KR101046337B1 - Protein Immobilization Method Using Polymer Electrolyte Multilayer Thin Film and Micro Contact Printing - Google Patents
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Abstract
본 발명은 선택적 단백질 고정화방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고분자 전해질을 이용한 다층박막 증착(Layer-by-layer deposition, LBL)의 표면 처리를 통하여 얻어진 표면 위에 정전기적 인력에 의한 선택적 단백질 고정화방법 및 상기 방법으로 항원 단백질을 고정화함으로써 항원-항체 반응을 유도할 수 있는 단백질 패터닝을 수행하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 고정화 방법은 단백질 활성 유지에 적합한 단백질의 3차원 입체구조가 유지되기에 유리한 조건이 되어 단백질 칩 내에서 탐침으로서의 효율을 높이고, 확산에 의한 단백질의 고정화가 아니므로 고분자 박막의 두께가 증가하여도 단백질 패턴의 크기가 동일하게 유지되고, 그 결과 동일 조건에서 형광세기가 항상 일정하므로 신호 세기에 대한 오차범위가 좁아져 보다 정확한 진단을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 진단을 위한 단백질 칩의 제작에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 미생물 칩, 세포 칩, 조직(tissue)칩을 제작하기 위한 미생물이나 세포의 고정화를 유도하는 단백질의 고정화시에 응용될 수 있다.The present invention relates to a selective protein immobilization method, and more particularly, to a selective protein immobilization method by electrostatic attraction on a surface obtained by surface treatment of multilayer-layer deposition (LBL) using a polymer electrolyte, and The present invention relates to a method for performing protein patterning capable of inducing an antigen-antibody response by immobilizing an antigenic protein. Since the protein immobilization method of the present invention is a favorable condition for maintaining the three-dimensional conformation of the protein suitable for maintaining protein activity, the efficiency of the probe in the protein chip is enhanced, and the thickness of the polymer thin film is not increased because the protein is not immobilized by diffusion. Although the size of the protein pattern remains the same, as a result, since the fluorescence intensity is always constant under the same conditions, the error range for the signal intensity is narrowed to enable more accurate diagnosis. Therefore, the present invention can be used not only for the production of protein chips for diagnosis, but also for the immobilization of proteins that induce the immobilization of microorganisms or cells for the production of microbial chips, cell chips, tissue chips. .
단백질 패터닝, 고분자 전해질, 다층박막 증착, 마이크로컨택트 프린팅, Protein patterning, polymer electrolytes, multilayer thin film deposition, microcontact printing,
Description
본 발명은 선택적 단백질 고정화방법으로, 고분자 전해질의 다층박막에 의해 처리된 기질 위에 마이크로 컨택트 프린팅 기법으로 단백질을 고정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of immobilizing a protein by a micro contact printing method on a substrate treated with a multilayer thin film of a polymer electrolyte by a selective protein immobilization method.
단백질 센서는 생체물질이 갖는 매우 우수한 분자인식능력을 이용하여 화학물질 혹은 생체물질의 농도를 측정하는 센서로써 이를 이용하여 각종 효소기질, 항원 등의 유무 판단 및 농도를 정량 분석할 수 있게 하는 장치이다. 이러한 단백질 센서를 제작하기 위해서는 효소나 항체 등 식별물질의 고정화가 필수적이다. 이러한 이유로 단백질 칩을 제작하기 위한 단백질의 고정화 방법에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다. 종래에 이루어진 연구 중 슬라이드 글라스 위에 단백질을 어레이하는 기술로써 단백질의 아민기와 반응하여 결합을 할 수 있는 교차결합제를 가 지고 슬라이드 글라스를 처리한 후, DNA 어레이를 제작할 때 사용된 마이크로어레이어(microarrayer)나 마이크로스캐너를 사용하여 DNA칩을 제작할 때와 같은 방식으로 제작을 한다. 이때 단백질의 안정성을 유지시키기 위하여 고정화시키고자 하는 단백질은 40% 글리세롤(glycerol) 용액에 처리하는 방법이다. 이는 단백질 어레이 기판을 슬라이드 글라스를 사용하여 경제적이고, 공유결합에 의한 단백질의 결합력이 강하다는 장점은 있으나, 각각의 단백질 패턴을 어레이어(arrayer) 팁(tip)으로 고정화해야 한다는 번거로움과 고정화된 단백질의 3차원 구조의 안정성을 고려하지 않아 단백질의 민감도가 떨어질 수 있다는 점, 그리고 단백질 용액이 표면에 고정화 될 때 확산 현상이 발생하기 때문에 정확한 사이즈와 모양을 구현할 수 없다는 단점이 있다.Protein sensor is a sensor that measures the concentration of chemicals or biomaterials using very good molecular recognition ability of biomaterials, and it is a device that can determine the presence or absence of various enzyme substrates and antigens and quantitatively analyze them using them. . In order to manufacture such a protein sensor, immobilization of an identification material such as an enzyme or an antibody is essential. For this reason, a lot of researches have been made on the method of immobilizing proteins for manufacturing protein chips. A technique for arranging proteins on a slide glass in a conventional study, which has a cross-linking agent that reacts with an amine group of a protein to bind to a slide glass, and then processes the slide glass and then uses a microarrayer used to fabricate a DNA array. I use a microscanner to produce DNA chips in the same way. At this time, the protein to be immobilized in order to maintain the stability of the protein is a method of treating in 40% glycerol (glycerol) solution. This has the advantage that the protein array substrate is economical by using slide glass, and the cohesion of the protein is strong, but the troublesome and immobilization of each protein pattern must be immobilized with an arrayer tip. It does not take into account the stability of the three-dimensional structure of the protein may reduce the sensitivity of the protein, and because the diffusion phenomenon occurs when the protein solution is immobilized on the surface has the disadvantage that the exact size and shape can not be implemented.
한편, 다공성 3D 젤 패드 글라스 위에 단백질을 어레이 시키는 기술은 Mirzabekov에 의해서 개발된 기술로써 silane 처리된 슬라이드 글라스 위에 3% polyacrylamide 젤과 젤의 다공성을 향상시키기 위한 교차결합제인 N,N'-(1,2-dihydroxyethylene) bisacrylamide(DHEBA)와의 혼합물을 먼저 어레이 시킨 후에 그 안에 단백질을 고정화시킴으로써 단백질을 100 × 100 × 20 ㎛ 크기에 200 ㎛ 간격으로 고정화 시키는 방법이다. 이는 3D 젤 패드를 사용함으로써 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있다는 장점이 있는 반면, 단백질의 고정화 과정이 복잡하고 번거롭기 때문에 경제성이 떨어진다는 단점이 있다.On the other hand, the technology of arranging proteins on porous 3D gel pad glass was developed by Mirzabekov, which is a crosslinking agent for improving the porosity of 3% polyacrylamide gel and gel on silane-treated slide glass, N, N '-(1, It is a method of immobilizing proteins at 100 × 100 × 20 ㎛ size at 200 μm intervals by first arranging a mixture with 2-dihydroxyethylene) bisacrylamide (DHEBA) and then immobilizing the protein therein. This has the advantage of improving the stability of the protein by using a 3D gel pad, while the disadvantages of economical because the immobilization process of the protein is complicated and cumbersome.
다른 기술로는 미국 예일대 Heng Zhu의 연구팀에 의해 개발된 기술로서 소프트리소그래피(soft-lithography) 방법으로 PDMS 마이크로 웰(microwell)을 제작한 후 교차결합제인 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane(GPTS)을 이용하여 마이크로웰을 처리하여 단백질의 아민기와 공유결합을 가능하게 함으로써 단백질을 고정화시킨 기술이다. 기존의 기술에 비해서는 비교적 간단하고 획기적인 방법이지만 역시 공유결합에 의한 단백질의 고정화로 인해서 단백질의 활성이 낮아질 수 있다는 것과 형광 단백질로 신호를 감지할 때 형광램프의 광원에서 나오는 빛에 의한 PDMS의 자가형광(autofluorescence)에 의한 낮은 신호는 감지하기 어려워지므로 센서의 감도가 떨어지는 단점이 있다. Another technique developed by Heng Zhu's team at Yale University in the United States is to produce PDMS microwells by soft-lithography and then use microglycol 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTS) as a crosslinker. It is a technology that immobilizes a protein by allowing covalent bonding to the amine group of the protein by treating. Compared to the existing technology, the method is relatively simple and innovative, but also the covalent bond immobilization of the protein may lower the activity of the protein, and the detection of the signal by the fluorescent protein causes the PDMS Low signal due to fluorescence (autofluorescence) is difficult to detect, so there is a disadvantage that the sensitivity of the sensor is inferior.
