CZ76195A3 - Immobilization method of proteins and polyelectrolytes on the surface of solid objects - Google Patents
Immobilization method of proteins and polyelectrolytes on the surface of solid objects Download PDFInfo
- Publication number
- CZ76195A3 CZ76195A3 CZ95761A CZ76195A CZ76195A3 CZ 76195 A3 CZ76195 A3 CZ 76195A3 CZ 95761 A CZ95761 A CZ 95761A CZ 76195 A CZ76195 A CZ 76195A CZ 76195 A3 CZ76195 A3 CZ 76195A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polyelectrolytes
- protein
- proteins
- polyelectrolyte
- film
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Název Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů-—as: povrchu pevných objektůMethod of immobilization of proteins and polyelectrolytes - as : surface of solid objects
Oblast technikyTechnical field
Vynález se týká imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů ve formě filmů složených z molekulárních vrstev bílkovin a polyelektrolytů uspořádaných podle volitelné architektury .The invention relates to the immobilization of proteins and polyelectrolytes on the surface of solid objects in the form of films composed of molecular layers of protein and polyelectrolytes arranged according to an optional architecture.
Stav technikvStav technikv
Systémy využívající bílkoviny imobilizované na povrchu pevných objektů se v současné dobé uplatňují v řadě oborů, například v lékařství, farmakologii, biotechnologiích atd. Irevesibilní fyzikální adsorpce je používána při imobilizaci bíkovin, které dostatečně silně interagují s povrchem. Nevýhodou tohoto způsobu je nestabilnost vrstvy v biologickém prostředí v důsledku postupné výměny adsorbované bílkoviny za bílkoviny z okolního roztoku, které mají větší afinitu k povrchu, a snižování biologické aktivity adsorbované bílkoviny v důsledku silné fyzikální interakce s povrchem. Nejčastěji používaným způsobem je imobilizace prostřednictvím chemické vazby mezi aktivní skupinou na bílkovině (amino, fenol a jiné nukleofilní skupiny) a aktivní skupinou na povrchu podložky.Systems using proteins immobilized on the surface of solid objects are currently used in a variety of fields, such as medicine, pharmacology, biotechnology, etc. Irreversible physical adsorption is used to immobilize protein that interacts strongly with the surface. The disadvantage of this method is the instability of the layer in the biological environment due to the gradual exchange of the adsorbed protein for proteins from the surrounding solution, which have a greater affinity for the surface, and a decrease in the biological activity of the adsorbed protein due to strong physical interaction with the surface. The most commonly used method is immobilization through chemical bonding between the active group on the protein (amino, phenol and other nucleophilic groups) and the active group on the surface of the support.
Historicky nejrozsířenějsi je vazba na povrchy nesoucí hydroxylové skupiny aktivované bromkyanem. Nevýhodou je nestabilita vazby, iontoměničové vlastnosti aktivovaného povrchu a toxicita používaných činidel. Stabilnější vazbu na hydroxylové skupiny povrchu lze dosáhnout aktivací chloromravenčany. Jiný typ aktivních povrchů poskytují materiály nesoucí reaktivní epoxydové skupiny. Nevýhodou jsou vysoké hodnoty pH 9-13 nutné pro aktivaci epoxydů, které často poškozují reagující bílkoviny.Binding to cyanogen bromide-activated hydroxyl-bearing surfaces is historically most widespread. The disadvantage is the instability of the bond, the ion exchange properties of the activated surface and the toxicity of the reagents used. More stable bonding to the hydroxyl groups of the surface can be achieved by activating chloroformates. Another type of active surface is provided by materials carrying reactive epoxy groups. The disadvantage is the high pH values of 9-13 required for the activation of epoxyids, which often damage the reacting proteins.
Zmíněné postupy jsou využívány pro vazbu bílkovin na hydrogelové podložky z hydrofilních polymeru nesoucích příslušné reaktivní skupiny. Pro praktické aplikace je však '-z mnoha případech nezbytné nebo výhodnější imobilizovat bílkoviny na povrch materiálu nebotnajících vodou a odolných v biologickém prostředí (porézní částice a membrány, dutá vlákna, potrubí, protézy a jiné pevné objekty). Aktivní skupiny se na tyto materiály zavádějí povrchovou úpravou. Povrchy křemíkových materiálů jsou upravovány pomocí chlorosilanú. Povrchy inertních polymeru jsou upravovány drastickými metodami (radiační roubování, plasmový výboj, silná oxidační činidla), které mohou příslušný výrobek poškodit.Said processes are used to bind proteins to hydrogel substrates of hydrophilic polymers bearing the respective reactive groups. For practical applications, however, in many cases it is necessary or preferable to immobilize proteins to the surface of a non-water-swellable and bio-resistant material (porous particles and membranes, hollow fibers, pipes, prostheses and other solid objects). The active groups are introduced by surface treatment of these materials. The surfaces of silicon materials are treated with chlorosilane. The surfaces of inert polymers are treated by drastic methods (radiation grafting, plasma discharge, strong oxidizing agents) that can damage the product.
Společnou nevýhodou systémů bílkovin imobilizovaných na aktivovaných rigidních površích je snížení aktivity bílkovin v důsledku fyzikální interakce s povrchem a přítomnost nezakrytého povrchu materiálu mezi statisticky navázanými molekulami bílkovin, na kterém dochází k nespecifické adsorpci cizorodých bílkovin z okolního roztoku a k aktivaci odmítavých reakcí organismu při použití ve fyziologickém prostředí.A common disadvantage of protein systems immobilized on activated rigid surfaces is the decrease in protein activity due to physical surface interaction and the presence of uncovered surface material between statistically bound protein molecules, which causes non-specific adsorption of foreign proteins from the surrounding solution and activation of rejection reactions when used in physiological environment.
