CN114014831B - 一种赭曲霉毒素a半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

一种赭曲霉毒素a半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，该赭曲霉毒素A半抗原结构如式I所示，赭曲霉毒素A人工抗原的结构式如式IV所示。本发明中的赭曲霉毒素A半抗原的制备方法简单，引入的手臂不仅具有活性基团，还完整保留了赭曲霉毒素A的羧基结构特征，使得半抗原与待测目标物的电子云密度一致。而且，基于本发明中的赭曲霉毒素A半抗原制备得到的人工抗原和抗体特异性好，能够准确的识别靶向物质。基于其制备得到的检测试纸条特异性好，灵敏度高，试纸条对赭曲霉毒素A的检测灵敏度可达0.08μg/L，在0.08～1.28μg/L呈线性关系，对于赭曲霉毒素A具有极高的检测效果。

Description

一种赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种赭曲霉毒素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
赭曲霉毒素(Ochratoxins)是曲霉和青霉产生的一组结构类似的真菌毒素，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高的为赭曲霉毒素A(OTA)。赭曲霉毒素A对动物和人类的毒性主要有肾脏毒、肝毒、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用，对人类健康和农业经济具有极高的危害性，在世界范围内，大部分国家及地区、组织均建立相关法律法规，严格把控OTA在谷类食品中的残留量。
相关技术中，OTA残留检测方法主要为薄层色谱、液相色谱和荧光光度法。以上方法虽然可以精确定量OTA，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，无法真正意义上的实现现场检测和快速临检，给日常检测工作带来了极大的不便。
因此，开发一种快速、高灵敏度、高特异性、成本低以及携带操作方便的新型检测方法对于环境及食品检测等领域具有极为重要的意义，而开发的重点则在于获得更优质的赭曲霉毒素A半抗原或人工抗原。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，其半抗原不仅具有活性基团，还完整保留了赭曲霉毒素A的羧基结构特征，使得半抗原与赭曲霉毒素A的电子云密度一致。基于该半抗原制备得到的人工抗原和特异性抗体特异性强，灵敏度高，具有极高的应用价值。
本发明的第一个方面，提供一种赭曲霉毒素A半抗原，该赭曲霉毒素A半抗原的结构如式I所示：
Figure SMS_1
本发明设计得到的赭曲霉毒素A半抗原所引入的手臂不仅具有活性基团(直链且带活性基团)，还完整保留了赭曲霉毒素A半抗原的羧基结构特征，使得半抗原与赭曲霉毒素A的电子云密度一致。基于此结构，使其制备得到的人工抗原及特异性抗体具有极强的特异性。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的赭曲霉毒素A半抗原的制备方法，包括如下步骤：
将式II所示化合物、式III所示的化合物在室温下反应，即得；
其中，式II所示化合物的结构式为：
Figure SMS_2
式III所示化合物的结构式为：
Figure SMS_3
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，反应中还含有催化剂、溶剂和缚酸剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述缚酸剂包括醋酸钠、碳酸钠和碳酸钾中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述缚酸剂为碳酸钾。
在本发明的一些优选实施方式中，所述溶剂包括乙腈。
在本发明的一些优选实施方式中，所述催化剂包括苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵和十四烷基三甲基氯化铵中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述催化剂为四丁基溴化铵。
本发明的第三个方面，提供一种赭曲霉毒素A人工抗原，该赭曲霉毒素A人工抗原由本发明第一个方面所述的赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联得到。
根据本发明第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，偶联其他的载体蛋白。
根据本发明第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述赭曲霉毒素A人工抗原的结构式如式IV所示，
