CN117420313A - 一种用于检测抗原的化学发光试剂盒及其制备、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测抗原的化学发光试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4；试剂R1包括：待测抗原抗体1，StrepII标签修饰的待测抗原抗体2，缓冲液；试剂R2包括：抗体3包被的磁性微粒复合物，缓冲液；试剂R3包括：链霉亲和素‑化学发光物偶联复合物，缓冲液，保护液试剂R4包括：化学发光激发液/发光底物，缓冲液。本发明还提供了一种上述化学发光试剂盒的制备与检测方法。本发明试剂盒中的试剂R2、R3、R4组分，不同检测项目之间可通用，这一特性使得本试剂盒可以实现不同发光项目之间的试剂标准化，从而使使用更为简便，便于医院进行各种检测，并简化了对试剂的管理。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，尤其涉及一种用于检测抗原的化学发光试剂盒及其制备、检测方法。
背景技术
化学发光免疫分析技术(Chemiluminescent Immunoassay，CLIA)是一项在生物医学领域广泛应用的高度敏感和特异性的生化分析技术。CLIA的发展源自对传统免疫分析方法(如酶联免疫吸附测定，ELISA，和放射免疫分析，RIA)的不足之处的认识。传统方法在某些方面存在灵敏度、特异性和安全性等方面的局限性，因此CLIA的出现填补了这些技术上的空白。
化学发光原理早在20世纪50年代就开始被研究，但直到20世纪70年代后期才开始在免疫分析中得到广泛应用。化学发光的原理基于特定底物与催化剂之间的反应，这种反应会产生可见光或荧光信号，而无需外部激发光源。这一原理的开发推动了CLIA技术的迅速发展。
随着免疫学和抗体技术的不断进步，特异性抗体的制备变得更加高效和精确，使得CLIA技术的应用范围更广泛，并提高了其特异性和灵敏度。
在现代化学发光免疫分析技术中，仪器和自动化技术方面也取得了显著进展。引入自动化系统使得CLIA能够高效地处理大批样本，从而提高了实验室工作的效率。
随着临床诊断需求的不断增加，对于快速、敏感和特异性的诊断工具的需求也在增加。CLIA技术正好满足了这些需求，因此在临床诊断中得到了广泛应用。
此外，随着化学发光技术的不断进步，目前市场上主要存在三种类型的化学发光免疫分析方法，分别是直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。
直接化学发光免疫分析：这种方法利用吖啶酯直接标记抗体(或抗原)，与待测标本中对应的抗原(或抗体)发生免疫反应，形成一个稳定的固相复合物，包括固相包被抗体-待测抗原和吖啶酯标记抗体。接下来，只需加入氧化剂(如H2O2)和NaOH，使环境呈碱性，吖啶酯将在不需要外部催化剂的情况下分解并产生发光。
化学发光酶免疫分析：在这种方法中，我们使用具有催化特性的酶，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)，来标记抗原或抗体。首先，待测标本中的抗原(或抗体)与固相包被抗体发生免疫反应，形成固相复合物。然后，通过洗涤步骤，去除未结合的物质。接下来，加入化学发光底物(发光剂)，酶催化并分解底物，产生发光信号。这个信号被光量子阅读系统接收，并由光电倍增管将其转化为电信号，随后传送至计算机数据处理系统，最终计算出测定物的浓度。
电化学发光免疫分析：电化学发光免疫分析(ECLIA)使用电化学发光剂，通常是三联吡啶钌，来标记抗原(或抗体)。在这种方法中，抗原(或抗体)与待测标本中的目标物质发生免疫反应。接着，通过电子传递的过程，在电场中引发特异性的化学发光反应。这个过程包括电化学和化学发光两个步骤，产生可测量的发光信号。这个信号被光量子阅读系统接收，光电倍增管将其放大，并将信号传输至计算机数据处理系统，最终用于计算测定物的浓度。
以上三种化学发光免疫分析方法分别具有独特的特点和应用领域，在医学、生物研究和临床诊断等领域发挥了重要作用。
然而，尽管化学发光免疫分析技术具有高灵敏度、广泛的线性范围、持久的光信号、简单快速的分析方法以及结果稳定性等众多优点，但也存在一些挑战。例如，目前市场上不同厂家的化学发光试剂之间互不通用，仪器与试剂必须配套使用，这导致试剂原料替换的困难和进口依赖性的增加，同时也增加了医院对不同厂家发光试剂管理的复杂性和成本。这些问题需要在未来的发展中得到解决，以进一步推动CLIA技术的应用和改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、便捷、经济的用于检测抗原的化学发光试剂盒及其制备、检测方法，该试剂盒由试剂R1、试剂R2、试剂R3及试剂R4组成，不同检测项目之间的试剂R2、R3及R4组分可以为相同组分，仅需要改变试剂R1组分中的抗体，就能实现各种不同项目的检测，这一特性使得本试剂盒可以实现不同发光项目之间的试剂标准化，从而使使用更为简便，便于医院进行各种检测，并简化了对试剂的管理。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种用于检测抗原的化学发光试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4；