Způsobem imobilizace použitelným na neaktivovaných rigidních površích je jejich mechanické pokrytí tlustou vrstvou chemicky síťovaného hydrogelu, obvykle albuminu s inkorporovanou aktivní bílkovinou. Nanesení filmu je však proveditelné pouze na některé typy objektů (nelze jej například aplikovat na porésní materiály) . Nevýhodou je špatná adhese tlustých filmů k podložce při mechanických kontrakcích způsobených změnou stupně nabotnání filmu. Imobilizace aktivní bílkoviny uvnitř filmu znemožňuje použití těchto systémů jestliže příslušné reagenty nemohou pro svou velikost difundovat do nitra tlustého síťovaného filmu.The method of immobilization applicable to non-activated rigid surfaces is to mechanically coat them with a thick layer of chemically crosslinked hydrogel, usually albumin with incorporated active protein. However, film application is only feasible on certain types of objects (for example, it cannot be applied to porous materials). A disadvantage is the poor adhesion of the thick films to the substrate during mechanical contractions caused by the change in the degree of swelling of the film. The immobilization of the active protein within the film makes it impossible to use these systems if the respective reagents cannot diffuse into the interior of the thick crosslinked film due to their size.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Předmět vynálezu spočívá ve způsobu imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektu ve formě filmů složených z molekulárních vrstev bílkovin a polyelektrolytů uspořádaných podle volitelné architektury postupem charakterizovaným (a) imobilizací bílkoviny nebo polyelektrolytů na povrch fyzikální adsorpci nebo chemickou vazbou následovanou (b) střídáním adsorpce bílkoví·', a polyelektrolytu za podmínek, kdy vzniká iontová vazba mezi bílkovinou a polyelektrolytem, čímž je na povrchu vytvořen film složený z alternujících molekul bílkovin a polyelektrolytu, která je následné (c) fixována chemickým síťováním mezi aktivními skupinami bílkovin, případně i polyelektrolytu; (d) výsledný film neobsahující polyelektrolyt může být získán použitím polyelektrolytu bez chemických skupin reagujících se síťovadlem a vymytím tohoto polyektrolytu ze síťovaného filmu roztokem, ve kterém se rozpadá iontová vazba mezi bílkovinou a polyelektrolytem.The present invention relates to a method of immobilizing proteins and polyelectrolytes on a solid object surface in the form of films composed of molecular layers of protein and polyelectrolytes arranged according to an optional architecture by a process characterized by (a) immobilizing the protein or polyelectrolytes to the surface by physical adsorption or chemical bonding followed by (b) alternating protein adsorption And the polyelectrolyte under conditions that form an ionic bond between the protein and the polyelectrolyte, thereby forming a film on the surface consisting of alternating protein molecules and a polyelectrolyte which is subsequently (c) fixed by chemical crosslinking between the active groups of the protein or polyelectrolyte; (d) the resulting polyelectrolyte-free film can be obtained by using a polyelectrolyte without chemical groups reacting with the crosslinker and washing the polyelectrolyte from the crosslinked film with a solution in which the ionic bond between the protein and the polyelectrolyte disintegrates.
(a) Imobilizace první vrstvy. Monomolekulární vrstvu bílkoviny lze získat kontaktováním povrchu s vodným roztokem globulárních bílkovin například albuminu, fibrinogenu, globulinu atd., které se ireversibilně adsorbují prostřednictvím hydrofobní interakce na povrchy materiálů s vysokou volnou energií na rozhraní s vodou například polymery jako polyolefiny, polyvinylchlorid, fluorované polymery, polystyren, polyestery, silikony, polymetakrylaty, polyamidy, acetáty celulózy, polyimidy, polyakrylonitril, polyuretany, polykarbonáty, epoxidové a formaldehydové pryskyřice, přírodní kaučuk, kovy, polovodiče, keramika, grafit nebo kombinací hydrofobní a iontové interakce na hydrofilní pevné povrchy například sklo, křemen, slída. Výhodou je, že fyzikální adsorpce může být prováděna pouhým kontaktováním povrchu s vodným roztokem bez chemické aktivace povrchu a bílkoviny. Fyzikální adsorpce není ireversibilní na neutrálních hydrogelech složených z pohyblivých polymerních řetězců jako například cuprofan, polyhydroxyalkyl-akryláty a metakryláty, polyakryláty, agaróza, sepharoza, polyakrylamid. Na těchto materiálech lze první vrstvu bílkoviny imobilizovat chemickou vazbou s použitím některé ze známých metod. Adsorpci bílkoviny prostřednictvím iontové interakce lze použít jestliže iontová vazba je stabilní v průběhu následujícího postupu přípravy vícevrstevného filmu a při závěrečném síťování je vytvořena chemická vazba mezi bílkovinou a povrchem. Polyelektrolyt muže být imobilizován fyzikální adsorpci prostřednictvím iontové interakce s povrchem nesoucím elektricky opačně nabité skupiny; polyelektrolyt s reaktivními skupinami muže být imobilizován chemickou vazbou na aktivovaném povrchu některou ze známých metod. V obou případech je ovšem nutné, aby bílkovina, která se v dalším postupu adsorbuje na imobilizovaný polyelektrolyt vytvářela chemickou vazbu s aktivními skupinami na povrchu při konečném síťování. Jako pevné podložky může být při tomto postupu použit například kolagen, želatina, síťovaný albumin, fibrin.