結乾燥保護薬剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）を含み、前記再水和可能乾燥試薬マトリックスが、前記光学窓の内面上に液体前駆体としてプリントされその場で乾燥される、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
9. 前記マイクロ流体カートリッジが、ゼロ次反応速度による被検物質のアッセイのための色素原を伴って構成され、前記被検物質が、乳酸デヒドロゲナーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、リパーゼ、コレステロール、トリグリセリド、尿酸、グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、リン、カルシウム、塩化物、鉄、二酸化炭素、総タンパク、抗原、または抗体である、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
10. 前記被検物質のエンドポイントアッセイのために構成されたアッセイ回路アームをさらに含み、前記被検物質が、遊離ヘモグロビン、総ヘモグロビン、ビリルビン、抗原、または抗体である、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
11. アッセイのパネルが１２０秒未満で完了される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロ流体カートリッジ。
12. 前記マイクロ流体カートリッジが、前記全血レセプタクルから複数のアッセイ回路アームの各々へ順に血漿を引き出すために構成される複数のアッセイ回路アームを含み、各アッセイ回路アームが、前記ホストワークステーションの別個の空気マニホールドの制御下にある、請求項７に記載のマイクロ流体カートリッジ。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のマイクロ流体カートリッジを含むキットであって、前記マイクロ流体カートリッジが、密封されたフォイルパウチで供給され、前記流体マイクロサンプルの添加だけを必要とする、キット。
14. 前記流体マイクロサンプルが、血清、血漿、全血、脳脊髄液、滑液、または尿のサンプルである、請求項１３に記載のキット。
    

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