所述试剂R1包括如下组分：待测抗原抗体1，StrepII标签修饰的待测抗原抗体2，缓冲液；所述待测抗原抗体2与待测抗原抗体1不同源，用于分别结合同一待测抗原的不同表位；
所述试剂R2包括如下组分：抗体3包被的磁性微粒复合物，缓冲液；所述抗体3用于特异性识别所述待测抗原抗体1的Fc端；
所述试剂R3包括如下组分：链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，缓冲液，保护液；所述链霉亲和素-化学发光物偶联复合物用于结合所述StrepII标签修饰的待测抗原抗体2；
所述试剂R4包括如下组分：化学发光激发液/发光底物，缓冲液；所述发光激发液/发光底物用于对应所述链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，并发生光反应。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1的组分中：待测抗原抗体1选择兔源、鼠源或羊源抗体；StrepII标签修饰的待测抗原抗体2选择人源、兔源、鼠源或羊源抗体，但与所述待测抗原抗体1不同源。
作为本发明的优选方式之一，所述待测抗原抗体1具体选择鼠源抗体，StrepII标签修饰的待测抗原抗体2选择人源抗体。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2的组分中，抗体3包被的磁性微粒复合物的制备方法如下：
(1)磁珠的清洗及活化：选用0.5～3μm的磁珠，在0.1M、pH4.0～6.5的MES溶液中清洗磁珠2次，然后在室温下加入0.1M、pH4.0～6.5的MES溶液，随后根据磁珠用量和羧基含量添加1.12倍EDC，进行磁珠的活化，反应持续20min；
(2)抗体偶联：加入终浓度0.1～2mg/ml的抗体3，室温孵育偶联3h；
(3)磁珠的封闭：加入终浓度0.1～1％BSA，室温封闭3h，即得目标复合物。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R3的组分中，链霉亲和素-化学发光物偶联复合物选择链酶亲和素与直接发光剂形成的复合物、链酶亲和素与酶促化学发光中的酶偶联形成的复合物，或者，链酶亲和素与电化学发光剂偶联形成的复合物。
作为本发明的优选方式之一，所述链酶亲和素与直接发光剂形成的复合物中的“直接发光剂”，为吖啶酯类化学发光剂；
所述链酶亲和素与酶促化学发光中的酶偶联形成的复合物中的“酶”，为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP；
所述链酶亲和素与电化学发光剂偶联形成的复合物中的“电化学发光剂”为三联吡啶钌。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R4的组分中，化学发光激发液/发光底物的选择与试剂R3中的化学发光物相对应；
当试剂R3中的化学发光物为直接发光剂时，试剂R4的对应组分选择化学发光激发液“NaOH”；
当试剂R3中的化学发光物为酶时，试剂R4的对应组分选择发光底物“普米诺及其衍生物”；
当试剂R3中的化学发光物为电化学发光剂时，试剂R4的对应组分选择电发光底物“三丙胺缓冲液”。
作为本发明的优选方式之一，当检测抗原具体为GP73时：
所述试剂R1包括：0.5μg/mL鼠抗人GP73抗体，5μg/mL带有Strep-II标签的人源化GP73抗体，50mM Tris-HCl pH7.4，1％NaCl，5％甘油，1％BSA，10％海藻糖，0.1％proclin300；
所述试剂R2包括：1％人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物，50mM MOPSpH8.0，5％甜菜碱，0.1％Tween20，0.1％BSA，0.1％PC300；
所述试剂R3包括：0.5mg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联复合物，50mM Tris 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl，10％海藻糖，5％甘油，0.5％BSA；