(a) Immobilizing the first layer. A monomolecular layer of protein can be obtained by contacting the surface with an aqueous solution of globular proteins such as albumin, fibrinogen, globulin, etc., which are irreversibly adsorbed through hydrophobic interaction on surfaces of high free energy materials at the water interface e.g. polyolefins, polyvinyl chloride, fluorinated polymers, polystyrene , polyesters, silicones, polymethacrylates, polyamides, cellulose acetates, polyimides, polyacrylonitrile, polyurethanes, polycarbonates, epoxy and formaldehyde resins, natural rubber, metals, semiconductors, ceramics, graphite or combinations of hydrophobic and ionic interactions on hydrophilic solid surfaces such as glass, mica. The advantage is that physical adsorption can be accomplished by simply contacting the surface with an aqueous solution without chemical activation of the surface and protein. Physical adsorption is not irreversible on neutral hydrogels composed of movable polymer chains such as cuprofan, polyhydroxyalkyl acrylates and methacrylates, polyacrylates, agarose, sepharose, polyacrylamide. On these materials, the first layer of protein can be immobilized by chemical bonding using any of the known methods. Protein adsorption through ionic interaction can be used if the ionic bond is stable during the following multilayer film preparation process and the final crosslinking produces a chemical bond between the protein and the surface. The polyelectrolyte may be immobilized by physical adsorption through ionic interaction with a surface carrying electrically oppositely charged groups; the polyelectrolyte with reactive groups can be immobilized by chemical bonding on the activated surface by any of the known methods. In both cases, however, it is necessary that the protein, which is further adsorbed to the immobilized polyelectrolyte, forms a chemical bond with the active groups on the surface during the final crosslinking. For example, collagen, gelatin, cross-linked albumin, fibrin can be used as solid supports in this process.
(b) Střídavá adsorpce bílkovin a polyelektrolytů. Na první vrstvu molekul imobilizovaných na povrchu se postupně adsorbují další vrstvy střídavým kontaktováním povrchu s roztokem bílkoviny a roztokem polyelektrolytů. Použitím vodných roztoků různých bílkovin, případně různých polyelektrolytů, lze připravit film kde se střídají molekulární vrstvy polyelektrolytů s vrstvami různých bílkovin seřazených v předem navrženém pořadí. Iontová síla a pH v roztocích jsou voleny tak, aby v nich vznikal iontově vázaný komplex mezi bílkovinou a polyelektrolytem. Ve vícevrstevném filmu je pak vždy molekulární vrstva polyelektrolytů spojnicí mezi sousedními vrstvami bílkovin. Jako polyelektrolyt lze použít polysacharidy, polypeptidy a syntetické vodorozpustné polymery například polystyrensulfonát, polyvinylsulfonát, sulfonovanou celulózu, kyselinu metakrylovou a její kopolymery, polyglutamáty, polyvinylpyridin, polyioneny.(b) Alternating adsorption of proteins and polyelectrolytes. Additional layers are gradually adsorbed onto the first layer of molecules immobilized on the surface by alternately contacting the surface with a protein solution and a polyelectrolyte solution. By using aqueous solutions of different proteins or different polyelectrolytes, a film can be prepared where the molecular layers of the polyelectrolytes alternate with the layers of different proteins lined up in a predetermined order. The ionic strength and pH in the solutions are selected to form an ion-bound complex between the protein and the polyelectrolyte. In a multilayer film, the molecular layer of polyelectrolytes is always the link between adjacent layers of protein. Polysaccharides, polypeptides and synthetic water-soluble polymers such as polystyrene sulfonate, polyvinyl sulfonate, sulfonated cellulose, methacrylic acid and its copolymers, polyglutamates, polyvinylpyridine, polyionenes can be used as the polyelectrolyte.
(c) Chemické síťování je prováděno kontaktováním vícevrstevného filmu s vodným roztokem síťovadla (například glutaraldehydu), ve kterém se zachovává iontová vazba mezi vrstvami bílkovin a polyelektrolytů. Síťovadlo tvoří chemickou vazbu mezi reaktivními skupinami molekul bílkovin (amino, fenol a jiné nukleofilní skupiny). Pro většinu aplikací je žádoucí, aby v podmínkách přirozených pro funkci použitých bílkovin došlo ve vrstevném filmu ke zrušení iontové interakce mezi bílkovinou a polyelektrolytem tak, aby bílkovina byla co nejblíže své nativní konformaci a film byl fixován pouze malým stupněm kovalentního síťování. Jsou-li reaktivní skupiny přítomny i v polyelektrolytů (například aminoskupiny v některých polysacharidech nebo syntetických kopolymerech), stává se polyelektrolyt součástí kovalentně vázané sítě.(c) Chemical crosslinking is accomplished by contacting the multilayer film with an aqueous crosslinker solution (e.g., glutaraldehyde) in which the ionic bond between the protein and polyelectrolyte layers is maintained. The crosslinker forms a chemical bond between the reactive groups of protein molecules (amino, phenol, and other nucleophilic groups). For most applications, it is desirable that, under conditions natural to the function of the proteins used, the ionic interaction between the protein and the polyelectrolyte in the layer film should be abolished so that the protein is as close as possible to its native conformation and fixed only by a small degree of covalent crosslinking. When reactive groups are also present in polyelectrolytes (e.g., amino groups in some polysaccharides or synthetic copolymers), the polyelectrolyte becomes part of a covalently bonded network.