이에, 본 발명자들은 단백질의 고정화방법을 연구하던 중, 고분자 전해질을 이용한 다층박막의 기판에 미세패턴을 가지는 마이크로 스탬프를 사용하여 마이크로 컨택트 프린팅을 이용한 단백질을 고정화를 시킨 결과, 단백질 센서의 제작에 있어서 효율성과 경제성을 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Thus, the inventors of the present invention, while studying the method of immobilizing the protein, using a micro stamp having a micropattern on the substrate of the multilayer thin film using the polymer electrolyte to immobilize the protein using the micro-contact printing, as a result, in the manufacture of the protein sensor The present invention has been completed by confirming that the efficiency and economy can be improved.
본 발명의 목적은 단백질의 고정화가 간단한 방법으로 빠르고 효율적으로 이루어지는 동시에 기질에 고정화된 단백질의 3차원 입체구조가 잘 유지되도록 함으 로써 단백질의 활성이 우수한 단백질 칩을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a protein chip having excellent protein activity by allowing protein to be immobilized quickly and efficiently in a simple manner and maintaining the three-dimensional conformation of the protein immobilized on a substrate.
본 발명의 또 다른 목적은 고정화된 단백질의 패턴의 크기와 모양을 정확하게 제어함으로써, 기질 위에 단백질이 확산되어 면적이 넓어짐으로 인해 발생될 수 있는 형광신호의 왜곡현상을 방지하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method of accurately preventing the distortion of the fluorescent signal which may be caused by the diffusion of the protein onto the substrate and the area of the immobilized protein by precisely controlling the size and shape of the pattern.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고분자 전해질을 이용한 다층박막 증착(Layer-by-layer deposition, LBL)의 표면 처리를 통하여 얻어진 표면 위에 정전기적 인력에 의한 선택적 단백질 고정화방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a selective protein immobilization method by the electrostatic attraction on the surface obtained through the surface treatment of the layer-by-layer deposition (LBL) using a polymer electrolyte.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 항원 단백질을 고정화함으로써 항원-항체 반응을 유도할 수 있는 단백질 패터닝을 수행하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for performing protein patterning capable of inducing an antigen-antibody response by immobilizing the antigenic protein by the above method.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 단백질을 기반으로 하는 고속 스크리닝 시스템의 마이크로어레이를 제작하기 위해서 사용될 수 있는 방법으로, 고체 기판 위에 효율적으로 단백질을 고정화시키기 위한 표면처리 방법과 단백질 고정화 방법에 관한 것이다.The present invention is a method that can be used to fabricate a microarray of a protein-based high-speed screening system, and relates to a surface treatment method and a protein immobilization method for efficiently immobilizing a protein on a solid substrate.
본 발명은 고분자 전해질을 이용한 다층박막 증착(Layer-by-layer deposition, LBL)의 표면 처리를 통하여 얻어진 표면 위에 정전기적 인력에 의한 선택적 단백질 고정화방법을 제공한다.The present invention provides a method for selective protein immobilization by electrostatic attraction on a surface obtained through surface treatment of multilayer-by-layer deposition (LBL) using a polymer electrolyte.
본 발명의 선택적 단백질 고정화방법에 있어서, 상기 고분자 전해질은 폴리(아릴아민 하이드로클로라이드)(poly(allyamine hydrochloride), PAH) 및/또는 폴리(4-암모늄 스티렌 설폰산)(poly(4-ammonium styrene sulfonic acid, PSS)를 포함하는 것이 바람직하고, 이때 상기 PAH는 20 mM(pH 9.0)이고, 상기 PSS는 60 mM(pH 7.0)인 것이 보다 바람직하다.In the selective protein immobilization method of the present invention, the polymer electrolyte is poly (allyamine hydrochloride) (PAH) and / or poly (4-ammonium styrene sulfonic acid) (poly (4-ammonium styrene sulfonic acid) acid, PSS), wherein the PAH is 20 mM (pH 9.0), and the PSS is more preferably 60 mM (pH 7.0).
또한, 본 발명의 선택적 단백질 고정화방법에 있어서, 상기 다층박막 증착의 표면 처리는 다층박막의 마지막 층으로 단백질의 등전점과 사용되는 완충용액의 pH의 상호관계에 따른 단백질의 알짜전하(net charge)를 고려하여, 단백질이 갖게 되는 전하와 반대되는 전하의 고분자 전해질을 처리하는 것이 바람직하고, 상기 정전기적 인력에 의한 선택적 단백질 고정화는 마이크로 컨택트 프린팅 방법인 것이 바람직하다.In addition, in the selective protein immobilization method of the present invention, the surface treatment of the multilayer thin film deposition is a final layer of the multilayer thin film is a net charge of the protein according to the correlation between the isoelectric point of the protein and the pH of the buffer solution used In view of the above, it is preferable to treat the polymer electrolyte having a charge opposite to that of the protein, and the selective protein immobilization by the electrostatic attraction is preferably a micro contact printing method.
또한, 본 발명의 선택적 단백질 고정화방법에 있어서, ⅰ) 고분자 전해질을 이용한 다층박막의 기판을 제작하는 단계; ⅱ) 미세패턴을 가지는 마이크로 스탬프를 제작하는 단계; 및 ⅲ) 상기 ⅰ) 단계의 기판에 상기 ⅱ) 단계의 마이크로 스탬프를 이용하여 마이크로 컨택트 프린팅을 이용한 단백질을 고정화시키는 단계;를 포함하는 것이 바람직하고, 이때 상기 단백질 고정화는 산소 플라즈마 처리를 통하여 친수성기가 도입된 PDMS 마이크로 스탬프를 단백질 용액 내에 담지한 후 꺼내어서 질소를 이용하여 과잉의 단백질을 제거한 뒤 마이크로 컨택트 프린팅하거나 단백질의 전사가 잘 이루어질 수 있도록 하기 위해서 마이크로 컨택트 프린팅 하기 전에 저온의 냉동고에서 일정시간 유지시키는 것이 보다 바람직하다. 또한 이때 상기 기판은 고분자 전해질 용액을 처리하기 전에, 각각 H2SO4 및 H2O2를 포함하는 피라나 용액, 증류수, 에탄올(ethanol) 및 아세톤(acetone)으로 세척하는 것이 보다 바람직하고, 상기 마이크로 스탬프는 PDMS 전중합체(prepolymer)와 경화제를 섞은 후에, 이것을 실리콘 마스터 위에 올리고 나서, 열적 경화 후에 상기 실리콘 마스터로부터 경화된 PDMS를 분리해 내에 제작되는 것이 보다 바람직하고, 상기 마이크로 컨택트 프린팅은 ⅰ) 마이크로 스탬프를 세척하는 단계; ⅱ) 상기 세척 후 플라즈마 처리를 이용하여 PDMS 마이크로 스탬트의 표면을 친수성 표면으로 유도하는 단계; ⅲ) 상기 친수성 표면으로 유도된 스탬프 위에 단백질을 잉킹시키는 단계; ⅳ) 상기 단백질 잉킹 후, 과잉의 단백질을 제거하고 단일층 수준의 단백질만을 남기는 단계; ⅴ) 상기 단일층 단백질이 결합된 것을 고분자 전해질의 다층박막 위에 마이크로 스탬핑하는 단계; 및 ⅵ) 상기 마이크로 스탬핑 후, 유리기판에 정전기적 인력 외에 물리적으로 흡착된 과잉의 단백질을 제거하기 위해 스탬핑이 이루어진 유리 기판을 세척하는 단계를 포함하는 것이 보다 바람직하다.In addition, in the selective protein immobilization method of the present invention, i) preparing a substrate of a multilayer thin film using a polymer electrolyte; Ii) preparing a micro stamp having a fine pattern; And iii) immobilizing the protein using micro-contact printing using the micro stamp of step ii) on the substrate of step iii), wherein the protein immobilization is carried out by oxygen plasma treatment. The PDMS micro stamps were introduced into a protein solution and then taken out to remove excess protein using nitrogen, and then maintained in a low temperature freezer before micro contact printing or micro contact printing to facilitate protein transcription. It is more preferable to make it. In addition, at this time, the substrate is more preferably washed with a piranha solution, distilled water, ethanol and acetone containing H 2 SO 4 and H 2 O 2 , respectively, before treating the polymer electrolyte solution. The micro stamp is more preferably produced after mixing the PDMS prepolymer and the curing agent, raising it on the silicon master, and then separating the cured PDMS from the silicon master after thermal curing, and the micro contact printing is performed in the following manner. Washing the micro stamp; Ii) directing the surface of the PDMS microstamp to a hydrophilic surface using the post-cleaning plasma treatment; Iii) inking the protein onto the stamp induced into the hydrophilic surface; Iii) after the protein inking, removing excess protein and leaving only the monolayer level of protein; Iii) microstamping the conjugated monolayer protein onto the multilayer thin film of the polymer electrolyte; And iii) after the micro stamping, cleaning the glass substrate with stamping to remove excess protein physically adsorbed on the glass substrate in addition to electrostatic attraction.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 항원 단백질을 고정화함으로써 항원-항체 반응을 유도할 수 있는 단백질 패터닝을 수행하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for performing protein patterning capable of inducing an antigen-antibody response by immobilizing the antigenic protein by the above method.
본 발명의 단백질 패터닝을 수행하는 방법에 있어서, 상기 항원단백질의 고정화는 ⅰ) 항원 단백질 토끼(rabbit) IgG를 마이크로 컨택트 프린팅 방법으로 고분자 전해질 다층박막에 고정화시키는 단계; ⅱ) 상기 고정화된 항원 단백질에 BSA 로 표면을 처리하여 블록킹하는 단계; 및 ⅲ) 블록킹 후 , 항체가 되는 산양 항-토끼(goat anti-rabbit) IgG-FITC를 표면 위로 흘려줌으로써 표면 위로 비특이적인 결합이 발생하지 않으면서 항원-항체가 반응하는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.In the method of performing protein patterning of the present invention, immobilization of the antigenic protein comprises the steps of: i) immobilizing the antigenic protein rabbit (rabbit) IgG to the polymer electrolyte multilayer thin film by a microcontact printing method; Ii) blocking the immobilized antigen protein by treating the surface with BSA; And iii) reacting the antigen-antibody without blocking nonspecific binding onto the surface by flowing a goat anti-rabbit IgG-FITC that becomes the antibody after blocking, onto the surface. Do.
본 발명의 단백질 고정화방법은, 정전기적 인력을 이용한 간단한 공정을 사용하여 단백질을 고정화시킬 수 있다. 따라서 단백질 센서의 제작에 있어서 효율성과 경제성을 향상시킬 수 있다.The protein immobilization method of the present invention can immobilize proteins using a simple process using electrostatic attraction. Therefore, the efficiency and economics in manufacturing a protein sensor can be improved.
본 발명은 단백질 칩 및 바이오센서의 제작을 위해 기질 표면 위에 단백질을 고정화하는 기술에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 폴리(아릴아민 하이드로클로라이드)와 폴리(4-암모늄 스티렌 설폰산)(poly(4-ammonium styrene sulfonic acid, PSS)의 고분자 전해질을 이용한 다층박막 증착(Layer-by-layer deposition, LBL)의 표면 처리를 통하여 얻어진 표면 위에 정전기적 인력을 이용하여 선택적으로 단백질을 고정화시키는 방법에 관한 것으로, 기질과 단백질간 정전기적 인력에 의해 단백질이 효과적으로 고정화됨과 동시에 단백질의 3차원 입체구조를 유지시킴으로써 인지 대상 물질에 대한 감도를 높일 수 있는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a technique for immobilizing proteins on a substrate surface for the production of protein chips and biosensors, and more particularly, poly (arylamine hydrochloride) and poly (4-ammonium styrene sulfonic acid) (poly (4- The present invention relates to a method of selectively immobilizing proteins using electrostatic attraction on a surface obtained by surface treatment of multilayer thin film deposition (LBL) using a polymer electrolyte of ammonium styrene sulfonic acid (PSS). The present invention relates to a method of increasing the sensitivity of a substance to be recognized by effectively fixing the protein by the electrostatic attraction between the substrate and the protein and maintaining the three-dimensional conformation of the protein.
본 발명의 단백질 고정화를 위한 기판의 표면처리 방법에 있어서, 상기 기판은 유리 기판이고, 피라나 용액(50%의 H2SO4: 30%의 H2O2 = 1 : 4)으로 처리함으로써 유리 기판의 표면이 하이드록실기(-OH-)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 단백질 고정화를 위한 표면 처리 방법에 있어서는, 다수의 양이온을 갖는 고분자 전해질과 다수의 음이온을 갖는 고분자 전해질을 이용하여 반복, 교차적으로 담지하여 고분자 다층박막(Layer-by-layer deposition, LBL)을 형성하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용한 양이온 고분자 전해질은 하기 화학식 1로 기재되는 폴리(아릴아민 하이드로클로라이드)(poly(allyamine hydrochloride), PAH) 또는 하기 화학식 2로 기재되는 폴리(4-암모늄 스티렌 설폰산)(poly(4-ammonium styrene sulfonic acid, PSS)인 것이 바람직하다.In the method for surface treatment of a substrate for protein immobilization of the present invention, the substrate is a glass substrate, and the glass is treated with a Pirana solution (50% H 2 SO 4 : 30% H 2 O 2 = 1: 4). it is desirable to have a - the surface of the substrate hydroxyl groups (-OH). In addition, in the surface treatment method for protein immobilization of the present invention, by repeatedly and cross-supporting using a polymer electrolyte having a plurality of cations and a polymer electrolyte having a plurality of anions, a polymer multilayer thin film (Layer-by-layer deposition, LBL) is preferred. The cationic polymer electrolyte used in the present invention may be a poly (allyamine hydrochloride) (PAH) represented by the following Chemical Formula 1 or a poly (4-ammonium styrene sulfonic acid) represented by the following Chemical Formula 2 (poly (4 ammonium styrene sulfonic acid (PSS).
Poly(allylamine hydrochloride)Poly (allylamine hydrochloride)
Poly(4-ammonium styrene sulfonic acid)Poly (4-ammonium styrene sulfonic acid)
또한, 본 연구의 가장 핵심적인 기술 중 하나는 고정화시킬 단백질의 등전점과 단백질을 둘러싸고 있는 완충용액의 pH와의 상호 관계를 통하여 단백질의 알짜 전하(net charge)를 양의 값을 갖도록 혹은 음의 값을 같도록 함으로써, 기판 위에 단백질을 정전기적 인력으로 고정화시킬 수 있도록 단백질의 알짜 전하와 반대되는 전하를 갖는 고분자 전해질을 다층박막의 제일 마지막 층에 처리하는 것이다. 도 1은 유기 기판 위에 고분자 전해질의 다층박막을 처리한 것에 대한 개념도이며 이것은 단백질을 고정화하기 위한 하나의 예시로써 본 개념도는 단백질 고유의 등전점과 단백질을 둘러싸고 있는 완충용액의 상호관계를 통하여 단백질의 알짜전하가 음전하를 갖게 되는 경우를 나타낸 것이다. 단백질이 갖게 되는 알짜 전하에 따라서 매우 간단하고 쉽게 표면의 전하를 다르게 함으로써 다양한 단백질의 고정화를 매우 자유롭게 구현할 수 있다.In addition, one of the most important techniques of this study is to make the net charge of the protein positive or negative through the correlation between the isoelectric point of the protein to be immobilized and the pH of the buffer surrounding the protein. By doing so, a polymer electrolyte having a charge opposite to the net charge of the protein is treated on the last layer of the multilayer thin film so that the protein can be immobilized on the substrate by electrostatic attraction. 1 is a conceptual diagram of the treatment of a multilayer thin film of a polymer electrolyte on an organic substrate, and this is one example for immobilizing proteins. The conceptual diagram illustrates the net structure of a protein through a correlation between its intrinsic isoelectric point and a buffer solution surrounding the protein. It shows the case where the charge has a negative charge. Immobilization of various proteins can be implemented very freely by changing the charge on the surface very simply and easily according to the net charge of the protein.
본 발명은 단백질의 고정화 방법에 마이크로 컨택트 프린팅 기법을 이용하였고, 이를 구현하기 위해서는 마이크로 스탬프가 필요하다. 도 2에 도시된 바와 같이 마이크로 스탬프를 얻기 위해서는 ⅰ) 포토리소그래피 공정; ⅱ) 포토리소그래피 공정을 이용하여 얻어진 실리콘 마스터 위에 경화시키지 않은 PDMS를 붓고 경화시키는 공정; ⅲ) 실리콘 마스터와 경화된 PDMS를 분리시킴으로써 실리콘 마스터의 음각이 되는 패턴을 갖는 마이크로 스탬프를 얻는 공정이 포함된다. 단백질을 고정화하기에 요구되는 혹은 필요로 하는 크기나 모양이 있다면 포토리소그래피 공정 을 위해 마스크를 제작할 때 그에 맞게 디자인을 하면 원하는 마이크로 스탬프를 얻을 수 있게 된다. 마이크로 스탬프의 제조는 전중합체(prepolymer)와 경화제를 섞은 것을 실리콘 마스터 위에 올리고 오븐 내에서 열적 경화 후에 실리콘 마스터로부터 경화된 PDMS를 분리해 냄으로써 미세패턴을 가지고 있는 마이크로 스탬프를 제조할 수 있다(도 2 참조).In the present invention, a micro contact printing technique is used for a method of immobilizing a protein, and a micro stamp is required to implement the protein. 2) a photolithography process to obtain a micro stamp as shown in FIG. Ii) pouring and curing uncured PDMS onto the silicon master obtained using the photolithography process; Iii) separating the silicon master from the cured PDMS to obtain a micro stamp with the engraved pattern of the silicon master. If you have the size or shape required or required to immobilize the protein, you can design the mask for the photolithography process and design it accordingly to get the desired micro stamp. The preparation of the micro stamp can produce a micro stamp having a micropattern by mixing a prepolymer and a curing agent on the silicon master and separating the cured PDMS from the silicon master after thermal curing in an oven (FIG. 2). Reference).
본 발명에서 사용된 마이크로 컨택트 프린팅 기법은 종래의 마이크로어레이어를 사용했을 때 각 패턴을 개별적으로 고정화해야 한다는 단점을 극복할 수 있는 데, 이것 또한 상기에 서술한 포토 공정을 위한 마스크를 제작하는 과정에서 스탬프 하나에 포함되는 패턴의 수를 결정하여 디자인함으로써 한 번의 프린팅으로 수백, 수천 개의 패턴을 구현할 수 있다는 장점이 있다. 더욱이 유리 기판을 기질로 사용함으로써 가격도 저렴하고 자가 발광이 매우 낮아서 낮은 농도의 생체물질도 감지가 가능하기 때문에 단백질 칩의 제작에 있어서 매우 유용한 기술이다.The microcontact printing technique used in the present invention can overcome the disadvantage of having to immobilize each pattern individually when using a conventional microarray, which is also a process for manufacturing a mask for the photo process described above. By determining and designing the number of patterns included in one stamp in, there is an advantage that hundreds or thousands of patterns can be realized in one printing. In addition, the use of a glass substrate as a substrate is a very useful technology in the manufacture of protein chips because it is inexpensive and low self-luminous to detect low concentrations of biomaterials.
도 3은 상기에 서술한대로 표면처리를 한 고분자 다층박막(도 1) 위에, 상기에 서술한대로 얻어진 PDMS 마이크로 스탬프(도 2)를 이용하여 단백질을 마이크로 컨택트 프린팅 함으로써 단백질의 고정화를 나타낸 모식도이다. 마이크로 컨택트 프린팅은 ⅰ) 마이크로 스탬프를 세척하는 단계; ⅱ) 플라즈마 처리를 이용하여 PDMS 마이크로 스탬트의 표면을 친수성 표면으로 유도하는 단계; ⅲ)친수성 표면으로 유도된 스탬프 위에 단백질을 잉킹시키는 단계; ⅳ) 과잉의 단백질을 제거하고 단일층 수준의 단백질만을 남기는 단계; ⅴ) 고분자 전해질의 다층박막 위에 마이크로 스탬핑하는 단계; ⅵ) 유리기판에 정전기적 인력 외에 물리적으로 흡착된 과 잉의 단백질을 제거하기 위해 스탬핑이 이루어진 유리 기판을 세척하는 단계로 이루어지는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 이러한 실시예로 FITC-BSA 단백질을 사용하였다. 상기 실시예에서 고분자 전해질의 다층박막의 마지막 층을 PAH로 처리하면 양전하로 유도되고, 상기 FITC-BSA 단백질은 사용된 완충용액인 50mM, pH 7.2의 인산완충용액에서 음전하를 띄므로 단백질이 기판 위에서 정전기적 인력에 의해서 고정화된다. 아울러, PDMS 마이크로 스탬프를 산소 플라즈마 처리를 통하여 친수성 스탬프로 유도하고 FITC-BSA 용액 내에 스탬프를 담지시켜 단백질이 PDMS 마이크로 스탬프로 충분히 흡착되게 한다. 과잉의 BSA를 제거한 후 단백질이 표면으로의 전사 효율을 높이기 위하여 약간의 수분을 제공한다. 그 후 단백질이 흡착되어있는 마이크로 스탬프를 고분자 전해질의 다층박막 위에 접촉시켜 단백질이 정전기적 인력에 의해서 스탬프에서 유리 기질 위로 전사되게 한 뒤, 정전기적 인력 외의 물리적 흡착에 의해 고정화된 단백질을 제거하기 위해 세척한다.Fig. 3 is a schematic diagram showing the immobilization of proteins by microcontact printing of the proteins on the polymer multilayer thin film (Fig. 1) subjected to the surface treatment as described above using the PDMS micro stamp (Fig. 2) obtained as described above. Micro-contact printing comprises the steps of iii) washing the micro stamp; Ii) directing the surface of the PDMS micro stamp to a hydrophilic surface using plasma treatment; Iii) inking the protein onto the stamp induced into the hydrophilic surface; Iii) removing excess protein and leaving only monolayer level protein; Iii) micro stamping on the multilayer thin film of the polymer electrolyte; Iii) It is preferable that the step of cleaning the glass substrate is stamped to remove the excess protein physically adsorbed in addition to the electrostatic attraction to the glass substrate. We used the FITC-BSA protein in this example. In the above embodiment, when the last layer of the multilayer polymer membrane of the polymer electrolyte was treated with PAH, the positive charge was induced, and the FITC-BSA protein was negatively charged in the phosphate buffer solution of 50 mM, pH 7.2, which was used as a buffer solution. It is immobilized by electrostatic attraction. In addition, the PDMS micro stamp is guided to the hydrophilic stamp through oxygen plasma treatment and the stamp is immersed in the FITC-BSA solution so that the protein is sufficiently adsorbed into the PDMS micro stamp. After removing excess BSA, the protein provides some moisture to increase the efficiency of transcription to the surface. Thereafter, the micro-stamped protein is contacted on the multilayer thin film of the polymer electrolyte so that the protein is transferred from the stamp to the glass substrate by the electrostatic attraction, and then to remove the immobilized protein by physical adsorption outside the electrostatic attraction. Wash.
그 결과 상기 마이크로 컨택트 프린팅 기법으로 인하여 단백질 고정화는 단백질 패턴의 크기를 다층박막의 두께와 관계없이 동일하게 생성시켰다(도 4 참조). 다층박막 위로 전사된 단백질의 마이크로 패턴의 크기는 오차범위가 매우 작아 기존의 방법에 비해 현저하게 개선된 결과를 나타낸다. 결국, 본 발명의 단백질 고정화방법은 정량분석을 위한 단백질 칩 혹은 센서의 제작에 매우 중요하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 고정화방법은 물리적 흡착, 단일층의 정전기적 인력, 공유결합으로 고정화된 단백질과 비교했을 때 단백질 활성을 유지하는 측면에서 매우 우수하다(도 5 참조). 구체적으로, 본 발명자들은 고분자 전해질의 다 층박막과 비교를 하기 위해 처리를 전혀 하지 않은 유리 기판, 아민기가 유도된 기판, 알레하이드가 유도된 기판, 에폭사이드 유도된 기판, 폴리-L-라이신 기판에 대한 immunoassay(도 5a 참조)와 이에 대한 형광신호 세기(도 5b 참조)를 측정하였다. 그 결과, 정전기적 인력에 의한 고정화가 공유결합에 의한 고정화에 비해서 단백질의 고정화 밀도는 낮을 수 있지만 활성을 유지하고 있는 단백질의 양은 더 많았고, 정전기적 인력을 이용한 경우로만 비교하여 보면 단일층인 폴리-L-라이신 기판과 다층박막 기판의 신호세기는 단일층 기판 위에서의 신호보다 고분자 전해질 다층박막 위에서 신호가 큰 값을 나타내었다. 즉 전하를 가지고 있는 기판의 표면은 단층박막으로 존재할 때 보다는 다층박막일 경우 표면 내에 존재하는 전하의 양이 많아 고정화 효율을 높일 수 있다. As a result, protein immobilization produced the same size of the protein pattern regardless of the thickness of the multilayer thin film due to the micro contact printing technique (see FIG. 4). The size of the micropattern of the protein transferred onto the multilayer thin film shows a significantly improved error compared to the conventional method because the error range is very small. As a result, the protein immobilization method of the present invention can be very important for the production of protein chips or sensors for quantitative analysis. In addition, the protein immobilization method of the present invention is very excellent in terms of maintaining protein activity compared to the protein that is immobilized by physical adsorption, electrostatic attraction of a single layer, covalent bond (see Fig. 5). Specifically, the present inventors have described the glass substrate, the amine group-induced substrate, the aldehyde-induced substrate, the epoxide-induced substrate, the poly-L-lysine substrate, which has not been treated at all for comparison with the multilayer film of the polymer electrolyte. For immunoassay (see FIG. 5a) and fluorescence signal intensity (see FIG. 5b) was measured. As a result, the immobilization by electrostatic attraction may be lower than the covalent immobilization, but the immobilization density of the protein is higher. The signal strengths of the -L-lysine substrate and the multilayer thin film substrate showed higher values on the polymer electrolyte multilayer thin film than the signal on the single layer substrate. In other words, the surface of the substrate having the charge has a higher amount of charge in the surface than in the case of the single layer thin film, thereby increasing the immobilization efficiency.
지금까지 기술한 바와 같이, 본 발명은 고분자 전해질의 다층 박막 증착을 이용한 표면처리 과정 후 마이크로 컨택트 프린팅 방법으로 단백질을 고정화시키는 방법으로 종래방법과 비교하여 단백질 칩 및 센서의 제작시 고정화된 단백질의 3차 입체 구조의 측면에서 효과적으로 단백질의 활성을 유지시킨다. 또한, 단백질 고정화시에 마이크로어레이어를 사용하는 방법 대신 마이크로 컨택트 프린팅 방법을 사용함으로써 다층박막 위에 고정화되는 단백질 패턴의 크기가 다층박막의 두께와 관계없이 항상 일정한 크기를 유지하고 있기 때문에 정량분석을 할 경우 신호세기의 오차범위를 줄일 수 있어 보다 정확한 단백질 칩 및 센서를 제작을 가능하게 한 다. 아울러, 본 발명은 과정자체가 쉽고 단순하며, 유기용매를 사용하지 않고 수용액 기반이기 때문에 친환경적 방법으로 단백질을 고정화한다는 의의도 가지고 있다.As described above, the present invention is a method of immobilizing proteins by a micro contact printing method after the surface treatment process using multilayer thin film deposition of a polymer electrolyte. It effectively maintains protein activity in terms of secondary conformation. In addition, instead of using microarrays for protein immobilization, microcontact printing is used to quantitative analysis because the size of the protein pattern immobilized on the multilayer thin film is always kept constant regardless of the thickness of the multilayer thin film. In this case, the error range of the signal strength can be reduced, which enables more accurate protein chip and sensor fabrication. In addition, the present invention has the meaning that the process itself is easy and simple, immobilize the protein in an environmentally friendly way because it is based on an aqueous solution without using an organic solvent.
이와 같이, 본 발명의 단백질 고정화 방법은 단백질 칩을 제작함에 있어서 필수조건 중 하나인 단백질의 고정화를 고분자 전해질의 다층박막 위에 마이크로 컨택트 프린팅 기법을 이용하여 정전기적 인력에 의해 이루어지도록 함으로써, 단백질 활성 유지에 적합한 단백질의 3차원 입체구조가 유지되기에 유리한 조건이 되어 단백질 칩 내에서 탐침으로서의 효율이 높아지고, 단백질 용액의 확산에 의한 고정화가 아니어서 고분자 박막의 두께가 증가하여도 단백질 패턴의 크기가 동일하게 유지되어 형광세기가 동일 조건에서 항상 일정하므로 신호 세기에 대한 오차범위가 좁아져 보다 정확한 진단을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 진단을 위한 단백질 칩의 제작에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 미생물 칩, 세포 칩, 조직(tissue)칩을 제작하기 위한 미생물이나 세포의 고정화를 유도하는 단백질의 고정화시에 응용 될 수 있다.As described above, the protein immobilization method of the present invention maintains protein activity by allowing protein immobilization, which is one of the prerequisites in manufacturing a protein chip, to be performed by electrostatic attraction by using microcontact printing technique on the multilayer thin film of the polymer electrolyte. It is a favorable condition to maintain the three-dimensional conformation of the protein suitable for the increase in efficiency as a probe in the protein chip, the size of the protein pattern is the same even if the thickness of the polymer thin film is increased because it is not immobilized by the diffusion of the protein solution Since the fluorescence intensity is always constant under the same conditions, the error range for the signal intensity is narrowed to allow more accurate diagnosis. Therefore, the present invention can be used not only for the manufacture of protein chips for diagnosis, but also for the immobilization of proteins that induce the immobilization of microorganisms or cells for manufacturing microbial chips, cell chips, tissue chips. .
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the present invention is not limited to the following examples and may be changed to other embodiments equivalent to substitutions and equivalents without departing from the technical spirit of the present invention. Will be apparent to those of ordinary skill in the art.
<실시예 1> 고분자 전해질 다층박막의 기판 제작 Example 1 Preparation of Substrate of Polymer Electrolyte Multilayer Thin Film
단백질을 고정화하기 위한 기질의 고분자 전해질의 다층박막 처리를 위하여, 먼저 기판으로 사용될 슬라이드 글라스를 가로 x 세로(2.5㎝ x 2.5㎝)로 절단한 후 80℃ 피라나 용액(50%의 H2SO4 : 30%의 H2O2 = 1 : 4)에 1시간 동안 담지시킴으로써 세척하였다. 그리고 나서, 증류수, 에탄올(ethanol) 그리고 아세톤(acetone)에 각각 5분씩 초음파 세척 후 질소로 건조한 후에 세척된 슬라이드 글래스를 20 mM, pH 9.0의 폴리(아릴아민 하이드로클로라이드)(poly(allyamine hydrochloride), PAH) 용액에 20분간 담지시켰다. 그리고 나서, 증류수로 30초간 세척하는 것을 3번 반복하여 유리 기판에 과잉으로 흡착된 고분자 전해질을 제거함으로써 단일층의 고분자 전해질 층을 얻었다. 그리고 나서, 바로 음전하 용액인 60 mM, pH 7.0의 폴리(4-암모늄 스티렌 설폰산)(poly(4-ammonium styrene sulfonic acid, PSS) 용액에 20분간 담지함으로써 두 번째 층을 코팅하였다. 그리고 첫 번째 층과 마찬가지로 증류수에 30초간 3번 반복하여 세척하여 과잉으로 흡착된 음전하 고분자를 제거함으로써 균일하게 음전하로 처리된 표면을 얻을 수 있었다. 이러한 방법을 원하는 층만큼 반복하고 마지막 층의 처리는 고정화해야 하는 단백질의 알짜전하와 반대되는 전하를 갖도록 처리를 하였다(도 1).For the multilayer thin film treatment of the polymer electrolyte of the substrate to immobilize the protein, firstly, the slide glass to be used as the substrate was cut to length x length (2.5 cm x 2.5 cm), and then 80 ° C. pyrana solution (50% of H 2 SO 4). : It was immersed in 30% of H 2 O 2 = 1: 4) for 1 hour. Then, after ultrasonic cleaning for 5 minutes each in distilled water, ethanol and acetone, and dried with nitrogen, the slide glass was washed with poly (allyamine hydrochloride) at 20 mM, pH 9.0, PAH) was immersed in the solution for 20 minutes. Then, washing with distilled water for 30 seconds was repeated three times to remove the polymer electrolyte that was excessively adsorbed on the glass substrate, thereby obtaining a single-layer polymer electrolyte layer. Then, the second layer was coated by immersing in a solution of poly (4-ammonium styrene sulfonic acid (PSS) at 60 mM, pH 7.0 (negative charge solution) for 20 minutes. As with the layers, it was repeatedly washed with distilled water three times for 30 seconds to remove excessively adsorbed negatively charged polymers, thereby obtaining a uniformly negatively charged surface. Treatment was carried out to have a charge opposite to the net charge of the protein (FIG. 1).