所述试剂R4包括：2.5％AMPPD，100mM Tris-HCl pH7.4，5％NaCl，0.1％KCl，0.1％proclin 300。
作为本发明的优选方式之一，当检测抗原具体为CKMB时：
所述试剂R1包括：0.8μg/mL鼠抗人CKMB抗体，8μg/mL带有Strep-II标签的人源化CKMB抗体，50mM Tris-HCl pH7.4，1％NaCl，5％甘油，1％BSA，10％海藻糖，0.1％proclin300；
所述试剂R2包括：1％人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物，50mM MOPSpH8.0，5％甜菜碱，0.1％Tween20，0.1％BSA，0.1％PC300；
所述试剂R3包括：0.5mg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联复合物，50mM Tris 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl，10％海藻糖，5％甘油，0.5％BSA；
所述试剂R4包括：2.5％AMPPD，100mM Tris-HCl pH7.4，5％NaCl，0.1％KCl，0.1％proclin 300。
一种用于检测抗原的化学发光试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照试剂R1组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)先制备抗体3包被的磁性微粒复合物，再按照试剂R3组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
(3)先制备链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，再按照试剂R3组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R3；
(4)按照试剂R4组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R4。
一种用于检测抗原的化学发光试剂盒进行抗原检测的化学发光免疫分析方法，包括如下步骤：
(1)将待测抗原与试剂R1混合孵育，形成“抗体1-抗原-抗体2复合物”；
(2)加入试剂R2，混匀孵育，试剂R2中的抗体3包被的磁性微粒复合物与“抗体1-抗原-抗体2复合物”进行反应，形成“磁珠-抗体3-抗体1-抗原-抗体2复合物”；
(3)将步骤(2)形成的混合液置于磁场中，去除上清，加入试剂R3，混匀孵育，形成“磁珠-抗体3-抗体1-抗原-抗体2-链霉亲和素-发光物复合物”；
(4)将步骤(3)形成的混合液置于磁场中，洗涤复合物；
(5)向步骤(4)复合物中加入试剂R4，检测其化学发光强度。
检测原理：如图1所示，当待测抗原与R1试剂混合后，R1试剂中的抗体1与抗体2同时与抗原相结合并形成“抗体1-抗原-抗体2”复合物。向该复合物中加入R2试剂，由于R2试剂中的抗体3能够特异性识别抗体1，因此“抗体1-抗原-抗体2”复合物会被磁珠-抗体3所捕获，形成“磁珠-抗体3-抗体1-抗原-抗体2”复合物。向该复合物中加入R3试剂后，由于R3试剂中的“链霉素亲和素-发光物”复合物能够特异性结合抗体2上的strepII标签，因为会形成新的“磁珠-抗体3-抗体1-抗原-抗体2-链霉亲和素-发光物”复合物，该复合物遇到R4试剂中的发光底物时会产生光信号，该光信号与抗原的浓度具有正相关性。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒中的试剂R2、R3、R4组分，不同检测项目之间可通用，这一特性使得本试剂盒可以实现不同发光项目之间的试剂标准化，从而使使用更为简便，便于医院进行各种检测，并简化了对试剂的管理；
(2)本发明试剂盒中所使用的抗体基本不需要经过额外的标记修饰(除了待测抗原抗体2)，从而降低了试剂厂商在试剂盒开发过程中的技术难度，这一创新大大减少了试剂厂商在标记工艺和原料筛选方面的研发投入，同时也使得原料国产替代变的更简单，从而降低了对进口原料的依赖程度。
附图说明
图1是本发明检测原理图；
图2是实施例1化学发光试剂盒的线性图；
图3是实施例2化学发光试剂盒的线性图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
本发明的一种用于检测抗原的化学发光试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4。
试剂R1包括如下组分：待测抗原抗体1，StrepII标签修饰的待测抗原抗体2，缓冲液；所述待测抗原抗体2与待测抗原抗体1不同源，用于分别结合同一待测抗原的不同表位。
试剂R2包括如下组分：抗体3包被的磁性微粒复合物，缓冲液；所述抗体3用于特异性识别所述待测抗原抗体1的Fc端。
试剂R3包括如下组分：链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，缓冲液，保护液；所述链霉亲和素-化学发光物偶联复合物用于结合所述StrepII标签修饰的待测抗原抗体2。
试剂R4包括如下组分：化学发光激发液/发光底物，缓冲液；所述发光激发液/发光底物用于对应所述链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，并发生光反应。
进一步地，试剂R1的待测抗原抗体1选择兔源、鼠源、羊源或其他非人源抗体，优选为鼠源抗体；StrepII标签修饰的待测抗原抗体2与所述待测抗原抗体1不同源，选择人源、兔源、鼠源或羊源抗体，优选为人源抗体。
进一步地，试剂R3的链霉亲和素-化学发光物偶联复合物选择链酶亲和素与直接发光剂形成的复合物、链酶亲和素与酶促化学发光中的酶偶联形成的复合物，或者，链酶亲和素与电化学发光剂偶联形成的复合物，优选为链酶亲和素与酶促化学发光中的酶偶联形成的复合物。其中，直接发光剂为吖啶酯类化学发光剂；酶为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)；电化学发光剂为三联吡啶钌等电化学发光剂。
进一步地，试剂R4的化学发光激发液/发光底物的选择与试剂R3中的化学发光物相对应；当试剂R3中的化学发光物为直接发光剂时，试剂R4的对应组分选择化学发光激发液，如NaOH；当试剂R3中的化学发光物为酶时，试剂R4的对应组分选择发光底物，如普米诺及其衍生物；当试剂R3中的化学发光物为电化学发光剂时，试剂R4的对应组分选择电发光底物，如三丙胺(TPA)缓冲液。
实施例1
本实施例的一种用于检测GP73抗原的化学发光试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4。
试剂R1包括如下组分：0.5μg/mL鼠抗人GP73抗体(安徽千诚生物技术有限公司，货号：MC02501M)，5μg/mL带有Strep-II标签的人源化GP73抗体(安徽千诚生物技术有限公司，货号：MC02501HS)，50mM Tris-HCl pH7.4，1％NaCl，5％甘油，1％BSA，10％海藻糖，0.1％proclin 300。
试剂R2包括如下组分：1％人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物，50mMMOPS pH8.0，5％甜菜碱，0.1％Tween20，0.1％BSA，0.1％PC300。
试剂R3包括如下组分：0.5mg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联复合物，50mM Tris7.5，150mM NaCl，5mM CaCl，10％海藻糖，5％甘油，0.5％BSA。
试剂R4包括如下组分：2.5％AMPPD，100mM Tris-HCl pH7.4，5％NaCl，0.1％KCl，0.1％proclin 300。
实施例2
本实施例的一种用于检测CKMB抗原的化学发光试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4。
试剂R1包括：0.8μg/mL鼠抗人CKMB抗体(安徽千诚生物技术有限公司，货号：MC00802M)，8μg/mL带有Strep-II标签的人源化CKMB抗体(安徽千诚生物技术有限公司，货号：MC00801HS)，50mM Tris-HCl pH7.4，1％NaCl，5％甘油，1％BSA，10％海藻糖，0.1％proclin 300。
试剂R2包括：1％人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物，50mM MOPSpH8.0，5％甜菜碱，0.1％Tween20，0.1％BSA，0.1％PC300。
试剂R3包括：0.5mg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联复合物，50mM Tris 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl，10％海藻糖，5％甘油，0.5％BSA。