(d) Vymývání polyelektrolytu. Při použití polyelektrolytu bez aktivních skupin reagujících se sítovadlem je možné získat kovalentně síťovaný film složený pouze z vrstev bílkovin vymytím polyelektrolytu roztokem, ve kterém dochází k rozpuštění iontové mezi bílkovinou a polyelektrolytem. Přítomnost polyelektrolytu může v některých případech ovlivnit konformaci bílkovin vytvářením lokálního pH uvnitř filmu. Je-li to žádoucí, mohou být použity polyelektrolyty obsahující sítovatelné skupiny, které zůstanou zmobilizovány ve filmu prostřednictvím kovalentní vazby. Přednosti navrhovaného postupu, které vytvářejí nový kvalitativní efekt ve srovnání s dosud používanými způsoby imobilizace bílkovin a polyelektrolytů:(d) Elution of the polyelectrolyte. When using a polyelectrolyte without crosslinker reactive groups, it is possible to obtain a covalently crosslinked film composed of protein layers only by washing the polyelectrolyte with a solution in which ionic dissolution occurs between the protein and the polyelectrolyte. The presence of polyelectrolyte may in some cases affect protein conformation by creating a local pH within the film. If desired, polyelectrolytes containing crosslinkable groups can be used, which remain mobilized in the film via a covalent bond. Advantages of the proposed process, which create a new quality effect compared to the methods used to immobilize proteins and polyelectrolytes hitherto used:
Univerzálnost použití. Postup je použitelný na pevné podložky z libovolného materiálu, který není negativně ovlivněn závěrečným chemickým síťováním (syntetické polymerní hmoty, anorganické pevné látky, přírodní organické látky). Materiály (s výjimkou neutrálních hydrogelů) nemusí být chemicky aktivovány. Proto lze bílkovinové filmy vytvářet na hotových výrobcích pouhým kontaktováním jejich povrchů s vodnými roztoky. Vzhledem k molekulární povaze procesu lze filmy připravit na povrchu objektů o rozměrech od nanometrů výše s libovolným tvarem, jako jsou součástky přístrojů, potrubí, folie, vlákna, dutá vlákna, prášky, porézní částice a membrány, koloidní částice atd.Versatility of use. The process is applicable to solid substrates of any material that is not adversely affected by chemical cross-linking (synthetic polymer masses, inorganic solids, natural organic substances). Materials (except neutral hydrogels) need not be chemically activated. Therefore, protein films can be produced on finished products by simply contacting their surfaces with aqueous solutions. Due to the molecular nature of the process, films can be prepared on the surface of objects measuring nanometer upwards with any shape, such as instrument parts, pipes, foils, fibers, hollow fibers, powders, porous particles and membranes, colloidal particles, etc.
Vicevrstevnost filmu. Na rozdíl od bílkovin imobilizovaných v monomolekulární vrstvě je vícevrstevný síťovaný film odolný proti smývání s povrchu a k erozi v biologickém prostředí. Adheze filmu k povrchu je zajišťována mnoha kontaktními vazbami jednotlivých bílkovin u povrchu, které se sice mohou v různých časových okamžicích uvolňovat, ale vzhledem k fixaci bílkovin v makroskopické síti je pravděpodobnost současného uvolnění větší části vazeb nulová. Současně horní vrstvy filmu chrání bílkoviny zajišťující kontakt s povrchem před výměnou za bílkoviny z okolního roztoku, které mají větší afinitu k povrchu. Eroze povrchu vícevrstevného filmu v biologickém prostředí odhaluje níže ležící vrstvy filmu. Ve srovnání s mikronovými filmy připravovanými mechanickým nanášením na podložku je tloušťka vícevrstevného molekulárního filmu řádově menší takže adhese filmu k podložce není podstatně narušena objemovými kontrakcemi při různém stupni nabotnání filmu. Molekulární filmy na nebocnavých podložkách mohou být vysušeny a znovu nabotnány před použitím. Vysušením je značně usnadněno skladování a manipulace s hotovými výrobky. Vícevrstevný film z neaktivní bílkoviny (albumin) vytváří dokonalý přechod mezi pevným povrchem a vodnou fází přes vrstvu bílkoviny deformované interakcí s povrchem k povrchové vrstvě imobilizovaných molekul v nativní formě. Takový film minimalizuje mezifázové napětí mezi povrchem a vodou, pasivuje povrch proti nespecifické adsorpci bílkovin a nevyvolává odmítavé reakce organismu. Aktivní molekuly imobilizované na povrchu filmu jsou snadno přístupné pro libovolně velké reagenty. Složení filmu z vrstev různých bílkovin a polyelektrolytů uspořádaných ve zvoleném pořadí. Vícevrstevný film z albuminu může sloužit jako přirozený podklad pro imobilizaci aktivních bílkovin (protilátek, enzymů a vazebných bílkovin pro buňky) jejichž aktivita není potlačována interakcí s cizím povrchem. Prostřednictvím adsorbovaného albuminu je možno imobilizovat i bílkoviny, které se sami na povrch podložky neadsorbují. Jestliže je antigen nebo substrát pro aktivní bílkovinu schopen migrace přes albuminový film, může být vrstva albuminu imobilizována na povrchu aktivní vrstvy jako ochrana před vlivem fyziologického prostředí. V případě imobilizovaných enzymů je možné uvedeným postupem sestavovat soubory vrstev vzájemně kooperujících