JPH01250066A - 少なくとも１つのラベルした成分を使用して、特異的に結合するたん白質と対応する結合可能な物質との間の反応の１以上の成分を１つのテストサンプルで測定する方法、ラベルされた成分を調製する方法、及び免疫成分の測定のためのテストキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特異的に結合するたん白質と対応する結合可
能な物質との間の反応の１以上の成分を１つのテストサ
ンプルで、そのような成分の相互の反応性及びラベルの
ゾルの粒子を成分へ直接的に又は間接的に結合又は吸着
することによって得られる少なくとも１つのラベルされ
た成分の相互の反応性を利用して測定する方法であって
、反応の際又は反応の完結後、場合によっては結合した
ラベルされた成分と遊離のラベルされた成分とを分離し
た後、前記テストサンプルで又は分離１卦に得られたフ
ラクションの１つでラベルの存在及び／又は但を、測定
すべき成分の定性的又は定量的指標を得るために適当な
方法によって測定することを含む方法に関する。

ざらに、本発明は、特異的な結合性たん白質と対応する
結合可能な物質との間の反応のラベルした成分を、ラベ
ルのゾルの粒子を成分へ直接的に又は間接的に結合又は
吸着することによって調製する方法及び水性テストサン
プル中の免疫成分の測定用テストキットに関する。

ここに使用される用語“特異的な結合性たん白質と対応
する結合可能な物質との間の反応成分″は細胞の表面に
存在し得る受容体たん白質及び抗原決定基のような物質
又はその部分、及び水性媒質、特に血液プラズマ、血清
等のような体液中に又は細胞の培地中に存在し得るハプ
テン、抗原、及び抗体のような免疫化学物質を意味する
。従って、本発明は、免疫化学反応が生じ、また結合が
コロイドのラベルを非免疫化学成分、例えばＤＮＡ及び
／又はＲＮＡとの間に生じることができ、さらにコロイ
ドのラベルと他の高分子構造体、例えば酵素、ストレプ
トアビジン（ＳｔｒｅｐｔａＶｉｄｉｎ）との間の結合
が可能であるところの組織学、例えば組織及び細胞染色
の複数の分野と関連している。

これらの分野に加えて、本発明はまた、例えば診断の目
的の免疫学的検定法（水性テストサンプル中の抗体、抗
原又はハプテンの測定）の分野にも関連している。以下
の明細書の一部分には本発明は、最後に述べた分野、す
なわち診断の免疫学的検定法への適用を挙げて詳細に説
明されるが、本発明がそのような適用に限定されると解
釈されるべきではなく、組織学的及び組織化学的試験方
法に等しく適用できると理解されるべきである。

ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０００７６５４ニハ、与
えられた免疫学的成分の存在をそのような成分間の相互
の反応、例えば抗原とそれに対する抗体との間の反応を
利用して定性的に及び／又は定量的に測定する公知の免
疫学的方法の調査が掲げられている。これらの公知の方
法はそれぞれある欠点をもっているが、それらの欠点は
、前述のヨーロッパ特許出願に従って、金属又は金属化
合物の水性分散液の粒子又は金属又は金属化合物で被覆
されたポリマー核の水性分散液の粒子であって６〜ｉ　
００ｎｍの大きさの粒子へ成分を直接的に又は間接的に
結合又は吸着することによって得られる金属でラベルさ
れた成分を冒頭で記述したような方法で使用して除去す
ることができる。

前記金属−免疫学的方法は公知の放射−及び酵素−免疫
法よりも高感度であるばかりでなく、ざらに別々の金属
のラベルを使用することによって同じテスト媒質中で同
時に１以上の免疫学的成分を検出しかつ測定することを
可能にする。

金属ゾルは金属又は金属化合物、例えば金属水酸化物又
は金属塩であることができる。例えば金、銀、鉄、ニッ
ケル、アルミニウム、クロム、鉛、バナジウム、水銀、
マンガンの金属又は金属化合物、及び公知の方法によっ
て容易に検出することができるあらゆるすべての金属を
挙げることができる。

金属のゾルは、例えば、銀、金及び白金のものである。

金属化合物のゾルは、例えば、ヨウ化銀酸化鉄、水酸化
アルミニウム、水酸化クロム、酸化バナジウム、水酸化
鉄、水酸化マンガン及び硫化水銀のものである。

テスト媒質中に生じない金属又は金属化合物であって、
特に、選択された方法を用いて可能な限り低濃度で証明
することができるものを使用することが好ましい。

ヨーロッパ特許用［ＥＰ７Ａ−００３２２７０ニハ、１
以上のラベルした成分を使用する免疫化学成分の定性的
及び／又は定量的測定の可能性の調査が掲げられている
。１以上のラベルした成分は、疎水性染料又は顔料の水
性分散液の粒子又はそのような染料又は顔料で被覆され
たポリマー核の水性分散液の粒子へそのような１以上の
成分を直接又は間接的に結合することによって得られる
。

驚くべきことには、非金属元素又は金属元素を含まない
ところのその無機化合物もまたラベルとして使用するこ
とができ、そして金属を含むラベルよりもある一定の利
点を有していることが今わかった。

従って、本発明の方法は非金属元素又は金属元素を含ま
ないところのその無機化合物のゾルをラベルのために使
用することを特徴としている。

本発明による砕ましいゾル粒子はセレン、テルル、イオ
ウ、リン、炭素及び／又はケイ素である。

もう１つの好ましい実Ｍ態様において使用されるゾル粒
子は金属元素を含まないセレン、テルル、リン、イオウ
及び／又はケイ素の無機化合物、例えば二酸化ケイ素で
ある。

そのような非金属ゾルはそれ自体公知の多数の方法によ
って調製することができる。

例えば、セレンゾルの調製についてはｚ、　ｆｉｉｒＡ
ｎＯｒｇ、　Ｃｈｅｍｉｅ　３１．４４８−４５０．１
９０２の中のＧｏｔｂｒｅｒ’による論文が挙げられる
：テルルゾルについてはＫｏｌｌｏｉｄ　Ｚｅｉｔｓｃ
ｈｒｉｆｔ　７８．２２−２３．１９３６の中のＢｒ　
１ｎｔｚ　ｉｎｇｅｒによる論文が挙げられるニリンゾ
ルについてはＢｅｒｉｃｈｔｅ　３７．１４　（１９０
４）が挙げられる：ケイ素ゾルについてはＫｏｌｌｏｉ
ｄ　Ｚ、　１４゜６５−６９．１９１４の中のＧ、　Ｗ
ｅｇｅｌｉｎによる論文が挙げられる；そして酸化ケイ
素ゾルについてはＪ、　　ｏｆ　　Ｃｏ１１ｏ、ｉｄ　
　ａｎｄ　　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　　５ｃｉｅｎｃｅ　
　２８．　６２−６９、１９６８が挙げられる。

前）ホのゾルのいくつかの調製のために、水素化ホウ素
を使用して非金属元素の酸化物を還元する新規な方法が
開発された。この方法は実施例において説明される。

非金属元素のゾル粒子は電荷を持っていて、相互の反発
によって安定化効果を与える。主とじて強電解質を加え
ることによって、電荷のパターンが変化し、凝集及びフ
ロキュレーションを生じる。

極性基を有する高分子、例えばたん白質、ポリエチレン
グリコール、高分子炭水化物、ポリビニルアルコール等
で被覆することによってごれを防止することができる。

適当な保護たん白質は抗原、抗体及び抗抗体又は免疫化
学的に活性なそのフラグメント、又はハプテンであり、
それらは免疫化学的に不活性な保護高分子に結合されて
、非金属元素のゾル粒子でラベルされた免疫成分を直接
生じる。