<실시예 2> 마이크로 스탬프의 제작 Example 2 Preparation of Micro Stamp
원하는 패턴을 만들 수 있도록 캐드를 이용하여 포토리소그라피에 사용될 마스크를 디자인하였다. 제작된 마스크를 이용하여 포토리소그라피 공정을 통하여 실리콘 웨이퍼 위에 패턴이 생기도록 하였다. PDMS 전중합체(prepolymer)와 경화제를 10 : 1 비율로 섞은 후 제작된 실리콘 마스터 위에 올리고 진공 펌프 내에서 PDMS 전중합체와 경화제가 섞일 때 주입된 기포를 제거해 주었다. 그리고 나서, 65℃ 오븐 내에서 8시간 열적 경화 후에 실리콘 마스터로부터 경화된 PDMS를 분리해 냄으로써 미세패턴을 가지고 있는 마이크로 스탬프를 얻을 수 있었다(도 2).To create the desired pattern, CAD was used to design a mask to be used for photolithography. Using the manufactured mask, a pattern was formed on the silicon wafer through a photolithography process. The PDMS prepolymer and the curing agent were mixed at a ratio of 10: 1 and then placed on the fabricated silicone master to remove the bubble injected when the PDMS prepolymer and the curing agent were mixed in a vacuum pump. Then, after 8 hours of thermal curing in an oven at 65 ° C., the cured PDMS was separated from the silicon master to obtain a micro stamp having a fine pattern (FIG. 2).
<실시예 3> 마이크로 컨택트 프린팅을 이용한 단백질의 고정화 Example 3 Immobilization of Protein Using Micro Contact Printing
상기 실시예 1을 통해 제조된 고분자 전해질의 다층박막 위에 상기 실시예 2를 통해 제조된 PDMS 마이크로 스탬프를 이용하여 단백질을 마이크로 컨택트 프린팅 하였다(도 3). 사용된 단백질은 FITC-BSA(bovine serum albumin-fluorescein isothiocyanate) 10 ㎍/㎖이었다. BSA의 등전점은 4.6으로써 BSA가 안정적으로 유지할 수 있는 pH 7.2의 인산완충 용액 내에서 음전하를 띄게 된다. 그러므로, 본 실시예에서는 고분자 전해질의 다층 박막의 마지막 층을 PAH로 하였고 이로 인하여 고분자 전해질 층의 마지막 층은 양전하로 유도되었고 단백질은 음전하를 띄고 있으므로 단백질이 기판 위에서 정전기적 인력에 의해서 고정화되었다.Proteins were micro contact printed on the multilayer thin film of the polymer electrolyte prepared in Example 1 using the PDMS micro stamp prepared in Example 2 (FIG. 3). The protein used was 10 μg / ml of bovine serum albumin-fluorescein isothiocyanate (FITC-BSA). The isoelectric point of BSA is 4.6, resulting in a negative charge in a pH 7.2 phosphate buffer solution that BSA can maintain stably. Therefore, in the present embodiment, the last layer of the multilayer thin film of the polymer electrolyte was PAH. As a result, the last layer of the polymer electrolyte layer was induced with a positive charge and the protein had a negative charge, so that the protein was immobilized by electrostatic attraction on the substrate.
또한, PDMS 마이크로 스탬프를 20초간 산소 플라즈마 처리를 통하여 친수성 스탬프로 유도하였고 10 ㎍/㎖의 FITC-BSA 용액 내에 스탬프를 30분간 담지시킴으로써 단백질이 PDMS 마이크로 스탬프로 충분히 흡착될 수 있게 하였다. 과잉의 단 백질은 오히려 정확한 모양과 크기의 단백질 패턴을 얻는데 방해를 하기 때문에 질소를 이용하여 과잉의 BSA를 제거한 후 단백질이 표면으로 전사 효율을 높이기 위하여 -20℃ 냉장고에 10초간 유지시킴으로써 약간의 수분을 제공하였다. 그 후 단백질이 흡착되어있는 마이크로 스탬프를 고분자 전해질의 다층박막 위에 30분간 접촉시킴으로써 단백질이 정전기적 인력에 의해서 스탬프에서 유리 기질 위로 전사 될 수 있게 하였고, 0.1 wt% PBST(20 mM, pH 7.2) 용액을 이용하여 세척함으로써 정전기적 인력 외의 물리적 흡착에 의해 고정화된 단백질을 제거하였다.In addition, PDMS micro stamps were induced to hydrophilic stamps through oxygen plasma treatment for 20 seconds and the proteins were sufficiently adsorbed into PDMS micro stamps by soaking the stamps in 10 μg / ml FITC-BSA solution for 30 minutes. Excess protein rather interferes with obtaining protein patterns of the correct shape and size, so the excess BSA is removed using nitrogen and the protein is kept in a -20 ° C refrigerator for 10 seconds to improve the transfer efficiency to the surface. Provided. The protein-adsorbed microstamp was then contacted on the multilayered thin film of polymer electrolyte for 30 minutes to allow the protein to be transferred from the stamp onto the glass substrate by electrostatic attraction, and a 0.1 wt% PBST (20 mM, pH 7.2) solution The immobilized protein was removed by physical adsorption outside of electrostatic attraction by washing with a.
<실시예 4> 고분자 전해질 박막의 두께와 고정화된 단백질의 크기 변화 Example 4 Thickness Change of Polymer Electrolyte Thin Film and Size of Immobilized Protein
고분자 전해질의 박막 위에 단백질을 마이크로어레이어를 통해 단백질을 고정화시켰을 경우 단백질이 고분자 전해질 박막 내부로 확산(diffusion)되어 일정한 패턴 모양과 크기를 구현할 수 없다. 기판 위로 고정화되는 단백질의 크기가 일정하지 않은 경우 센서로서의 응용시에 치명적일 수 있다. 왜냐하면 동일한 조건에서 고정화시킨 단백질의 면적이 일정치 않음으로 인해서 형광신호가 증폭 혹은 감소되어 진단의 오차 범위를 넓히기 때문이다. 즉 정량분석이 요구되는 단백질의 칩 혹은 센서에 사용하기 위해서는 고분자 전해질 다층박막 위의 고정화되는 단백질 패턴의 크기는 다층박막의 두께와 관계없이 동일하게 생성되어야 한다. When the protein is immobilized on the thin film of the polymer electrolyte through the microarray, the protein is diffused into the polymer electrolyte thin film and thus cannot realize a certain pattern shape and size. If the size of the protein to be immobilized onto the substrate is not constant, it can be fatal in application as a sensor. Because the area of the immobilized protein under the same conditions is not constant, the fluorescence signal is amplified or reduced to widen the error range of diagnosis. In other words, the size of the protein pattern immobilized on the polymer electrolyte multilayer thin film should be generated the same regardless of the thickness of the multilayer thin film in order to be used in the chip or sensor of the protein requiring quantitative analysis.
이와 같은 문제를 본 발명은 상기 실시예 3의 마이크로 컨택트 프린팅 기법으로 고정화함으로써 극복할 수 있었다(도 4). 구체적으로, 본 발명에서의 표면처리는 상기의 도 2의 방법과 동일하게 PAH와 PSS를 이용하여 다층박막을 1층부터 19 층까지 처리하였다. PDMS 마이크로 몰드는 40 ㎛, 90 ㎛의 원모양의 패턴으로 이용하였으며 10 ㎍/㎖의 FITC-BSA를 이용하여 도 3의 방법으로 각 표면 위를 마이크로 패터닝하였다. 다층박막 위로 전사된 단백질의 마이크로 패턴의 크기는 각각 39.9±1.0 ㎛와 90.5±0.9 ㎛로써 오차범위가 2% 이내로 기존의 방법에 비해 현저하게 개선된 결과를 나타냄으로써 단백질이 다층박막 위로 전사되는 것은 확산에 의존하지 않음을 알 수 있었다. 때문에 본 발명은 정량분석을 위한 단백질 칩 혹은 센서의 제작에 매우 중요하게 사용될 수 있는 기술이 될 수 있음을 나타낸다.This problem could be overcome by immobilizing the microcontact printing technique of Example 3 (Fig. 4). Specifically, the surface treatment in the present invention treated the multilayer thin film from 1 layer to 19 layers using PAH and PSS as in the method of FIG. PDMS micro molds were used in a circular pattern of 40 μm, 90 μm and micropatterned on each surface by the method of FIG. 3 using 10 μg / ml FITC-BSA. The size of the micropattern of the protein transferred onto the multilayer thin film was 39.9 ± 1.0 μm and 90.5 ± 0.9 μm, respectively, and the error range was within 2%, which is a significant improvement over the conventional method. It was found that it does not depend on diffusion. Therefore, the present invention shows that it can be a technology that can be used very important in the manufacture of protein chips or sensors for quantitative analysis.
<실시예 5> 다양한 표면 위에서의 immuno-assay를 이용한 효율성 비교 Example 5 Comparison of Efficiency Using Immunoassay on Various Surfaces
본 발명에서는 고분자 전해질 다층박막의 정전기적 인력을 이용하여 단백질을 고정화하였다. 종래의 기술은 단순 물리적 흡착, 다층이 아닌 단일층의 정전기적 인력, 화학 공유결합에 의한 결합을 이용하여 단백질을 표면에 고정화하는 것이다. 단순 물리적 흡착은 결합력이 매우 약하다는 단점이 있었으며, 결합력만 고려한다면 공유결합에 의한 고정화가 가장 좋은 방법이라고 할 수 있지만, 단백질 칩/센서를 위한 단백질의 고정화는 단순히 단백질을 가장 안정적인 방법으로 고정화하는 것이 목적이라고 할 수 없다. 왜냐하면 단백질을 고정화하는 목적은 고정화된 단백질을 하나의 탐침으로 사용하여 인지물질을 감지하는 것이기 때문이다. 즉 고정화된 단백질과 특이적으로 결합해야 하는 단백질이 나타났을 때, 그 단백질과 결합하여 검출신호를 나타내야 하기 때문이다. 때문에 단백질의 고정화만큼 중요한 것이 고정화된 단백질이 자신의 단백질 활성을 얼마나 유지할 수 있느냐 하는 것이 다.In the present invention, the protein is immobilized using the electrostatic attraction of the polymer electrolyte multilayer thin film. The prior art is to immobilize proteins to surfaces using simple physical adsorption, electrostatic attraction of a single layer rather than multiple layers, and binding by chemical covalent bonds. Simple physical adsorption has the disadvantage of very weak binding force, and considering the binding force, covalent immobilization may be the best method, but immobilization of protein for protein chip / sensor simply fixes the protein in the most stable way. That is not the purpose. This is because the purpose of immobilizing proteins is to detect cognitive substances using the immobilized protein as a probe. That is, when a protein to be specifically bound to an immobilized protein appears, it must bind to the protein and display a detection signal. As important as protein immobilization is how much an immobilized protein can retain its protein activity.
본 발명에 따라 고정화된 단백질이 활성을 유지하는 정도는 다른 방법 즉 물리적 흡착, 단일층의 정전기적 인력, 공유결합으로 고정화된 단백질과 비교했을 때 매우 우수하다(도 5). 이하, 그 결과를 보다 구체적으로 설명한다.The degree to which the immobilized protein maintains activity according to the present invention is very excellent compared to other immobilized proteins, ie physical adsorption, electrostatic attraction in a single layer, and covalent bonds (FIG. 5). Hereinafter, the results will be described in more detail.
<5-1> 표면 처리예<5-1> Surface Treatment Example
도 5a는 각 표면에 대한 immunoassay 결과의 사진이고, 도 5b는 형광신호의 세기를 분석했을 때 나타나는 형광 신호의 세기를 표로 나타낸 것이다. 그리고 고분자 전해질의 다층박막과 비교를 하기 위해 사용된 표면은 처리를 전혀 하지 않은 유리 기판, 아민기가 유도된 기판, 알레하이드가 유도된 기판, 에폭사이드 유도된 기판, 폴리-L-라이신 기판이다.Figure 5a is a photograph of the immunoassay results for each surface, Figure 5b is a table showing the intensity of the fluorescence signal appearing when analyzing the intensity of the fluorescence signal. And the surface used for comparison with the multilayer thin film of the polymer electrolyte is a glass substrate which is not treated at all, an amine group-induced substrate, an aldehyde-induced substrate, an epoxide-induced substrate, a poly-L-lysine substrate.
아민기를 기질에 도입하는 방법은 다음과 같다. 먼저 슬라이드 글래스를 80℃ 피라나 용액(50%의 H2SO4 : 30%의 H2O2 = 1 : 4)에 1시간 동안 담지시켜 세척한다. 그리고 나서, 증류수, 에탄올(ethanol) 그리고 아세톤(acetone)에 각각 5분씩 초음파 세척 후 질소로 건조한 뒤에 플라즈마를 20초간 처리함으로써 슬라이드 글래스의 활성화 상태를 좋도록 한 다음 에탄올로 희석시킨 2%의 3-aminopropyl triethoxysilane 용액에 담지시킨 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 그리고 나서, 에탄올로 세척한 뒤에 95℃ 오븐에서 30분간 건조시킴으로써 표면에 아민기를 도입시켰다.The method of introducing an amine group into a substrate is as follows. First slide glass to 80 ° C Pirana solution (50% H 2 SO 4 : Wash by soaking in 30% H 2 O 2 = 1: 4) for 1 hour. Then, ultrasonic cleaning was performed in distilled water, ethanol and acetone for 5 minutes each, followed by drying with nitrogen, and then plasma treatment for 20 seconds to improve the activation state of the slide glass. After being supported in an aminopropyl triethoxysilane solution, the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. The amine group was then introduced to the surface by washing with ethanol and drying in an oven at 95 ° C. for 30 minutes.
알데하이드기를 기질에 도입하는 방법은 아민기를 도입시킨 표면을 인산완충용액으로 희석시킨 2%의 gutaraldehyde 용액에 상온에서 2시간 담지시킨 후 인산완충용액으로 세척한 뒤 질소로 건조하였다.In the method of introducing the aldehyde group to the substrate, the surface of the amine group introduced was immersed in a 2% gutaraldehyde solution diluted with phosphate buffer solution at room temperature for 2 hours, washed with phosphate buffer solution and dried with nitrogen.
에폭사이드를 기질에 도입하는 것은 다음과 같다. 먼저 유리 기판을 80℃ 피라나 용액(50%의 H2SO4 : 30%의 H2O2 = 1 : 4)에 1시간 동안 담지시켜 세척하였다. 그리고 나서, 증류수, 에탄올(ethanol) 그리고 아세톤(acetone)에 각각 5분씩 초음파 세척 후 질소로 건조한 뒤에 플라즈마를 20초간 처리함으로써 유리 기판의의 활성화 상태를 좋도록 한 다음 에탄올로 희석시킨 1%의 3-glucidoxypropyltrimethoxysilane 용액에 1시간 동안 담지한 후 에탄올로 3번 세척 해 주었다. 그 후 처리된 표면은 135℃ 오븐에서 2시간 동안 건조되면서 표면처리가 더욱더 안정하게 되도록 하였다.Introduction of the epoxide to the substrate is as follows. First, the
<5-2> immunoassay<5-2> immunoassay
먼저 immunoassay의 탐침으로 사용된 단백질은 Rabbit IgG(sigma aldrich, I5006)이고 Rabbit IgG의 등전점은 6.1-6.5로써 이 단백질에 적절한 완충용액인 20 mM, pH 7.2 인산완충용액에서 단백질의 알짜 전하는 음전하를 띄게 되므로 마지막 층이 양이온으로 하전된 고분자 박막 위에서 10 ㎍/㎖의 rabbit IgG를 마이크로 컨택트 프린팅 방법으로 고정화시켰다. 또한 고분자 전해질 박막과 비교하기 위해 준비한 다양한 기판 즉 유리기판, 알데하이드가 도입된 기판, 아민기가 도입된 기 판, 에폭시가 도입된 기판, 폴리-L-라이신 기판위에도 동일한 방법으로 rabbit-IgG를 고정화하였다. 그리고 나서, 인산완충 용액으로 충분히 세척하여 표면에 안정적으로 고정화된 단백질만 남기고 1%의 BSA 용액을 이용하여 30분간 블록킹 처리하였다. 인산완충용액으로 충분히 세척한 후에 rabbit IgG의 감지 물질인 10 ㎍/㎖의 Goat-anti rabbit IgG-FITC(sigma-aldrich, F9887)와 30분간 반응시킨 후 0.1 wt% PBST(20 mM, pH 7.2)용액으로 충분히 세척하였다. 형광현미경을 통하여 FITC의 형광세기를 관찰함으로써 표면에 고정화된 Rabbit IgG의 밀도와 고정화된 단백질의 활성 정도를 유추해 낼 수 있었다.First, the protein used as an immunoassay probe was Rabbit IgG (sigma aldrich, I5006), and the isoelectric point of Rabbit IgG is 6.1-6.5, and the net charge of the protein in 20 mM, pH 7.2 phosphate buffer solution appropriate for the protein is negatively charged. As a result, 10 μg / ml rabbit IgG was immobilized by a microcontact printing method on the polymer film of which the last layer was charged with cations. In addition, rabbit-IgG was immobilized on a variety of substrates prepared for comparison with a polymer electrolyte thin film, ie, a glass substrate, an aldehyde-introduced substrate, an amine-introduced substrate, an epoxy-introduced substrate, and a poly-L-lysine substrate. . Then, the solution was sufficiently washed with phosphate buffer solution and blocked for 30 minutes using 1% BSA solution, leaving only proteins that were stably immobilized on the surface. After washing sufficiently with phosphate buffer solution, it was reacted with 10 μg / ml Goat-anti rabbit IgG-FITC (sigma-aldrich, F9887), which is a detectable substance of rabbit IgG, for 30 minutes, and then 0.1 wt% PBST (20 mM, pH 7.2). Washed well with solution. By observing the fluorescence intensity of FITC through the fluorescence microscope, the density of rabbit IgG immobilized on the surface and the degree of activity of the immobilized protein could be inferred.
형광세기가 강한 이유는 첫째, 고체 표면 위에 고정화된 단백질의 밀도가 높기 때문이고, 둘째는 고체 표면 위에 고정화된 단백질의 3차 입체구조가 잘 유지되어서 단백질의 활성이 잘 유지되기 때문에 인지감도가 높은 상태로 유지될 수 있기 때문에 2차 항체와의 결합력이 높기 때문이라고 생각할 수 있다. 형광세기가 가장 낮은 것은 어떠한 처리도하지 않은 유리기판 위에 단백질을 고정화했을 때로서 형광세기가 35.40±0.99로 매우 낮다. 단순 물리적 흡착에 의한 방법으로는 단백질을 고밀도로 고정화시키기 어렵다는 것을 보여주고 있다. 공유결합에 의한 방법으로 단백질을 고정화시키기 위해 사용된 표면은 알데하이드, 에폭사이드로 처리된 표면이다. 알데하이드 표면에서의 형광세기는 80.67±12.22이고 에폭사이드로 처리된 표면 위에서의 형광세기는 80.09±10.61로써 정전기적 인력에 의해 고정된 단백질보다 고밀도로 고정되었지만 고정된 단백질의 3차 입체구조가 유지되기 어려운 조건이기 때문에 Rabbit IgG가 활성을 많이 손실하여 Goat anti-rabbit IgG-FITC와 반응률이 낮아지게 됨으로써 결합량이 비교적 저조하게 된다. 다른 경우에 비해 표준편차가 상대적으로 높은 편인데 이것 역시 고정화된 단백질 중에서 활성을 유지하고 있는 것과 활성을 손상된 것이 무작위로 혼재되어있기 때문에 나타나는 현상이다. 반면에 단백질과 표면이 정전기적 인력에 의해 고정되도록 하기 위해서 제작된 표면인 폴리-L-라이신, 아민(amine) 그리고 고분자 전해질의 다층박막에서는 높은 형광 신호가 나타났다. 이것으로 보아 정전기적 인력에 의한 고정화가 공유결합에 의한 고정화에 비해서 단백질의 고정화 밀도는 낮아지겠지만 활성을 유지하고 있는 단백질의 양은 정전기적 인력에 의한 고정화일 때 더 많다는 것을 알 수 있었다. 그 중에서 고분자 전해질의 다층박막에서 신호세기가 110.20±4.40으로 표준편차도 비교적 작고 형광신호도 가장 좋았다. 이것은 전하를 가지고 있는 표면 단층박막으로 존재할 때 보다는 다층박막일 경우 표면 내에 존재하는 전하의 양이 많기 때문에 고정화 효율이 높기 때문이다.The fluorescence intensity is strong because, firstly, the density of the protein immobilized on the solid surface is high, and secondly, because the tertiary conformation of the protein immobilized on the solid surface is well maintained, the activity of the protein is well maintained. It can be considered that the binding force with the secondary antibody is high because it can be maintained in a state. The lowest fluorescence intensity is when the protein is immobilized on an untreated glass substrate and the fluorescence intensity is very low, 35.40 ± 0.99. It has been shown that it is difficult to immobilize proteins at high density by simple physical adsorption. The surface used to immobilize the protein by the covalent method is a surface treated with aldehyde, epoxide. The fluorescence intensity at the aldehyde surface is 80.67 ± 12.22 and the fluorescence intensity on the epoxide treated surface is 80.09 ± 10.61, which is fixed at higher density than the protein fixed by electrostatic attraction, but the tertiary conformation of the fixed protein is maintained. Because of the difficult conditions, rabbit IgG loses a lot of activity and the reaction rate with Goat anti-rabbit IgG-FITC is lowered, resulting in a relatively low binding amount. Compared to other cases, the standard deviation is relatively high, which is also caused by a random mixture of immobilized and retained activities. On the other hand, high fluorescence signal was observed in multilayer thin films of poly-L-lysine, amine, and polymer electrolyte, which are manufactured to fix proteins and surfaces by electrostatic attraction. This suggests that the immobilization by the electrostatic attraction will be lower than the covalent bond immobilization density of the protein, but the amount of the active protein is more when the immobilization by the electrostatic attraction. Among them, the signal strength was 110.20 ± 4.40 in the multilayer thin film of the polymer electrolyte, and the standard deviation was relatively small and the fluorescence signal was the best. This is because the immobilization efficiency is high because the amount of charge present in the surface of the multilayer thin film is higher than that of the surface monolayer thin film having charge.
도 1은 단백질을 고정화하기 위해 기질에 고분자 전해질의 다층박막을 증착함으로 표면처리 하는 방법을 나타낸 것이다.1 shows a method of surface treatment by depositing a multilayer thin film of a polymer electrolyte on a substrate to immobilize proteins.
도 2는 소프트 리소그래피의 방법으로 PDMS 마이크로 스탬프를 얻는 과정이다. 2 is a process of obtaining a PDMS micro stamp by the method of soft lithography.
도 3은 마이크로 스탬프에 단백질을 도입하여 상기 도 1에서 얻어진 표면 위에 마이크로 컨택트 프린팅 방법을 이용하여 단백질을 고정화하는 방법에 관한 것이다.FIG. 3 relates to a method of immobilizing a protein using a micro contact printing method on a surface obtained in FIG. 1 by introducing a protein into a micro stamp.
도 4는 본 발명의 고정화 방법을 통해 다층박막 위에 고정화 하였을 때 다층박막의 수에 따라 고정화된 단백질 패턴의 크기를 나타내는 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the size of the immobilized protein pattern according to the number of the multilayer thin film when immobilized on the multilayer thin film through the immobilization method of the present invention.
도 5a는 다양한 표면과 정전기적 고분자 다층박막 위에서 고정화된 단백질의 탐침으로서의 효율을 비교한 형광 사진이고,5A is a fluorescence photograph comparing the efficiency as a probe of proteins immobilized on various surfaces and electrostatic polymer multilayer thin films,
도 5b는 상기 도 5a의 형광 사진의 형광이미지를 정량 분석한 그래프이다.5B is a graph quantitatively analyzing the fluorescence image of the fluorescence image of FIG. 5A.
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