enzymů, kde produkt enzymů v jedné vrstvě je substrátem pro enzymy v sousední molekulární vrstvě.The film's multilayered character. Unlike proteins immobilized in the monomolecular layer, the multilayer crosslinked film is resistant to surface wash and erosion in the biological environment. Adhesion of the film to the surface is ensured by many contact bonds of individual proteins at the surface, which may be released at different times, but due to the fixation of the proteins in the macroscopic network, the probability of simultaneous release of most of the bonds is zero. At the same time, the topsheets of the film protect the proteins ensuring contact with the surface from being exchanged for proteins from the surrounding solution having greater affinity for the surface. The erosion of the surface of the multilayer film in the biological environment reveals the underlying layers of the film. Compared to micron films prepared by mechanical coating on a support, the thickness of the multilayered molecular film is of the order of magnitude less, so that the adhesion of the film to the support is not substantially impaired by volume contractions at different degrees of film swelling. Molecular films on non-swellable substrates can be dried and re-swollen prior to use. Drying greatly facilitates the storage and handling of finished products. The multilayered film of inactive protein (albumin) creates a perfect transition between the solid surface and the aqueous phase through a layer of protein deformed by interaction with the surface to the surface layer of immobilized molecules in native form. Such a film minimizes the interfacial tension between surface and water, passivates the surface against non-specific protein adsorption, and does not elicit negative organism reactions. Active molecules immobilized on the surface of the film are readily accessible to any size reagent. Film composition of layers of different proteins and polyelectrolytes arranged in a selected order. The multilayered albumin film can serve as a natural substrate for the immobilization of active proteins (antibodies, enzymes and cell binding proteins) whose activity is not inhibited by interaction with a foreign surface. By adsorbed albumin it is also possible to immobilize proteins that do not adsorb themselves to the surface of the substrate. If the antigen or substrate for the active protein is capable of migration through an albumin film, the albumin layer may be immobilized on the surface of the active layer as protection from the effects of the physiological environment. In the case of immobilized enzymes, it is possible by this procedure to assemble layers of mutually cooperating enzymes, wherein the enzyme product in one layer is a substrate for enzymes in the adjacent molecular layer.
Příklady provedení vvnálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Příklad 1Example 1
Imobilizace čtyř molekulárních vrstev sérum albuminu (SA) na povrchu membrány z acetátu celulózy.Immobilization of four molecular serum serum albumin (SA) layers on cellulose acetate membrane surface.
(1) Adsorpci z 0.1 hmot.% roztoku SA v 0.05 M roztoku NaCI, HCl, pH 3.0 (roztok NaCI) byla na povrchu membrány získána monomolekulární vrstva SA obsahující 0.24 pg/cm2.(1) Adsorption of 0.1 wt% SA solution in 0.05 M NaCl, HCl, pH 3.0 (NaCl solution) resulted in a monomolecular SA layer containing 0.24 pg / cm 2 on the membrane surface.
(2) Omytí povrchu roztokem NaCI.(2) Surface washing with NaCl solution.
(3) Na vrstvu SA byl adsorbován polystyrensulfonát sodný (PSS) ς o.l hmot.% roztoku PSS v roztoku NaCI.(3) Sodium polystyrene sulphonate (PSS) 0% by weight of the PSS solution in NaCl solution was adsorbed onto the SA layer.
(4) Omytí povrcni; ^oztokem NaCI.(4) Wash the surfaces; NaCl solution.
(5) Druhá molekulární vrstva SA byla získána absorpcí na PSS za stejných podmínek jako v kroku (1). Vrstva obsahovala 0.44 pg/cm2 SA.(5) The second molecular layer SA was obtained by absorption on PSS under the same conditions as in step (1). The layer contained 0.44 pg / cm 2 SA.
(6) Třetí a čtvrtá molekulární vrstva, obsahující 0.42 a 0.45 pg/cm2 SA, byly získány dvojnásobným opakováním sekvence kroků (2), (3), (4) a (5).(6) The third and fourth molecular layers, containing 0.42 and 0.45 pg / cm 2 SA, were obtained by repeating the sequence of steps (2), (3), (4) and (5) twice.
(7) Omytí povrchu roztokem NaCI.(7) Surface washing with NaCl solution.
(8) Síťování filmu přes aminoskupiny SA bylo provedeno působením roztoku 0.5 hmot.% roztoku glutaraldehydu v roztoku NaCI.(8) Crosslinking of the film through the amino groups SA was accomplished by treatment with a 0.5 wt% solution of glutaraldehyde in NaCl solution.
(9) Vymytí roztokem NaCI.(9) Wash with NaCl solution.
(10) Vymývání 0.1 hmot.% roztokem SA v roztoku NaCI.(10) Elution with 0.1 wt% SA solution in NaCl solution.
(11) Vymytí destilovanou vodou.(11) Wash with distilled water.
(12) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7.4).(12) Wash with phosphate buffer (pH 7.4).
(13) Vymytí destilovanou vodou.(13) Wash with distilled water.
