CN111381030B - 一种定量检测液态奶中霉菌毒素的方法和检测条 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种改良的胶体金检测条，并具体示例了采用该检测条定量检测牛奶中赭曲霉毒素A的方法。该方法简便经济、快速准确，检测结果与HPLC法无显著差异，能够满足多种的检测需求。

Description

一种定量检测液态奶中霉菌毒素的方法和检测条

技术领域

本发明涉及一种定量检测液态奶中霉菌毒素的方法和检测条，尤其涉及采用流速归一化设计及多平行检测的方法，属于生物检测领域。

背景技术

目前，国内外关于霉菌毒素的检测方法一般有高效液相法、酶联免疫法和胶体金方法。其中，高效液相法准确度和灵敏度度高，精度较好，但是需要昂贵的精密仪器和试剂，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，不适宜大规模现场快速检测；另外，酶联免疫法操作步骤较多，检测时间通常为30分钟-120分钟，并且存在基质效应。而胶体金法操作简单，检测速度快，特异性和灵敏度高，成本低，这是胶体金法区别于其他方法的最大特点及优势。然而，现有的胶体金方法也存在一定缺陷。胶体金试纸条通常是利用一条检测线(T线)和一条质控线(C线)来定性或半定量地估计出样品中的霉菌毒素，或者采用了多条检测线(T线)，但不同检测线分别包被不同的抗原，因而对于一个目标检测成分而言，实际上也只采用一条检测线来检测，导致检测准确度不高。

近年来，中国国民对液态乳品的消费量逐渐增大，乳液的安全与国民的健康水平密切相关，同时，乳制品安全事件频发，使人们对乳制品的安全性越来越重视，因此有必要建立乳制品中霉菌毒素残留的检测方法。然而，与粮食谷物等不同，液态乳品中含有大量的蛋白、脂类、糖类等大分子，它们在检测条的层析渗透过程中流动性各不同，容易造成奶样中的各成分在测试条的微孔膜里流速不均一，导致测定结果不准确。

另外，常规的检测条通常为固定的结构和材料，其渗透率、流速等参数相对固定，因而能够检测的目标物质也相对单一，无法用灵活地满足不同的检测需求。

由于液态乳品属于保鲜期短不适合长途运输的物质，对其进行现场快速检测具有很深远意义。因此，需要一种既简便、经济，又能快速、准确定量检测液态乳品中霉菌毒素含量的技术。

发明内容

为了克服上述不足，提高检测准确度，本发明提供一种定量检测液态奶中霉菌毒素的方法和检测条。本发明的第一个改进点在于通过进行流速归一化设计来稳定液态奶中各成分的流速，从而提高检测结果的准确性。

本发明的第二个改进点在于将产生流速归一化的部分设置为能够被随时置入或移除的方式，从而能灵活适应不同的检测需求。

本发明的第三个改进点在于设置了包被具有梯度浓度的同一抗原的多平行检测线(例如为双平行检测线)来实现准确定量的目的。

在一种实施方式中，流速归一化设计为在检测条的样品垫背面紧贴一海绵层，优选的，该海绵层为梯形或近似梯形。人们知道，海绵由于其吸水性强，通常被用于快速吸收液体，避免液体飞溅；或者由于其质地柔软蓬松，被用于防撞或保温等，而本发明采用海绵并非是利用这些已知的性能。发明人经研究发现，海绵的孔隙结构实际上能使待测奶样中的成分(尤其是大分子)得以缓慢释放，于是大胆尝试在检测条原有的样品垫下面另外加垫一层海绵材料，使液态奶中的各成分经海绵的归一化作用获得相对一致的、稳定的流速，从而提高检测结果的准确性。尤其是，发明人对海绵层的形状进行研究发现，海绵层为梯形或近似梯形时效果最好，此时梯形海绵的短边(或上底)与胶体金垫相接或部分重叠。或许是因为梯形具有两个斜边，与具有固定宽度的矩形相比，更能有效地促进不同成分聚拢而形成流速归一化。