Figure SMS_4
其中，式IV中的protein表示载体蛋白。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的赭曲霉毒素A半抗原或本发明第二个方面所述的制备方法制备得到的赭曲霉毒素A半抗原在下述(1)～(2)任一项中的应用；
(1)制备赭曲霉毒素A特异性抗体；
(2)检测赭曲霉毒素A特异性抗体。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体为单克隆抗体。
本发明的第五个方面，提供一种赭曲霉毒素A特异性抗体，该赭曲霉毒素A特异性抗体是以本发明第三个方面所述的赭曲霉毒素A人工抗原为免疫原免疫动物得到的。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述动物包括家兔、绵羊、豚鼠、小鼠、鸡、山羊和马中的至少一种。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体为单克隆抗体。
本发明的第六个方面，提供本发明第五个方面所述的赭曲霉毒素A特异性抗体在在下述 (1)～(2)任一项中的应用；
(1)检测赭曲霉毒素A；
(2)制备赭曲霉毒素A检测产品。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体为单克隆抗体。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括：检测试剂、检测试剂盒、检测试纸或检测卡中的至少一种。
本发明的第七个方面，提供一种检测试剂或检测试纸，该检测试剂或检测试纸中含有本发明第五个方面所述的赭曲霉毒素A特异性抗体。
根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述赭曲霉毒素A特异性抗体为单克隆抗体。
本发明的第八个方面，提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒中含有本发明第七个方面所述的检测试剂或检测试纸。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的赭曲霉毒素A半抗原的制备方法简单，产率高，纯度佳符合产品质量要求，可以实现规模化量产。
2.基于本发明中的赭曲霉毒素A半抗原制备得到的人工抗原和抗体特异性好，能够准确的识别靶向物质，可用于制备针对赭曲霉毒素A的快速检测试纸条、试剂盒及其他相关检测设备，具有极高的应用前景。
3.基于本发明中的人工抗原和特异性抗体制备得到的检测试纸条特异性高，灵敏度强，对赭曲霉毒素A的检测灵敏度至少为0.08μg/L，在0.06～0.96μg/L呈线性关系，对于赭曲霉毒素A具有极高的检测效果。
附图说明
图1为本发明实施例中的赭曲霉毒素A半抗原的质谱图；
图2为本发明实施例中不同浓度赭曲霉毒素A标准品的标准曲线；
图3为本发明实施例中的荧光定量免疫层析试纸条的定量标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
赭曲霉毒素A半抗原的制备
取0.020g(0.050mmol)结构式如式II所示的化合物于50mL圆底烧瓶中，依次加入0.5 mL乙腈、0.5mL纯水、0.030g(0.250mmol)结构式如式III所示的化合物、0.021g(0.150mmol)碳酸钾和0.005mg正四丁基溴化胺，在室温环境(23～27℃)下反应12h以上。反应完毕后，减压去除溶剂(乙腈)。加入氯化钠-正己烷混合液(2mL饱和氯化钠水溶液和2mL 正己烷混合得到)萃取两次，以除去多余的式III所示化合物，取水相，使用1M稀盐酸将pH 值调至4～5，过滤，收集滤渣，即得赭曲霉毒素A半抗原。
其中，式II所示的化合物结构式为：
Figure SMS_5
式III所示的化合物结构式为：
Figure SMS_6
本实施例中共获得赭曲霉毒素A半抗原0.017g。
本实施例中获得的赭曲霉毒素A半抗原ESI-MS为：444.0[M-1]。
其质谱图如图1所示。
反应方程式如下：
Figure SMS_7
赭曲霉毒素A人工抗原的制备
(1)牛血清白蛋白-赭曲霉毒素A半抗原偶联得到的人工抗原：
取上述实施例中制备得到的赭曲霉毒素A半抗原(3mg)，加入0.1mL二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解。在搅拌条件下加入牛血清白蛋白(BSA)溶液(10mg BSA+1mL MES 缓冲液(pH 6.0))，在室温下避光搅拌16h以上。然后保持搅拌条件，逐滴加入硼氢化钠溶液(10mg硼氢化钠+2mL冰水)，室温下避光搅拌1～2h。用0.01mol/L的PBS室温透析3 天，每天换3次透析液，以除去溶液中的未反应小分子物质，即得赭曲霉毒素A人工抗原。
所得赭曲霉毒素A人工抗原可保存于4℃条件下备用。
(2)血蓝蛋白-赭曲霉毒素A半抗原偶联得到的人工抗原：
方法同(1)，区别在于：