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaraldehydu a PSS. Výsledný síťovaný film obsahoval 1.55 pg/cm2 SA.The residual unreacted glutaraldehyde and PSS were removed from the film by washing. The resulting crosslinked film contained 1.55 pg / cm 2 SA.
Příklad 2Example 2
Pokrytí teflonu filmem složeným ze tří molekulárních vrstev lidského fibrinogenu (Fb).Teflon coating with a film composed of three molecular layers of human fibrinogen (Fb).
(1) Adsorpcí z 0.025 hmot.% roztoku Fb v 0.01 M citrátovém pufru pH 4 (pufr) byla na povrchu teflonu získána monomolekulární vrstva Fb obsahující 0.49 pg/cm2.(1) By adsorption of 0.025 wt% Fb solution in 0.01 M citrate buffer pH 4 (buffer), a monomeric layer of Fb containing 0.49 pg / cm 2 was obtained on the surface of teflon.
(2) Omytí povrchu pufrem.(2) Washing the surface with buffer.
(3) Na vrstvu Fb byl adsorbován polystyrensulfonát sodný (PSS) z 0.1 hmot.% roztoku PSS v pufru.(3) Sodium polystyrene sulfonate (PSS) from a 0.1 wt% solution of PSS in buffer was adsorbed onto layer Fb.
(4) Omytí povrchu pufrem.(4) Washing the surface with buffer.
(5) Druhá molekulární vrstva Fb byla získána adsorpcí na PSS za stejných podmínek jako v kroku (1). Vrstva obsahovala 1.37pg/cm2 Fb.(5) The second molecular layer Fb was obtained by adsorption to PSS under the same conditions as in step (1). The layer contained 1.37pg / cm 2 Fb.
(6) Třetí molekulární vrstva obsahující 1.57 pg/cm2 Fb byla získána opakováním sekvence kroku (2), (3), (4) a (5).(6) A third molecular layer containing 1.57 pg / cm 2 Fb was obtained by repeating the sequence of steps (2), (3), (4) and (5).
(7) Omytí povrchu pufrem.(7) Washing the surface with buffer.
(3) Síťování filmu přes aminoskupiny Fb působením 0.5 hmot.% roztoku glutaraldehydu v pufru.(3) Crosslinking of the film through amino groups Fb by treatment with a 0.5 wt.% Solution of glutaraldehyde in buffer.
(9) Vymytí pufrem.(9) Wash with buffer.
(10) Vymývání 0.025 hmot.% roztokem Fb v pufru.(10) Elution with 0.025 wt% Fb solution in buffer.
(11) Vymytí destilovanou vodou.(11) Wash with distilled water.
(12) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7.4).(12) Wash with phosphate buffer (pH 7.4).
(13) Vymytí destilovanou vodou.(13) Wash with distilled water.
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaraldehydu a PSS. Výsledný síťovaný film obsahoval 3.43 pg/cm2 Fb.The residual unreacted glutaraldehyde and PSS were removed from the film by washing. The resulting crosslinked film contained 3.43 pg / cm 2 Fb.
Příklad 3Example 3
Imobilizace tří vrstev γ-globulinu (IgG) na povrchu polyethylenu pokrytém trojnásobnou vrstvou sérum albuminu (SA).Immobilization of three layers of γ-globulin (IgG) on the surface of polyethylene covered with triple layer serum albumin (SA).
(polyethylen/SA-SA-SA-IgG-IgG-IgG) (1) Adsorpcí z 0.1 hmot.% roztoku SA ve fosfátovém pufru (pH 7.3) (pufr) byla na povrchu teflonu získána molekulární vrstva SA.(polyethylene / SA-SA-SA-IgG-IgG-IgG) (1) Adsorption of a 0.1 wt% SA solution in phosphate buffer (pH 7.3) (buffer) yielded a molecular layer of SA on the surface of the Teflon.
(2) Omytí povrchu destilovanou vodou.(2) Washing the surface with distilled water.
(3) Adsorpce polystyrensulfonátu sodného (PSS) z 0.1 hmot.% roztoku PSS v citrátovém pufru (pH 4.2).(3) Adsorption of sodium polystyrene sulfonate (PSS) from a 0.1 wt% solution of PSS in citrate buffer (pH 4.2).
(4) Omytí povrchu pufrem.(4) Washing the surface with buffer.
(5) Druhá molekulární vrstva SA byla získána adsorpcí z 0.2 hmot.% roztoku SA v citrátovém pufru (pH 4.2) (6) Třetí molekulární vrstva SA byla získána opakováním sekvence kroků (4), (3), (5) a (4).(5) The second molecular layer of SA was obtained by adsorption of a 0.2 wt% solution of SA in citrate buffer (pH 4.2). (6) The third molecular layer of SA was obtained by repeating the sequence of steps (4), (3), (5) and (4). ).
Postupem (1) až (5) bylo na povrchu imobilizováno celkově 1 pg/cm2 SA ve třech molekulárních vrstvách.A total of 1 µg / cm 2 SA was immobilized on the surface in three molecular layers by steps (1) to (5).
(7) Adsorpcí IgG na horní vrstvu PSS z 0.1 hmot.% roztoku IgG v citrátovém pufru (pH 4.2) byla imobilizována vrstva IgG obsahující 0.52 pg/cm2.(7) An IgG layer containing 0.52 pg / cm 2 was immobilized by adsorption of IgG to the top layer of PSS from a 0.1 wt% IgG solution in citrate buffer (pH 4.2).