可以理解，由于海绵垫是针对常规检测条的额外设置的部分，其本身不是加样垫或不属于加样垫的一部分，因而可以采用目前已知的、能够方便地随时置入或移除的手段将海绵垫置于加样垫的背面，当用于其他测试情境(例如无需准确定量乳液成分)时，可方便地、快速完好地移除海绵垫。也就是说，液体样品不是直接加载在海绵垫上，而是先流经样品垫(完成液体样品的吸入)，再通过海绵垫(归一化流速)后流入金标垫。海绵垫的作用是单独的、用于控制样品流速、使其中各成分流速归一化的部件，可被随时置入或移除而不影响整个检测条的结构完整性或正常功能的完全性。这样的设计的好处是，能够灵活满足不同的检测需求。

在一种实施方式中，设置具有梯度浓度的多平行检测线是通过在硝酸纤维素膜上包被两条检测线(T1线和T2线)和一条质控线，胶体金抗体先后与两条检测线上包被的不同浓度的同一抗原反应，相当于检测同一目标物质时做了一次平行实验，因此检测结果更准确，检测范围更宽。所述“不同浓度”优选为梯度浓度，例如依次为1.0mg/mL、2.0mg/mL等。普通技术人员可以理解，设置两条以上的平行检测线，并使其包被多个浓度梯度的同一抗原来检测同一目标物质也均可适用该方法和思路。

本发明通过单独或联合(两者或三者)运用上述三个改进点实现了对液态奶中霉菌毒素的准确定量检测，并适用于多种检测情境。而且，本发明还对抗原、抗体浓度等进行了优化，获得了最佳的检测效果。

在一种实施方式中，霉菌毒素为赭曲霉毒素A。

本发明的样品垫可为玻璃纤维、尼龙材料等。

本发明的液态奶为牛奶或普通牛奶、水牛奶、骆驼奶、马奶或羊奶等。

本发明的检测条可有外包装。

本发明的检测条可进行水平检测或垂直检测。

本发明是对常规胶体金检测条的进一步改良，除本发明特别提到的外，检测条的其他材料组分、相关试剂及其浓度、制备方法等均可参照常规胶体金检测条的制备方法。

附图说明

图1取出海绵垫后的本发明检测条。其中：1-样品垫，2-金标结合垫，3-硝酸纤维素膜，4-吸水垫，5-PVC底，6-检测线(T1线和T2线)，7-质控线C线。

图2本发明检测条的线性关系。

具体实施方式

本发明的实施例1-10以测定牛乳中的赭曲霉毒素A为例，具体示例了本发明的检测方法和本发明的检测条(海绵垫+多平行检测线)制备过程。应当注意，这种示例不应当理解为对本发明的限制，本领域技术人员有能力将本发明的方法进行适当调整以便用于其他适宜的目标检测物的检测。

实施例

实施例1、检测条的制备及结果判读方法

一、制备检测条，步骤如下：

1)如图1所示，不含海绵垫的胶体金检测条示意图包括PVC底板(5)、硝酸纤维素膜(3)、金标结合垫(2)、吸水垫(4)和样品垫(1)，所述硝酸纤维素膜、金标结合垫、吸水垫和样品垫固定在所述PVC底板上。将PVC底板(5)平放在操作台上，在距PVC板上端30mm处贴上硝酸纤维素膜(3)，所述硝酸纤维素膜从样品垫端到吸水垫端依次设有检测线T1线、检测线T2线和质控线C线，所述检测线T1线、T2线和质控线C线、相互平行且与所述胶体金试纸条长度方向相垂直，其特征在于，所述检测线T1和T2线上包被有赭曲霉毒素A－卵清白蛋白OVA偶联物，所述质控线C包被有山羊抗小鼠IgG二抗。