试剂R4包括：2.5％AMPPD，100mM Tris-HCl pH7.4，5％NaCl，0.1％KCl，0.1％proclin 300。
实施例3
本实施例的一种上述实施例1中用于检测GP73抗原的化学发光试剂盒的试剂R1制备方法：
试剂R1由0.5μg/mL鼠抗人GP73抗体、5μg/mL带有Strep-II标签的人源化GP73抗体、50mM Tris-HCl pH7.4、1％NaCl、5％甘油、1％BSA、10％海藻糖、0.1％proclin 300组成，其中，50mM Tris-HCl pH7.4、1％NaCl、5％甘油、1％BSA、10％海藻糖、0.1％proclin300为缓冲液；制备时，按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，即得目标试剂R1。
实施例4
本实施例的一种上述实施例2中用于检测CKMB抗原的化学发光试剂盒的试剂R1制备方法：
试剂R1由0.8μg/mL鼠抗人CKMB抗体、8μg/mL带有Strep-II标签的人源化CKMB抗体、50mM Tris-HCl pH7.4、1％NaCl、5％甘油、1％BSA、10％海藻糖、0.1％proclin 300组成，其中，50mM Tris-HCl pH7.4、1％NaCl、5％甘油、1％BSA、10％海藻糖、0.1％proclin300为缓冲液；制备时，按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，即得目标试剂R1。
实施例5
本实施例的一种上述实施例1、2化学发光试剂盒中通用型试剂R2的制备方法：
(1)磁珠的清洗及活化：选用0.5～3μm的磁珠，在0.1M、pH4.0～6.5的MES溶液中清洗磁珠2次，然后在室温下加入0.1M、pH4.0～6.5的MES溶液，随后根据磁珠用量和羧基含量添加1.12倍EDC，进行磁珠的活化，反应持续20min。
(2)抗体偶联：加入终浓度0.1～2mg/ml的抗体3，室温孵育偶联3h。
(3)磁珠的封闭：加入终浓度0.1～1％BSA，室温封闭3h，即得“抗体3包被的磁性微粒复合物”。
(4)磁珠的清洗及保存：置于磁场中，用含50mM MOPS pH8.0、5％甜菜碱、0.1％Tween20、0.1％BSA、0.1％PC300缓冲液清洗磁珠3次，并重悬至终浓度1％，即得到通用型试剂R2。
实施例6
本实施例的一种上述实施例1、2化学发光试剂盒中通用型试剂R3的制备方法：
(1)透析换液：将10mg碱性磷酸酶加入到3mg链酶亲和素中，装入透析袋中，置于4℃，放入PBS缓冲液中透析过夜；
(2)偶联：加入40μl的2％戊二醛溶液，室温搅拌孵育偶联3h；
(3)分子筛纯化分离：使用SuperdexTM 200分离纯化，去除未标记的链酶亲和素和碱性磷酸酶；
(4)稀释至工作液：将纯化得到的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联复合物用含50mMTris 7.5、150mM NaCl、5mM CaCl、10％海藻糖、5％甘油、0.5％BSA的混合液稀释至蛋白浓度0.5mg/mL，即得到通用型试剂R3。其中，50mM Tris 7.5、150mM NaCl为缓冲液，5mM CaCl、10％海藻糖、5％甘油、0.5％BSA为保护液。
实施例7
本实施例的一种上述实施例1、2化学发光试剂盒中通用型试剂R4的制备方法：
试剂R4由2.5％AMPPD、100mM Tris-HCl pH7.4、5％NaCl、0.1％KCl、0.1％proclin300组成，其中，100mM Tris-HCl pH7.4、5％NaCl、0.1％KCl、0.1％proclin300为缓冲液；按照试剂R4的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得通用型试剂R4。
实施例8
本实施例的一种利用上述实施例1化学发光试剂盒进行GP73抗原检测的化学发光免疫分析方法，包括如下步骤：
(1)将20μL样本与40μL试剂R1混合孵育，形成“鼠抗人GP73抗体-抗原-人源化GP73抗体复合物”。
(2)加入20μL试剂R2，混匀孵育，试剂R2中的人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物与“鼠抗人GP73抗体-抗原-人源化GP73抗体复合物”进行反应，形成“磁珠-人源化抗鼠单克隆抗体-鼠抗人GP73抗体-抗原-人源化GP73抗体复合物”。
(3)将步骤(2)形成的混合液置于磁场中，去除上清，加入40μL试剂R3，37℃孵育反应5min，形成“磁珠-人源化抗鼠单克隆抗体-鼠抗人GP73抗体-抗原-人源化GP73抗体-链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物”。
(4)将步骤(3)形成的混合液置于磁场中，洗涤复合物2次。
(5)向步骤(4)复合物中加入100μL试剂R4，37℃孵育反应6min后检测其化学发光强度。
实施例9
本实施例的一种利用上述实施例2化学发光试剂盒进行CKMB抗原检测的化学发光免疫分析方法，包括如下步骤：
(1)将20μL样本与40μL试剂R1混合孵育，形成“鼠抗人CKMB抗体-抗原-人源化CKMB抗体复合物”。
(2)加入20μL试剂R2，混匀孵育，试剂R2中的人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物与“鼠抗人CKMB抗体-抗原-人源化CKMB抗体复合物”进行反应，形成“磁珠-人源化抗鼠单克隆抗体-鼠抗人CKMB抗体-抗原-人源化CKMB抗体复合物”。
(3)将步骤(2)形成的混合液置于磁场中，去除上清，加入40μL试剂R3，37℃孵育反应5min，形成“磁珠-人源化抗鼠单克隆抗体-鼠抗人CKMB抗体-抗原-人源化CKMB抗体-链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物”。
(4)将步骤(3)形成的混合液置于磁场中，洗涤复合物2次。
(5)向步骤(4)复合物中加入100μL试剂R4，37℃孵育反应6min后检测其化学发光强度。
试验例1
本试验例用于测试实施例1用于检测GP73抗原的化学发光试剂盒的整体性能。
一、化学发光分析仪检测方法：
以菲鹏Shine i1000全自动化学发光免疫分析仪为例：先加入R1试剂40μL，加入样本20μL，加入R2试剂20μL；上磁分离器分离移除上清，加入R3试剂40μL，并37℃孵育反应5min；上磁分离器分离移除上清，用清洗液清洗2次；加入R4试剂100μL，37℃孵育反应6min后检测发光值。
试验结果计算：校准品设定浓度测定后，系统根据校准品的浓度及发光信号值自动生成校准曲线，测定样本时，仪器自动根据样本信号值得出对应的样本浓度。
二、灵敏度检测：
5％牛血清白蛋白溶液为空白样本，按照上述全自动化学发光免疫分析仪检测方法反复测定20次以上，以空白均值加上两倍标准差作为最低检测限，结果显示本发明试剂盒的最低检测限为0.1μg/L。
三、线性范围检测：
用接近300μg/L的高值样本，用生理盐水按照1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256稀释，共配制成9个梯度稀释浓度的样本溶液，用所述全自动化学发光免疫分析仪检测方法测定每个稀释的样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值。
以稀释浓度为自变量，以测定结果平均值为因变量求出线性回归方程，按照相应公式计算线性回归相关系数r。检测结果见表1，证明线性性能达到300μg/L，相关方程为y＝1.0207x-0.3877，相关系数R2＝1，见图2。
表1、实施例1试剂盒线性范围检测
| 稀释比例 | 理论浓度(μg/L) | 检测浓度(μg/L) | 回收率(％) |
| 1/256 | 1.2 | 1.33 | 113.5 |
| 1/128 | 2.3 | 2.39 | 102.0 |
| 1/64 | 4.7 | 4.52 | 96.4 |
| 1/32 | 9.4 | 9.63 | 102.7 |
| 1/16 | 18.8 | 19.02 | 101.4 |
| 1/8 | 37.5 | 36.98 | 98.6 |
| 1/4 | 75.0 | 75.36 | 100.5 |
| 1/2 | 150.0 | 152.11 | 101.4 |
| 1/1 | 300.0 | 306.42 | 102.1 |
四、重复性和精密度：
GP73的浓度为20μg/L与120μg/L的校准品作为样本，按所述全自动化学发光免疫分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，结果见表2。
表2、实施例1试剂盒的重复性和精密度检测
由表2可知：本发明GP73检测试剂盒的重复性及准确性都能达到临床应用的要求。
试验例2
本试验例用于测试本发明实施例2用于检测CKMB抗原的化学发光试剂盒的整体性能。
一、化学发光分析仪检测方法：
以菲鹏Shine i1000全自动化学发光免疫分析仪为例：先加入R1试剂40μL，加入样本20μL，加入R2试剂20μL；上磁分离器分离移除上清，加入R3试剂40μL，并37℃孵育反应5min；上磁分离器分离移除上清，用清洗液清洗2次；加入R4试剂100μL，37℃孵育反应6min后检测发光值。
试验结果计算：校准品设定浓度测定后，系统根据校准品的浓度及发光信号值自动生成校准曲线，测定样本时，仪器自动根据样本信号值得出对应的样本浓度。
二、灵敏度检测：
5％牛血清白蛋白溶液为空白样本，按照上述全自动化学发光免疫分析仪检测方法反复测定20次以上，以空白均值加上两倍标准差作为最低检测限，结果显示本发明试剂盒的最低检测限为0.05μg/L。
三、线性范围检测：
用接近200μg/L的高值样本，用生理盐水按照1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256稀释，共配制成9个梯度稀释浓度的样本溶液，用所述全自动化学发光免疫分析仪检测方法测定每个稀释的样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值。
以稀释浓度为自变量，以测定结果平均值为因变量求出线性回归方程，按照相应公式计算线性回归相关系数r。检测结果见表3，证明线性性能达到200μg/L，相关方程为y＝1.0408x+0.1299，相关系数R2＝1，见图3。
表3、实施例2试剂盒线性范围检测
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四、重复性和精密度：
肌酸激酶同工酶CKMB的浓度为10μg/L与100μg/L的校准品作为样本，按所述全自动化学发光免疫分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，结果见表4。
表4、实施例2试剂盒的重复性和精密度检测
由表4可知：本发明肌酸激酶同工酶CKMB检测试剂盒的重复性及准确性都能达到临床应用的要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4；
所述试剂R1包括如下组分：待测抗原抗体1，StrepII标签修饰的待测抗原抗体2，缓冲液；所述待测抗原抗体2与待测抗原抗体1不同源，用于分别结合同一待测抗原的不同表位；
所述试剂R2包括如下组分：抗体3包被的磁性微粒复合物，缓冲液；所述抗体3用于特异性识别所述待测抗原抗体1的Fc端；
所述试剂R3包括如下组分：链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，缓冲液，保护液；所述链霉亲和素-化学发光物偶联复合物用于结合所述StrepII标签修饰的待测抗原抗体2；
所述试剂R4包括如下组分：化学发光激发液/发光底物，缓冲液；所述发光激发液/发光底物用于对应所述链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，并发生光反应。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的组分中：待测抗原抗体1选择兔源、鼠源或羊源抗体；StrepII标签修饰的待测抗原抗体2选择人源、兔源、鼠源或羊源抗体，但与所述待测抗原抗体1不同源。
3.根据权利要求1所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的组分中，抗体3包被的磁性微粒复合物的制备方法如下：
(1)磁珠的清洗及活化：选用0.5～3μm的磁珠，在0.1M、pH4.0～6.5的MES溶液中清洗磁珠2次，然后在室温下加入0.1M、pH4.0～6.5的MES溶液，随后根据磁珠用量和羧基含量添加1.12倍EDC，进行磁珠的活化，反应持续20min；
(2)抗体偶联：加入终浓度0.1～2mg/ml的抗体3，室温孵育偶联3h；
(3)磁珠的封闭：加入终浓度0.1～1％BSA，室温封闭3h，即得目标复合物。
4.根据权利要求1所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂R3的组分中，链霉亲和素-化学发光物偶联复合物选择链酶亲和素与直接发光剂形成的复合物、链酶亲和素与酶促化学发光中的酶偶联形成的复合物，或者，链酶亲和素与电化学发光剂偶联形成的复合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，所述链酶亲和素与直接发光剂形成的复合物中的“直接发光剂”，为吖啶酯类化学发光剂；
所述链酶亲和素与酶促化学发光中的酶偶联形成的复合物中的“酶”，为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP；
所述链酶亲和素与电化学发光剂偶联形成的复合物中的“电化学发光剂”为三联吡啶钌。
6.根据权利要求1所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂R4的组分中，化学发光激发液/发光底物的选择与试剂R3中的化学发光物相对应；
当试剂R3中的化学发光物为直接发光剂时，试剂R4的对应组分选择化学发光激发液“NaOH”；
当试剂R3中的化学发光物为酶时，试剂R4的对应组分选择发光底物“普米诺及其衍生物”；
当试剂R3中的化学发光物为电化学发光剂时，试剂R4的对应组分选择电发光底物“三丙胺缓冲液”。
7.根据权利要求1～6任一所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，当检测抗原具体为GP73时：
所述试剂R1包括：0.5μg/mL鼠抗人GP73抗体，5μg/mL带有Strep-II标签的人源化GP73抗体，50mM Tris-HCl pH7.4，1％NaCl，5％甘油，1％BSA，10％海藻糖，0.1％proclin 300；
所述试剂R2包括：1％人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物，50mM MOPSpH8.0，5％甜菜碱，0.1％Tween20，0.1％BSA，0.1％PC300；
所述试剂R3包括：0.5mg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联复合物，50mM Tris 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl，10％海藻糖，5％甘油，0.5％BSA；
所述试剂R4包括：2.5％AMPPD，100mM Tris-HCl pH7.4，5％NaCl，0.1％KCl，0.1％proclin 300。
8.根据权利要求1～6任一所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒，其特征在于，当检测抗原具体为CKMB时：
所述试剂R1包括：0.8μg/mL鼠抗人CKMB抗体，8μg/mL带有Strep-II标签的人源化CKMB抗体，50mM Tris-HCl pH7.4，1％NaCl，5％甘油，1％BSA，10％海藻糖，0.1％proclin 300；
所述试剂R2包括：1％人源化抗鼠单克隆抗体包被的磁性微粒复合物，50mM MOPSpH8.0，5％甜菜碱，0.1％Tween20，0.1％BSA，0.1％PC300；
所述试剂R3包括：0.5mg/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联复合物，50mM Tris 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl，10％海藻糖，5％甘油，0.5％BSA；
所述试剂R4包括：2.5％AMPPD，100mM Tris-HCl pH7.4，5％NaCl，0.1％KCl，0.1％proclin 300。
9.一种如权利要求1～8任一所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照试剂R1组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)先制备抗体3包被的磁性微粒复合物，再按照试剂R3组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
(3)先制备链霉亲和素-化学发光物偶联复合物，再按照试剂R3组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R3；
(4)按照试剂R4组分，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R4。
10.一种利用如权利要求1～8任一所述的用于检测抗原的化学发光试剂盒进行抗原检测的化学发光免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待测抗原与试剂R1混合孵育，形成“抗体1-抗原-抗体2复合物”；
(2)加入试剂R2，混匀孵育，试剂R2中的抗体3包被的磁性微粒复合物与“抗体1-抗原-抗体2复合物”进行反应，形成“磁珠-抗体3-抗体1-抗原-抗体2复合物”；
(3)将步骤(2)形成的混合液置于磁场中，去除上清，加入试剂R3，混匀孵育，形成“磁珠-抗体3-抗体1-抗原-抗体2-链霉亲和素-发光物复合物”；
(4)将步骤(3)形成的混合液置于磁场中，洗涤复合物；
(5)向步骤(4)复合物中加入试剂R4，检测其化学发光强度。
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