(8) Druhá a třetí molekulární vrstva IgG byly získány dvojnásobným opakováním sekvence kroků (2), (3), (4) a (6).(8) The second and third molecular layers of IgG were obtained by repeating the sequence of steps (2), (3), (4) and (6) twice.
Celkově bylo na povrchu imobilizováno 2.4 pg/cm2 IgG ve třech molekulárních vrstvách.Overall, 2.4 µg / cm 2 IgG was immobilized on the surface in three molecular layers.
(9) Omytí povrchu pufrem.(9) Washing the surface with buffer.
(10) Síťování fiLmu přes aminoskupiny SA a globulinu působením(10) Crosslinking of fiLm via amino groups SA and globulin by action
0.5 hmot.% roztoku glutaraldehydu v pufru.0.5 wt.% Glutaraldehyde solution in buffer.
(11) Vymytí pufrem.(11) Wash with buffer.
(12) Vymývání 0.1 hmot.% roztokem IgG v pufru.(12) Elution with 0.1 wt% IgG solution in buffer.
(13) Vymytí destilovanou vodou.(13) Wash with distilled water.
(14) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7.4).(14) Wash with phosphate buffer (pH 7.4).
(10) Vymytí destilovanou vodou. I(10) Wash with distilled water. AND
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaralb dehydu a PSS.Remnants of unreacted glutaralb dehyde and PSS were removed from the film by washing.
Příklad 4Example 4
Trojnásobná vrstva ureázy (U) s ochrannou vrstvou albuminu (SA) na povrchu imobilizovaná na povrchu zlata (Au) pokrytého albuminovým filmem.A triple layer of urease (U) with a protective layer of albumin (SA) on the surface immobilized on the surface of gold (Au) covered with albumin film.
(Au/SA-SA-U-U-U-SA-SA) (1) Adsorpcí z 0.1 hmot.% roztoku SA v citrátovém pufru (pH 3.95) (pufr) byla na povrchu zlata získána monomolekulární vrstva SA.(Au / SA-SA-U-U-U-SA-SA) (1) Adsorption of a 0.1 wt% SA solution in citrate buffer (pH 3.95) (buffer) provided a monomolecular SA layer on the gold surface.
(2) Omytí povrchu pufrem.(2) Washing the surface with buffer.
(3) Na vrstvu SA byl adsorbován polystyrensulfonát sodný (PSS) z 0.1 hmot.% roztoku PSS v pufru.(3) Sodium polystyrene sulfonate (PSS) from a 0.1 wt% solution of PSS in buffer was adsorbed onto the SA layer.
(4) Omytí povrchu pufrem.(4) Washing the surface with buffer.
(5) Druhá molekulární vrstva SA byla získána opakováním sekvence kroků (1), (2), (3) a (4).(5) The second molecular layer SA was obtained by repeating the sequence of steps (1), (2), (3) and (4).
(6) Na horní vrstvu PSS byla adsorbována ureáza z 0.1 hmot.% roztoku U v pufru.(6) Urease from 0.1 wt% U solution in buffer was adsorbed to the top layer of PSS.
(7) Omytí povrchu pufrem.(7) Washing the surface with buffer.
V naadsorbované vrstvě bylo imobilizováno lpg/cm2 U.Lpg / cm 2 U was immobilized in the adsorbed layer.
(3) Na vrstvu U byl adsorbován PSS z 0.1 hmot.% roztoku PSS v pufru.(3) PSS was adsorbed onto the U layer from a 0.1 wt% PSS solution in buffer.
(9) Omytí povrchu citrátovým pufrem.(9) Washing the surface with citrate buffer.
(10 Druhá a třetí molekulární vrstva U byla získána dvojnásobným opakováním sekvence kroků (6), (7), (8) a (9).(10) The second and third molecular layers U were obtained by repeating the sequence of steps (6), (7), (8) and (9) twice.
Celkem bylo na povrchu imobilizováno 4.25 pg/cm2 ureázy ve třech malekulárních vrstvách.A total of 4.25 pg / cm 2 of urease was immobilized on the surface in three maleicular layers.
(11) Na horní vrstvu PSS byly adsorbovány dvě molekulární vrstvy SA provedením sekvence kroků (1), (2), (3), (4), (1) a (2).(11) Two molecular layers of SA were adsorbed onto the top layer of PSS by performing the sequence of steps (1), (2), (3), (4), (1) and (2).
Dvě horní vrstvy obsahovaly cpi'<em 0. <3 uq/cm2 SA.The two upper layers contained a cpi <em 0. 3 3 µq / cm 2 SA.
(12) Síťování filmu přes aminoskupiny SA a U působením 0.5 hmot. roztoku glutaraldehydu v pufru.(12) Crosslinking of the film through the amino groups SA and U by 0.5 wt. solution of glutaraldehyde in buffer.
(13) Vymytí pufrem.(13) Wash with buffer.
(14) Vymývání 0.1 hmot.% roztokem SA v pufru.(14) Elution with 0.1 wt% SA solution in buffer.
(13) Vymytí destilovanou vodou.(13) Wash with distilled water.
(15) Vymytí fosfátovým pufrem (pH 7,4).(15) Wash with phosphate buffer (pH 7.4).
(16) Vymytí destilovanou vodou.(16) Wash with distilled water.
Vymýváním byly z filmu odstraněny zbytky nezreagovaného glutaral dehydu a PSS.Remnants of unreacted glutaral dehyde and PSS were removed from the film by washing.