在本实施例中，血蓝蛋白(KLH)溶液的配制方法为15mg KLH+1.5mL MES缓冲液(pH6.0)。
在本实施例中，硼氢化钠溶液的配制方法为10mg硼氢化钠+0.5mL冰水。
赭曲霉毒素A人工抗原的应用
(1)赭曲霉毒素A人工抗原在制备赭曲霉毒素A单克隆抗体中的应用：
具体制备方法如下：
取上述实施例中的血蓝蛋白-赭曲霉毒素A半抗原偶联得到的人工抗原作为免疫原，加入等体积弗氏佐剂充分乳化后进行免疫BALB/C小鼠处理。每只BALB/C小鼠接种的免疫原剂量为100μg，每次免疫间隔2周。免疫3次后，采集小鼠尾部静脉血，检测血清中的抗体效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫。
待抗体效价不再升高后，以100μg接种量的全抗原(血蓝蛋白-赭曲霉毒素A半抗原偶联得到的人工抗原)进行皮下加强免疫。
加强免疫5天后，取试验小鼠脾细胞与SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)进行细胞融合。融合后的融合细胞在HAT培养基中进行孵育筛选，孵育5天后以完全培养基进行培养。
用ELISA法对获得的融合细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的融合细胞使用有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的融合细胞即为赭曲霉毒素A单克隆抗体的杂交瘤细胞。将该杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含赭曲霉毒素A单克隆抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，冷冻干燥后即可得到赭曲霉毒素A单克隆抗体。
(2)赭曲霉毒素A人工抗原在免疫分析中的应用：
在本实施例中，以ELISA法作为示例展示赭曲霉毒素A人工抗原在免疫分析中的应用，具体步骤如下：
取上述实施例中的牛血清白蛋白-赭曲霉毒素A半抗原偶联得到的人工抗原，用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)作为包被稀释液将其稀释至0.04μg/mL。然后按照100μL/孔的量将其加至聚苯乙烯微孔板中4℃包被过夜。甩干孔中的液体，以250μL/孔的量加入1％的BSA(磷酸盐缓冲液作为稀释液)，37℃封闭1h，干燥，得到包被好的检测板。向包被好的检测板中依次加入赭曲霉毒素A系列代谢物标准溶液(100μL/孔)、赭曲霉毒素A单克隆抗体(20μL/孔)，37℃孵育0.5h。甩干孔中的液体，加入300μL/孔的洗涤液，洗涤3次，拍干。加入100μL/ 孔的酶标二抗，37℃反应15min。再次洗涤3次后拍干，加入50μL/孔的显色液，37℃避光反应15min。加入50μL/孔的2M硫酸终止反应，于450nm波长下测定每孔的OD值。结果如表1所示。
表1不同浓度的赭曲霉毒素A系列代谢物标准溶液的OD值
浓度(μg/L) 0 0.03 0.06 0.12 0.24 0.48 0.96
OD值 2.044 1.807 1.546 1.027 0.649 0.375 0.208
将表1中的数据利用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合，绘制标准曲线(图 2)。
可以发现，获得的赭曲霉毒素A系列代谢物标准溶液的线性方程为：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；
其中，r2＝0.998，A＝2.04956，B＝1.46647，C＝0.11487，D＝0.14687；
x表示待测样品中的待测物浓度；
y表示OD值。
通过计算发现，得到的IC50值为0.13μg/L，在0.06～0.96μg/L呈线性关系。
(3)赭曲霉毒素A人工抗原在制备用于检测赭曲霉毒素A的荧光定量免疫层析试纸条中的应用：
具体制备方法如下：
以硝酸纤维素膜(NC膜)为反应膜，将上述实施例中的牛血清白蛋白-赭曲霉毒素A半抗原偶联得到的人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1～0.5mg/mL，并将兔IgG用包被缓冲液调节浓度至0.1～1mg/mL。按照0.8～1.2μL/cm的膜液量，将人工抗原和兔IgG分别喷到反应膜上对应的检测区和控制区表面。检测区和控制区之间间隔为5mm，放置于烘箱中40～45℃处理24～48h。
其中，按质量百分比计，所述包被缓冲液为含有0.5％ PEG20000、1％蔗糖、0.05％BSA 和0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
在PVC板背衬中部叠置上述反应膜，两端分别叠置样品垫(样品垫在样品垫处理液中浸泡5min，37℃干燥16h后得到，按质量百分比计，样品垫处理液为含有0.3％吐温20、1％蔗糖、0.5％ BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液)和吸水垫。反应膜分别和吸水垫、样品垫搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，即得用于检测赭曲霉毒素A的荧光定量免疫层析试纸板，将试纸板切割即得试纸条。
取本实施例中得到的荧光定量免疫层析试纸条，进行检测，评估其检测灵敏度。
以荧光微球作为标记物，采用免疫荧光方法进行检验，具体步骤为：
(a)取500μL荧光微球溶液(荧光微球固含量1％，即含荧光微球5mg)，在搅拌条件下分别加入5mg N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)和4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(CEDC或DEC)作为偶联剂，控制荧光微球溶液的温度为4～10℃，并在此温度下活化40min。活化完成后，加入0.1M碳酸钾溶液，pH调节为8～9，在此期间保持荧光微球溶液温度为4～10℃。加入0.25mg上述实施例中制备得到的赭曲霉毒素A单克隆抗体，搅拌均匀后，冰浴，让其自然升至室温，并在室温下搅拌4～6h进行偶联。偶联完成后，将反应液在12000rpm下离心10min，除去上清，加入1mL荧光缓冲液，超声重悬后，离心，除去上清，重复3次。加入0.5mL荧光缓冲液，再次超声重悬，并在2～8℃冰箱保存备用。
其中，本实施例中的荧光缓冲液为含有0.5％ PEG20000、2％蔗糖、0.1％吐温20，0.5％ BSA、 0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。
(b)采用(a)中的方法，将荧光微球与羊抗兔IgG偶联。
(c)将(a)中的荧光微球标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体与荧光微球标记的羊抗兔IgG 混合后，用荧光缓冲液稀释100～1000倍，得到赭曲霉毒素A单克隆抗体检测液。
(d)用0.1M PBS缓冲液配备一系列不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液(各浓度各100μL)，分别加入(c)中得到的赭曲霉毒素A单克隆抗体检测液(20μL)，反应1min。分别取80μL混合液滴加到上述制备得到的荧光定量免疫层析试纸条的样品区。静置15min，用荧光定量检测仪读取T/C的荧光信号值比值，重复3组。
检测结果如表2所示。
表2荧光定量免疫层析试纸条检测赭曲霉毒素A标准品的测定结果
赭曲霉毒素A标准品浓度(μg/L) 0 0.08 0.16 0.32 0.64 1.28
T/C值 4.742 3.278 2.215 1.281 0.654 0.274
B/B<sub>0</sub> 100％ 69.13％ 46.71％ 27.01％ 13.79％ 5.78％
其中，B表示不同浓度的赭曲霉毒素A标准品的T/C值，B0表示赭曲霉毒素A标准品浓度为0时的T/C值。
从上述结果可以看出，当赭曲霉毒素A的标准品浓度为0.08μg/L时，其B/B0值为69.13％，说明此浓度下检测的T/C值与含0μg/L浓度的赭曲霉A标准液的测试卡T/C值有显著差异，故本发明制备的荧光定量免疫层析试纸条对赭曲霉毒素A的检测灵敏度至少为0.08μg/L。
通过上表数据，采用ELISA Calc软件进行四参数Logistic曲线拟合绘制荧光定量免疫层析试纸条的定量标准曲线(标准曲线图如图3所示)。
其对应的标准曲线线性方程为：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；
其中，r2＝0.999，A＝4.7505，B＝1.29949，C＝0.14558，D＝0.02818；
x表示待测样品中的待测物(赭曲霉毒素A)浓度；
y表示T/C值。
通过不同浓度的标准品浓度对应的T/C值建立四参数Logistic曲线，曲线所得的四个参数值录入荧光定量检测仪的标定软件，以实现荧光定量免疫层析试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。
同时，取上述实施例中得到的荧光定量免疫层析试纸条，进行检测，评估其稳定性。
上述实施例中得到的荧光定量免疫层析试纸条的正常保存条件为室温保存。但在本实施例中，为了更真实表现试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验，将上述实施例中得到的荧光定量免疫层析试纸条分别在室温、45℃(高温加速产品老化)条件下连续放置60 天，并在第3天、第6天、第15天、第30天和第60天使用同一样品分别检测荧光信号值(重复3组)。
结果如表3所示。
表3荧光定量免疫层析试纸条的储存条件和T/C值关系
Figure SMS_8
由上表可知，上述实施例中得到的荧光定量免疫层析试纸条在常温和45℃下密封保存条件下保存60天后，两组试纸条的T/C值均无明显变化，说明上述实施例中得到的荧光定量免疫层析试纸条在极端条件下(45℃)下最少可稳定保存60天，且检测效果与正常试纸条相比无显著变化。而对于常温保存的荧光定量免疫层析试纸条，其在室温下稳定保存一年以上对于检测效果无显著影响，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
取上述实施例中得到的荧光定量免疫层析试纸条，进行检测，评估其精密度。
在本实施例中，通过试纸条的T/C值的板内误差(同一板试纸条，可理解为同一批次) 和板间误差(不同板试纸条，可理解为不同批次)来检测基于上述制备方法制备得到的荧光定量免疫层析试纸条的精密度。
板内变异系数的测定是对同一板的10条荧光定量免疫层析试纸条的T/C值的数据，板间变异系数的测定是对不同板的10条荧光定量免疫层析试纸条的T/C值的数据，板内变异系数和板间变异系数均需进行离散程度分析。
变异系数公式为：
CV％＝标准偏差SD值测定平均值×100％
结果如表4所示。
表4上述实施例中的荧光定量免疫层析试纸条的板内变异系数和板间变异系数
序号 板内T/C值 板间T/C值
1 4.751 4.732
2 4.960 4.477
3 5.001 4.770
4 4.713 4.524
5 5.011 4.996
6 5.129 4.599
7 4.996 4.778
8 4.780 4.769
9 4.961 4.803
10 5.106 4.818
CV值 2.93％ 3.25％
由表4可知，上述荧光定量免疫层析试纸条在板内和板间的检测中，T/C值均变化较小。通过变异系数计算公式进一步计算得到板内和板间的变异系数分别为2.93％和3.25％，说明上述荧光定量免疫层析试纸条的板内和板间变异系数小，在统计学意义上可以认为该试纸条精密度高，可满足目前常规试纸条的定量需求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的。

Claims (10)

1.赭曲霉毒素A半抗原，其特征在于，所述赭曲霉毒素A半抗原的结构如式I所示：
Figure FDA0003988951120000011
2.权利要求1所述的赭曲霉毒素A半抗原的制备方法，包括如下步骤：
将式II所示的化合物、式III所示的化合物在室温下反应，即得；
其中，式II所示化合物的结构式为：
Figure FDA0003988951120000012
式III所示化合物的结构式为：
Figure FDA0003988951120000013
其中，反应中包括催化剂、溶剂和缚酸剂；
所述缚酸剂选自碳酸氢钠、碳酸钠和碳酸钾中的至少一种；
所述溶剂选自乙腈、丙酮、四氢呋喃中的至少一种；
所述催化剂选自苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵、三辛基甲基氯化铵和四丁基碘化胺中的至少一种。
3.赭曲霉毒素A人工抗原，其特征在于，所述赭曲霉毒素A人工抗原由权利要求1所述的赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联得到。
4.根据权利要求3所述的赭曲霉毒素A人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的赭曲霉毒素A人工抗原，其特征在于，所述利要求3所述的赭曲霉毒素A人工抗原，其特征在于，所述赭曲霉毒素A人工抗原的结构式如式IV所示，
Figure FDA0003988951120000021
其中，式IV中的protein表示载体蛋白。
6.权利要求1所述的赭曲霉毒素A半抗原在下述(1)～(2)任一项中的应用；
(1)制备赭曲霉毒素A特异性抗体；
(2)检测赭曲霉毒素A特异性抗体。
7.赭曲霉毒素A特异性抗体，其特征在于，所述赭曲霉毒素A特异性抗体是以权利要求3～5任一项所述的赭曲霉毒素A人工抗原为免疫原免疫动物得到的。
8.权利要求7所述的赭曲霉毒素A特异性抗体在下述(1)～(2)任一项中的应用；
(1)检测赭曲霉毒素A；
(2)制备赭曲霉毒素A检测产品；
其中，所述产品选自：检测试剂、检测试剂盒、检测试纸或检测卡中的至少一种。
9.一种检测试剂或检测试纸，其特征在于，所述检测试剂或检测试纸中含有权利要求7所述的赭曲霉毒素A特异性抗体。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求9中所述的检测试剂或检测试纸。
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CN106496323B (zh) * 2016-10-08 2020-02-04 华南农业大学 一种簇选择性赭曲霉毒素人工抗原及其广谱性多克隆抗体的制备方法
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