2)将吸水垫(4)与硝酸纤维素膜上端重叠2mm贴上，上端与PVC底板取齐。

3)将金标结合垫(2)压硝酸纤维素膜下端2mm处贴上，所述金标结合垫的材料是吸附胶体金标记的赭曲霉毒素A单抗的玻璃纤维膜。

4)将样品垫(1)的背面可移除地置入一层海绵垫后，压于金标结合垫(2)上约2mm，下端与塑料板下端取齐贴上。

5)将装配好的试纸用自动斩切机切成宽约3.5mm的条带。切好的金标免疫层析试纸条装入放有干燥剂的铝箔袋，密封，4℃保存。

二、硝酸纤维素膜的包被

1、用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)将抗原(赭曲霉毒素A-卵清白蛋白OVA偶联物)稀释至1.0mg/mL和2.0mg/mL，分别作为T1线和T2线的包被浓度，将山羊抗小鼠IgG二抗稀释至1.5mg/mL，放入三维点膜喷金仪的试剂瓶中；

2、将硝酸纤维素膜固定于三维点膜喷金仪平台上，用喷头分别于设定的T1线、T2线喷涂抗原(赭曲霉毒素A－卵清白蛋白OVA偶联物)，C线处喷涂二抗(山羊抗小鼠IgG二抗)，喷量均为1μL/cm；

3、喷涂结束后，将膜置于37℃干燥箱中干燥2h，然后将干燥后的硝酸纤维素膜浸入膜封闭液(0.01mol/L PBS缓冲液内含1％BSA)中2h，再用PBST(Tween-20浓度为0.05％的0.01mol/L PBS缓冲液)洗涤3次，37℃干燥箱中干燥2h，置于放入干燥剂的密封袋中，4℃保存备用。

三、金标垫的制备

1、向25nm胶体金溶液中按终浓度20μl/ml加入适量0.1mol/L K₂C0₃溶液；将2mg/mL赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白BSA抗体溶液逐滴缓慢加入胶体金溶液中，使其终浓度为7.2μg/ml，继续搅拌30min；加入10％BSA至终浓度为1％，以稳定金颗粒的残留表位；再继续搅拌30min后静置2h。

2、2000r/min、4℃离心20min，弃去沉淀；将上清再以10000r/min、4℃离心30min，弃去上清；以原体积的金标抗体重悬液(0.01mol/L PB缓冲液内含1％BSA和5％蔗糖)溶解沉淀；

3、重复2步骤2～3次，最后将沉淀重悬于1/10原体积的金标抗体复溶液(0.01mol/L PB缓冲液内含1％BSA、5％蔗糖、0.1％Tween-20、0.05％甘油和0.2％PEG 20000)中，获得金标抗体溶液。

4、将优化的玻璃纤维膜浸泡于6倍稀释的金标抗体溶液中，2min后取出，置于晾干架上，37℃干燥1h，即为金标垫。

四、结果判读方法

1)将孵育器预热至45±1℃；

2)将50μl样品加入1000μl稀释缓冲液中，混匀；

3)将试纸条放入孵育器；

4)移取稀释后的样品300±15μL至样品垫；

5)盖上孵育器盖子并锁定，孵育10min；

6)取出试纸条，观察T线和C线的显色情况，判断试纸条是否有效；

7)将有效试纸条插入读数仪中读取结果。

实施例2、海绵垫(梯形)对测量准确度的影响

分别采用本发明所述检测条(即带海绵垫)、取出海绵垫的检测条和HPLC方法，检测牛奶赭曲霉毒素A加标样品，加标浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml和20ng/ml，每个浓度做10个平行，结果取平均值，同时计算变异系数(CV)，检测结果见表1-表2。

表1带海绵垫检测条检测结果

表2无海绵垫检测条检测结果

由表1和表2可以看出，带海绵垫检测条的准确度为99.21-105.27％，平均准确度为101％，变异系数为1.2-4.15％，平均变异系数为2.74％；无海绵垫检测条的准确度为70.47-80.24％，平均准确度为74.5％，变异系数为8.58-14.27％，平均变异系数为11.78％。因此，本发明的检测条不论从准确度还是变异系数来看，均优于无海绵垫检测条。

实施例3、研究金标抗体的稀释度

将不同稀释度的金标抗体制成金标垫，与硝酸纤维素膜(T1线、T2线和C线的包被浓度均为2mg/mL)组装成试纸条，用添加有赭曲霉毒素A标准品的奶样进行检测，结果见表3。

表3金标抗体不同稀释度的比较

注：T1/T2/C各线的显色，+表示显色深，±表示显色淡，-表示无显色。由表3可以看出，金标抗体作2～4倍稀释时，T线和C线显色无明显变化；而到6倍稀释时，T线对浓度在10ng/mL以上的赭曲霉毒素A样品开始出现显色变化；到8倍稀释时，C线在赭曲霉毒素A浓度较低时不显色或显色较淡，说明金标抗体的量不能满足在C线处正常显色，从而影响结果的正常判定。因此，选择6倍稀释的金标抗体制作金标垫。

实施例4、研究抗原的包被浓度

用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)将包被抗原分别稀释到0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL和2.0mg/mL，二抗稀释到固定浓度2mg/mL，喷涂于在硝酸纤维素膜上，与最佳稀释度的金标抗体制成的金标垫组装成试纸条，用阴性奶样配制的OTA标准系列溶液进行检测，结果见表4。

表4抗原包被浓度的确定

由表4可以看出，当包被浓度为0.25～0.5mg/mL时，用阴性奶样低浓度奶样检测时T线结合金标抗体量不足，容易误判为假阳性。当T1/T2线的包被浓度为1.0/1.5mg/mL或1.5/2.0mg/mL时，检测范围分别偏低或偏高。T1/T2线的包被浓度为1.0/2.0mg/mL时，能够满足本研究对灵敏度和检测范围的要求，因此，选择抗原浓度1.0mg/mL和2.0mg/mL分别作为T1线和T2线的包被浓度。

实施例5、研究二抗的包被浓度

不同浓度的二抗与最佳包被浓度的抗原、最佳稀释度的金标抗体组装成的试纸条，用添加有OTA标准品的奶样进行检测，并采用比色卡对C线的显色深浅进行评估，级别分为1～10级，数字越大，显色越深。

表5二抗包被浓度的确定

注：T1/T2/C各线的显色，+表示显色深，±表示显色淡，-表示无显色，数字表示对应于比色卡的显色级别。

由表5可以看出，二抗浓度为0.5～1.0mg/mL时，C线显色过浅；当二抗浓度为1.5mg/mL时，C线显色随OTA加标浓度升高而略有加深，检测阴性样品时的C线与T线的显色颜色相近、深浅适宜；当二抗浓度为2.0mg/mL时，检测阴性样品时的C线颜色较T线略深，且不再随OTA加标浓度变化而变化。因此，选择1.5mg/mL作为二抗包被浓度。

实施例6、研究检测条的线性范围

用阴性牛奶配制成浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL和200ng/mL的加标溶液，分别使用本发明所述检测条和HPLC法检测加标溶液，每个浓度做6次重复，检测结果取平均值。以HPLC法检测结果为横坐标，本发明所述检测条的检测结果为纵坐标，绘制标准曲线，同时确定检测条的线性范围。检测结果见表6，线性关系见图2。

表6不同浓度OTA对应的检测条和HPLC法检测结果

可见，赭曲霉毒素A浓度在2～100ng/mL范围内具有良好的线性，回归方程为y＝1.0047x-0.4359，R²＝0.9995，因此，定量线性范围为2～100ng/mL。

实施例7、研究检测条的检测限

使用本发明所述检测条检测20份阴性牛奶样品，计算平均值(AVG)和标准偏差(SD)，再按照AVG加上3倍SD计算检测限(LOD)，AVG加上10倍SD计算定量限(LOQ)。检测结果见表7。经计算，检测条的LOD为0.8ng/mL，定量限为2ng/mL。而实际上，发明人在实验中优化其他工艺条件后，定量检测限可达0.48ng/mL。

表7阴性奶样检测结果

阴性奶样	检测值(ng/mL)
		1	0
2	0.3
		3	0.4
4	0.2
		5	0.4
6	0.4
		7	0.4
8	0.4
		9	0.4
10	0
		11	0.5
12	0
		13	0.4
14	0.4
		15	0.1
16	0
		17	0.2
18	0.1
		19	0.2
20	0.4
		AVG	0.26
SD	0.17
		LOD	0.8
LOQ	2.0

实施例8、研究检测条的特异性

向阴性牛奶样品中分别添加赭曲霉毒素A及其它真菌毒素(包括AFM1、AFB1、ZEA、DON、T-2、FB1、PAT和CIT)标准品，加标浓度为5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL，使用本发明所述检测条检测上述加标样品，每个浓度做3个平行，结果取平均值。检测结果见表8。

表8几种真菌毒素的加标样品检测结果

由表8可见，试纸条除了可以检测出OTA外，其它几种真菌毒素均未能检出，当真菌毒素的浓度在1000ng/mL以下时，试纸条与这几种真菌毒素不发生交叉反应，说明该试纸条对OTA有较好的特异性。

实施例9、研究检测条的准确度

向阴性牛奶样品中添加赭曲霉毒素A标准品，加标浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、65ng/mL、75ng/mL和80ng/mL，分别使用本发明所述检测条和HPLC法进行检测，每个浓度10次重复。采用配对t检验法比较两种方法的检测结果是否存在显著性差异，结果见表9。

表9配对t检验表

经计算，t_D＝0.946，查t分布表，t_0.05,8＝2.306，t_D＝0.946<t_0.05,8＝2.306，说明液相参考值与本发明所述检测条测定值之间无显著差异。

将高效液相色谱法的测定结果作为认定值，本发明所述检测条的测定结果与之比较，按正确度(％)＝检测值/认定值×100计算。正确度范围为98.6％～105.27％之间，平均为100.31％。

每个浓度的10次重复间的变异系数(CV值)为1.14-4.15％。

实施例10、研究检测条的精密度

使用3批次本发明所述检测条检测牛奶加标样品(共5个浓度)，每个浓度做3平行，结果取平均值，检测结果见表10。

表10不同批次检测条检测结果

由表10可见，测定牛奶加标的5个浓度的变异系数为2.09-4.03％，均低于10％，表明精密度高。

Claims (2)

1.一种提高定量检测液态奶中赭曲霉毒素A的检测准确度的方法，包括采用检测条进行检测，所述检测条含有样品垫、金标垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水垫、以及底板，其特征在于，所述样品垫的背面另外设置有海绵垫，所述检测线为多条平行检测线，并依次包被不同浓度的同一抗原；

所述液态奶不是直接加载在海绵垫上，而是先流经样品垫，再通过海绵垫后流入金标垫；海绵垫能被随时置入或移除而不影响整个检测条的结构完整性或正常功能的完全性；

所述的海绵垫为梯形或近梯形；

所述检测条的制备步骤如下：

1)不含海绵垫的胶体金检测条包括PVC底板、硝酸纤维素膜、金标结合垫、吸水垫和样品垫，所述硝酸纤维素膜、金标结合垫、吸水垫和样品垫固定在所述PVC底板上；将PVC底板平放在操作台上，在距PVC板上端30mm处贴上硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜从样品垫端到吸水垫端依次设有检测线T1线、检测线T2线和质控线C线，所述检测线T1线、T2线和质控线C线、相互平行且与所述胶体金试纸条长度方向相垂直，所述检测线T1和T2线上包被有赭曲霉毒素A－卵清白蛋白OVA偶联物，所述质控线C包被有山羊抗小鼠IgG二抗；

2)将吸水垫与硝酸纤维素膜上端重叠2mm贴上，上端与PVC底板取齐；

3)将金标结合垫压硝酸纤维素膜下端2mm处贴上，所述金标结合垫的材料是吸附胶体金标记的赭曲霉毒素A单抗的玻璃纤维膜；

4)将样品垫的背面可移除地置入一层海绵垫后，压于金标结合垫上约2mm，下端与塑料板下端取齐贴上；

5)将装配好的试纸用自动斩切机切成宽约3.5mm的条带；切好的金标免疫层析试纸条装入放有干燥剂的铝箔袋，密封，4℃保存。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述液态奶为普通牛奶、水牛奶、骆驼奶、马奶或羊奶。

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