Tvpí/- 7)Tvpe / - 7)
Claims (2)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ1995761A CZ286845B6 (en) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | Immobilization process of proteins on surface of solid objects |
| PCT/CZ1996/000010 WO1996030409A1 (en) | 1995-03-27 | 1996-03-26 | Method for immobilisation of proteins and polyelectrolytes on surfaces of solids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ1995761A CZ286845B6 (en) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | Immobilization process of proteins on surface of solid objects |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ76195A3 true CZ76195A3 (en) | 1996-10-16 |
| CZ286845B6 CZ286845B6 (en) | 2000-07-12 |
Family
ID=5462202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1995761A CZ286845B6 (en) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | Immobilization process of proteins on surface of solid objects |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ286845B6 (en) |
| WO (1) | WO1996030409A1 (en) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7101575B2 (en) | 1998-03-19 | 2006-09-05 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly |
| JP4650976B2 (en) | 1998-07-15 | 2011-03-16 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | Polyelectrolytes on biological templates |
| US8093039B2 (en) | 2007-04-10 | 2012-01-10 | The Trustees Of The Stevens Institute Of Technology | Surfaces differentially adhesive to eukaryotic cells and non-eukaryotic cells |
| KR101046337B1 (en) | 2008-06-10 | 2011-07-05 | 충남대학교산학협력단 | Protein Immobilization Method Using Polymer Electrolyte Multilayer Thin Film and Micro Contact Printing |
| US9733242B2 (en) | 2012-10-07 | 2017-08-15 | Sevident, Inc. | Devices for capturing analyte |
| US9910040B2 (en) | 2012-07-09 | 2018-03-06 | Sevident, Inc. | Molecular nets comprising capture agents and linking agents |
| WO2011066449A1 (en) * | 2009-11-24 | 2011-06-03 | Sevident | Devices for detection of analytes |
| CN110068677A (en) * | 2013-03-14 | 2019-07-30 | 赛维德恩特有限公司 | Molecular network in solid phase |
| GB201904697D0 (en) | 2019-04-03 | 2019-05-15 | Vib Vzw | Means and methods for single molecule peptide sequencing |
| WO2024184407A1 (en) | 2023-03-06 | 2024-09-12 | Vib Vzw | Method for identifying tumor-specific cell surface o-glycopeptides |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3109123A1 (en) * | 1981-03-11 | 1982-09-23 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 8000 München | Process for the covalent immobilisation of biological detoxification systems on artificial surfaces |
| DE4141302A1 (en) * | 1991-12-14 | 1993-06-17 | Inst Molekularbiologie Ak | Protein irreversibly immobilised on macroporous cellulose@ beads - by reversible adsorption then crosslinking or physical inclusion, e.g. for conversion or sepn. processes |
-
1995
- 1995-03-27 CZ CZ1995761A patent/CZ286845B6/en unknown
-
1996
- 1996-03-26 WO PCT/CZ1996/000010 patent/WO1996030409A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1996030409A1 (en) | 1996-10-03 |
| CZ286845B6 (en) | 2000-07-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2074730C (en) | Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications | |
| US5451453A (en) | Supports having azlactone-functional surfaces, adduct supports, and methods of preparing both | |
| JP3357919B2 (en) | Surface modification method | |
| AU716543B2 (en) | Immobilization of chemical species in crosslinked matrices | |
| US5275838A (en) | Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications | |
| JP4652684B2 (en) | Multilayer porous material and method for producing the same | |
| US5405618A (en) | Biomosaic polymer obtained by emulsion polymerization of hydrophobic monomers in the presence of bioactive materials | |
| US20030087099A1 (en) | Poly(ethylene oxide) coated surfaces | |
| Hoffman | Applications of radiation processing in biomedical engineering—A review of the preparation and properties of novel biomaterials | |
| US5476665A (en) | Azlactone functional particles incorporated in a membrane formed by solvent phase inversion | |
| EP1458797A1 (en) | Discrete hydrophilic-hydrophobic porous materials and methods for making the same | |
| CZ76195A3 (en) | Immobilization method of proteins and polyelectrolytes on the surface of solid objects | |
| JPH041013B2 (en) | ||
| JP4505581B2 (en) | Substance immobilization method | |
| Brynda et al. | Preparation of organized protein multilayers | |
| Bergström et al. | Microemulsions as reaction media for immobilization of proteins to hydrophilized surfaces | |
| EP0122209B2 (en) | Process for binding biological macromolecules to carriers | |
| JPH02119937A (en) | Base membrane for affinity separation membrane and production thereof | |
| Sugiyama et al. | Adsorption of protein on the surface of thermosensitive poly (methyl methacrylate) microspheres modified with the N‐(2‐hydroxypropyl) methacrylamide and 2‐(methacryloyloxy) ethyl phosphorylcholine moieties | |
| Swanson | A unique photochemical approach for polymer surface modification | |
| EP1352018B1 (en) | Surface passivation of organic polymers and elastomers | |
| Sakohara | Adsorption and separation | |
| Hegazy | Radiation synthesis of supported hydrogels for biomedical and biotechnological purposes | |
| JPS59135887A (en) | Support for immobilizing physiologically active substance and selective adsorbent | |
| JPH07277952A (en) | Method for immobilizing carrier of chemotherapeutic agent to carrier by photochemical reaction, method for adsorption-removing and determining physiologically active substance charged in negative by using the same carrier |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic |