CZ286845B6 - Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů - Google Patents

Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů Download PDF

Info

Publication number
CZ286845B6
CZ286845B6 CZ1995761A CZ76195A CZ286845B6 CZ 286845 B6 CZ286845 B6 CZ 286845B6 CZ 1995761 A CZ1995761 A CZ 1995761A CZ 76195 A CZ76195 A CZ 76195A CZ 286845 B6 CZ286845 B6 CZ 286845B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
proteins
polyelectrolyte
protein
solution
film
Prior art date
Application number
CZ1995761A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ76195A3 (en
Inventor
Eduard Rndr. Csc. Brynda
Milan Ing. Csc. Houska
Original Assignee
Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr filed Critical Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr
Priority to CZ1995761A priority Critical patent/CZ286845B6/cs
Priority to PCT/CZ1996/000010 priority patent/WO1996030409A1/en
Publication of CZ76195A3 publication Critical patent/CZ76195A3/cs
Publication of CZ286845B6 publication Critical patent/CZ286845B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Způsob imobilizace bílkovin rozpustných ve vodných roztocích na povrchu pevných objektů ve formě filmů složených z určeného počtu dvou a více molekulárních vrstev bílkovin, přičemž film může být tvořen více vrstvami jedné bílkoviny nebo vrstvami různých bílkovin v určeném pořadí, charakterizovaném (a) imobilizací bílkoviny na povrch fyzikální adsorpcí nebo chemickou vazbou následovanou (b) střídáním adsorpce polyelektrolytu rozpustného ve vodných roztocích a bílkovin za podmínek kdy se mezi bílkovinou a polyelektrolytem tvoří iontová vazba, jmenovitě při pH roztoku, kdy se polyanionty vážou na bílkoviny pod jejich isoelektrickým bodem nebo kdy se polykationty vážou na bílkoviny nad jejich isoelektrickým bodem a při iontové síle roztoku, kdy nedochází k odstínění přitažlivých elektrostatických sil mezi bílkovinou a polyelektrolytem, za vzniku filmu složeného z alternujících molekulárních vrstev bílkovin a polyelektrolytu, (c) fixací chemickým síťováním mezi reaktivními skupinami bílkovŕ

Description

Způsob imobilizace bílkovin na povrchu pevných objektů
Oblast techniky
Vynález se týká imobilizace bílkovin na povrchu pevných objektů ve formě filmů složených z určeného počtu dvou a více molekulárních vrstev bílkovin, přičemž film může být tvořen více vrstvami jedné bílkoviny nebo vrstvami různých bílkovin v určeném pořadí.
Stav techniky
Systémy využívají bílkoviny imobilizované na povrchu pevných objektů se v současné době uplatňují v řadě oborů, například v lékařství, farmakologii, biotechnologiích atd. (viz Development and Uses of Immobilized Biological Compounds, NATO ASI Ser., Ser.E. 1993, Handbook of Enzyme Biotechnology, Ed., Wisemsn A., Jonh Wiley & Sons, new York, 1987, Immobilized Biosystems, Eds. Veliký J.A., Mclean R.J.C., Blackie: Glasgow, 1994).
Ireversibilní fyzikální adsorpce je používána při imobilizací bílkovin, které dostatečně silně interagují s povrchem. Nevýhodou tohoto způsobuje nestabilnost vrstvy v biologickém prostředí v důsledku postupné výměny adsorbované bílkoviny za bílkoviny z okolního roztoku, které mají větší afinitu k povrchu, a snižování biologické aktivity adsorbované bílkoviny v důsledku silné fyzikální interakce s povrchem (Andrade J. D., Hlady V. L., Van Wagenen R. L., Pure Appl. Chem. 1984;56:1345-1350, Scott F.C., J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1991 ;2:173-181).
Vícevrstvé filmy složené ze střídavých vrstev bílkovin a polyelektrolytů byly získány elektrostatickou adsorpcí elektrolytu na povrchu podložek nesoucích elektrický náboj opačný k náboji polyelektrolytů a následnou střídavou elektrostatickou adsorpcí vrstev molekul bílkoviny opačně nabitých než molekuly polyelektrolytů (Decher, G.; Hong, J.-D.; Schmitt, J. Thin Solid Films, 1992, 210/211, 831, Lvov, Y.; Decher, G.; Sukhorukov, G., Macromolecules, 1993, 26, 5396).
Uvedeným způsobem nelze získat vrstvy složené pouze z bílkovin. Je-li vazba mezi bílkovinou a polyelektrolytem pouze elektrostatická, dochází záměnou vnějšího roztoku za roztok o jiném pH nebo iontové síle (např. při přechodu do fyziologického roztoku) kjejímu rozpadu a rozpuštění vícevrstevného filmu. Stabilní film lze získat použitím polyelektrolytů, který se váže ireversibilně k bílkovině kombinací iontové vazby a fyzikálních interakcí jiného typu. Z takového filmu již nelze odstranit polyelektrolyt. Přítomnost polyelektrolytů může negativně ovlivnit biologickou aktivitu bílkovin ve filmu změnou jejich konformace a vytvářením lokálního pH uvnitř filmu a vést k nežádoucím interakcím s kontaktujícím biologickým prostředím (např. k nespecifické adsorpcí z krevní plazmy a k vyvolání odmítavé reakce organismu).
Nejčastěji používaným způsobem je imobilizace bílkovin prostřednictvím chemické vazby mezi aktivní skupinou na bílkovině (amino, fenol a jiné nukleofilní skupiny) a aktivní skupinou na povrchu podložky (viz Development and Uses of Immobilized Biological Compounds, NATO ASI Ser., Ser.E, 1993, Handbook of Enzyme Biotechnology, Ed., Wisemsn A., John Wiley & Sons, new York, 1987, Immobilized Biosystems, Eds. Veliký J. A., Mclean R.J.C., Blackie: Glasgow, 1994). Historicky nejrozšířenější je vazba na povrchy nesoucí hydroxylové skupiny aktivované bromkyanem. Nevýhodou je nestabilita vazby, iontoměničové vlastnosti aktivovaného povrchu a toxicita používaných činidel. Stabilnější vazbu na hydroxylové skupiny povrchu lze dosáhnout aktivací chloromravenčany. Jiný typ aktivovaných povrchů poskytují materiály nesoucí reaktivní epoxidové skupiny. Nevýhodou jsou vysoké hodnoty pH 9-13 nutné pro aktivaci epoxidů, které často poškozují reagující bílkoviny. Zmíněné postupy jsou využívány pro vazbu bílkovin na hydrogelové podložky z hydrofilních polymerů nesoucích příslušné reaktivní skupiny. Pro praktické aplikace je však v mnoha případech nezbytné nebo výhodnější
-1 CZ 286845 B6 imobilizovat bílkoviny na povrch materiálů nebotnajících vodou a odolných v biologickém prostředí (porézní částice a membrány, dutá vlákna, potrubí, protézy a jiné pevné objekty). Aktivní skupiny se na tyto materiály zavádějí povrchovou úpravou. Povrchy křemíkových materiálů jsou upravovány pomocí silanů (Immobilized Biosystems, Eds. Veliký J.A., Mclean R.J.C., Blackie: Glasgow, 1994).
Povrchy inertních polymerů jsou upravovány drastickými metodami (radiační roubování, plazmový výboj, silná oxidační činidla), které mohou příslušný výrobek poškodit (Polymer Surfaces - from Physics to Technology, Eds. Gackassi F., Mora M., Occhietto E., John Wiley & Sons, new York, 1994). Společnou nevýhodou systémů bílkovin imobilizovaných na aktivních rigidních površích v jedné molekulární vrstvě je snížení aktivity bílkovin v důsledku fyzikální s povrchem a přítomnost nezakrytého povrchu materiálu mezi statisticky navázanými molekulami bílkovin, na kterém dochází k nespecifické adsorpci cizorodých bílkovin z okolního roztoku a aktivaci odmítavých reakcí organismu při použití ve fyziologickém prostředí.
Způsobem imobilizace použitelným na neaktivovaných rigidních površích je jejich mechanické pokrytí silnou vrstvou chemicky síťovaného hydrogelu s inkorporovanou aktivní bílkovinou (Handbook of Enzyme Biotechnology, Ed., Wiseman A., John Wiley & Sons, new York, 1987). Nanesení filmuje však proveditelné pouze na některé typy objektů (nelze jej například aplikovat na porézní materiály). Nevýhodou je špatná adheze silných filmů k podložce pří mechanických kontrakcích způsobených změnou stupně nabotnání filmu. Imobilizace aktivní bílkoviny uvnitř znemožňuje použití těchto systémů jestliže příslušné reagenty nemohou pro svou velikost difundovat do nitra silného síťovaného filmu.
Podstata vynálezu
Předmět vynálezu spočívá ve způsobu imobilizace bílkovin rozpustných ve vodných roztocích na povrchu pevných objektů ve formě filmů složených z určeného počtu dvou a více molekulárních vrstev bílkovin, přičemž film může být tvořen více vrstvami jedné bílkoviny nebo vrstvami různých bílkovin v určeném pořadí, charakterizovaném (a) imobilizací bílkoviny na povrch fyzikální adsorpci nebo chemickou vazbou následovanou (b) střídáním adsorpce polyelektrolytu rozpustného ve vodných roztocích a bílkovin za podmínek, kdy se mezi bílkovinou a polyelektrolytem tvoří iontová vazba, jmenovitě při pH roztoku, kdy se polyanionty vážou na bílkoviny pod jejich isoelektrickým bodem nebo kdy se polykationty vážou na bílkoviny nad jejich isoelektrickým bodem a při iontové síle roztoku, kdy nedochází k odstínění přitažlivých elektrostatických sil mezi bílkovinou a polyelektrolytem, za vzniku filmu složeného z alternujících vrstev bílkovin a polyelektrolytu, (c) fixací chemickým síťováním mezi reaktivními skupinami bílkovin a vícefunkčním síťovadlem, které nereaguje s polyelektrolytem, a (d) vymytím tohoto polyelektrolytu ze síťovaného filmu roztokem, ve kterém se rozpadá iontová vazba mezi bílkovinami a polyelektrolytem, jmenovitě při pH roztoku, kdy bílkoviny nad isoelektrickým bodem odpuzují polyanionty nebo kdy bílkoviny pod isoelektrickým bodem odpuzují polykationty a při iontové síle roztoku, kdy dochází k odstínění přitažlivých elektrostatických sil mezi bílkovinou a polyelektrolytem.
(a) Imobilizace první vrstvy. Monomolekulámí vrstvu bílkoviny lze získat kontaktováním povrchu s vodným roztokem globulámích bílkovin, například albuminu, fibrinogenu, globulinu atd., které se ireversibilně adsorbují prostřednictvím hydrofobní interakce na povrchy materiálů s vysokou volnou energií na rozhraní s vodou, například polymery jako polyolefiny, polyvinylchlorid, fluorované polymery, polystyren, polyestery, silikony, polymetakryláty, polyamidy, acetáty celulózy, polyimidy, polyakrylonitril, polyuretany, polykarbonáty, epoxidové a formaldehydové pryskyřice, přírodní kaučuk, kovy, polovodiče, keramika, grafit nebo kombinací hydrofobní a iontové interakce na hydrofilní pevné povrchy například sklo, křemen, slída. Výhodou je, že fyzikální adsorpce může být prováděna pouhým kontaktováním povrchu
-2CZ 286845 B6 s vodným roztokem bez chemické aktivace povrchu a bílkoviny. Fyzikální adsorpce není zcela ireversibilní na hydrofilních površích. Na těchto materiálech lze vrstvu bílkoviny imobilizovat chemickou vazbou s použitím některé ze známých metod. Adsorpci bílkoviny prostřednictvím iontové interakce lze použít, jestliže iontová vazba je stabilní v průběhu následujícího postupu přípravy vícevrstevného filmu a při závěrečném síťování je vytvořena chemická vazba mezi bílkovinou a povrchem. Polyelektrolyt může být imobilizován fyzikální adsorpci prostřednictvím iontové interakce s povrchem nesoucím elektricky opačně nabité skupiny; polyelektrolyt s reaktivními skupinami může být imobilizována chemickou vazbou na aktivovaném povrchu některou ze známých metod. V obou případech je ovšem nutné, aby bílkovina, která se v dalším postupu adsorbuje na imobilizovaný polyelektrolyt vytvářela chemickou vazbu s aktivními skupinami na povrchu při konečném síťování. Jako pevné podložky může být při tomto postupu použit například kolagen, želatina, síťovaný albumin, fibrin.
(b) Střídavá adsorpce bílkovin a polyelektrolytů. Na první vrstvu molekul imobilizovaných na povrchu se postupně adsorbují další vrstvy střídavým kontaktováním povrchu s roztokem bílkoviny a roztokem polyelektrolytů. Použitím vodných roztoků různých bílkovin, případně různých polyelektrolytů, lze připravit film kde se střídají molekulární vrstvy polyelektrolytů s vrstvami různých bílkovin seřazených v předem navrženém pořadí. Iontová síla a pH v roztocích jsou voleny tak, aby v nich vznikal iontově vázaný komplex mezi bílkovinou a olyelektrolytem, jmenovitě při pH roztoku, kdy se polyanionty vážou na bílkoviny pod jejich isoelektrickým bodem nebo kdy se polykationty vážou na bílkoviny nad jejich isoelektrickým bodem a při iontové síle roztoku, kdy nedochází k odstínění přitažlivých elektrostatických sil mezi bílkovinou a polyelektrolytem, ze vzniku filmu složeného z alternujících molekulárních vrstev bílkovin a polyelektrolytů. Jako polyelektrolyt lze použít ionizované polysacharidy, polypeptidy a syntetické vodorozpustné polymery například polystyrensulfonát, polyvinylsulfonát, sulfonovanou celulózu, kyselinu metakrylovou a její kopolymery, polyglutamáty, polyvinylpyridin, polyioneny.
(c) Chemické síťování je prováděno kontaktováním vícevrstvého filmu svodným roztokem síťovadla (například glutaraldehydu), ve kterém se zachovává iontová vazba mezi vrstvami bílkovin a polyelektrolytů. Síťovadlo tvoří chemickou vazbu mezi reaktivními skupinami molekul bílkovin (amino, fenol ajiné nukleofilní skupiny). Pro většinu aplikací je žádoucí, aby v podmínkách přirozených pro funkci použitých bílkovin došlo ve vrstveném filmu ke zrušení iontové interakce mezi bílkovinou a polyelektrolytem tak, aby bílkovina byla co nejblíže své nativní konformaci a film byl fixován pouze malým stupněm kovalentního síťování. Jsou-li reaktivní skupiny přítomny i v polyelektrolytů (například aminoskupiny v některých polysacharidech nebo syntetických kopolymerech), stává se polyelektrolyt součástí kovalentně vázané sítě.
(d) Vymývání polyelektrolytů. Při použití polyelektrolytů bez aktivních reagujících se síťovadlem se vymytím polyelektrolytů roztokem, ve které dochází k rozpadu iontové vazby mezi bílkovinou a polyelektrolytem, získá kovalentně síťovaný film složený pouze z vrstev bílkovin. Bez kovalentního síťování se film za těchto podmínek rozpouští kromě první molekulární vrstvy bílkoviny adsorbované ireversibilně na pevnou podložku. Je-li to žádoucí, mohou být použity polyelektrolyty obsahující síťovatelné skupiny, které zůstanou imobilizovány ve filmu prostřednictvím kovalentní vazby.
Přednosti navrhovaného postupu, které vytvářejí nový kvalitativní efekt ve srovnání s dosud používanými způsoby imobilizace bílkovin:
Univerzálnost použití: Postup je použitelný na pevné podložky z libovolného materiálu, který není negativně ovlivněn závěrečným chemickým síťováním (syntetické polymerní hmoty, anorganické pevné látky, přírodní organické látky). Materiály (s výjimkou neutrálních vysoce bobtnavých hydrogelů) nemusí být chemicky aktivovány. Proto lze filmy z bílkovin vytvářet na
-3CZ 286845 Β6 hotových výrobcích pouhým kontaktováním jejich povrchů svodnými roztoky. Vzhledem k molekulární povaze procesu lze filmy připravit na povrchu objektů o rozměrech od nanometrů výše s libovolným tvarem, jako jsou součástky přístrojů, potrubí, fólie, vlákna, dutá vlákna, prášky, porézní částice a membrány, koloidní částice atd.
Vícevrstevnost filmu: Na rozdíl od bílkovin imobilizovaných v monomolekulámí vrstvě je vícevrstevný síťovaný film odolnější proti smývání s povrchu a k erozi v biologickém prostředí. Adheze filmu k povrchu je zajišťována mnoha kontaktními vazbami jednotlivých bílkovin u povrchu, které se sice mohou v různých časových okamžicích uvolňovat, ale vzhledem k fixaci bílkovin v makroskopické síti je pravděpodobnost současného uvolnění větší části vazeb nulová. Současně horní vrstvy filmu chrání bílkoviny zajišťující kontakt s povrchem před výměnou za bílkoviny z okolního roztoku, které mají větší afinitu k povrchu. Eroze povrchu vícevrstevného filmu v biologickém prostředí odhaluje níže ležící vrstvy filmu. Film je složen pouze ze zvolených bílkovin a neobsahuje polyelektrolyty, které by negativně ovlivnily jeho vlastnosti. Ve srovnání s mikronovými filmy připravovanými mechanickým nanášením na podložku je tloušťka vícevrstevného molekulárního filmu řádově menší, takže adheze filmu k podložce není podstatně narušena objemovými koncentracemi při různém stupni nabotnání filmu. Molekulární filmy na nebotnavých podložkách mohou být vysušeny a znovu nabotnány před použitím. Vysušením je značně usnadněno skladování a manipulace s hotovými výrobky. Vícevrstevný film z neaktivní bílkoviny (albumin) vytváří dokonalý přechod mezi pevným povrchem a vodnou fází přes vrstvu bílkoviny deformované interakcí s povrchem k povrchové vrstvě imobilizovaných molekul v nativní formě. Takový film minimalizuje mezifázové napětí mezi povrchem a vodou, pasivuje povrch proti nespecifické adsorpci bílkovin a nevyvolává odmítavé reakce organismu. Aktivní molekuly imobilizované na povrchu filmu jsou snadno přístupné pro libovolně velké reagenty.
Složení filmu z vrstev různých bílkovin uspořádaných ve zvoleném pořadí: Vícevrstevný film z albuminu může sloužit jako přirozený podklad pro imobilizaci aktivních bílkovin (protilátek, enzymů a vazebných bílkovin pro buňky) jejichž aktivita není potlačována interakcí s cizím povrchem. Prostřednictvím adsorbovaného albuminu je možno imobilizovat i bílkoviny, které se samy na povrch podložky neadsorbují. Jestliže je antigen nebo substrát pro aktivní bílkovinu schopen migrace přes albuminový film, může být vrstva albuminu imobilizována na povrchu aktivní vrstvy jako ochrana před vlivem fyziologického prostředí. V případě imobilizovaných enzymů je možné uvedeným postupem sestavovat soubory vrstev vzájemně kooperujících enzymů, kde produkt enzymů v jedné vrstvě je substrátem pro enzymy v sousední molekulární vrstvě.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Imobilizace čtyř molekulárních vrstev séra albuminu (SA) na povrchu membrány zacetátu celulózy. (Množství bílkoviny a polyelektrolytu imobilizované na podložce po jednotlivých krocích bylo stanoveno infračervenou reflexní spektroskopií, IR MIRS, umožňující spektrálně rozlišit bílkovinu a polyelektrolyt a vypočítat povrchové koncentrace látek na povrchu podložky).
(1) Adsorpci z 0,1 hmotn. % roztoku SA v 0,05 m roztoku NaCl, HC1, pH 3,0 (roztok NaCl) byla na povrchu membrány získána monomolekulámí vrstva SA obsahující 0,24 pg/cm2.
(2) Omytí povrchu roztokem NaCl.
(3) Na vrstvu SA byl adsorbován polystyrensulfonát sodný (PSS) z 0,1 hmotn. % roztoku PSS v roztoku NaC 1.
-4CZ 286845 B6 (4) Omytí povrchu roztokem NaC 1.
(5) Druhá molekulární vrstva SA byla získána adsorpcí na PSS za stejných podmínek jako v kroku (1). Vrstva obsahovala 0,44 pg/cm2SA.
(7) Třetí a čtvrtá molekulární vrstva, obsahující 0,42 a 0,45 pg/cm2SA, byly získány dvojnásobným opakováním sekvence kroků (2), (3), (4) a (5).
(8) Omytí povrchu roztokem NaC 1.
(9) Síťování filmu před aminoskupiny SA bylo provedeno působením roztoku 0,5 hmotn. % roztoku glutaraldehydu v roztoku NaCl.
(10) Vymytí roztokem NaC 1.
(11) Vymývání 0,1 hmotn. % roztokem SA v roztoku NaCl.
(12) Vymytí destilovanou vodou.
(13) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7,4).
(14) Vymytí destilovanou vodou.
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaraldehydu a PSS. Výsledný síťovaný film obsahoval 1,55 pg/cm2 SA a neobsahoval detekovatelný PSS.
Vliv síťování: Film připravený stejným postupem bez kovalentního síťování, tj. s vypouštěním kroků 8-10, obsahoval po aplikaci kroků 12 a 13 pouze SA v množství 0,24 pg/cm2 odpovídající vrstvě SA adsorbovaného v kroku 1 přímo na povrch podložky.
Příklad 2
Pokrytí teflonu filmem složeným ze tří molekulárních vrstev lidského fibrinogenu (Fb). (Množství bílkoviny a polyelektrolytu imobilizované na podložce po jednotlivých krocích bylo stanoveno IR MIRS).
(1) Adsorpcí z 0,025 hmotn. % roztoku Fb v 0,01 M citrátového pufru pH 4 (pufr) byla na povrchu teflonu získána monomolekulámí vrstva Fb obsahující 0,49 pg/cm2.
(2) Omytí povrchu pufrem.
(3) Na vrstvu Fb byl adsorbován polystyrensulfonát sodný (PSS) z 0,1 hmotn. % roztoku PSS v pufru.
(4) Omytí povrchu pufrem.
(5) Druhá molekulární vrstva Fb byla získána adsorpcí na PSS za stejných podmínek jako v kroku (1). Vrstva 1,37 pg/cm2Fb.
(6) Třetí molekulární vrstva obsahující 1,57 pg/cm2 Fb byla získána opakováním sekvence kroků (2), (3), (4) a (5).
(7) Omytím povrchu pufrem.
(8) Síťování filmu přes aminoskupiny Fb působením 0,5 hmotn. % roztoku glutaraldehydu v pufru.
(9) Vymytí pufrem.
(10) Vymývání 0,025 hmotn. % roztokem Fb v pufru.
(11) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7,4).
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaraldehydu a PSS. Výsledný síťovaný film obsahoval 3,43 pg/cm2Fb.
-5CZ 286845 B6
Příklad 3
Imobilizace tří vrstev γ-globulinu (IgG) na povrchu polyethylenu pokrytém trojnásobnou vrstvou sérum albuminu (SA). (Množství bílkoviny a polyelektrolytů imobilizované na podložce po jednotlivých krocích bylo stanoveno IR MIRS.) (polyethylen/SA-SA-SA-IgG-IgG-IgG) (1) Adsorpcí z 0,1 hmotn. % roztoku SA ve fosfátovém pufru (pH 7,4) byla na povrchu teflonu získána molekulární vrstva SA obsahující 0,2 pg/cm2.
(2) Omytí povrchu destilovanou vodou.
(3) Adsorpce polystyrensulfonátu sodného (PSS) z 0,1 hmotn. % roztoku PSS vcitrátovém pufru (pH 4,2).
(4) Omytí povrchu PB.
(5) Druhá molekulární vrstva SA byla získána adsorpcí z 0,2 hmotn. % roztoku SA v citrátovém pufru (pH 4,2).
(6) Třetí molekulární vrstva SA byla získána opakováním sekvence kroků (4), (3) (5) a (4).
Postupem (1) až (5) bylo na povrchu imobilizováno celkově 1 pg/cm2 SA ve třech molekulárních vrstvách.
(7) Adsorpcí IgG na homí vrstvu PSS z 0,1 hmotn. % roztoku IgG v citrátovém pufru (pH 4,2) byla imobilizována vrstva IgG obsahující 0,52 pg/cm2.
(8) Druhá a třetí molekulární vrstva IgG byly získány dvojnásobným opakováním sekvence kroků (2), (3), (4) a (6).
Celkově bylo na povrchu imobilizováno 2,4 pg/cm2 IgG ve třech molekulárních vrstvách.
(9) Omytí povrchu citrátovým pufrem (pH 4,2).
(10) Síťování filmu přes aminoskupiny SA a globulinu působením 0,5 hmotn. % roztoku glutaraldehydu v citrátovém pufru (pH 4,2).
(11) Vymytí citrátovým pufrem (pH 4,2).
(12) Vymývání 0,1 hmotn. % roztokem IgG v citrátovém pufru (pH 4,2).
(13) Vymytí citrátovým pufrem (pH 4,2).
(14) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7,4).
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaraldehydu a PSS.