しかしながら、安定化効果を生じないので、非金属元素
のゾル粒子を被覆するために免疫成分のみを使用するこ
とは好ましくないが、多分立体障害のために免疫化学反
応性は予想されるよりも小さい。事実、被覆を部分的に
のみ免疫成分で行いそして不活性たん白質のような免疫
化学的に不活性な別の保護物質、例えばアルブミン、ポ
リエチレングリコール又は別の極性高分子で被覆を完成
させることが有利であるということがわかった。

もう１つの適当な被覆物質はたん白質Ａ又は抗体のＦｃ
部分に活性を有する関連たん白質である。

たん白ＭＡによる非金属元素のゾル粒子の被覆後、所望
の抗体でさらに被覆することができる。

もう１つの可能性は、非金属元素のゾル粒子を不活性な
親水性ポリマー又はコポリマーでまず被覆し、その後に
免疫学的成分を被覆物質に吸着によって又は共有結合に
よって結合することである。

被覆後に得られた球状物は単一のゾル粒子を含むことが
できるが、ポリマーが１以上のゾル粒子を被覆すること
も可能である。

不活性ポリマーによるゾル粒子の被覆を前述のヨーロッ
パ特許出願ＥＰ−Ａ−０００７６５４に記載されている
ようないろいろな方法で行うことができる。

本発明で使用する非金属ゾル粒子は、前述の特許出願に
記載された金属ゾル粒子よりも多くの利点をもっている
。そのような利点は、例えば次のようなものである。

１、例えばセレンは金よりも安価である。

２、例えばセレンゾルの調製方法は金のそれよりも簡単
でかつ速い。

３、金ゾル粒子は小さい単分散か又は大きい非単分散カ
ノイずれかテｃｉるが（Ｊ、ｔ＋、ｗ、　Ｌｅｕｖｅｒ
ｉｎａ。

論文１９８４）　、セレンゾルではこれと異なり少なく
とももつとずっと小さな範囲である（Ａ。

Ｗａｔｉｌｌｏｎ、　Ｊ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ　
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　５ｃｉｅｎｃｅ２７　（３）　５
０５−１５．１９６８）。これらの粒子は実質的に必ら
ゆる大きざの単分散である。

４、例えばセレンのゾルは調製の方法に依存して陰及び
陽電荷のいずれももつことができる（Ｇｍｅｌｉｎｓ　
　Ｈａｎｄｂｕｃｈ　　Ａｎｏｒｇ、　　Ｃｈｅｍｉｅ
　　１９５３八　２６〜２７ページ）が、例えば金では
これと異なっている。

５、鋭敏なテスト系、例えば凝集（又は凝集の抑制）法
、テストストリップ系統的分類法及びスポット／プロッ
ト法におけるラベルとして使用するために、比較的低い
比質量（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｓｓ）を有する無機非
金属コロイド粒子は、もつと高い比質量を有する無機金
属元素と比較してより大ぎな粒子サイズでのより高度な
溶液安定性を与える利点がある。一般により大きな粒子
サイズがテス］〜の感度を改良するので好ましい。免疫
化学反応において生成される抗体−コロイド粒子−抗原
複合体の検出は複合体の中のより高い含有量の検出可能
なラベルによって容易になる。より大きな粒子の使用に
加えて、該粒子に結合するところの特異的に結合するた
ん白質の吊を犠牲にしてコロイド粒子に多量の免疫化学
的に不活性なたん白質を結合することによってテストの
感度を改良することもできる。そのような方法はラベル
複合体の全結合能力の減少をもたらすであろう。

米国特許出願ＵＳ−Ａ−４３４１７５７は、セレンがラ
ベルの一部分である方法を記載している。セレン化合物
を有機化合物にまず入れて、その後に全体を免疫化学化
成分に結合する。複合体が別の特異免疫化学成分で生成
される場合、この複合体を単離し、そして複合体中のセ
レンを例えば原子吸光によって測定する。本発明の場合
のように、ここでは赤いセレンゾルはラベルとして使用
されない。

ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−００３２２７０は、化学
反応によって免疫化学成分を結合した疎水性染料又は顔
料の水中分散系からなるトレーサーを使用する方法を記
載している。得られた複合体は別の特異免疫化学成分と
反応することができる。使用する染料又は／及び顔料は
ラベル系に色を与える。それ自体有機成分である系の染
料部分がテスト液中に存在する他の生成物と反応するこ
とを前もって除外することができないので、この方法は
特別なものではない。

非金属元素のゾル粒子でラベルされた免疫成分が、水性
テスト媒質中のハプテン、抗原及び抗体を検出及び定量
するための試薬として通常他の試薬と組合せて使用され
、そしてそのためには放射免疫検定法及び酵素免疫検定
法に使用するようなあらゆる種類の免疫化学法が適当で
ある。

従って、本発明はまたそのような免疫化学法で使用する
テストキットに関し、そして非金属元素のゾルからなる
非金属元素又は金属元素を含まないその無機化合物でラ
ベルされた免疫成分を最も重要な成分として含み、その
ゾルの粒子が所望の免疫成分によってか又は免疫成分が
結合され又は吸着されている不活性ポリマーによってか
のいずれかによって直接被覆されている。

従来の免疫化学法の１つは拮抗的な免疫検定法であり、
免疫成分を検出及び測定するために使用することができ
る。例えばある抗原を検出するためのこの方法は、非金
属元素でラベルされた予め決められた量の問題の抗原及
びこの抗原に対して不溶化された抗体と、又は予め決め
られた量の不溶化された抗原及び非金属元素又はその化
合物でラベルされたこの抗原に対抗する抗体と未知量の
抗原を含むテストサンプルとを接触させることを含む。

反応の完結後、非金属元素の性質及び／又は量を結合又
は遊離のフラクションで測定し、測定すべき抗原の定性
的及び定量的指標がそれぞれ得られる。必要な変更を加
えて同様な方法が他の免疫成分を測定するために適用さ
れる。

しばしば使用される他の方法はいわゆる１Ｊンドイツチ
法である。この方法はまた本発明の非金属元素でラベル
された成分を使用するために特に適している。この方法
によれば、免疫学的成分、例えば抗原を測定しなければ
ならない場合の抗体は固体キャリヤーにそれを結合する
ことによって不溶化される。

この固体キャリヤーは、例えば免疫化学反応が行われる
反応容器の内側の表面である。第１のインキュベーショ
ン後、出来れば次に洗浄工程を行い、第２のインキュベ
ーションを非金属元素でラベルされた抗体で行い、その
後非金属元素又はその化合物を結合又は遊離相で測定す
る。

また、非金属でラベルされた免疫成分は、いわゆる均質
免疫検定法（ｈｅｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｒｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ）、すなわち免疫化学反応で結合されたラベル
された免疫学的成分とまだ遊離の成分との間の分離が不
必要である免疫検定法における適用にも十分に役立つ。

そのような検定は行うのに簡単であり、相当に速く所望
の知見を与え、そして自動化に非常に役立つという利点
をもっている。

実際の検定において、例えば、測定されるべき抗原を含
むテストサンプル（又は標準溶液）をラベルされた抗体
と共にマイ゛クロタイタープレートの溜めの中でインキ
ュベートされる。抗原と抗体（ラベルされている抗体又
はラベルされていない抗体）との間の免疫化学反応は凝
集を生じる。非金属元素のゾル中の粒子のこのように誘
発された凝集は色の変化を伴い、そしてその変化を、例
えば分光測光法的に又は裸眼で追跡することができる。

免疫化学的な点において一価である小さな抗原を測定す
るために、同じ原理に基づくところの凝集抑制反応を利
用する。

前述の方法に加えて多くの他の免疫化学方法があり、そ
れらの方法では、非金属元素でラベルされた免疫成分を
試薬として使用することができる。

本発明はまた、非金属元素の別のゾル粒子でラベルされ
ている免疫成分を検出されるべき成分のそれぞれのため
の試薬として使用することによって、テストサンプル中
の別々のハプテン、抗原、抗体、又はそれらの組合せを
同時に検出することも可能にする。

反応混合物のある相の中の非金属元素の性質及び／又は
濃度の測定はそれ自体公知の多くの方法で行うことがで
きる。例えば比色検定法がある。

この方法においては、非金属元素のいくつかのゾルが高
度に着色した分散系であるという性質を利用する： セレン−赤→青、テルル−褐色→青、ケイ素＝褐色→黄
、リン−蛍光青、これらは物理化学的変化に基づいてさ
らに色を変化する； 目視法、これの方法は、非金属元素のいくつかのゾルが
着色しているという上記事実を考慮して、定性的検定の
ためにはしばしば十分である；フレーム発光分光測光法
又はあらゆる他のプラズマ発光分光測光法（この方法は
同時測定を可能にする）、及びフレームレス原子吸光分
光測光法高感度法の利用。

ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０１５８７４６にはコロ
イド金属粒子を、物理的顕色剤を使用して（よりよく）
目に見えるようにすることができる方法を記載している
。この物理的顕色剤は銀を含む化合物である。非金属元
素からなるコロイド粒子の可視性を３〜１０のオーダー
の大きさだけ増すこともできるということがわかったこ
とは驚きである。実質的に色のない、従って極めて弱い
可視性を有するゾル又はゾルを有する化合物でさえも、
次の実施例に記載されるように、このようにして見える
ようにすることができる。

本発明は以下の実施例において説明される。

文献から得られる知見に基づいて、例えば次のものから
なる強く着色した単分散コロイド溶液を調製することが
できる。

１、次のサイズ分布及び次のカラースペクトルを有する
球状のＳｅ粒子か 粒子サイズ（ｎｍ）　　　　　色 直径４０〜５００　　　　　　青→赤 ２、または次のサイズ分布及びカラースペクトルを有す
る引伸したＴｅ粒子かのいずれかのもの。

粒子サイズ（ｎｍ）　　　　　色 長さ３０〜１８０　　　　　褐色→前 幅１２〜２５ 調製方法を改良することによって、コロイド粒子のサイ
ズを１〜１１０００ｎの範囲まで増加することができる
。Ｔｅゾルの調製のためのプロトコルを変更して、その
ような知見に従って調製されたコロイド７−ｅ粒子が確
実に球状になるようにすることができる。

実施例　１ ポテトのソラニジングリコシドの定損アッセイのための
抗ソラニシングリコシドＩｇＧと複合したＳｅ粒子。

序： 精製した抗体をコロイドＳｅ粒子に化学的又は物理的に
結合することによって得られる複合体を均質イムノアッ
セイに使用してポテトエキス中のソラニジンを測定する
。

該アラごイはサンプル中の遊離ソラニジングリコシドに
よる反応混合物の凝集プロセスの抑制に基づいている。

この反応混合物はテストされるべきサンプル（又は標準
溶液）、Ｓｅ粒子と抗ソラニジングリコシドＩＣＩＧの
複合体、及び与えられたアッセイの感度のために必要な
量のソラニジングリコシドチログロブリン複合体からな
る。−価ハブテン（ソラニジングリコシド分子）をキャ
リヤーたん白質（チログロブリン）に結合することによ
って免疫化学的多価ハプテン錯体が得られる。

このハプテンはｓｅ粒子／抗ソラニジングリコシド複合
体を凝集することができる。ソラニジングリコシドチロ
グロブリン錯体によるＳｅ粒子／抗ソラニジングリコシ
ド複合体のこの凝集をサンプル（又は標準溶液）中の遊
離ソラニジングリコシドによって抑制することができる
。

１．３ｃゾルの調製 連続して攪拌しながら、０．５０７３！？のＳ　ｅ　Ｏ
２を６戒の冷８０％ヒドラジン水和物に注意深く加えて
、血赤色を有する油状の混合物を生成し、そしてそれを
氷上で３０分間攪拌する。

次に、１ｍｉの混合物を９９９ｍ１の沸騰蒸留水に素早
く、そして激しく攪拌しながら加える。このＳｅゾルを
１５分間煮沸する。

平均径（１００ｎｍ）を有する（球状の）Ｓｅ粒子から
なるわずかに濁った、オレンジ赤みのあるＳｅゾルがこ
のようにして生成される（Ｗａｔｉｌｌｏｎ、　Ｖａｎ
Ｇｒｕｎｄｅｒｂｅｅｃｋ、　１９５６）。

ゾルのｐｉｔは９．４で必りそしてＡ２ｏＦｆｎｒｎ　
＝’−３５２、ソラニジングリコシドたん白質複合体の
製造。

ソラニジングリコシドＢＳＡ複合体（抗原）及びソラニ
ジングリコシドチログロブリン複合体の両方が過ヨウ素
酸塩法によって合成される（Ｂｕｔｌｅｒ、　　Ｖ、　
　Ｐ、　　；　　Ｃｈｅｎ、、　　Ｊ、　　Ｐ、　　［
）ｉｇｏｘｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｈａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　１９６７；　５７，７１−７８＞。

３、ウサギソラニジングリコシド抗血清の調製数のプロ
トコルに従ってンラニジンーＢＳＡ複合体でウサギを免
疫にすることによってソラニジングリコシド抗血清を調
製する。

この目的のために、５旬のソラニジン−ＢＳＡ（凍結乾
燥されている）を次のものからなる５ｄの媒質中に溶解
する。

１部の（殺菌）生理食塩水 （９ｍｇ／ｍ　　ＮａＣＮ　＞。

１部のフロイントコンプリートアジュバント。

１部のトウィーン〔丁ｗｅｅｎ）−８０（１０ｍｔｉｔ
／　ｍｌ　）。

注射：４Ｘ（ｌｘ／月）０．２５ｍ１背中に皮下注射。

１×１ｒｄ！背−足（ｂａｃｋ−ｐａｗ）に筋肉注射。

この注射計画は、抗血清のタイターが十分に高くなるま
で（できれば）くり返される。

粗血清をウサギから回収する。

４゜粗ウサギ血清からのＩｇＧフラクションの精製 Ｃ１０／　１０カラムを１ｄのたん白質Ａ−セファ０−
スＣｌ−４Ｂで満たす。カラムの通流速度は０．８ｄ／
分である。カラムを５ｍｌの結合緩衝液によって平衡さ
せる（下記参照）。

同体積の出発ｒｉＵ衝液で希釈した５ｄの血清をカラム
に適用する。次に負荷したカラムを緩衝液によってｐＨ
を下げながら段階的に溶出する。

溶出したフラクションを５ミリモルＮａＣ，ｌ！、Ｅ）
１１７．０（４℃）に対して２４時間透析し、次に２０
．０ＯＯｘ　ｇ　（４°Ｃ）で３０分間遠心する。

最後に上澄みを５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡによっ
て分析する（所望であれば、ＢＳＡ溶液で抗ＢＳＡ　　
ＩｇＧフラクションを撮って出すことができる）。

■ｇＧ含有量を、種々なフラクションの１０倍希釈溶液
ノＡ２８８？１Ｉｌｌ及ヒＡ２１６ｅＩＩｌヲ測定スル
コトニよって分光測光法的に測定する。

この含有量Ｇ（／Ｉｉ！ｆｆ／ｒｄｌ）は次の式から計
算され緩衝液組成 結合緩衝液：１．５Ｍグリジン、３Ｍ　　ＮａＣｌ。

５Ｍ　　ＮａＯＨでｐＨ８，９Ｌ調整 溶出緩衝液：１００ミリモルクエン酸、５Ｍ　　ＮａＯ
ＨでｐＨ４，０、５，０又は６．０に調整 再生緩衝液：　　１００ミリモルクエン酸、５ＭＮ　ａ
　ＯＨｒｐＨ３，ＯニＨｌ［ ５、ＳＯ粒子抗ソラニジングリコシド複合体の調製 （以下に述べるすべての操作は別に断わりのない限り室
温で行われる。） ５００ｄのＳｅゾル（調製法は前記１の項参照）を１０
％及び０．１％ＨＣ，Ｉｌ溶液でｐＨ７，０に調整する
。

含有量２００μｇ／ｍｌを有する精製したウサギ抗ソラ
ニジングリコシドイムノグロプリン溶液１．５−を２５
ｄの中和したＳｅゾルに激しく攪拌しながら一滴ずつ加
える。

次に、５ミリモルＮ　ａ　Ｃ，ｌｌ　、　ｐＨ７，０中
の２５ｇ、ｆｆの正常なウサギＩＣＩＧ溶液１戒を同様
にして加える。

得られたＳＯ粒子ウつギ抗ソラニジングリコシドイムノ
グロプリン複合体を３０．０００ｘ　ｇで１０分間遠心
する。上澄みを吸引濾過で集め複合体からなるベレット
をＡ２ｏ５’Ｗｍ　＝”であるような大容積の０．１Ｍ
トリス／ＨＣ，ｌ！緩衝液、ｐＨ７，６（下記６の項参
照）中に再懸濁する。

６、トリス緩衝液組成 ０．１モル／ｆｌトリス／ＨＣ，Ｉ！ ３０ｇ／　Ｊ）　　　スクロース ０．１　ｇ／　Ｍ　　　チメロサール ０．２５モル／、１１　　　　ＮａＣ，ｌｌ１．５　ｇ
／　ｆＩＰＥＧ６０００ ７、検出限界 ソラニジングリコシドの検出限界は、対照のＡ　１　ｃ
ｍの標準偏差の値を３倍した対照の平均ｍａ× １　ｃｍ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　ｃ
ｍＡ　　に等しいアッセイにおけるＡｌｌ１ａｘ値を生
じａｘ るところのソラニジングリコシドの濃度として定義され
る。

８、テスト手順 （以下に述べるすべての操作は室温で行うことができる
。） ５０ｇｇの緩衝ソラニジングリコシド標準溶液又は５０
ｇｇのサンプルを無被覆９６−溜めマイクロタイターＥ
ＬＩＳＡプレートの溜めにピペットで分注する。

少なくとも５分間後、Ａ　ｍｌａｃｍ　＝　１．０を有
する１００μρの緩衝したｓｅ　　＜抗ソラニジングリ
コシド）複合体を溜め毎に加える。

ざらに少なくとも５分間後、５０μｐの緩衝ソラニジン
グリコシドチログロブリン溶液を各溜めにビレットで分
注する（所望のアッセイ感度に依存する濃度）。

室温で２時間インキュベーションを行った後、Ａｌｌｌ
８ｘはミクロ−ＥＬＩＳＡリーダーニヨツｌｌ！！定さ
れる。

実施例　２ この実施例においてはＴｅゾルが使用される。

１、Ｔｅゾルの調製 １００ｍ１の０．５％（ｗ／ｖ）Ｈ６Ｔｅ０６を３０ｄ
の０．１　Ｎ　　Ｋ２　ＣＯ３と混合し、そして１５分
間煮沸する。

その後、５ｄの０．６５〜０．８５％（ｗ／ｖ）アスコ
ルビン酸を素早く激しく攪拌しながら加える。この混合
物を１５分間再び煮沸する。平均たて軸（３１ｎｍ）及
び平均よこ軸（１２ｎｍ　；　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　１９
５３）を有する引伸したＴｅ粒子からなる透明な褐色味
のある赤色のＴｅゾルが生成される。ゾルのｐＨは９．
１である。Ａ２１６鰭１１．Ｏｏ 続く手順は実施例１と同じである。

実施例３及び４ 免疫組織化学及び免疫細胞化学における電子顕微鏡及び
光学顕微鏡の両方のためのラベルしたコロイドＳｅゾル
及びＴｅゾルの調製及び精製５ｎｍ、　１０ｎｍ、　１
５ｎｍ、又は２０ｍの平均直径を有する粒子からなり、
前もってｐｔｌを７゜Ｏに調整した２５ｄのＳｅゾル及
びＴｅゾルのそれぞれに、１００μｇ／ｄの含有量を有
する１０ｄの精製したウサギ抗ソラニジングリコシドイ
ムノグロプリン溶液を激しく攪拌しながら一滴ずつ加え
る。（注意：ＩｑＧフラクションをＢＳＡ溶液といっし
ょに振るべきである。） この混合物を室温で２分間攪拌する。

次に、最終濃度が１％（Ｗ／Ｖ）になるまで水（ｐＨ７
、Ｏ）中ノ１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液を加える。

次に、混合物を４°Ｃで次のように遠心する。

直径（Ｏｍ） ５　　　　４５．０ＯＯｘ　ｑ　　　　　４５分間１０
　　　　４５、０００ｘ　ｇ　　　　　　３０分間１５
　　　　１２．０ＯＯｘ　ｇ　　　　　４５分間２０　
　　　１２．０ＯＯｘ　ｇ　　　　　　３０分間上澄み
を最初の体積の１０％まで除去する。残りの上澄み中の
ペレット（ゆるい）を再懸濁する。

１０．５ｍｌの遠心管中で、８　ｃｍの長さを有する１
％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ　−トリス緩衝液、　ｐＨ８，２
に１０〜３０％グリセロール勾配をつくる。

緩衝液　：　　２０ｍＭトリス １５０ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｌ！ １％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ ｐＨ８゜２に１Ｎ　Ｆｌｃ、ｌ！で調整その勾配に２ｍ
ｆ！の再懸濁したペレットを負荷し、Ｓ　Ｗ４１０−タ
ー中１８℃で次のように遠心する。

５　　１２５．０００ｘ　ｇ　　　　２００分間　　　
１３５分間１０　　５０、０ＯＯｘ　ｇ　　　　２００
分間　　　１３５分間１５　　１５．０ＯＯｘ　ｔｊ２
００分間　　　１３５分間２０　　１５．０００ｘ　ｇ
　　　　１３５分間　　　９０分間勾配の上部３　ｃｍ
を集める。

１％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ　−トリス緩衝液、　ｐＨ８，
２ニ対して透析（室温で２４時間）によってグリセロー
ルを除去する。サンプルのＡ誌ｍを測定し、そして次の
ように希釈する。

直径（ｎｍ　）　　　　　Ａ　１　ｃｍａｘ ５２．５ １０　　　　　　　　　　２．５ １５　　　　　　　　　　３．５ ２０　　　　　　　　　　５．０ Ｅ、Ｈ，及びし、Ｈｌの調製については、Ｂｕｌｌｏｃ
ｋ、　Ｇ、Ｒ。

ｐｅｔｒｕｓｚ、　ｐ、　　（編集者）１丁ｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ　ｉｎｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　２　　アカデミツクプレス。

ロンドン、２１７〜２８４ページ（１９８３年）　；　
ＧｅｔＪＺｅ。

Ｈ，Ｊ、、　Ｓｌｏ℃、　Ｊ、Ｗ、、　　Ｌｅｙ、　Ｐ
、Ａ、、　５ｃｈｅｆｆｅｒ、　Ｒ，Ｃ，Ｔ。

及びＧｒｉｆｆｉｔｈ、　Ｊ、Ｈ，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌＢｉＯ１Ｏ（ＩＶ、　　第８９巻
６５３〜６６５ページ（１９８１年）；ｔｌｏｒｒｉｓ
ｂｅｒｇｅｒ、　）１．及びＲｏｓｓｅｔ、　Ｊ、　Ｊ
、　ｌ−１ｉｓｔｏｃｈ１−１ｉｓｔｏｃｈｅ、　２５
　：　２９５〜３０５（１９７７）が挙げられる。

実施例　５ 単分散セレンゾルの調製 １０ｍ１の脱鉱物質水中の０．２ｇのＳ　ｅ　０２　（
Ｂａｋｅｒｃｈｅｍ、社製）の濾過した溶液（０，２２
μ雇フイルター）を９８５ｄの脱鉱物質水に加える。少
なくとも１０分間混合した後、５ｄの脱鉱物質水中の０
，２５９のＮａＢＨ４（Ｃｈｅｍｅｔａ１社製）の溶液
を素早く激しく攪拌しながら加える。混合物を３０分間
室温で反応させた後、そのゾルを透析によって精製する
ことができる。この種のＳｅゾルについての電子顕微鏡
法は、平均直径が３５．Ｚｎｍ±４．１２１１ｍ　（Ｓ
、ｔ）、　）でおることを示した。波長吸収スペクトル
は、１０％ＮａＣｆ１溶液でのフロキュレーションの後
、そのゾルがλ＝　５５０ｎｍで吸収の最大差異をもっ
ているということを示した。

実施例　６ 多分散テルルゾルの調製 溶液Ａ　：　０．２２μ亀のフィルターを通して濾過す
ることによって精製した１ｄの脱鉱物 質水当りｏ、ｉｏｇのＨ６Ｔｅ０６（メルク社製）。

溶液Ｂ：１ｄの脱鉱物質水当り０．１０ｇのＮａＢＨ４
（Ｃｈｅｍｅｔａ１社製）。

１．２の脱鉱物質水に８００μｇの溶液Ａを加え、そし
て１０分間後に２戒の溶液Ｂを加える（激しく攪拌しな
がら行う）。全反応時間は３０分間で必る（室温）。そ
の後このゾルを透析によって精製することができる。Ｔ
ｅゾルについては、最大吸収値がλ＝　５６０ｎｍであ
ることがわかる。

実施例　７ “染色パ、単分散二酸化ケイ素の調製 （ａ）序 コロイドＳｉＯ２粒子が、アルコール、水及びアンモニ
アからなる混合物中でテトラアルキルシリケート　エス
テルを加水分解することによって得られる。このプロセ
スにおいて、二種類の反応が１つの役割をする。

１、テトラアルキルエステルを加水分解して反応性シラ
ノールを生成する。このプロセスにおいて、アンモニア
は触媒として作用する。

２、縮合反応による生成されたシラノールの５ｉ０２へ
の転化。

このようにして生成されコロイドＳｉＯ２粒子の直径は
主として、反応混合物中の最初の水及びアンモニアの濃
度によって決定される。上記の方法において得られるシ
ケートゾルは乳児であり、乳白色を示す。

コロイドシリカ粒子の“染色″は、テトラアルキルシリ
ケートエステルの加水分解、次に縮合／重合反応を、特
定の成分に加えて染料を含む反応容器中で起させること
によって可能になる。

そのような染料はアルコール及び水の両方に十分に可溶
性であるべきである。帯電効果に関連して、アルカリ性
を有する染料が（正味）負に帯電した５１０２粒子を染
色するのに都合がよい。

選択した染料が蛍光性を有する場合には、“染色’５ｈ
ｏ２粒子がラベルとして作用するイムノアッセイによっ
て得られるテスト結果のＵＶ範囲の読みが可能である。

イムノアッセイにおける蛍光Ｓ！０２ラベルの使用は一
般に、そのようなテスト系の感度を増す。

相互に明確に区別できる染料によって“染色″されかつ
必要な特異性を有する抗体を与えられたＳ！０２ラベル
の使用は、別々の抗原（抗原決定基）を１つのテストサ
ンプルで速くかつ正確に検出する（又は定量する）機会
を提供する。

（ｂ）　　”染色’５ｉｏ２ゾルの調製１８６ｍ１の無
水エタノール（メルク社製）中に１１００ｆｆ１のロー
ダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）（Ｓｉｇｍａ社
製）を溶解する。

この溶液に７４ｍの２５％ＮＨ３水溶液（メルク社製）
を２つの溶液を混合するためにマグネヂックスターラー
を使用しながら加える。次に、６４ＩＩｄ！、のテトラ
エチルオルトシリケート（メルク社製）を激しく攪拌し
ながら素早く加える。最初の透明な紫／赤の溶液は約７
分間後に乳児に見えてくる。

１２分間後、そのゾルを透析によって精製する（人工腎
臓による）。この透析の間にゾルのｐＨはｐｌｌｌｏか
らｐｔ１６．５に下がる。透析物がＲＩＴＣの分光測光
法的ニ測定テキル（Ａ５１６６７１１Ｉｌ＝Ｏ）量ヲモ
はや含まないことがわかるやいなや透析を中止する。

このようにして水性媒質中に含まれる乳児、紫色のＳｉ
Ｏ２ゾルが生成される。

球状のＳｉＯ２粒子の平均直径は１５６ｎｍ±８ｎｍで
ある。

使用の前にゾルをＡ（λ＝　５６０ｎｍ）　＝　１　、
０まで希釈する。

注意： ■、保護のないゾルは一価カチオン（例えばＮａ　　＞
の影響下で急速にフロキュレーションを起す。正しい条
件（実施例８（ａ）参照）であることを前提として、コ
ロイドシリカへのたん白質の物理的吸着は電解質で誘発
されるフロキュレーションからゾルを保護する。

そのプロトコルに従って処理されたサスペンション及び
それに６４ｄの水を６４ｒｄｌテトラエチルオルトシリ
ケートの代わりに加えたサスペンションは電解質の添加
後に、フロキュレーションの感知できる徴候を示さない
。

このサスペンションの透析は激しい変色を生じる。これ
はすべて、コロイドシリカ粒子は存在せず、“染色”５
ｈｏ２粒子が前記方法によって調製された染色されたゾ
ルで存在するということを示唆している。

■、これらのＣＮ５Ｗがたん白質に接近できるかぎり、
アルカリ性媒質（ｐｔ１９．５）中のＲＩＴＣで“染色
″されたＳｉＯ２粒子へのたん白質の物理的吸着は、た
ん白質がたん白質の−ＮＨ２及び／又は−８Ｈ基を含む
付加反応によってＲＩＴＣのイソチオシアネート基に共
有結合する可能性を提供する。たん白質の５ｉ０２への
予想される結合に加えて、たん白質とＲＩＴＣとの好ま
しくない結合も可能である。比較的低いｐＨの条件下で
は、言及された付加反応をもつと困難にする。

ＲＩ　ＴＣ−Ｓ　ｉ　０２でラベルされたイムノグロブ
リンとくたん白質）抗原との間の反応の特異性に関して
も、付加反応を除外することが重要でおる。

（Ｃ）　　モノクローナルマウスＩｇＧのコロイドＲＩ
ＴＣ／Ｓｉｏ２への吸着 （次の操作はすべて別に断わりのない限り室温で行われ
る。） ５ｍｌのＲＩＴＣ／Ｓ＋Ｃ２ゾルを０．１ＭＫ２ＣＯ３
で１）８７．０に調整する。

５μｇのマウス腹水を５威の中和したＲＩＴＣ／Ｓ！０
２ゾルに注意深く攪拌しながら加える。

１５分間インキュベーションを行った後、体積を水で１
５ｄにする。

生成されたＲ　ＩＴＣ／Ｓ　ｉ　０２−１　ｇＧ　（腹
水）複合体を１３０（）ｘ　ｇ（４℃）で５分間遠心す
る。上澄みを吸引濾過で集め、そして複合体からなるゆ
るいペレットを５００μρの５ｍＭ　　Ｎａ（ｊ！溶液
中に再懸濁する。

テスト手順及び結果 ニトロセルローステストストリップ（実施例８（ｅ）１
参照）。一連の濃度のヤギー抗マウスポリクローナルＩ
　ＣＩ　Ｇ　（１２８０ｎｇ　〜２．５ＤＯ）をスポッ
トする。否定的な対照として一連の濃度のβ−ガラクト
シダーゼ（１５００ｎａ　〜２．０ｐａ）を含む。

種々なストリップの交差インキュベーションをＲＩＴＣ
／Ｓ　ｉ０２−　ＩｇＧ　（腹水）複合体及び保護のな
いＲＩＴＣ／Ｓ！０２ゾルで行う。インキュベーション
の条件に関しては実施例８（ｅ）２が参照される。

ヤギー抗マウススポットが特に、ＲＩＴＣ／Ｓｉ０Ｓ１
０２−Ｉ腹水）複合体によって４０１（ｌまで染色され
る。ヤギー抗マウススポットは保護のないＲＩＴＣ／Ｓ
　！　０２ゾルでは特異な染色を与えない。

β−ガラクトシダーゼスポットはＲＩＴＣ／５ｉ０２−
ＩＯＧ（腹水）複合体及び保護のないＲＩ　ＴＣ／Ｓ　
ｉ　０２ゾルのいずれでも特異な染色を示さない。

実施例　８ たん白質のコロイド粒子への吸着 （ａ）序 たん白質のコロイド粒子への結合はコロイドの物理的性
質に基づいている。たん白質及び他の高分子がゾルを電
解質で誘発されるフロキュレーションに対して安定化す
る役割をする。

たん白質の吸着は粒子サイズ、イオン濃度（吸着の際に
は可能な限り低い）、及び関係しているたん白質の種類
、量及び分子量によって影響される。しかしながら、こ
の関係で最も重要なパラメーターはｐｔｌである。ゾル
のｐｔｔはたん白質の全体的な電気的負荷に直接的に影
響する（アルカリ：より負に帯電したたん白質；酸：よ
り正に帯電したたん白質）。

た／υ白質のゾル粒子への吸着は、一方のたん白質と他
方の粒子表面との間に最大の“′多点接触（ｍｕｌｔｉ
ｐｏｉｎｔ−ｃｏｎｔａｃｔ）”を可能とする条件下で
最もよく進行する。そのような多点接触は不可逆的な結
合を生じる。これらの条件は、結合のために最適なｐＨ
（実験的に決定される）での吸着プロセスの際に最少保
護（安定化＞ｉｔ（ＭＰＡ）のたん白質を使用すること
によって達成される。

たん白’ｄＡ（及びまたたん白質Ｇ）は比較的小さなた
ん白質であり、広い範囲のイムノグロブリンに１：１の
比で結合する。この性質のために、両方のたん白質はラ
ベル／キャリヤーとしての使用に非常に適している。従
って視覚的に又は別の方法で感知できるラベル、例えば
着色したコロイド粒子をこれらのたん白質に結合して、
特異的な検出方法を行うことができる。

（ｂ）　　コロイドセレン又はテルルへの吸着のために
適当なたん白質Ａ溶液の調製 たん白質Ａ（水溶性、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、社製）
の保存溶液＜１ｍｆｌ／ｒｒｄｌ＞を脱鉱物質水を用い
て作り、ミリポアフィルタ（０，２２μｍ〉で濾過する
。

塩を含まない凍結乾燥たん白質Ａが供給されるので、そ
の溶液をさらに精製する必要はなく、電解質を含まない
水に完全に溶解する。

濾過したたん白質Ａ溶液を一２０°Ｃに保ち、解凍及び
ホモジナイズして、使用することができる。

（Ｃ）　　たん白ＭＡのコロイドセレンへの吸着１、Ｒ
適安定化たん白質１ｍ度の決定 これは濃度依存吸着等温線を作図することによって行わ
れる。たん白質Ａ溶液のｐＨを０．０１ＭＫ２ＣＯ３で
６．１調整する（たん白質のｐＨは５．１である）。ゾ
ルのＩ）Ｈも同様にする。使用する前にゾルを簡単に（
５分間）　　５ｏｏｇで遠心し、あらゆる凝集体を除去
する。

一連の希釈たん白質Ａは次のものである。

１７！の脱鉱物質水当り５０−４５−３５−３０−２５
−２０−１５−１０−５−及びＯμ９゜ 各々の希釈に５ｄのゾルを加える。これは、１０分間後
に１ｍの１０％ＮａＣＪｌを加える前に混合される。

さ、らに５分間後、５５０止での光学密度（０，Ｄ、）
を測定する。ｊｑられた値を対応するたん白質の濃度に
対してプロットする。最少保ｉｔのたん白質を０．Ｄ、
が一定になる点によって決定する。

たん白ＭＡ及びセレンゾルについての濃度依存吸着等温
線はＭＰＡが３５μｙ１５ｍｌ（すなわち、７μｇ／ｄ
ゾル）であったということを示す。

２、結合のための最適ｐ１１の決定 １の下に見出された最適な安定化たん白質濃度はｌ）Ｈ
とゾルの安定性との間の関係を決定するために使用され
る。この目的のために多くのたん白質溶液（ＭＰＡのた
ん白質濃度を有する）を４〜１０の範囲のｐＨ（０，５
９Ｈ単位の増加分）で作成する。

各溶液（１ｄ）に５ｍｌの対応するｐＨの３ｅゾルを加
え、１０分間後に７０キユレーシヨンを１ｄの１０％Ｎ
ａＣρ溶液で試み、そしてざらに５分間後に吸収をλ＝
　５５０ｎｍで測定する。得られた値をそれらの対応す
るＩ）Ｈ値に対してプロットする。最適なｐＨは、ゾル
−たん白質混合物が最も低い吸収値を有するｐＨ（又は
ｐｔ＋範囲）である。

（ｄ）　　セレンゾルでラベルされたたん白）！Ａの調
製 最適な安定化たん白質濃度は１０％増加する。実験的な
条件下で、出発点は５０ｄのＳｅゾル（ｐＨ６，１；０
、　Ｄ、　５５０ｎｍ　：０．５）である。これに３８
５μ９のたん白質Ａを室温で速く撹拌しながら加える。

全結合時間は１０分間である。この後、たん白質Ａ−ｓ
ｅ複合体を１５分間４６００ｇ（４℃）で遠心する。

ゆるいペレット上の上ｔＷみを吸引することによって除
去した後、ペレットを５ｍＭ　　ＮａＣＪ）溶液（最初
の体積の１／２０部）に懸濁する。さらに安定化剤を加
えない。

（ｅ）　　たん白質Ａ−セレンプローブの感度及び特異
性のテスト １、ニトロセルローステストストリップの作成ニトロセ
ルロース紙（細孔直径０．５μＴｒＬ）をサイズ１．２
ｘ　５．５ｃｍにカットする。これらのピースに検出さ
れるべきたん白質濃度の１μｇのスポットを適用する（
例えば、たん白質ＡはウサギＩｇＧに対して高い親和性
をもっている（表１参照））。一連のＳ度（一般に１２
８０ｎｇ〜２．５ｐ（］の範囲）をスポットした後、そ
のストリップを３７℃で２０分間乾燥する。

この後直ちに、たん白質で被覆されていないストリップ
の部分を、リン酸塩でＭ衝止された生理的食塩水中（Ｐ
ＢＳ）の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２０’Ｃ
で封鎖する。３７分間後、ストリップを３７℃で乾燥し
て使用することができる。

２、たん白質Ａ−セレンプローブとのテストストリップ
のインキュベーション テストストリップを、１：５０希釈のＰ　Ｂ　Ｓ　＋１
％ＢＳＡ中のたん白質Ａ−セレンプローブ中で２時間を
越えない時間インキュベートする。インキュベーション
の間ストリップ及びインキュベーション混合物をポリプ
ロピレンチューブ中の振どう機でかきまぜる。プローブ
の感度は一般に、最適化されていない系の中のスポット
された（固定化された）たん白質の目視的に検出可能な
最も低い濃度によって測定される。テスト結果は表２に
掲げられている。検出限界を銀増感法を使用することに
よってファクター２〜４だけ上昇させることができる。

（ｆ）　　たん白質Ａのコロイドテルルへの吸着基本的
にはＳｅゾルについての方法と同じ結合方法をＴｅゾル
について適用する。たん白ｉＡ保存溶液は（ｉｌ）で示
されたものと同じである。

１、最適な安定化たん白質濃度の決定 ３ｅゾルについての方法と同じ方法で濃度依存吸着等温
線をＴｅゾルについて作図する（（Ｃ）　１参照）。し
かしながら、テルルに関してはＱ、Ｄ、　　　　＝　１
．０及びｐＨ＝　６．１であることが６０ｎｍ わかっている。

濃度依存吸着等温線によれば、最少安定化たん白質濃度
（ＭＰＡ）は３０μ９　／　５　ｍ１Ｔｅゾル（すなわ
ち、６μｇ／ｉ！テルルゾル）である。

２、Ｒ適な結合ｐＨの決定 Ｔｅゾルについてのｐｔ＋依存吸着等温線の作図は３ｅ
ゾルについて記載したのと同じで必る（（Ｃ）　２参照
）。たん白質ＡをＴｅゾルに結合するための最適なｐＨ
はＯ−Ｄ−５６０ｎｍ　＝　”でｐＨ６，１である。

（ＣＩ）　　テルルプローブでラベルされたたん白質Ａ
の調製 最適な安定化たん白質濃度は１０％増加覆る（６．６　
μｇ／ｍ１Ｔｅ−ゾル）。ゾルのｐｔｌを０．０１ＭＫ
２ＣＯ３でｐｌ−１６，１に調整する。所望量のゾル（
実際には５０ｄ＞をたん白質と室温で混合する。

１０分間反応させた後、混合物を１０分間１８，０００
ｇかつ４℃で遠心する。ゆるいペレット上の上澄みを吸
引によって除去した後、５ｍＭ　　ＮａＣｊ！　　（初
期体積の１／２０部）中に懸濁する。さらに安定化剤は
このサスペンションに加えない。

（ｈ）　　たん白質Ａテルルプローブの感度及び特異性
のテスト ニトロセルロースストリップを作成し、（ｅ）で記載し
たように処理する。Ｔｅゾル−たん白質Ａとのインキュ
ベーションはＳｅゾル−たん白質Ａとのインキュベーシ
ョンと同様である。Ｔｅプローブで染色したストリップ
を２時間以内に読む。

まだ最適化されていない系の目視的に検出可能な最も低
い′ａ度は表２に与えられている。

（ｉ）　　抗β−ガラクトシダーゼＩｇＧ（腹水からの
もの）のコロイドセレンへの吸着 原則としてすべての他のたん白質についての手順と同じ
手順を適用する。抗β−ガラクトシダーゼＩＱＧの濃度
は未知である。従って、量は単位体積で表示される。ｔ
Ｘｉ度依存及びｐＨ依存吸着等温線の作図によってＭＰ
Ａは０．８μ、Ｑ／ｍｌゾルでありそして最適結合ｐＨ
は７．５であることがわかった。

（ｊ）　　セレンプローブでラベルされた抗β−ガラク
トシダーゼＩｇＧ（腹水からのもの）の調製５０ｄのゾ
ルを０．０１Ｍ　　Ｋ２　ＣＯ３でｐＨ７，５に調整す
る。８０Ｍｇの抗β−ガラクトシダーゼＩＣＩＧ（腹水
からのもの）を加える。結合を室温で１０分間行う。次
に、混合物を４６００　ｇかつ４０’Ｃで１０分間遠心
する。ゆるいペレット上の上澄みを吸引によって除去し
、ペレットを５ｍＭ　　ＮａＣρ　（初期体積の１／２
０部）中に懸濁する。ざらに安定化剤はこのサスペンシ
ョンに加えない。このようにして得られた抗β−ガラク
トシダーゼＩｇＧ（腹水）セレンプローブを検出の目的
に使用する。

（ｋ）　　セレンプローブでラベルされた抗β−ガラク
トシダーゼＩｑＧ（腹水からのもの）の感度及び特異性
のテスト ニトロセルローステストストリップ：　（ｅ）１参照。

一連の濃度のヤギー抗マウスＩｑＧ（ポリクローナル１
２８０ｎｇ　〜２．５ｐＯ）、β−ガラクトシダーゼ（
１５００ｎｇ〜２．Ｏｐｃ＋）、及び否定的な対照とし
てα−ガラクトシダーｔ’　（１５００ｎｃ＋　〜２．
０１）（１）をスポｙ　ｔ〜する。

Ｓｅゾルプローブとのインキュベーションは（ｅ）２で
記載したものと同様である。テスト結果を表２に示す。

（１）抗β−ガラクトシダーゼＩｑＧ（腹水からのもの
）のコロイドテルルへの吸着及び固定化されたβ−ガラ
クトシダーゼのテスト 次のすべての手順は、結合のためのＴｅゾルの吸収値が
１．０でありかつＭＰＡが１μρ／ｍｌＴｅゾルである
以外はセレン結合のもの同じである。

抗β−ガラクトシダーゼテルルプローブの調製、精製及
び濃縮については前記（（１）参照。ニトロセルロース
ストリップを一連の希釈ヤギ−抗マウスＩＣＩＧ、β−
ガラクトシダーゼ及びα−ガラクトシダーゼでスポット
する（前記（ｋ）参照）。テスト結果は表２に掲げられ
ている。

（ｍ）　　抗−トマチンＩｇＧ（腹水からのもの）のコ
ロイドセレンへの吸着及び固定化されたトマチン及びソ
ラニン複合体☆のテスト 手順等は前記（ｊ）で記載したものと同じである。パラ
メーターは、最適ｐ）ｌ＝７．５．ＭＰＡ＝１．８μＮ
／ｍｉゾルである。

☆テストストリップをキーホール　リンベットヘモシア
ニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｃｔｔ　ｔｆａｅｍｏ
ｃｙａｎｉｎｅ）（ＫＬＨ）キャリヤーたん白質を有す
るトマチン又はソラニンの複合体でのみスポットするこ
とができる。

テスト結果は表２に掲げられている。

（ｎ）　　抗トマチンＩｇＧ（腹水からのもの）のコロ
イドテルルへの吸着及び固定化されたＫ　Ｌ　Ｈ−トマ
チンのテスト 濃度依存吸着等温線を得るための手順等は前記（１）で
記載されているものが腹水からの抗トマチンＩＱＧに直
接適用できる。

パラメーターは、最適ｐＨ＝７．５　、ＭＰＡ＝１μｆ
ｌ／威ゾルである。

結合手順は前記（（Ｊ）で記載したものと同じである。

ニトロセルロースストリップ（前記（ｅ）　参照）をＫ
ＬＨ−トマチン（１５００ｎｇ　〜２．Ｏｐ（］）、　
Ｋ　Ｌ　Ｈ−ソラニン（ｔ５００ｎｇ　〜２．０ｐ（１
）及びヤギー抗マウス（１２８０ｎａ〜２．５ｎｇ）で
スポットした。

テスト結果は表２に掲げられている。

（０）　　精製された（たん白質Ａカラム）モノクロー
ナル抗γ−インターフェロン（ＭＤ−２）のコロイドセ
レンへの吸着及び固定化されたヤギー抗マウスＩｇＧの
テスト １、最適な安定化ＭＤ−２濃度及び最適結合ｐＨの決定 濃度依存吸着等温線は、ＭＤ−２についてのＭＰＡがゾ
ル１威当り２２μｇ（１）＋１７．４で）であるという
ことを示す。この濃度でｌ）Ｈ依存吸着等回線を作成し
ておく。最適結合ｐＨは８．０〜９．０の範囲である。

２、ＭＤ−２でラベルされたセレンゾルの調製パラメー
ターは５０ｄの３ｅゾル（ｐＨ８，５）当り１１００μ
ＪのＭＤ　−２：　Ｏ，Ｄ、　５５０ｎｍ　＝０．５で
ある。

精製及び濃縮は前記（ｄ）で記載したように行なわれる
。

ニトロセルロースストリップ（前記（ｅ）　参照）を一
連の希釈（１２８０ｎｇ〜２．５＋）（Ｊ）ヤギー抗マ
ウスＩｇＧでスポットする。

テスト結果は表に掲げられている。

（１））　　ストレストアビジンのコロイドセレンへの
吸着及び固定化されたビオチン複合体のテストパラメー
ターはゾル１ｄ当り１２．５μ９のストレプトアビジン
、ＤＨ６，５である。

精製等は前記（ｄ）参照。

ニトロセルロースストリップを、一連の希釈ビオチン化
されたマウスモノクローナル抗γ−インターフェロンＩ
ＣＪＧ及びビオチン化されていないマウスモノクローナ
ル抗γ−インターフェロンの否定的な対照でスポットす
る。

テスト結果は表２参照。

表　　　　１ 表　　　１　　（続き） 表　　　　２ テスト結果 プローブに結合した種々なセレン、テルル及び☆　　：
抗トマチンＩ（ＪＧ（腹水からのもの）はソラニンと交
差反応性を示す ＫＬ＋−１：キーホールリンペットキャリャーたん白質
（平均分子量５．５００．０００）。

ＭＤ−２：抗γ−インターフェロン抗体（たん白質Ａカ
ラムによって精製されたマウス モノクローナル） アッセイで行なわれた対照は否定的（又はそれらが論理
的である場合肯定的）であった。

検出限界は裸眼による検出を利用する実験で決定された
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特異的に結合するたん白質と対応する結合可能な物
   質との間の反応の１以上の成分を１つのテストサンプル
   で、そのような成分の相互の反応性及びラベルのゾルの
   粒子を成分へ直接的に又は間接的に結合又は吸着するこ
   とによつて得られる少なくとも１つのラベルされた成分
   の相互の反応性を利用して測定する方法であって、反応
   の際又は反応の完結後、場合によっては結合したラベル
   された成分と遊離のラベルされた成分とを分離した後、
   前記テストサンプルで又は分離後に得られたフラクシヨ
   ンの１つでラベルの存在及び／又は量を、測定すべき成
   分の定性的又は定量的指標を得るために適当な方法によ
   つて測定することを含む方法において、非金属元素又は
   金属元素を含まないその無機化合物のゾルを、ラベルす
   るために使用することを特徴とする方法。 ２、前記ラベルされた化合物が、非金属元素又は金属元
   素を含まないその無機化合物のゾルにあらかじめ決めら
   れた量のラベルされるべき成分を加えることによって得
   られ、前記ラベルされるべき成分がゾル粒子を完全に又
   は部分的に被覆し、そして場合によっては次に、不活性
   な極性高分子でさらに被覆することを特徴とする請求項
   第１項の方法。 ３、非金属元素又は金属元素を含まないその無機化合物
   のゾルに該非金属粒子を被覆する１以上の不活性な親水
   性高分子を加えた後、成分を前記被覆物質に吸着によっ
   て又は共有結合によって結合することによって前記ラベ
   ルされた成分を得ることを特徴とする請求項第１項の方
   法。 ４、非金属元素又は金属元素を含まないその無機化合物
   のゾルをモノマーの媒質中に入れ、該モノマーをその場
   で重合又は共重合させ、それによつて前記非金属元素又
   は金属元素を含まないその無機化合物のゾル粒子を被覆
   し、そして次に成分をポリマー物質に吸着又は共有結合
   させることによって前記ラベルされた成分を得ることを
   特徴とする請求項第１項の方法。 ５、前記非金属元素又は金属元素を含まないその無機化
   合物のゾル粒子を最初に親水性高分子によって保護した
   後、無機開始剤によって重合又は共重合させることを特
   徴とする請求項第４項の方法。 ６、セレン、テルル、イオウ、リン、炭素及び／又はケ
   イ素をゾル粒子として使用することを特徴とする請求項
   第１項乃至第５項のいずれか１項の方法。 ７、金属元素を含まないセレン、テルル、リン、イオウ
   及び／又はケイ素の無機化合物をゾル粒子として使用す
   ることを特徴とする請求項第１項乃至第５項のいずれか
   １項の方法。 ８、前記無機化合物が二酸化ケイ素である請求項第７項
   の方法。 ９、測定されるべき成分が細胞の表面に存在する１以上
   の受容体たん白質及び／又は抗原決定基からなることを
   特徴とする請求項第１項乃至第８項のいずれか１項の方
   法。 １０、測定されるべき成分が水性テストサンプル中に存
   在する１以上の免疫学的成分からなることを特徴とする
   請求項第１項乃至第９項のいずれか１項の方法。 １１、前記免疫学的成分がハプテン、抗原又は抗体であ
   る請求項第１０項の方法。 １２、特異的に結合するたん白質と対応する結合可能な
   物質との間の反応のラベルされた成分を、ラベルのゾル
   の粒子を成分に直接的に又は間接的に結合又は吸着する
   ことによつて製造する方法において、非金属元素又は金
   属元素を含まないその無機化合物のゾルを、ラベルする
   ために使用することを特徴とする方法。 １３、セレン、テルル、イオウ、リン、炭素及び／又は
   ケイ素の粒子のゾル又は金属元素を含まないセレン、テ
   ルル、リン、イオウ及び／又はケイ素の無機化合物の粒
   子のゾルを、ラベルするために使用することを特徴とす
   る請求第１２項の方法。 １４、前記無機化合物が二酸化ケイ素である請求項第１
   ３項の方法。 １５、（ａ）非金属元素又は金属元素を含まないその無
   機化合物のゾル粒子をラベルとして含むラベルされた免
   疫成分；及び （ｂ）他の試薬 を含む、水性テストサンプル中の免疫成分を測定するた
   めに使用するテストキット。 １６、非金属元素又は金属元素を含まないその無機化合
   物のゾル粒子をラベルとして含む免疫成分からなるラベ
   ルされた物質。 １７、前記免疫成分がイムノグロブリン、たん白質、ハ
   プテン又は別の高分子有機物質である請求項第１６項の
   ラベルされた物質。 １８、前記高分子有機物質がＤＮＡ又はＲＮＡである請
   求項第１６項のラベルされた物質。