Vliv síťování: Film připravený stejným postupem bez kovalentního síťování, tj. s vypuštěním kroků 10-13 obsahoval po aplikaci kroku 14 pouze bílkovinu v množství 0,2 pg/cm2 odpovídající vrstvě SA adsorbovaného v kroku 1 přímo na povrch podložky.
Příklad 4
Trojnásobná vrstva ureázy (U) s ochrannou vrstvou albuminu (SA) na povrchu imobilizovaná na povrchu zlata (Au) pokrytého albuminovým filmem. (Vrstva zlata byla napařena ve vakuu na povrch polystyrénové fólie. Množství bílkoviny a polyelektrolytů imobilizované na podložce po jednotlivých krocích bylo stanoveno IR MIRS.) (Au/SA-SA-U-U-U-SA-SA)
-6CZ 286845 B6 (1) Adsorpcí z 0,1 hmotn. % roztoku SA v citrátovém pufru (pH 3,95) (pufr) byla na povrchu zlata získána monomolekulámí vrstva SA.
(2) Omytí povrchu pufrem.
(3) Na vrstvu SA byl adsorbován polystyrensulfonát sodný (PSS) z 0,1 hmotn. % roztoku PSS v pufru.
(4) Omytí povrchu pufrem.
(5) Druhá molekulární vrstva SA byla získána opakováním sekvence kroků (1), (2), (3) a (4).
(6) Na horní vrstvu PSS byla adsorbována ureáza z 0,1 hmotn. % roztoku U v pufru.
(7) Omytí povrchu pufrem.
V naadsorbované vrstvě bylo imobilizováno 1 pg/cm2U.
(8) Na vrstvu U byl adsorbován PSS z 0,1 hmotn. % roztoku PSS v pufru.
(9) Omytí povrchu citrátovým pufrem.
(10) Druhá a třetí molekulární vrstva U byla získána dvojnásobným opakováním sekvence kroků (6), (7), (8) a (9).
Celkem bylo na povrchu imobilizováno 4,25 pg/cm2 ureázy ve třech molekulárních vrstvách.
(11) Na horní vrstvu PSS byly adsorbovány dvě molekulární vrstvy SA provedením sekvence kroků (1), (2), (3), (4), (1) a (2). Dvě horní vrstvy obsahovaly celkem 0,9 pg/cm2SA.
(12) Síťování filmu přes aminoskupiny SA a U působením 0,5 hmotn. % roztoku glutaraldehydu v pufru.
(13) Vymytí pufrem.
(14) Vymývání 0,1 hmotn. % roztokem SA v pufru.
(13) Vymytí destilovanou vodou.
(15) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7,4).
(16) Vymytí destilovanou vodou.
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaraldehydu a PSS.

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob imobilizace bílkovin rozpustných ve vodných roztocích na povrchu pevných objektů ve formě filmů složených z určeného počtu dvou a více molekulárních vrstev bílkovin, přičemž film může být tvořen více vrstvami jedné bílkoviny nebo vrstvami různých bílkovin v určeném pořadí, vyznačený tím, že zahrnuje kroky (a) imobilizaci bílkoviny na povrch fyzikální adsorpcí nebo chemickou vazbou následovanou (b) střídáním adsorpce polyelektrolytů rozpustného ve vodných roztocích a bílkovin za podmínek, kdy se mezi bílkovinou a polyelektrolytem tvoří iontová vazba, jmenovitě při pH roztoku, kdy se polyanionty vážou na bílkoviny pod jejich isoelektrickým bodem nebo kdy se polykationty vážou na bílkoviny nad jejich isoelektrickým bodem a při iontové síle roztoku, kdy nedochází k odstínění přitažlivých elektrostatických sil mezi bílkovinou a polyelektrolytem, za vzniku filmu složeného z alternujících molekulárních vrstev bílkovin a polyelektrolytů, (c) fixací chemickým síťováním mezi reaktivními skupinami bílkovin a vícefunkčním síťovadlem, které nereaguje s polyelektrolytem, a (d) vymytím tohoto polyelektrolytů ze síťovaného filmu roztokem, ve kterém se rozpadá iontová vazba mezi bílkovinami a polyelektrolytem, jmenovitě při pH roztoku, kdy bílkoviny nad isoelektrickým bodem odpuzují polyanionty nebo kdy bílkoviny pod isoelektrickým bodem odpuzují polykationty a při iontové síle roztoku, kdy dochází k odstínění přitažlivých elektrostatických sil mezi bílkovinou a polyelektrolytem.
CZ1995761A 1995-03-27 1995-03-27 Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů CZ286845B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ1995761A CZ286845B6 (cs) 1995-03-27 1995-03-27 Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů
PCT/CZ1996/000010 WO1996030409A1 (en) 1995-03-27 1996-03-26 Method for immobilisation of proteins and polyelectrolytes on surfaces of solids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ1995761A CZ286845B6 (cs) 1995-03-27 1995-03-27 Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ76195A3 CZ76195A3 (en) 1996-10-16
CZ286845B6 true CZ286845B6 (cs) 2000-07-12

Family

ID=5462202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1995761A CZ286845B6 (cs) 1995-03-27 1995-03-27 Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ286845B6 (cs)
WO (1) WO1996030409A1 (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7101575B2 (en) 1998-03-19 2006-09-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly
DE59914547D1 (de) 1998-07-15 2007-12-20 Max Planck Gesellschaft Polyelektrolythüllen auf biologischen templaten
US8093039B2 (en) 2007-04-10 2012-01-10 The Trustees Of The Stevens Institute Of Technology Surfaces differentially adhesive to eukaryotic cells and non-eukaryotic cells
KR101046337B1 (ko) 2008-06-10 2011-07-05 충남대학교산학협력단 고분자 전해질 다층박막과 마이크로 컨택트 프린팅을이용한 단백질 고정화방법
US20130052653A1 (en) * 2009-11-24 2013-02-28 Argos, Inc. Devices for detection of analytes
US9733242B2 (en) 2012-10-07 2017-08-15 Sevident, Inc. Devices for capturing analyte
US9910040B2 (en) 2012-07-09 2018-03-06 Sevident, Inc. Molecular nets comprising capture agents and linking agents
CN105339791B (zh) * 2013-03-14 2019-02-15 赛维德恩特有限公司 固相上的分子网
GB201904697D0 (en) 2019-04-03 2019-05-15 Vib Vzw Means and methods for single molecule peptide sequencing

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3109123A1 (de) * 1981-03-11 1982-09-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 8000 München Verfahren zur kovalenten immobilisierung von biologischen detoxikationssystemen auf kuenstlichen oberflaechen
DE4141302A1 (de) * 1991-12-14 1993-06-17 Inst Molekularbiologie Ak Traegerfixierte biologisch aktive oder physiologisch wirksame proteine und verfahren zu ihrer herstellung

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996030409A1 (en) 1996-10-03
CZ76195A3 (en) 1996-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5171264A (en) Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5275838A (en) Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6509098B1 (en) Poly(ethylene oxide) coated surfaces
Elbert et al. Surface treatments of polymers for biocompatibility
US5512329A (en) Substrate surface preparation
CA2107683C (en) Immobilization of chemical species in crosslinked matrices
JP3357919B2 (ja) 表面改質法
Plant et al. Phospholipid/alkanethiol bilayers for cell-surface receptor studies by surface plasmon resonance
US5451453A (en) Supports having azlactone-functional surfaces, adduct supports, and methods of preparing both
Brynda et al. Multiple alternating molecular layers of albumin and heparin on solid surfaces
US5405618A (en) Biomosaic polymer obtained by emulsion polymerization of hydrophobic monomers in the presence of bioactive materials
WO1990000887A1 (en) Preparation of polymeric surfaces
JPS63100355A (ja) 光学構造体の表面を処理する方法
WO1992007006A1 (en) A solid surface coated with a hydrophilic outer layer with covalently bonded biopolymers, a method of making such a surface, and a conjugate therefor
CZ286845B6 (cs) Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů
JPS5998138A (ja) 重合体層の形成方法
US5376692A (en) Method of binding using irradiation and product with albumin bound to biomaterials
Brynda et al. Preparation of organized protein multilayers
US4326009A (en) Polymeric particulate carrier
JPH02119937A (ja) アフィニティ分離膜用基材膜とその製造方法
Yavuz et al. Dye affinity hollow fibers for albumin purification
Bergström et al. Microemulsions as reaction media for immobilization of proteins to hydrophilized surfaces
WO1988000237A1 (en) Covalent membranes
Swanson A unique photochemical approach for polymer surface modification
EP0544450A1 (en) Supported Microspheres

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic